Gene Flow dari Gen Ketahanan Antibiotika (nptII) dan Promotor CaMV 35S pada Tanaman Kapas transgenik Bollgard NuCOTN 35B ke Kapas bukan transgenik

GENE FLOW DARI GEN ICETAHANAN ANTIBIOTIKA

(nptII)

DAN PROMOTOR CaMV 35s PADA TANAMAN

KAPAS TRANSGENIK BOLLGARD NuCOTN

35B

K E

IOiPAS

BUKAN TRANSGENIK

OLEH

:

REZA INDR.IAD1

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOH;

ABSTRAK

REZA INDRIADL. Gene Flow dari Gen Ketahanan Antibiotika (nptII) dan Promotor CaMV 3 5 s pada Tanaman Kapas Transgenik Bollgard NuCOTN 3SB ke Kapas Bukan 'Transgenik. Dibawah Bimbingan DWI ANDREAS SANTOSA dan MUHAMMAD I-IERMAN.

Penelitian tentang gene flow dari gen ketahanan antibiotika (nprII) dan promotor CaMV 3 5 s pada tanaman kapas transgenik Bollgard NuCOTN 35B l<e kapas bukan transgenik dilaksanakan dari bulan November 2001 sampai dengan Agustus 2002. I'enelitian ini bertujuan untuk memperoleh metoda untuk melakukan isolasi DNA genom total dari biji kapas yang sesuai untuk keperluan PCR dan molekular kloning, mendeteksi terjadinya gene $ow dari gen ketahanan antibiotika (nptII) dan pr~motor 35s CaMV pada kapas transgenik Bollgard ke kapas bukan transgenik, mendeteksi terjadinya multiplikasi kedua gen tersebut pada kapas bukan transgenik. Metodologi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrdksi dan isolasi DNA genom total dari biji, pelacakan sekuen DNA transgenik melalui lvebsite GenBank dan disain primer dengan meilggunakan software Primer3, pendeteksian gen nptII dan promotor 35s CaMV dengan proses polymerase chain reaction (PCR) dan pendeteksian multiplikasi sekuen rr~elalui

densitometer.

Hasil !rang diperoleh menunjukkan bahwa berhasil diperolehnya rrletoda isolasi DNA genom total dari biji kapas dengan berat molekul lebih dari 24 kb, dengan hasil 1.58

+

0.63 pg DNA per biji, dan tingkat kemurnian DNA 1.82

+

0.36. Terjadinya gene flow dari gen nptII dan promotor 35s CaMV pada tanarnan kapas transgenik Bollgard ke tanaman kapas jenis Kanesia-7. Sebaliknya tidak ditemukiin terjadinya multiplikasi kedua gen tersebut pada tanaman kapas Kanesia-7.

Saya ~nenyataknn dengan sebenar-benamya bahbva segala pernyataan

dala~n

tesis say;[

y a n g be~:judrll

:

GENE

FIdOFV

1)AIIl C1CN l<ICrI'A1lANAN AN'I1II~lO'l'Il<A (t ~ p t l l )

DAN I'ROMO'I'OIt

CirMV 3SS

A

' I ' A N A M A N ICAI'AS

T M N S G E N I l t BOLLGARD NuCOrl'N

3513

ICE

IOIl'AS

BUI<AN TRANSGENII<

Merupakan gagasan atau hasil penelitian tesis saya sendiri dengan

pernbimbingan ltolnisi pembimbing, kecuali yang dengall secara jelas

ditunjukkan ri~,jukkannya. Tesis ini belunl pernah diajukan untuk

memperoleh gelar pada program sejenis di Perguruan Tinggi lain.

,

Semua data dall inforrllasi yang digunaltan telah dinyatakan secara

jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

Reza Indriadi

GENE FLOW

D A N GEN KETAHANAN ANTIBIOTIIKA

(nptII)

DAN PROMOTOR CaMV

35s

PADA TANAMAN

KAPAS TRANSGENIK BOLLGARD NuCOTN 35B

K E KAPAS BUKAN TRANSGENIIC

OLEH

:

REZA INDRIADI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains Pada

Program Studi Bioteknologi

PROGRAM PASCASA,RJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Tesis : GENE FLOW DARI GEN KETAHANAN ANTIBIOTIKA (nptII) DAN PROMOTOR CaMV 35s PADA TANAMAN KAPAS TRANSGENIK BOLLGARD NuCOTN 35B KE KAPAS BUKAN TRANSGENIK

Nama Mahasiswa : Reza Indriadi

NRP : 99643

Program Studi : Bioteknologi

\ Menyetujui,

1. Komisi Pembimbing

*Q*-

Dr. Ir. Muhammad Herman

Ketua Anggota

Mengetahui,

2. Ketua Program Studi rogram Pascasarjana

Bioteknologi

fP1

C

-

Alhamdulillah..

. .

ku syukuri atas segala rahmat. MU

mungkin kecil bagi MU tapi sangat berarti bagi ku sepenggal asa, telnh kuraih dalam panjangnya perjalanan hidup ini

Penulis dilahirkan di Padang pada tanggal 23 Januari 1976 sebagai analc

kedua dari tiga bcrseudara dari keluarga Nasri Taharudin dan Indrawati. Jenjang

pendidikan SD di S11 Negeri 2 Nanggalo Padang, SMP Negeri 12 Padang d m

SMA PGRI 1 Paditng. I

Pendidikall sarjana ditempuh pada tahun 1994 di Program Studi Agronomi

Junlsan Budidaya Pcrtanian, Fakultas Pertaniaii. Universitas Andalas, lulus pada

tahun 1999. Patla tahun yang sarna, penulis diterima di Program Studli

PRAKATA

Puji dan s ~ u k u r penulis haturkan kehadirat Allah SWT atas segala Rahmat

dan Karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan

Tesis ini dengan baik. Tesis yang berjudul "Gene flow dari Gen Ketahanan Antibiotika (nprJI) dan Promotor CaMV 35s pada Tanaman Kapas Transgenik Bollgard NuCOTN 35B ke Kapas Bukan Transgenik" irii merupakan salah sat11 syarat untuk memperoleh gelas Magister Sains (MSi) pada

Program Studi 13ioieknologi Institut Pertanian Uogor. Pada Kesempatan i r ~ i

penulis bermaksutl mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada :

1. Dr. Ir. DM i Andreas Santosa dan Dr. Ir. Muhammad Herman selaku ketua

dan anggota komisi pembimbing yang memberikan arahan clan bimbingan

dalam pe1itks;lnaan penelitian ini.

2. Kedua ormg tua penulis, Nasri Taharudin (Alm) dan Indrawati beserta

kedua sattdara, Ivan Indriawan dan Yohall Indriansyah yang telah

8

memlerikiin doa, kepercayaan dan sernangat yang tak ternilai bagi

penulis.

3." Jajaran direksi dan staff Indonesia Center for Biodiveisity ant1

Biotechnology (ICBB) yang memberikan bantuan dana sehingga

penelitian ini dapat terlaksana dengan baik.

4. Ir. FX. I<~.istiyono selaku direktur PT. Saraswanti Endogenetech beserta

staff yarg telah memberikan bantuan fasilitas dalarn pelaksanaail

penelitian ini

5. Adinugrollo Setiawan, ST dan staff laboratorium PT. Saraswanti

Indogenetch atas kerjasama yang diberikan selama penelitian.

6. Rekan-rekan di laboratorium, Heru Kusdianto, SPi., Neni Yuliawati, SI' dm Marhirmrrh Nadir, SP dan rekan-rekan mahasiswa PPs Bioteknologi

7. Bapak, Ibu dan r ~ k a n di Ikatan Keluarga Besar Universitas Andalas

Bogor, rehan-rekan alumni jurusan Budidaya Pertanian Fal;ultas Pertanian

Universitas Andalas angkatan 1994 atas keakraban selama ini.

8. Keluarga I~esar Taharudin, Yazid dan Hasmanan yang telah memberikan.

dorongan selnangat kepada penulis untuk dapat menyelesaikan studi

dengan b a ~ k.

9. Guru-guru yang telah mendidik dan mengajariku.

Akhir kata penulis berharap tesis ini dapat memberikan manfaat bagi

yang membaca dan nlenjadi pertimbangan dan masukan untuk pelepasarl tanaman

kapas transgenik.

Bogor, September 2002

DAFTAR IS1

.

.

DAFTARTABEL

...

11

...

...

DAFTAR GAMBAR 111

...

DAFTAR

LAMPI

RAN iv

PENDAHU1,UAN

...

Latar Belakang 1

Tujuan

...

5 Manfaat Perleli tian

...

5

TIN JAUAN PUSTAKA

...

Tanaman Hasil Modifikasi Genetik 6

...

Analisis Resiko Lingkungan 9

BAHAN DAN METODE

...

Tempat dan Waktu

...

Bahan Tanaman

...

Sekuen DNA Kapas Transgenik dan Disain Primer

Ekstraksi dan Isolasi DNA Genom Total dari Biji Kapas ... Pendeteksiail Gene I~lovv dari Gen nptII dan

...

...

Promotor CaMV 35s Melalui PCR

.

.

Pendeteksian Multiplikasi Melalui Densitomerer

...

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sekuen DNA Kapas Transgenik dan Disain Primer

...

28 Ekstraksi dan Isolasi DNA Genom Total dari Biji Kapas

...

33 Pendeteksian Gene Flow dari Gen nptII dan

...

Promotor CaMV 35s Melalui PCR 36

...

Pendeteksian Multiplikasi Melalui Densitometer 43

...

KESIMPULAN 45

...

DAFTARPUSTAKA 45

DAFTAR TABEL

Halaman

1

. Hibridisasi Tailaman dengan Spesies Liarnya

(Wild Relatives)

...

15

2

. Sekuen dan Ciri Primer- primer CaMV 35s dan

nptII

...

28

3

. Kapas Bollgard dan Karakteristiknya Berdasarkail USFDA ...

29

4

.

Kapas Bollgard dan Karakteristiknya Berdasarkan BLAST

...

30

5

.

Karakteristik Sekuen DNA Transgenik dan Komplemensitas

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1

.

Hasil E. kstraksi dan Isolasi DNA Genom Total biji Kapas

...

34

...

2

.

Hasil PCR dari Biji Kapas Jenis Bollgard 38

3

.

Hasil Amplifikasi dengan Menggunakan Primer TN5

...

Untuk mendeteksi Fragmen nptII 39

4

.

Hasil Amplifikasi dengan Menggunakan Primer 35s-B

...

Untuk mendeteks; Fragmen CaMV 3 5 S 39

5

.

Hasil Amplifikasi Terhadap Kanesia-7 yang

...

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1

.

Denah Pengambilail Sampel Biji Kapas

...

51

...

.

2 Deskripsi Kapas Varietas NuCOTN 35B (Bollgard) 52

.

...

3 Sekuen Lengkap dari PBI 1012T 53

.

...

4 Sekuen Legkap dari Promotor CaMV 35s 57

PENDAHULIJAN

Teknologi rekayasa genetik tanaman telah mengalami perkembangan yanlg

sangat pesat pada dekade belakangan ini. Teknologi ini memberikan pengertis~n

dalam transfer DNA dari berbagai organisme kedalam tanaman dengan harapan

bahan genetik yang ditransfer tersebut dapat meinberikan keuntungan terhada.~

industri pertanian, makanan dan konsumen.

Tanarnan transgenik mengandung bahan genetik yang secara artifisial

dimasukkan kedalanl susunan genoln tanaman. Susunan dari baharl genetik

tersebut murlgkin dapat berasal dari tanaman dari spesies lain, atari bahkan dari

organisme lainnya. Seperti halnya yang terdapat pada kapas Bt. dimana tanarnan

pada kapas Bt mengandung bahan genetik dari bakteri Bacilius thuringiezzsis

(crylAc) d m protein dihasilkan efektif terha'dap serangan harna Lepidoptera

(Monsanto, 2001). Tananlan transgenik dikenal dengan istilah tanarnan hasil

rekayasa genetik atau hasil modifikasi genetik (genetically moJiJiec(' crops),

walaupun sebenarnya tanaman itu sendiri telah mengalarni modifikasi genetik

dalam jangka waktu yang cukup lama dengan jalan membudidayakan spesies liar,

adanya seleksi serta kontrol terhadap pemakaian bmih yang baik untuk musinn

tanam berikutnya, kesemuarlya ini dilakukan secara konkensional oleh petani

sejak lama tanpa lnengetahui proses pemodifilcasian / perekayasaan genetik yang

Data yang diperoleh International Service for Acquisition of Agri-biotech

Applications (ISAAA) oleh James pada tahun 2001 mznyatakan bahwa secara

global terjadi peningkatan penanaman tanaman transgenik yaitu sekitar 1,7 juta

hektar pada t'hun 1996 menjadi 52,6 juta hektai pada tahun 2001. Tanaman kapas

transgenik sendiri menyumbang sekitar 13 % dari total area penanaman tanamal;

transgenik pada tahun 2001 dan mengalami peningkatan sekitar 28 % dari tahutl

sebelurnnya. Penanaman tanaman transgenik di Indonesia hanya sekitar 4.000

hektar (James, 21301).

Penggunaan tanaman transgenik secara komersial telah menjadi perhatiark

hampir di seluruh negara di dunia, termasuk di lndonesie. Sr;:jak tahun 1997

prinsip kehati-hatian merupakan pendekatan yang dilakukan olzh pemerintal-1

.

Indonesia terhadap pengaturan keamanan hayati Produk Bioteknologi Hasil Rekayasa Genetik (PBPHRG) dengan keluarnya keputusan Menteri Pertanian

No. 856/Kpts/HW.330/9/1997. Karena keputusan Menteri Pertanian tersebut

belum mencakup aspek keamanan pangan produk PBPMRG, maka pada tahun

1999 dikeluarkan Surat Keputusan Bersama Empat Menteri, Menteri Pertanian,

Menteri Kehutanan dan Perkebunan, Menteri Kesehatan dan Menteri Negara

Pangan dan Hortikultura tentang Keamanan Hayati dan Keamanan Pangan Produk

Pertanian Hasil Rekayasa'Genetik (PPHRG) (Herman, 2002. komunikasi pribadi)

Sehubungan dengan itu telah dikeluarkan beberapa peraturan dan pedoman

serta dibangunnya Fasilitas Unit Terbatas (FUT) yang bertujuan pengujian

keamanan hayati tanaman transgenik. Disamping itu telah dibentuk suatu

s

yaitu Komisi Kearnanan Hayati dan Keamanan Pangan (KKHKP) yang dalanl

tugasnya dibantu oleh Tim Teknis Keamanan Hayati dan Keamanan pan gar^

(TTKHKP).

Menurut surat Keputusan Bersama Empat Menteri, Menteri Pertanian,

Menteri Kehutar~an dan Perkebunan, Menteri Kesehatan dan Menteri Negara

Pangan dan Hortikultura No. 998.l/Kpts/OT.210/9/99; 790.a/Kpts-IXf1399;

1 145A/MENKES/SKB/IX/l99; 01 SA/Nmeneg PH01U09/1999, tentang

Keamanan Hayati dan Keamanan Pangan Produk Pertanian I-Jasil Rekayasa

Genetik, setiap tanaman transgenik termasuk kapas Bt, yang akan dimarifaatkart di

Indonesia harus melalui suatu evaluasi, pengkajian, dan pengujian keamanari

hayati tanaman transgenik. Evaluasi dan kajian dokumen dan pustaka ilmidi

tentang keamanan hayati tanaman transgenik yang diuji dilakukan oleh TTKHKF'

Kelompok Tanaman. Pengujian tanaman transgenik dilakukan secara bertahap

yaitu di Fasilitas Uji Terbatas (FUT) dan Lapangan Uji Terbatas (LUT).

Persetujuan pengujian keamanan hayati di FUT diberikan oleh TTKHKP.

TTKHKP menetapkan pengujian keamanan hayati tanaman transgenik untuk.

dapat dilanjutkan di LUT. Pelaporan hasil evaluasi, pengkajian dan pengujian~

keamanan hayati oleh TTKHKP kepada KKHKP. Atas saran TTECHKP, KKHKP'

merekomendasikan arnan hayati terhadap tanaman transgenik yang dijui dalam ha1

ini kapas Bt kepada Direktur Jenderal terkait. Tanaman transgenik yang sudah,

mendapatkan ketetapan keamanan hayati dadatau keaimanan pangan dapal

Kapas Bt y ang dikpas oleh pemerintah telah m6ndapatkan status aman liayati dan

melalui prosedur pelepasan varietas tanaman.

Secara global Perkembangan dari penggunaan tanaman transgenik teial-1

menimbulkan menimbulkan perdebatan pro dan kontra pada masyarakat

(Johnson and Riordan, 1998; Ho, 2000; Herman, 2000) serta menjadi isu yang

penting di Indonesia (Amsar, 2001; Syamsari, 2001; YLK Sulsel, 2001).

Di Indonesia, kapas Bollgard adalah tanaman transgenik yang pertama kalii

ditanam pada skala komersial tahun 2001. Kapas transgenik yang cliintroduksikar~

tersebut dikenal dengan nama NuCOTN 35B (Bollgard), dengan karakteristik;

tahan terhadap serangan hama Helicoverpa armigera. Uji coba tanaman in^

dilakukan di Kabupaten Takalar, Bantaeng, Gowa dan Bulukumba Provinsi~

Sulawesi Selatan dengsrn jumlah keseluruhan 465 ha. Dengan keluarnya~

SK Mentan No. 107/KPTS/KB 430/2/200 1, maka penananan kapas Bollgardl

dilakukan secara komersial pada tujuh kabupaten di Sulawesi Selatan yaitu~

Gowa, Takalar, Bantaeng, Bulukumba, Bone, Soppeng yang bxlsku selama satul

tahun dan terbatas pada lahan seluas 8.000 ha.

Analisis risiko lingkungan (ARL) pada lahan penariaman tanaman

transgenik merupakan ha1 yang mendasar dan harus dilakukan. ARL ini

bertujuan menetaplcan risiko lingkungan yang mungkin muncul akibat dari

pelepasan secars kolnersial tanaman kapas transgenik serta kemungkiilan tindak

lanjutnya dan dik~arapkan untuk menjadi suatu kajian komprehensif'

(Santosa, 2001a; Santosa, 2001b komunikasi pribadi). Hasil evaluasi kapas

bahwa kapas transgenik Bollgrad aman terhadap lingkungan (Herman, 2002

komunikasi pribadi).

Penelitian yang telah dilakukan adalah kajian mengenai gene flow dari gen

ketahanan antibiotika (nptII) dan promotor CaMV 35s pada tanaman kapas

transgenik Bollgald NuCOTIq 35B ke kapas bukan transgenik. Hipotesis yang

diperoleh dimungkinkan terjadinya gene flow dari gen ltetahanan antibiotika

(nptII) dan promotor CaMV 35s pada kapas transgenik Bollgard ke kapas bukarl

transgenik.

Tujuan

1. Memperoleh metoda yang sesuai untuk mengisolasi DNA genom total darii

biji kapas.

2. Mendeteksi kemungkinan terjadinya gene flow darl gen ketahanani

antibiotikz (nptII) dan promotor CaMV 35s pada kapas transgenik. Bollgard

NuCOTN 35B ke kapas bukan transgenik.

3. Mendeteksi kemungkinan terjadinya multiplikasi atau peningkatan kopi gen

nptII dan pronlotor CaMV 35s pada kapas bukan transgenik.

6

Manfaat Penelitian

Wasi'l dari penelitian ini diharapkan dapat menjadi pertimbangan masukan

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Hasil Modifikasi Genetik.

Rendahnya kualitas dan kuantitas merupakan masalah utama yang ditemui

dalarn usaha pertanian yang disebabkan oleh cekaman bio~ik, seperti serangaii

hama dan penyakit tanaman serta oleh cekaman abiotik, seperti masalah tanah

masam yang banyak dijumpai terutama di Indonesia. Pemu!iaan tanarnan secara

konvensional dapat mengatasi masalah ini bila dapat diketahui plasma nutfahnya

(germpla3m). Teknologi rekayasa genetik melalui teknik DNA rekombinar~

(rDNA) membuka peluang untuk mernodifikasi bahan genetik ketahanan terhadap

cekarnan biotik dan abiotik dari organisme lain selain tanmarl. Langkah-langkah

essensial dari rekayasa genetik pada tanarnan adalah identifikasi gen yang;

diinginkan, kloning, studi fungsi dan regulasinya, introduksi gen sel-ta studj,

ekspresi kedalsm sel dan akhimya evaluasi genotipe yang dimaksud di lapangan

(Johnson and Riordan, 1998).

Metoda pemuliaan pada tanaman kapas (Gossypium hirsutum) yang

disarankan untuk lnernperoleh tanaman kapas yang tahan terhadap serangan harna

selain dengan n~elakukan penyilangan dengan spesies liar yang diketahui

mempunyai sifat ketahanan terhadap hama, adalah dengan mengintroduksikari gen

ketahanan ke dala~n tanaman kapas yang berasal dari organisme lain dengan cara

rekayasa genetik (Watson, 1989). Salah satu haina yang menyerang tanaman

dikenal dengan cotlon bollworm. Pada tanaman kapas, larva dari hama irli

menyerang bagjan pangkal dari pucuk bunga, bunga deavasa dan buah

(Menn, King and Coleman, 1989) dan pengendalian hama Heliothis sea secara

biologis adalah menggunakan bakteri Bacillus thuringien.sis. Menn et a1 (1989)

menyatakan bahwa lnetoda pengendalian hama Heliothis dengan menggunakan

bakteri Bacillus lhuringicnsis telah digunakan lebih dari dua puluh tahun ymg

lalu dan dianggap sebagai elemen pokok dari program manajemen pengendalian

yang terintegritas. Bakteri yang digunakan adalah Bacillus thurigl:ensis var.

kurstaki strain HD- 1

.

Pemanfaatan suatu bahan genetik yang menyandikan sifat ketahanan bag,i

tanarnan yang telah dikembangkan dan dikomersialkan dalam bentuk tanaman

transgenik adalah yang bersumber dari gen phosphinotricin acetil transferase

(pat) yang diisolasi dari' Streptomyces, gen 5-enolpyruvylshiki~mase-3-phospt

Synthase (epsps) yang digunakan untuk mentransfonnasi sifat tanaman toleran

bagi herbisida serta pemanfaatan protein kristal dari Bacillus thuringiensis untuk

gen ketahanan scrangan serangga hama bagi tanaman (Travers, h4artin and

Reichelderfer, 1987; Feitelson, Payne and Kim, 1942)

Kapas merupakan salah satu tanaman utama penghasil serat dan serangga

lepidoptera adalah masalah hama utarna yang ditemui. Kapas transgenik jenis

Bollgud dihasilkan dengan menyisipkan protein pengendali insekra (CrylAc)

yang diperoleh dari bakteri tanah Bacillus thuringiensis subsp. Kurstalci (B.t.61

yang dipindahkan dengan mediasi Agrobacterium tumefaciens. Laporan safety

produksi protevn CrylAc didalanl genom tanaman kapas &an memberikan

ketahanan alarni terhadap serangan hama serangga lepidoptera, diantaraya

tobacco budworn, pink bollworn, dan cotton bollworn (Monsanto, 2001).

Kapas Bollgard ini mulai dikembangkan, pada akhir tahun 1980 oleh

Monsanto St. Louis, Co dan mulai dikenalkan di Amerika Serikat pada tahun

1996 yang diikuti penanamannya oleh negara-negara Argentina, Australia, China.,

Meksiko dan Afrika Selatan (Edge et al., 2001). Penanaman kapas transgenik Bf

di dunia sekitar 1,9 juta hektar atau 4 % dari total 52,6 juta hektar dari total

tanaman transgenik pada tahun 2001, peningkatan yang peningkatan cukup

signifikan terdapat di China dari 0,5 juta hektar pada tahun 2001 menjadi 1 3 jutii

hektar pada tahun 200 1 (James, 200 1).

Kapas Bollgard ini mengandung dua T-DNA insert dari Agrobacteriurut

tumefaziens. Insert pertama mengandung kopi tunggal dari gen crylAc, nptII[

(neomycin phosphotransferase II yang mengkode ketahanan terhadap antibiotika

kanamisidner~misin), serta gen ketahanan antibiotika' spektinornisin dar.1

streptomysin [nad{3 "(9)-0-aminoglyciside adenyltmnsferase)]. Gen kaset cry1 Ac:

terdapat promotor 35s dan terminator 7S3', gen nptJI dikendali.k.an oleh promotor

caulzjlo~ver mosaic virus 35s dan terminator n o d ' (nophaline syrrthase), gen ini

berfungsi mcngatur polyadenilation dari mRNA. Insert T-DNA kedua terdapat

262 bp yang me~upakan bagian terminator polyadenylafion 7S3' dari gen cry1 Ac

(Monsanto, 2001).

Gen-gen dari organisme donor yang terlibat dalarn pembuatan kapas

nophaline synthase terminator dari bakteri Agrobacterium ~'umefaciens, nptII da~n

aad dari bakteri E. coli, 7S3 ' terminator dari Glycine max (Monsanto, 2001).

Analisis Risiko Lingkungan.

Pelepasan PI-IRG terutama tanaman transgenik ke lingkungan aka1

berpontensi untuk berinteraksi dengan keanekaragaman habitat yang terdapat di

sekitarnya dalam skala waktu dan ruang. Ekosistem bersifat komplek, maka tidalc

setiap pelepasa~l tanaman transgenilc dapat dilakukan kajian risiko lingkungan

secara tepat. Interkasi yang terjadi di alam terutama dalam jangka waktu yang

lama merupakan suatu kendala dalam melakukan prediksi mengenai potensial

risiko yarig terjadi disamping sedikitriya data yang menunjang niengenai dm~palc

lingkungan yang ditimbulkan. Pengelolaan yang tepat merupakm ha1 yang

dibutuhkan dalam nlenetapkan suatu kajian mengenai risiko lingkungan dari

pelepasan tanarnan transgenik (Wolfenbarger and Phifer, 2000).

Setiap tanaman transgenik termasuk kapas Bt, yang akan dimanfaatkan di

Indonesia hams ~nelalui suatu evaluasi, pengkajian, dan pengujian keamanari

hayati tanaman transgenik. Menurut Surat Keputusan Bersama Empat Menteri,

Menteri Pertanian, Menteri Kehutanan dan Perkebunan, Menteri Kesehatan darl

Menteri Negara Pangan dan Hortikultura No. !398.1/Kpts/OT.210/9/99;

790.alKpts-1x11999; 1 145A/MENKES/SKB/IX/l99; 01 5AAVmeneg PHORI 09,'

1999, tentang Keamanan Hayati dan Keamanan Pangan Produk Pertanian Hasil

Rekayasa Genetik bahwa pemanfaatan tanaman transgenik baik produk yang

hayati dan keamanan pangan serta memepertimbangkan kaidah agama, etika,

sosial budaya dan estetika (gen yang ditransformasikan harus tidak bertentangan

dengan kaidah agama atau harus halal).

Evaluasi dan kajian dokumen dan pustaka ilmiah tentang keamanan hayaiti

tanaman transgenik yang diuji dilakukan oleh TTKMKP Kelompob Tanaman.

Evaluasi dan kajian dokumen dan pustaka ilmiah dilakukan terhadap data d m

dokurnen jawaban pertanyaan-pertanyaan inti yang mencakup anatara lain spesies

yang akan diuji, tujuan khusus pengujian, lokasi, habitat dan ekologi, genetika

tanaman transgenik, prosedur percobaan, dan pemantaua~~, serta dok.ume~n

pernyataan aman yang disetujui untuk dikomersialkan diberbagai negara.

Pengujian keamanan hayati tanaman transgenik dilaltukan secara bertdiaj~

yaitu di Fasilitas Uji Terbats (FUT) dan Lapangari Llji 'T'erbatas (LUT).

Persetujuan pengu-jian keamanan hayati di FUT diberikan oleh T?'HE;IP. Pengujian

tanaman transgenik di FUT dilaksanakan sesuai dengan Pedoman Pengujian

Keamanan Hayati PI3HRG Seri Tanaman tahun 1998. 'TTKHKP melakukari

monitoring terhadap pelaksanaan pengujian tanaman transgenik di FUT. Evaluasi

dan pengkajian data hasil pengujian FUT dilakuarl oleh 'T'TKNKP Kelompok

Tanaman. Dari hasil review pengujian keamanan hayati di FUT dan kajian ilmiah

data-data dan dokumen keamanan hayati di luar negeri, diketahui tidak adanya

darnpak negatif dan efikasi positif dari sifat utama yang di klaim dari tanarnar~

transgenik.

TTKHKP nienetapkan pengujian keamanan hayati tanaman transgenik.

dilaksanakan di tiga lokasi. Pengujian tanaman transgenik di LUT dilaksanakan

sesuai dengan Pedoman Pengujian Keamanan Hayati PBHKG Seri Tanaman

tahun 1998. TTKHKP melakukan monitoring terhadap pelal~sanaan pengujian

keamanan hayati di LUT. Pelaporan hasil evaluasi, pengltajian dan pengujian

keamanan hayati oleh TTKHKP tentang rekomendasi aman hayati tanaman

transgenik kepada KKHKP. Atas saran TTKHKP, KKHKP merekomendasikan

arnan hayati terhadap taimnan transgenik yang diuji dalam ha1 ini kapas Bt

kepada Direktur Jendesal terkait.

Tanaman transgenik yang akan dilepas dan diedarkan di Indonesia harus

mendapatkan dua tipe surat keterangan aman, yaitu Iceamanan Hayati dain

Kearnanan Pangan uu~tuk tanaman transgenik yang ditumbuhkan di Indonesia d a i ~

digunakan sebagai bahan pangan dan pakan seperti jagung, kacang tanah, kedelai,

kentang, padi. Keamanan Hayati untuk tanaman transgenik yang ditumbuhkan,

tetapi bukan untuk bahar, pangan dan pakan seperti kapas. Tanaman transgenik

yang sudah mendap2tkan ketetapan keamanan hayati dantatau keamanan pangari

dapat dilakukan uji adaptasi di berbagai lokasi sebagai persyaratan pelepasarl

varietas. Kapas BI yang dilepas oleh pemerintah telah mendapatkan st- a t ~ ~ amarl

hayati dan melalui prosedur pelepasan varietas tanarnan.

Keluarnya SK Mentan No. 107lKPTSlKB 43 0121200 1 menandakan adanya

pelepasan terbatas tanaman kapas transgenik dalam usaha skala kornersial dii

Indonesia. Kerjasama bagi penelitian, monitoring dan pengujian pada tanaman,

kapas ini dari berbagai pihak hendaknya dikembangksm, sehingga apa dan

perusahaan sebazai produsen, akademisi, pemerintah akan tetapi dapat dipahmli

dan diterima oleh masyarakat sebagai konsumen.

Sehubungan dengan keperluan pemantauan dan pemanfaatan kapas Bt cli

Sulawesi Selatan, maka dalam rangka pendekatan kehati-hatian telah dikeluarkan

Keputusan Menteri Pertanian No: 3051KptslKp. 1 50151200 1 tentang pernbentukan

Tim Pengendalian Kapas Transgenik, tim ini terdiri dari unsur Menteri Negara

Lingkungan Hidup I Badan Pengendalian Dampak Lingkungan Pusait,

Departemen Pertanian, Pemerintah Daerah Propinsi Sulawesi Selatan, Tim Penila~i

dan Pelepas Varietas, Komisi Keamanan Mayati dan Keamanan Pangan.,

Kelompok Pakar 13ioteknologi, Lingkungan, Sosial Ekonomi dan Pemuliaan. Tim

ini bekerja dalam berbagai bidang, antara iain: Bidang Produksi dan

Pengembangan, Bidang Pengkajian yang terbagi menjadi 3 sub bidang yaitu Sub

Bidang Daya Hasil, Sub Bidang Analisis Risiko Lingkungan, Sub Bidang Sosial

Ekonomi dan Ridang Pemantauan clan Pengawasan (Herman, 2002 koniunikasi

pribadi).

Kajian analisis risiko lingkungan (ARL) bermanfaat untuk menetapkan

kemungkinan dan akibat yang sebenarnya terjadi dari pcnggunaavl tanaman

transgenik (Ammann, Jaot and A1 Mazyad, 2001). Regal (1994) mengajukan tiga~

kategori yang harus diuji dalam suatu kajian ARL pada tanarnan transgenik, yaitu.

1) kemungkinan dari tanaman transgenik bersifat invasive di lingkungan pertanian

(bersifat sebasai gulma), 2) kemungkinan terjadinya perpindahan gen secara

vertikal (vertical gene flow) melalui hibridisasi dengan tanaman sejenis atau

Pendapat Santosa (2001 b, komunikasi pribadi) mengenai kajian ARL yang

hendaknya dilakukan pada tanaman kapas transgenik Bt adalall 1) pengaruh kapa~s

transgenik terhadap ekologi tanah, 2) dampak perubahan fungsi metabolisme pada

komunitas mikroba, dan pengaruh yang mungkin terjadi pada hama sekunder,

3) persistensi rekoinbinan DbJA Bt dan degradasi protein Cry didalarn tanah,

4) kemungkinan tcrjadinya transfer gen horizontal gen ketahanan antibitotika ke

mikroba tanah, 5) kemungkinan terjadinya transfer gen cry dan ketahanarn

antibiotika ke tanaman bukan transgenik.

Sebagian lnasyarakat mengkhawatirkan adanya risiko keamanan hayati

dari penggunaan tanaman transgenik. Herman (2002, komunikasi pribadi)

mengelompokkan r i ~ i k o tersebut atas: 1) terjudinya pengaruh negatif terhadap

organisme bukan sasaran dan hewan ternak, 2) timbulnya gulma super, 3) tidak

stabilnya gen ketahanan dan terjadinya kepatahan ketahanan tanaman transgenik

terhadap hama sasaran sehingga timbul hama super yang kebal terhadap tanamarl

tersebut, 4) pembcntukan senyawa yang menimbulkan alergi atau keracunan bagl

manusia.

Gene fk)w dari tanaman transgenik merupakan perhatian utama dalam~

s

pengujian risiko I ingkungan (Ammann, Jaot, and A1 Mazyad, 200 1). Gene flow!

diartik,p sebagai pergerakan atau penyebaran dari gen (movement of genes)

(Mallet, 2001), penggabungan suatu gen ke dalam suaru gene pool dari sati~

populasi atau lebih (Eastham and Sweet, 2002). Terjadinya geneflow dipengaruhi

oleh keberhasilnn hibridisasi dan penyerbukan (pollination). sementara

seperti: jumlah serbuk sari yang dihasilkan oleh tanaman (transgenik), sebertpa

besar persentase tingkat penyerbukan yang dirniliki oleh suatu tanaman (apakah

bersifat menyerbuk sendiri atau menyerbuk silang), persentase dari tingkat

penyebaran serbuk sari (pollen dispersal), serangga yang melakukan penyerbukan

(insect pollinator), keadaan lingkungan (seperti: cuaca, lingkungan lokal,

halangan yang bersifat fisik), daya viabilitas dan sifat kompetitif dari serbuk sari,

serta sinkronisasi waktu penyerbukan antara matangnya serbuk sari dan stigma

yang bersamaan (Ammann, Jaot and A1 Mazyat, 2001; Eastham and Sweeit,

2002).

Secara alalni tanaman kapas bersifat seifpolination (menyerbuk sendiri)

dan hanya sekitar 2 % yang cross pollination (menyerbuk silang) dengan

perantara angin dan serangga, antara lain bumble hces dan honey bees (Canadian

Food Inspection LJecision Document, Decision Document No.96- 14, 1999). Gcnt?

flow melalui penyerbukan (pollination) merupakan peristiwa yang sangat alami

(CBI, 2001). Serbuk sari pada tanaman kapas berkarakteristik heavy and sticky

(sangat bany& dan lengket) dan penyerbukan silang terjadi pada batasan jarak:

yang terbatas pada sesama tanaman kapas (Canadian Food Inspection Decisior;,

Document, Decision Document No.96- 14, 1996). Faktor lain yang memungkinkan

perpindahan gen dapat terjadi selain hibridisasi dan penyerbukan adalah aclanya

kompabilitas seksi~al (sexual compability) antar tanaman (CBI, 2001).

Ammann, Jaot and A1 Mazyat (2001) melaporkan bahwa 12 dari 13

tanaman terpenting di dunia dapat berhibridisasi dengan spesies liarnya., seperti

Tabel 1. Hibridisasi tanaman dengan spesies liarnya (wild selativesj

(

Zea mays subsp liar

I

Glycine gracilis Tanaman

Gandurn Padi

I

Barlev

I

Hordeum suontaneum

I

Spesies Liar (wild relatives) ~riiicum turgidum subsp liar, beberapa~egiloPs sp Orvza s ~ e s i e s liar

Beberapa Brassicaea spesies liar Tidak ada l a ~ o r a n

Kapas Sorghum Millets Beans

Gossypium spesies liar ----

Sorghum spesies liar

Eleusine coracana subsp Africans, Pennisetum - spesies liar Phaseolus spesies liar

Kemungkinan terjadinya penyerbukan silang antara kal~as transgenilc

Bollgard dengan spesies liarnya khusus di Indonesia tidak nlungkin terjadi,

beberapa alasan antara lain, berbedanya jumlah ploidi dari kapas yang

dibudidayakan dengan spesies liar dan tidak samanya letak secara geografis dari

spesies kapas liar Gossypium tomentosum yang terdapat di Hawaii (lvfonsai~to,

2001). Kemungkinan terjadinya perpindahan gen ke tanarnan kapas budidaya

lainnya dalam lingkungan yang terdekat dapat terjadi dengan bantuan serangga Sunflower

Sugarcme

terutama lebah (Allis mellgera L) (Canadian Food Inspection Decision Document,

Decision Documetzt No.96- 14, 1 996; Monsanto, 200 1).

Terjadinya gcneflow dari kapas transgenik (cotton-Bt) telah teridentifikasi.,

di Australia didapatkan terjadinya tingkat gene flow pada t ~ h u n pertama sebesar

0,15 % pada plot ujl 1 meter dan 0,08 % pada plot uji 4 meter, sedangkan.

pengamatan pada tahun kedua ditemukan sebesar 0,4 % dan 0,03 Oh8 Helianthus annuus liar

Saccharum spesies liar -

[image:109.551.80.490.81.339.2]

pengujian penyebaran serbuk sari kapas transgenik adalah dengan mengukur

besaran frekuensi yang terjadi dari gen marker nprII pada turunan pertama dan

kedua dari daerah penyangga (buffer rows zone) (Liewellyn ,and Fitt, 1996).

Hasil penclitian lainnya adalah ditemukipya gene $ow dari kapas

transgenik sampai 6 meter ke arez penyangga bahkan perpindahan gen jug,a

teridentifikasi salnpai pada jarak 36 meter dari plot kapas transgenik

4

(Shen er al., 2001). Jenis kapas transgenik yang digunakan dalanl penelitian ini

adalah kapas transgenik GK-12 yang mengandung gen cry dan gen marker nptl[I

serta kapas bukan transgenik CCRC 12 dan Xinmian 13 yang ditanarn

disekelilingnya dengan ukuran plot 6 x 6 meter. Pengujian plot pada skala kecil.

yang dilakukan oleh Liewellyn and Fitt, (1996); Shen et al (2001) menyar,znkan

perlunya terdapat zona penyangga (buffer rows zone) sejauh 20 meter dan

70 meter dari tana~nan kapas transgenik yang disesuaikan dengan keadaan

lingkungan masing-masing.

Keberadaan gen ketahanan antibiotika spektinomisin dan streptomysi:n

(aad) pada tanalnan kapas transgenik adalah sebagai hasil dari penggunaaniiya

sebagai gen marker (penanda) untuk menyeleksi bakteri Agrobacteriufiv2

tumefaciens transl'orman yang membawa plasmid gen fungsional dan gen ini

berada dibiiwah kontroi promotor prokariot Agrobacterium tumefaciens dan tidal<

diekspresikan pada tanaman kapas transgenik. Kapas transgenik juga mengandung *

gen penyandi antibiotika yang lain yaitu nptII (neomycin phospotransferase 11)

menyjandikan ketahanan terhadap neomisinlkanamisin dan berada dibawah kontrol

mengidentifikasi sel kapas yang mengandung gerl crylAc (Monsanto, 2001;

Robinson, 1949; IJSFDA, 1998).

Sekitar 90 % dari total 5.769 tanaman transgenik yang telah dilakukan

pengujian di Amcrika Serikat sejak tahun 1998 mengandung gen npt1I sebaga.i

penanda seleksi (Gay, 2001). Antibiotika yang terekspresikan pada kapas

transgenik Bollgard adal3h dari jenis neomisin dan kanamisin yang dikode ole'n

gen npfII (Monsanto, 2001).

Gen ketahanan antibiotika ini diisolasi dari bagian Tn5 bakteri Escherichia

coli yang menyandi kan aminoglycoside 3 '-phosphotransferase II (-4 PH(3 YII)

(O'Sullivan, 1990). APH(3')II mempunyai berat molekul 25.000 yang

mengkatalisis perpindahan grup fosfat dari adenosine 5'-fosfat (ATP) menj3d.i

grup hidroksil pada antibiotika golongan aminoglikosida, dimtaranya adalal~

neomisin, kanamisin, paromomisin, ribostamisin, gentamisin A and B, serta

butirosin (USFDA, 1998; O'Sullivan, 1990) dan diantara antibiotika tersebut yang

digunakan secara inedis bagi manusia dan hewan adalah neomisin dan kanamiscin

(U.S. Pharrnacopeia, 1990).

Proses Polvmerase Chain Reaction (PCR) merupakan elemen pokok dari

0

kajian gene flow dari gen ketahanan antibiotika (nptII) dan promotor CaMV 35s

pada tanaman kapns transgenik Bollgard ke kapas bukan transgenik. Metoda PCR

juga digunakan dalam analisa GMO (genetically modiJied organism) ole11

European Commission, Joint Research Centre, Institufe for Helrlth and Consumer

PCR merupakan tcknik amplifikasi DNA yang spesifik, proses ini dikembangkan

oleh Kary Mullis tahun 1985 (Glick and Pasternack, 1994).

Teknik amplifikasi DNA dilakukan dengan cara melakukan prose:s

pemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemeri da:ri

utas DNA tersebut dengan cara simultan. Proses pemanjangarl nukleotida

merupakan proses polimerasi yang dilakukan oleh DNA polimerase berdasarkan

utas cetakan, proscs ini terjadi akibat adanya primer (Glick and Pasternack, 1994;

Komponen-komponen yang dibutuhkan da.lam suatu proses PCR ada1a.h

1) DNA cetakan (template), sebagai bahan cetakan DNA, 2) Deoksinukleotida

(dNTP), sebagai bahan untuk penyusun polimer DNA, 3) Primer untuk memulsd

I

sintesis bag& yang spesifik, yang merupakan pasangan komplemen dari DNA

cetakan, 4) Dl\JA polimerase, sebagai sintesa DNA dengan adanya primer, *

5) Buffer (larutan penyangga), berguna untuk menyangga berlangsungnya proses

polimerase DNA (Glick and Pasternack, 1994).

Secara umum keefektifan amplifikasi dalam proses PCR tergar~tung pada

kualitas d m kemurniaan DNA. Kualitas DNA dipengaruhi oleh panjang

fragement DNA yang dihasilkan dan tingkat kerusakan DNA dari proses

ekstraksi, sementnra kemurniaan DNA dipengaruhi oleh terdapatnya berbagai

residu senyawa ki~nia hasil proses ekstraksi DNA yang dapat men.ghambat proses

DNA poliml;rase (Laura et al., 2001). Tingkat kualitas dan kemurniaan DNA yang

baik diperlukan sebelum melakukan proses arnplifikasi PCK untuk rnendeteksi

"Biomultiplikasi diartikan sebagai bioakumulasi atau tingkat ekpresi yang

tidak diharapkan dari protein tertentu (greater-than-expected expression of the

protein) yang yang terjadi secara alarni di lingkungan (SAP Report No. 99-06Pi,

2000): Federal Insecticide, Fungicide, and Rodenticide Act (F'IFRA) juga

. ,

meniandang perlu dilakukan kajian lingkungan mengenai kemungkinan terjadinya

biomultiplikasi ke lingkungan (SAP Report No. 99..06A,2000).

Kajian biomultiplikasi yang dilakukan pada penelitian ini adalah

mendeteksi multiplikasi sekuen gen target (Promotor CaMV 35s dan nptII)

dengap menggunakan metoda quuntitative competitive YCR (QC-PCR),

penggunaan metoda ini berdasarkan adanya hubungan antara jumlah kopi gein

dengan tingkat ekspresinya pada transforman (Gendloff, Bowen and Buchholz:,

1990). Metoda QC-PCR dapat menentukan korelasi antara konsentrasi DNA

target dengan jumlah PCR produk yang dihasilkan melalui anlpllifikasi (Laura

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu

Percobaan ini dilakukan di laboratorium molekular PT. Saraswanti

IndoGenetch, Bogor. Dimulai dari bulan November 2001 s m p a i dengan bu1a.n

Agustus 2,002.

Bahan Tanaman

Bahan percobaan yang digunakan adalah biji turunan pertama dari

tanaman kapas transgenik varietas Bollgard NuCOTN 35B dan bukan transgenik

(varietas Kanesia-7 dan Delta Paint). Biji tanaman kapas ini diperoleh dari lahan

pertanaman kapas bji multilokasi pengujian daya hasil di Kecamatan Bajeng

Kabupaten Gowa, Sulawesi Selatan. Sarnpel diambil pada panen pertama kapas

pada bulan Oktobcr 200 1.

Sarnpel biji tanaman kapas yang dianalisis adalah dari varietas Delta Paint

dan Kanesia-7, scmcntara varietas Bollgard NuCOTN 35B digunakan sebagai

kontrol yositif. Pengambilan biji dilakukan pada tanaman ketiga dari pinggir plot

dan kemudian dikomposit. Sebanyak 20 buah biji dari tiap-tiap plot dianalisis

dengan prioritas iitama terletak pada sampel biji kapas Dp 2.11 (Delta Paint),

pemilihan ini berdasarkan letak dari plot tersebut dikelilingi oleh plot pertanaman

kapas Bollgard dengan jarak satu meter, pengambilan sampel juga dilakukan pada

persiapan, penanaman dan pemeliharaan dari tanaman yang dianalisa dam

dilaporkan dalam penelitian ini tidak didisain khusus untuk penelitian ini. Densth

pengarnbilan sampel dapat dilihat pada Lampiran 1.

Sekuen DNA Kapas Transgenik dan Disain Primer.

Sebelurn nlenentukan disain primer yang akan digunakan, terlebih dahulu

harus mendapatkan sekuen dari fragmen DNA yang akan dianalisis. lClasifikasi

fragment DNA yang umum terdapat dalam setiap tanaman transgenik adalah

prornotor, terminator, gen reporter, gen seleksi, dan gen fungsional. Untuk

fragment DNA dari promotor, terminator, gen reporter dan gen seleksi, sekuennya

dapat diakses rnelalui website dari GenBank.

Untuk mendapatkan sekuen dari gen fungsional dari tanaman transgenik,

ada beberapa ha1 yang harus diketahui yaitu : 1) jenis tanman transgenik yang

telah disetujui untuh. dikomersialisasikan, 2) perusahaan yang memproduksi,

3) gen fungsional yang digunakan dan 4) sumber dari gel1 fungsional tersebut

(Tao et al., 2001). Semua data diatas dapat diakses website dari IJnited States qf

Food bnd Drug A~lrninistrasion (USFDA) (htt~://cfsan.fda.eov/-Ird/~con.htmli)

dan yang berhubungan dengan paten dapat diakses website United States Patent

and Trademark Office (USPTO) pada (htt~://www.uspto.gov/patft/), pada situs ini

didapatkan sekuen dari gen-gen yang dimaksud.

Untuk ine~ldisain primer, digunakan software Primer3 dari Whitehead

Institute for Biomcdical Kesearch (Nielsen, 2002 komunikasi pribadi) pada situ!:

beberapa persyaratan yang harus diikutsertakan dalam penibuatan primer iai,

antara lain adalah : 1 ) ukuran produk yang akan diharapkan, 2) CG clamp, 3)

ukuran maksimu~n, minimum dan optimum dari primer, 4) suhu melting,

5) persei~tase kandungan baca G dan C, 6) batasan dari konsentrasi garam

terhadap primer serta 7) maksimum komplemensitas antara primer dengan

template.

Ekstraksi clan Isolasi DNA Genom Total dari Biji Kapas

Kegiatan ekstraksi dan isolasi DNA total tanaman dilakukan mengisolasi

DNA dari biji kapas, beberapa modifikasi metoda yang digunakan antara lain:

1. Metoda JAodifikasi CTAB.

Metoda C1'AB (Marcus et al., 1999) yang telah dimodifikasi untuk sampe:l

berukuran kEcil, sebagai berikut: biji digerus hingga berbentuk tepung dan

diletakkan ke tabung eppendorf 1,5 ml. Larutan ekstraksi CTAR 2X {CTAB ( w ~ v )

2%, 100 mM Tris-HC1 (pH 8,0), 20 mM EDTA, 1,4 M hTaCl, 2-mercaptoethanol

2 %) sebariyak 400 pl ditambahkan ke dalam tabung tersebut. Teyung da11

carnpuran larutan diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 65' C dan

ditarnbahkan 500 p1 chloroform. Tahap selanjutnya adalah sentrifugasi campuraii

tersebut selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 g. Lapisan teratas kemudian

dipindahkan ketabung baru. Larutan CTAB 1X f CTAB (wfv) 196, 50 mM Tris-

HCI (pH 8,0), 10 mM EDTA, 2-mercaptoethanol 2 %) sebanyak 300 pl

saat. Larutan diinkubasikan antara 40-60 menit, disentrifus 13.000 g selama 15

menit, kemudian supernatan dibuang.

Proses presipitasi dilakukan dengan ditarnbahkannya 1,25 M NaCl

sebanyak 120 pi clan dibiarkan sekitar 1 menit, lanitan chloroform ditambahkan

untuk kemudian disentrifius selama 10 menit, 13.000 g, supernatan dipindahkan

ke tabung ban1 dan 0.6 volume isopropanol ditambahkan, larutan diinkubasikan

selama 30 menit, dan setelah itu disentrifius selama 10 menit dengan kecepatan

13.000 g, pelet yang diperoleh kemudian dicuci dengan ethanol 70 % dan

dikeringkan; DNA dilarutkan dalam 40 pl TE.

2. Metoda biii kering

Metoda isolasi DNA genom total dari biji kering ini diperoleh dari Kang

et al., 1998). Yrosedur tersebut adalah sebagai berikut: kulit biji dibuang dan biji

dimasukkan ke'dalam tabung eppendorf 1,5 mL. Bufer ekstraksi (200 mM Tris-

HCI, pH 8,0,200 1nM NaC1, 25 mM EDTA dan 0,5 % SDS) yang mengandung

proteinase K (50 pg) sebanyak 400 p1 ditambahkan ke dalam tabung tersebui.

Larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37

'c.

Larutan CTAB {2 % CTAB

(wlv), 100 mM 'I'ris-HC1 pH 8,0, 20 mM EDTA pH 8,0, 1.4 b4 NaC1, 1 %

Polyvinilpyrolidone) sebanyak 400 p1 ditambahkan ke dadam tabung tersebut.

Tahap selanjutnya, 300 pl kloroform: Isoamilalkohol (24:l) dengan 5 % phenol1

ditambahkan ke dalarn tabung yang selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan

1 1.700 g pada suhu 4' C, 10 menit. Supernatan kemudian dipindahkan ke tabung *

selanjutnya disentrifus de'ngan kecepatan 11.700 g selama 5 menit. Supernatan

kemudian dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan ethanol 70 %. Pelet

DNA dikeringanginkan beberapa saat dan diresuspensi pada buffer TE sebanyak

3. Protokol C Gerus

Metoda ini nlerupakan modifikasi dari metoda Karig ('1 a1.,(1998) dan

Santosa (2001~). I'rosedur tersebut adalah sebagai berikut: kulit biji dibuang dan

biji digerus, selanjutnya tepung biji dimasukkan ke dalam tabung eppendorf

1,5 ml. 400 pZ buler skstraksi (200 mM Tris-HC1, pH 8.0,200 mM NaC1,25 mbA

EDTA dan 0.5 % SDS) yang mengandung proteinase K (50 pg) dan diirlkubasi

selama 1 jam pada suhu 37 OC dan untuk prosedur berikutnya sama dengan

aktifitas nomor 2 metoda biji kering diatas sampai diperoleh crude DNA, cnrd'e

DNA ditambahkan dengan 300 p1 larutan DAS-TIZ dan diinkubasikan pada suhu

ruang selama 5 nlenit. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 15.000 g selama

10 menit pada suhu 4' C. Tahap selanjutnya sebanyak 500 p1 phenol dan 500 pll

chloroform: isoam ylalkohol (24: 1) ditambahkan ke dalanl tabung untuk ekstraksi

DNA, selanjutnya larutan disentrifugasi. Supernatan (+ 250 p1) dipindahkan dan d

400 pl isopropanol ditambalzkan ke dalanl tabung baru. Tahap selanjutnya adalalh

sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 1 1.700 g. DNA murni kemudian

4. Pratokol C Tanpa Gerus

Metoda ini merupakan pengembangan dari ke-3 nietoda yang aipaparksn

diatas. Prosedur tersebut adalah sebagai berikut: kulit bi.ji dibuang dan biji

dimasukkan kedclam tabung eppendorf 1,5 ml dan ditambahkan 400 pl bufer

eksttaksi (200 mM l'ris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaC1, 25 mM EDTA dan 0.5 96

SDS) yang rnengandung proteinase-K (50 pg) dan diinkubasi selama 1 jam yada

suhu 37 OC, untuk aktifitas berikutnya sama dengan prosedur nomor 3 prosedur C

gems.

Larutan DNA hasil isolasi diukur dengan spektofc~tometer pada panjang

1

gelombang 260 nnl dan 280 m. untuk mengetahui kualitas DNA hasil isolasi yang

diperoleh. Proses PCR ini dilakukan dengan menggunakan beberapa set primer

spesifik yang mengenali fragmen-fragmen dari konstruksi DNA kapas transgenik.

Hal ini dilakukan karena pada awalnya tidak diperolehnya informasi mengenai

konstruksi rDNA Bt yang terdapat pada kapas transgenik varietas Bollgard yang

ditanam di Sulawesi &latan, sehingga diperlukan beberapa primer untuk

melacaknya.

l'endeteksian Gene FIow dari Gen nptII clan

Promotor CaMV 35s Melalui PCR

Dua pasang primer digwakan untuk mendeteksi fragmen dari genl

ptnyandi penanda antibiotika (nptII) dan promotor CaMV

35s

yang terdapat:

dalam DNA kapas transgenik. Primer-primer ini didisain oleh Invitrogen dengan

,

26

diperoleh selariiutnya diamplifikasi dengan primer-primer dari konstruksi geri

chimera kapas Bollgard dengan prosedur: 100 ng DNA template, primer:

0.12 pM (fctrwarci dan reverse), campuran PCR-kit (Master Rache) (25 U Taq

DNA Pbl, 100

mM

_{KC1, 3 mM MgC12, dNTP (0.4 mhl)}, dHzO. Prosedur}

amplifikasi dua primer tersebut adalah sebagai berikut:

1 . Primer CaMV 3 5 S

Primer CaMV 355: digunakan untuk mendeteksi fragmen promotor CaMV

35s. Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut: 3 menit denaturasi pada

suhu 95' C dan 35 kali siklus yang terdiri dari 1 menit denatrlrasi pada suhlu

95' C, annealing selama*30 detik pada suhu 57' C untuk primer 35s-A dan 30

detik pada suhu 55' C untuk primer 35s-B, 45 detik extension pada suhu 72' C

dan 3 menit pada suhu 72' C untuk last extension.

2) Primer CRY.

Primer CRY digunakan untuk mendeteksi fragmen gen fungsional dari cry

1Ac. Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut: 5 rnenit deniiturasi pada

suhu 95' C dan 42 kali siklus yang terdiri dari 40 detik denaturasi pada suhu

95' C, 45 detik a,znraling pada suhu 55' C, 30 detik extension pada suhu 72' C

dan 3 menit pada suhu 72' C untuk last extension.

3. Primer NPT

Primer ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan dari gen nptII.

95' C dan 37 kali siklus yang terdiri dari 1 menit denaturasi pada suhu 95' C:,

annealing pada suhu 55' C selama 30 detik pada suhu 50' C selama 40 detik

untuk primer TN 5, dan suhu 60' C untuk primer NPT, selardutnya 30 detik

extention pada suhu 72' C dan 3 menit untuk last extension pada suhu 72' C.

Petideteksian Multiplikasi Melalui Densitometer

Pendeteksian terjadinya multiplikasi atau peningkatan jumlah kopi dari

gen nptII dan prolnotor CaMV 35s dilakukan dengan metoda quantitive

competitive (Alkami, 1999) yang telah dimodifikasi sesuai dengan percobaan in^^.

Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut: dilakukan pengukurmn

konsentrasi (pglpl) DNA marker yang terdapat di gel agarose dan konsentrasi inli

digunakan sebagai standar pengukuran dilakukan dengan meinyergunakain

densitometer. Kegiatan dilanjutkan dengan mengukur konsentrasi produk F'CR

(pglpl) dari fragmen nptII, CaMV 35s dan crylAc. Hasil yang diperolell

kemudian dikonversikan dengan standar dari inarker tadi. Hasil konversi

merupakan nilai estimasi dari produk PCR. Keselunlhan prosedur ini

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sekuen DNA Kapas Transgenik dan Disain Prinaer

Secara umum sekuen-sekuen DNA yang terdapat didalam suatu genoin

tanarnan transgenik dikelompokkan atas promotor, terminator, penanda seleksi

dan fragment gen fungsional itu sendiri. Spkuen-sekuen yang digunakan dalain

percobaan in ditampilkan pada tabel berikut ini :

Tabel 2. ~ e k l e n d m ciri dari primer-primer CaMV 3 5 s d m nptII

Fragmen DNA " Sekuen (5-3) Ukuran produk (bp) Tm

('c)

Asal sekueri Kode akses Acuan Promotor CaMV 35s (35s-B) gctcctacaaatgcca tca 195 60 Promotor CaMV

35 S (3 5s-A)

gccatcattgcgataaag gaaaggc -

212

62 ,

Cauliflower mosaic virus

PROTEC'I'ION OF PLANT FROM VIRUS

INFECTION Patent: JP 1987201 527-A 3 05-SEP- 1987 ;

MONSANTO C0,WASI IINGTO N UNIV E01311 (GenBank) --

Gen Marker Gen Marker nptII (NPT) n tI1 (TN 5)

atgactgggcacaa gcatc:tcctgtcatlir cagacaatcgg 289 70.25 Cloning vector pBI101.2. GUS gene fusion vector pBI 10 1.2 T-DNA region

-- 5 9

--- -

--

-- European

Commision GMOs in Food and Environment (2002), Hemmer, (1 997)

- -

European Commision GMOs in Food and En~~ironment (2002), Hemmer, (1 997)

Pendeteksian sekuen DNA transgenik yang terdapat pada kapas Bollgard

NuCOTN 35 B yang ditanam di Sulawesi Selatan dimulai dengan mengakses situs

publik dari United States Food and Drug Administration (USFDA.)

(http://vni.cfsan.ft'a.~~ov/-lrd/biocon.html/), pada situs tersehut ditemukan bahwa

tanaman kapas jenis Bollgard terdaftar dengan nomor registrasi BNF No. 13,

Submitted November, 21, 1994 oleh perusahaan Monsanto, Co.

Tabel 3. Kapas Bollgard dan karakteristiknya berdasarkan USFDA

1

Daftar Lengkap Berdasarkan Nomor Pencatatan

1

(Environmental Protection Agency).

(BNF / Biotechnology NotiJication File No.)

Nomor paten dari kapas Bollgard dapat diperoleh dari dari situs publik;

dari badan paten Anlerika Serikat (United States Patent and Trademark Ofice

pada ( & : / / w w w . u s ~ ~ t o . ~ v / s a f t ~ , pada situs ini didapatkan bahwa namor paten

dari kapas jenis Bollgard adalah 5.322.938 dan juga diperoleh sekuen dari gen

cry1 Ac.

Jenis Gen, Gel1 Tujuan Produk,

atau Fraemen Gen

makart'an ternak dan manusia

-

~ a ~ a s - Protein Bacillus Ketahanan 531

FDI:

BNF No. 13, disampaikan 21 November 1994 oleh Monsanro, penggunaan untuk Sumber Gen Jenis

Cry 1 Ac

Surat Persetujuan

--

[image:123.551.73.491.203.755.2]

Informasi ~nengenai kapas Bollgard juga diperoleh dari laporan BLAS'T

(Biosicherheitsfor.schur2g und Abschatzung son Technologen des Scwerpunkt

Programmes Biotechnologie), Hemmer (1 997) melalui situs www.bats.ch, sepenti *

yang tercantum pada tabel berikut ini.

Tabel 4.' Kapas Bollgard dan karakteristiknya berdasarkan RLAST

L = lepidoptera

Untuk pelacakm sekuen dari promotor CaMV 35Sdan gen penanda

(nptII) yang terdapat pada tanaman kapas jenis Bollgard, sekuennya dapat diakses Keterangan : IR = Insectisidal resistance

Gen Introduksi

l)altered, sy~thetic 1Ac delta- cty

endotoxin

2) nptIl

3) aad

Produk

Kapas

melalui website dari GenBank-NCBI (Nutional Center for Biotechnol~gy Tujuan

I R ( L ) Produsen

BollgardB Monsanto

Information). Ditemukan sekitar 7 (tujuh) buah sekuen, ha1 ini disebabkan karena Prornotor

1)e-P-35s

2 ) P-35s

3) bacterial Sumber 1)Btssp. (HD-73)) kurstaki 2) Tn5

3) Tn7

sekuen (promotor 35s dan nptII) telah digunakan secara urnum pada tsnamari Terminator Tanggal

Pellgesahan

1 ) 7 S 3 '

r.

USDA: 3/95

EPA:

FDA:

-7

51/95 11 0194

2) nos 3'

3)bacterial

transgenik, ha1 yang sama diungkapkan oleh Tao et al., (2001).

Dari tujuh buah sekuen yang diperoleh, sekuen promotor CaM'V

35 Sdiperoleh dari c~~ulijlower mosaic virus, strain CM4- 184, clone pOS- 1 clone

dengan nomor akses GenBank: E0 13 1 1, pemilihan ini didasarkan atas perusahaar~

yang menghasilknn tanaman kapas jenis Bollgard tersebut. Sekuon dari nptIl

dipilih karena dari beberapa sekuen untuk gen nptII yang diperoleh dari GenBanl,,

kesemuanya menunjukkan urutan sekuen DNA yang sama, wi~lau terletak pada

vektor kloning yang berbeda dan juga ditunjukkar~ oleh asal dari gen nptIl itu

sendiri yang berasal dari gen tn 5.

Untuk mendisain primer, digunakan software Primer3 dari Whitehead

Institute for Biomedical Research (Nielsen, 2002, komunikasi pribadi) pada siti1.s

http:/lwww-genonle.\vi.mit.edul~enome software/otherl~ri111er3. htn.11. Terdapsit

-

beberapa persyaratan yang hams diikutsertakan dalam pembuatan primer ini,

antara lain adalah : 1 ) ukuran produk yang akan diharapkan: 100- 300 bp, 2) C(3

clamp adalah: 2 bp, 3) ukuran maksimum, minimum dan optimum dari primer

adalah: 25 I 18 120 bp, 4) suhu melting ( ~ m ' C) adalah: 60

-

70, 5) persentase

kandungan baca G dan C : 55 %

,

6) batasan dari konsentrasi gafim terhadalp

primer adalah: 50 %. Hasil pembuatan primer terhadap sekuen dapat dilihat pad,a

tabel berikut ini.

Tabel 5. Karakteristi k sekuen DNA transgenik dan komplemensitas dengan primer

A. Sekuen not-II.

I

Organisme

I

CJonine vector oBIl 01.2

I

Locus

Sumber

I

phosphotransferase; beta-glucuronidase

-

J

PBIlOl2T 5351 bp DNA linear, 1 6 - ~ ~ ~ - 1 9 9 7

--

Karakteristik : Location / Qualifiers

Surnber : 1 ..5351 lorganism="Cloning vector pBI101.2" /plasmid="pBI101.2"

/db_xref="taxon:36567"

/note="sequence from the right border to the left border"

1 ..2498 /note="pBinl9 sequence, containing a neomycin phosphotransferase gene driven by nos promoter" 1 ..25 /note="the right border repeat"

386.. 1 180 /codon-start=l /trans1

-

table=u

/product="neomycin phosphotransferase" 2498..2538 /note="polylinker"

255 3. .436 1 /note="modified beta-glucuronidase gene coding region fiom pRAJ260"

/codon-start= 1 /trans1 table=u

/produ~t="beta-glucuronidase"

I 4432..4684 /note="3'UTR of the nopaline synthase gene" 4688..5351 /note="pBinl9sequence"

5327..5351 /note="the left border repeat"

atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc~t~~~

~~cacaaca~acacxtc~~ctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcc

cggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggc,zgcgcggcta

tcgtggctggccac~:acgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaaggg

actggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcct~tcatctcaccttgctcct~cc~agu~~

a~atccatcat~ctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgacc

accaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtc~atcae~a~

a

tctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgc:at@;

-

cccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatg

gccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttg

gctacccgtgatattgctgaagrgcttggcggcgaatgggnnnnctgaccgcttcctcgtgc~ac@,

Keterangan :

Cetak tebal : komplemen primer dengan sekuen dari primer TN 5 , 173 bp Cetak miring : komplemen primer dengan sekuen dari primer NP'I', 289 bp

332 bp DNA linear PAT 29-SEP- 1997 Sumber clruliflower mosaic virus.

Nomor Akses

I

E0 1 3 1 1 ---A- --

-3

Karakteristik : Loccition/Qualij?ers

Sumber : 1 ..332 /organism="Cauliflower mosaic virus"

/db

-

xref="taxon: 1064 1 " _--

1

Versi Keterangan Kata Kunci .

Keterangan :

Cetak tebal : kompleinen primer dengan sekuen dari primer 35s-By ukuran produk 195 pasang basa

Cetak miring : komplemen primer dengan sekuen dari primer 35s-A, ukuran produk 2 12 pasang basa

E01311.1 GI:2169570

~ruliflower mosaic virus promoter (Promotor ---- C ~ % V 35s ).

JP 198720 1527-A/3.

---

, Ekstralcsi