Potensi Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Tempoyak Sebagai Probiotik

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(92)

(93)

(94)

(95)

(96)

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI

DARI TEMPOYAK SEBAGAI PROBIOTIK

OLEH:

CHANDRA UTAMI WIRAWATI

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(97)

ABSTRAK

CHANDRA UTAMI WIRAWATI. Potensi Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi Dari Tempoyak Sebagai Probiotik. Dibimbing oleh BETTY SRI LAKSMI JENIE dan LILIS W D A .

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui mikroflora tempoyak yang berasal dari berbagi daerah dengan umur yang berbeda-beda, serta menguji lebih lanjut sifat- sifat bakteri hasil isolasi untuk dikembangkan sebagai probiotik.

Dari 5 lokasi sampel yang digunakan, bakteri asam laktat berhasil diisolasi dari

3 sa~npel tempoyak yang berasal dari Bandar Lampung, Kalianda, dan Kotabumi dengan umur tempoyak kurang dari 1 bulan (1, 2, 3 minggu). Selanjutnya diperoleh 42 isolat bakteri asam laktat berbentuk batang pendek yang te~masuk dalanl genus Lactobacillus. Setelalt seleksi awal berdasarkan ketahanan terhadap asam lanlbung, asam empedu, dan sifat antimikroba terpilih 9 isolat untuk diidentifikasi lebih 1anj11t dan diuji sifat-sifat probiotiknya. Sembilan isolat teridentifikasi sebagai Lactobacillt~s corynefornnis (1 isolat) , Lactobacillus plarztaru~t~ (5 isolat), dan Lactobacillus casei (3 isolat) dengan tingkat kekerabataan yang berbeda-beda.

Lima dari 9 isolat yang diuji yaitu L. coryneforn~is To 8, L. pla~ztaru~?z To 9, L. plantartun To 23, L. casei To 25 dan L. casei To 26 yang manlpu berkoagregasi

(98)

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul:

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DAM

TEMPOYAK SEBAGAI PROBIOTIK

adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

Bogor, Juni 2002

(99)

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI

TEMPOYAK SEBAGAI PROBIOTIK

CHANDRA UTAMI WIRAWATI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Pangan

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(100)

Judul Tesis : Potensi Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Tempoyak Sebagai Probiotik

Nama Mahasiswa : Chandra Utarni Wirawati Nomor Pokok : 98146

Program Studi : Ilmu Pangan

Menyetujui,

1. Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS. Dr. Ir. Lilis Nuraida, MSc.

Ketua Anggota

Mengetahui,

2. Ketua Program Studi Ilmu Pangan

(101)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 12 Mei 1972 di Talang Padang Lampung, sebagai anak pertama dari empat bersaudara dengan orang tua M. Syarief Hidayat dan Heruwati. Pada tahun 1999 penulis menikah dengan Sofyan Syaiful dan dikaruniai seorang putra bernama M. Iqbal Alfarabi.

(102)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis persembahkan ke hadirat Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan, Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar- besarnya kepada:

- _{Ibu Prof.}_{Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS. dan Ibu Dr. Ir. Lilis Nuraida,} MSc.sebagai komisi pembimbing yang telah memberi pengarahan dan bimbingan sejak awal penelitian hingga akhir penulisan tesis ini.

- Pihak BPPS atas beasiswa yang telah diberikan selama penulis menjadi mahasiswa Program Pascasarjana IPB.

- Kedua orang tua atas doa yang tiada pernah putusnya, mertua, suami dan anak tercinta, serta adik-adik tersayang.

- Seluruh teknisi Lab PAU IPB yang telah membantu selama penelitian berlangsung.

- Teman-temanku Ibu Mutia, Ibu Rini, Ibu Asmarina, Mbak Ari, Neti, Ardi, Fatim, Yusuf dan rekan-rekan IPN 1998 atas kebersamaan dan bantuan tanpa pamrihnya.

- Semua pihak yang telah membantu dalam pembuatan tesis ini.

Penulis meyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan kritik untuk perbaikan tesis ini sangat diharapkan untuk inasa yaug alcau datang. Akhirnya penulis berharap semoga tesis ini bermanfaat

Bogor, Mei 2002

(103)

DAFTAR IS1

...

DAFTAR TABEL

DAFTAR GAMBAR

...

DAFTAR LAMPIRAN

...

PENDAHULUAN

Latar Belakang

...

Identifikasi Masalah

. .

...

Tujuan Penelltian

. .

...

Manfaat Penelitian

Hipotesis

...

TMJAUAN PUSTAKA

...

Sifat Fisik dan Kimia Tempoyak

...

Bakteri Asam Laktat

Bakteri Asam Laktat Sebagai probiotik

Keuntungan Mengkonsumsi Bakteri Asam Laktat Sebagai

Probiotik

...

METODOLOGI

Waktu dan Tempat Penelitian

...

Alat dan Bahan

. .

...

Metode Penelltian

...

HASIL DAN PEMBAHASAN

Profil Bakteri Asam Laktat dari Tempoyak

...

Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Asam Empedu

...

Sifat Antimikroba Bakteri Asam Laktat Tempoyak

...

Seleksi Bakteri Asam Laktat Tempoyak Unggul

...

Identifikasi Bakteri Asam Laktat Tempoyak

...

Uji Koagregasi Bakteri Asam Laktat Tempoyak

Sifat Hidrofobisitas Bakteri Asarn Laktat Tempoyak

...

Uji Penempelan Pada Lempeng Stainless Steel

...

Identifikasi Senyawa Antimikroba

...

KESIMPULAN DAN SARAN

(104)

DAFTAR TABEL

1 Komposisi kimia tempoyak dan durian segar dalam 100 gram

2 Tipe produk probiotik, mikroba yang terkandung, dan senyawa antimikroba yang dihasilkan

...

3 Profil bakteri asam laktat dari berbagai daerah dan umur yang berbeda

. . .

.

. . .

.

. . .

4 Ketahanan terhadap asam lambung dan asam empedu

. . . ...

5 Kriteria seleksi bakteri asam laktat tempoyak

. . . ..

6 Hasil identifikasi bakteri asam laktat tempoyak .

.

. . .

7 Persentase koagregasi bakteri asam laktat tempoyak

. . .

.

. . . .

8 Hasil uji penempelan bakteri asam laktat pada lempeng stainless

steel

. . .

.

. .

. . .

. . . .

.

. .

.

. . .

. .

.

. . .

(105)

DAFTAR GAMBAR

1 Mekanisme pencegahan kanker oleh mikroba probiotik

2 Diagram alir seleksi bakteri asam laktat dari tempoyak sebagai mikroba probiotik

...

3 Sifat antimikroba bakteri asam laktat tempoyak Bandar Lampung (a) umur 1 minggu (b) umur 2 minggu

. . .

4 Sifat antimikroba bakteri asam laktat tempoyak Kotabumi

umur 1 minggu

...

.

...

5 Sifat antimikroba bakteri asam laktat tempoyak Kotabumi

umur 2 minggu

. . .

.

. .

.

..

.

. .

.

..

.

. . .

. . . .. . .

6 Sifat antimikroba bakteri asam laktat tempoyak Kalianda

umur 3 minggu

. . .

.

. . . .

.

. . .

. . . .

.

. . .

, 7 Sifat hidrofobisitas bakteri asam laktat tempoyak

.

. . .

8 Total asam yang diproduksi oleh bakteri asam laktat

tempoyak

.

. . .

(106)

DAFTAR LAMPIRAN

1 Pengujian sifat fisiologis dan reaksi biokimia untuk bakteri asam laktat

...

... ... ... .

...

2 Sifat antimikroba bakteri asam laktat tempoyak

. . .

3 Hasil identifikasi bakteri asam laktat tempoyak

.

. . .

4 Hasil uji sifat hidrofobisitas bakteri asam laktat tempoyak

. . .

5 Hasil uji penempelan bakteri asam laktat tempoyak pada

lempeng stainles steel

. . . .. . .

.

. . .

. . . .

.

. .. .

. . .

.

. . .

6 Total asam yang diproduksi bakteri asam laktat tempoyak

selama 4 hari

. . .

.

. .

. . .

. . . ... . . .. . .

..

. . .

. . . ....

(107)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Bakteri asam laktat telah lama dikenal dan digunakan ole11 manusia dalam proses pengalahan pangan, yaitu sejak digunakamya fermentasi sebagai salah satu cara menlperoleh produk akhir yang secara organoleptik dan kualitas lebih diterima daripada bahan bakunya. Bakteri ini memberikan kontribusi yang cukup besar terhadap perbaikan flavour, tekstur, dan masa simpan produk fermentasi. Selain itu, ditinjau dari segi nilai gizi, fermentasi menghasilkan komponen-komponen nutrisi yang lebih mudah dicerna melalui perombakan serta diproduksinya senyawa-senyawa yang menguntungkan oleh mikroorganisme yang terlibat didalamnya.

Aspek lain yang akhir-akhir ini mulai dikeillbangkan adalah penggunaan bakteri asam laktat sebagai mikroba yang mampu membantu meningkatkan kesel~atan dan membantu dalam proses penyembuhan penyakit. Menurut Elmer et al. (1996) yang dikutip ole11 Drouault et al. (1999) bakteri asam laktat termasuk mikroba yang amau dan beberapa galur digunakan sebagai terapi dalam proses penyembuhan penyakit yang menyerang manusia seperti diare, konstipasi, infeksi saluran kemih, mencegah kanker, rematik arthritis, serta menurunkan kolesterol dalam darah (Reid 1999).

(108)

berlangsung (Rahayu et al. 1999). Selain asam laktat dan asam asetat, diproduksi juga senyawa penghambat lain yang ju~nlahnya lebih kecil

,

seperti asam format, asam lernak bebas, amonia, etanol, hidrogen peroksida, diasetil, asetoin, 2,3- butanadiol, asetaldehida, enzim bakteriolitik, bakteriosin, dan antibiotik, serta beberapa senyawa penghambat lain yang belum dapat diidentifikasi (Klaenhaml~mer

1988; Daeschel 1989; Lindgren dan Dobrogosz 1990; Schillinger 1990; Piard dan Desmazeaud 1991; Vandenberg 1993)

Bakteri asam laktat yang telah berhasil diisolasi dari berbagai ~nalcanan tradisional berbasis umbi-umnbian, buah, dan ikan seperti gatot, growol, tape singkong, tempoyak, bekasam, peda, wadi, dan terasi umumnya didominasi ole11 Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophillus, dan Pediococcus acidilactici. Dari hasil shining diperoleh bahwa L. plantaru~n TGR-2 yang diisolasi dari growol memiliki kemampuan memproduksi antimikroba yang dapat menghanlbat berbagai bakteri patogen yang diujikan. Demikian juga dengan isolat-isolat lain yang diperoleh dari fermentasi ikan (Rahayu et al. 1999).

(109)

ko~llponen gula dari buah, asam laktat yang terbentuk selama fermentasi, garam yang digunakan sebagai pengontrol proses ditambah dengan senyawa-se~lyawa aromatik dan senyawa berantai pendek yang terbentuk lainnya.

Selain menghasilkan flavour yang khas dan zat gizi siap cerna, fermentasi tempoyak oleh bakteri asam laktat merupakan salah satu cara peilgawetan alami tanpa penambahan bahan pengawet kimia. Masa simpan tempoyak sangat bervariasi antara 2 bulan sampai 1 tahun. Lamanya masa simpan ini akibat ditekannya pertumbuhan mikroba patogen dan pembusuk oleh asam yang diproduksi oleh bakteri asam laktat selama proses fermentasi dan garam yang ditambahkan pada awal proses sebesar 5-19%.

(110)

Perancis (L. casei DN 114) dan OMX dari Malaysia (campuran Lactobacillus, Bifidobacten'a, Streptococcus, dan Eilterococcus).

Penelitian terakhir yang dilakukan oleh Green et al. (1999) menunjukkan bahwa probiotik tidak hanya didominasi oleh galur-galur dari Lactobacillus dan BzJidobacteria tetapi juga mulai dikembangkan penggunaan genus Bacillus sebagai bacteriotherapy dan bacterioprophyluxis untuk pasien-pasien yang mengalami gangguan pencemaan setelah pengobatan dengan antibiotik untuk jangka waktu yang lama.

Identifikasi Masalah

Keamanan pangan di Indonesia sampai saat ini masih merupakan masalah serius dan perlu mendapat perhatian lebih dari pemerintah dan para pakar di bidang pangan. Masalah lain yang tak kalah pentingnya adalah gangguan kesehatan yang ditimbulkan oleh bakteri patogen yang mencemari makanan seperti Salii~onella typhiiiltruiuwz dan Escherichia coli penyebab sakit tifus dan diare. Tercatat selama periode 1997-2000, 63 kasus penyakit yang ditimbulkan oleh makanan yang tercemar dengan jumlah total 7067 kasus dan 15 diantaranya menyebabkan kematian. Kasus- kasus ini tersebar melalui jasa katering 22 kasus (33,8%), makanan rumah tangga 19 kasus (29,2%), makanan jajanan 12 kasus (4,66%), dan 9 kasus (13,9%) yang tidak diketahui penyebabnya (Kandun 2000).

(111)

yang tingkat kekebalan tubuhnya rendah. Selain kedua bakteri tersebut masih banyak bakteri patogen penyebab sakit dan keracunan pada manusia seperti Bacillus cereus,

Clostridiuin perfringens, dan Cainpylobacter. Makanan yang disimpan dinginpun temyata tidak selalu aman dengan ditemukannya Listeria inonocytogenes yyag tumbuh baik pada suhu dingin dan menimbulkan keracunan makanan (ICMSF 1996).

Salah satu cara penanggulangan dan pencegahan penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri patogen adalah terapi probiotik yang berfungsi menyeimbangkan mikroflora saluran pencernaan manusia. Pessi et al. (1999) mendefinisikan probiotik sebagai ballan pangan yang mengandung mikroba dalam keadaan hidup dan memberikan efek menyehatkan pada manusia yang mengkonsumsinya. Hal ini dibuktikan dengan penelitian yang dilakukan oleh Ilya Metchnikoff yang dikutip ole11 Adam dan Moss (1997) yang menunjukkan bahwa kondisi yang tidak seimbang pada usus besar manusia akibat pertumbuhan bakteri pembusuk yang menghasilkan toksin dan dapat mengganggu kesehatan, dapat diatasi ole11 konsumsi makanan asam terutama yogurt dalam jumlah yang cukup sehingga pertumbuhan bakteri kolifonn di dalam perut dan usus menjadi terhambat.

(112)

meilgalldung bakteri asam laktat ini tidak hanya terbatas pada produk-produk fermentasi susu tetapi juga mulai dikembangkan dalam bentuk kapsul atau tablet dengan kandungan utamanya kultur mumi atau campuran bakteri asam laktat.

Bakteri asam laktat diketahui mampu menstimulir sistem imunitas dau beberapa penelitian menunjukkan kemampuan bakteri ini untuk mengaktifkan makrofag dan limfosit, meningkatkan tingkat imunoglobulin A (IgA) dan produksi gama interferon. Pengaruh dari komponen-komponen ini mampu ineningkatkan resistensi terhadap mikroba patogen (Adam dan Moss 1997).

Makanan fermentasi tradisional Indonesia telah diteliti memiliki potensi sebagai probiotik, misalnya dadih dari Sumatra Barat yang dibuat dengan cara memfermentasi susu kerbau dalam tabung bambu. Beberapa galur yang diisolasi dari dadih diketahui memenuhi syarat sebagai probiotik antara lain Lactococcus lactis ssp lactis R-22, Leuconostoc paranzesenteroides R-51, Leuconostoc paratnesenteroides R-26 dan Lactobacillus casei ssp casei R-52 (Surono 1999).

(113)

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk (1) mengisolasi bakteri asam laktat tempoyak dari berbagai daerah dan umur yang berbeda (2) menguji sifat-sifat balcteri asam laktat basil isolasi untuk dikembangkan sebagai probiotik.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan mampu menghasilkan galur-galur bakteri asarn laktat yang diisolasi dari tempoyak yang berpotensi dan memiliki sifat-sifat sebagai inikroba probiotik. Informasi yang diperoleh, diharapkan mampu mendukung upaya pengembangan dan pemasyarakatan konsumsi makanan tradisional Indonesia, dala~n ha1 ini tempoyak sebagai makanan yang menyehatkan melalui perhaikan proses khususnya dengan memanfaatkan kultur bakteri asam laktat yang diketallui bersifat probiotik.

Hipotesis

(114)

TINJAUAN PUSTAKA

Sifat Pisik dan Kimia Tempoyak

Teinpoyak adalah jenis makanan tradisional yang diperoleh dengan cara n~emfermentasi daging buah durian, sehingga dihasilkan produk seperti pasta benvama putih kekuningan dan memiliki aroma yang khas dan tajanl. Oleh karena aroma yang tajam, maka konsumsi tempoyak hanya terbatas pada penduduk Melayu yang telah terbiasa dengan aroma dan rasanya (Merican 1977).

Berbeda dengan durian segar, tempoyak biasanya dikonsumsi sebagai makanan pembangkit selera (appetizer), ingridien makanan utama, maupun sebagai bulnbu masakan (co~~diment) bersama rempah-rempah lainnya. Tempoyak memiliki cita rasa gurih dengan aroma yang kuat. Cita rasa ini terbentuk karena keseimbangan antara komponen gula dari buah, asam laktat yang terbentuk selama fermentasi, garam yang ditambahkan sebagai faktor pengkondisi n~ikroba saat fermentasi, ditunjang dengan senyawa-senyawa organik rantai pendek lainnya ymg terbeiltuk seperti asetaldehida, asetoin, diasetil, dan butandienol. Gula dan alkohol dala~n durian mengalami penurunan pada saat fermentasi sehingga rasa manisnya menurun. Selanjutnya metabolisme asam-asam organik juga ikut memberikan flavour spesifik pada tempoyak.

(115)

fern~entasi juga berperan dalam penyediaan zat gizi siap cema. Sebagailnana yang dikemukakan oleh Adam dan Moss (1997), bahwa fermentasi asam laktat pada prinsipnya dapat meningkatkan kandungan asan amino esensial. Sifat awet yang ditunjukkan oleh tempoyak juga sangat baik untuk kesehatan, karena pengaweta~l yang terjadi tidak menggunakan bahan kimia yang akhir-akhir ini dihindari oleh konsumen karena dikhawatirkan dapat menimbulkan efek karsinogenik. Berikut ini perbandingan kandungan kimia tempoyak dan durian segar.

Tabel 1. Komposisi Kirnia Tempoyak dan Durian Segar dalaln 100 grain Ballan

Komposisi Durian Segaf

("/.I Tempoyak" Air Kalori Protein Lemak Karbohidrat Serat Kalsium Fosfor Besi Vitamin C

Vitamin A

NaCl

Bakteri Asam Laktat

59,9 147,Ol 2 8 1 2 36,l 1 3 0,181

0 5 6

0,11 0,44

Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai kelompok bakteri gram positif,

T o o d and Nutrition Center (1969) satuan dalam %

Hanum et al., (1997) satuan dalam %

(116)

illenggunakan karbohidrat sebagai sumber energi, serta produksi asam laktat sebagai produk tunggal atau produk utama merupakan faktor penciri metabolismenya (Salminen dan Deighton 1992).

Berdasarkan kemampuannya dalarn metabolisme glukosa dan produk akhir yang dihasilkan, bakteri asam laktat dibagi menjadi dua kelompok yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Bakteri asam laktat homofermentatif merupakan bakteri asam laktat yang memproduksi asan1 laktat sebagai produk utamafsatu-satunya produk hasil fermentasi glukosa, sedangkan bakteri asam laktat heterofermentatif yaitu bakteri asam laktat yang memproduksi laktat, CO,, dan etanol dari metabolisme heksosa (Kluyver dikutip oleh Jay 1997). Glukosa yang diubah menjadi asam laktat oleh golongan homofermentatif mencapai 95% dan ATP yang dihasilkan juga lebih hanyak. Hal inilah yang menyebabkan golongan homofennentatif mampu menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang lebih besar dibandingkan heterofermentatif (Jay 1996).

Berdasarkan filogeninya bakteri asam laktat dikelornpokkan dalam genus dengan % mol G

+

C di bawah 55%, kecuali golongan Bifidohakteria yang memiliki

% mol G

+

C di atas 55%. Genus-genus yang termasuk bakteri asam laktat berdasarkan klasifikasi ini adalah Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Vagococcus, Aerococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Leuco~zostoc,

Labtobacillus, dan Carnobacteriurn (Salminen dan Von Wright 1993).

(117)

tingkat konsistensi yang tinggi. Selain menghasilkan produk akhir yang koilsisten bakteri asam laktat temyata memiliki efek mengawetkan pada produk fermentasi yang diinginkan. Untuk keperluan yang terakhir ini dibutuhkan produksi massa sel yang tinggi, tahan selama proses pembekuan dan pengeringan, serta stabil selanla penyinlpanan. Disamping itu kultur hams mampu tumbuh pesat, tidak rentan terhadap phage, toleran terhadap garam, dan stabil secara genetika (Jenie et al. 1996b). Bakteri asam laktat homofermentatif sering digunakan dalam pengawetan makanan karena produksi asam laktat dalam jumlah besar dan mampu menghambat bakteri penyebab kebusukan makanan dan bakteri patogen lainnya (Fardiaz 1989). Sedangkan golongan heterofermentatif lebih ditujukan kepada pembentukan flavour dan komponen aroma, seperti asetaldehida, dan diasetil.

Selain peranan-peranan yang telah disebutkan di atas yang tidak kalah pentingnya dari bakteri asam laktat adalah kemampuannya memproduksi dan mengeluarkan senyawa-senyawa penghambat selain asam laktat dan asetat. Senyawa- senyawa ini bersifat antagonistik terhadap milaoba sekerabat maupun terhadap golongan di luar genusnya, sehingga mernberikan kontribusi yang nyata terhadap pengawetan (Jenie 1996a).

(118)

Perkembangan penggunaan biopreservatif sebagai antimikroba pada pengawetan nlakanan secara biologis sangat pesat, karena tidak menimbulkan efek samping terhadap kesehatan manusia (Rozbeh et al. 1993). Senyawa-senyawa antimikroba yang diproduksi olah bakteri asam laktat jumlahnya jauh lebih kecil daripada asam laktat dan asetat, seperti asam format, asam lemak bebas, amonia, etanol, hidrogen peroksida, diasetil, asetoin, 2,3-butanadiol, asetaldehida, enzim bakteriolitik, bakteriosin dan antibiotik, serta beberapa senyawa penghambat lain yang belunl diidentifikasi (Klaenhammer 1988; Daeschel 1989; Lindgren dan Dobrogosz 1990; Schillinger 1990; Piard dan Desmazeaud 1991; Vandenberg 1993).

Keunggulan bakteri asam laktat dalam memproduksi bakteriosin telah nlenlbuka peluang tersendiri dalam aplikasinya di bidang pangan sebagai peslgawet. Penggunaan bakteriosin sebagai pengawet makanan lnerupakan pendekatan yang efektif untuk mengendalikan kerusakan dan keracunan makanan ole11 bakteri seperti Bacillus cereus, Clostridiunt botulinunz, C. perfringens, Listeria mo~zocytogeizes,

Staphilococcus aureus dan lain-lain. Penggunaan bakteriosin untuk menghambat mikroba patogen khususnya adalah untuk memislimalkan proses pada produk-produk lnakanan olahan berasam rendah.

Bakteri Asam Laktat Sebagai Probiotik

(119)

tambahan yang mengandung mikroba hidup yang memberikan keuntungan pada temak yang mengkonsumsinya dengan cara meningkatkan keseimbangan mikroorganisme pada tubuh (Fuller 1989 dikutip oleh Phillip 1997).

Memang pada mulanya probiotik dikemhangkan sebagai tambahan pada pakan ternak untuk meningkatkan produktivitas dan kesehatan ternak. Fuller (1989) mendefinisikan probiotik sebagai mikroba hidup yang disuplementasikan ke dalam pakan dan memberikan efek menguntungkan dengan cara meningkatkan keseinlbangan mikroflora usus pada ternak. Genus-genus bakteri asam laktat yang digunakan untuk tujuan ini antara lain LactobaciNus dan Enterococcus. Definisi ini kemudian diperluas ole11 Havenaar dan Huis in't Veld (1992) yang dikutip oleh Rolfe (2000) sebagai kultur murni atau campuran dari mikroba hidup yang menguntunglcan bagi nlanusia atau hewan dengan cara meningkatkan mikroba indigenus. Terakhir, definisi probiotik dinyatalcan sebagai mikroba hidup yang ditelan dalam jumlah tertentu dan menguntungkan untuk kesehatan selain asupau zat-zat gizi dari makanan. Pada perkembangan selanjutnya ha1 ini dicoba diterapkan untuk inanusia dengan cara mengkonsumsi gafur-galur bakteri asam laktat yang dipercaya dapat meuingkatkan kesehatan melalui produk susu fermentasi atau dalam bentuk kapsul yang mengandung sel hidup bakteri asam laktat (Ray 1996).

(120)

jumlah, dan aktivitas metaboliknya. Secara ala~ni bakteri asam laktat dari gellus Bifidobacteria, Lactobacillus acidophillus, dan Lactobacillus reuteri merupakan mikroba alami saluran pencernaan ~nanusia selain beberapa spesies yang bukan berasal dari saluran pencernaan seperti Lactococcus lactis dan Lactobacillus bulgaricus.

Bakteri asam laktat yang bukan berasal dari saluran pencemaan ini banyak digunakan secara luas pada produk fermentasi susu, sehingga mampu memberikan keuntungan terhadap manusia yang mengkonsumsinya, walaupun tidak sebesar bakteri asam laktat yang berasal dari saluran pencemaan. Bakteri asam laktat ini lebih sensitif terhadap pH lambung, garam empedu, lisozim, dan senyawa antimikroba, sehingga hanya sedikit yang mampu mencapai lambung dan usus. Alcan tetapi keuntungan akan tetap diperoleh karena mikroba ini memproduksi metabolit- metabolit yang ~nenguntungkan seperti P-galaktosidase, asam lipoteilcoat, dan dinding sel bakteri (Ray, 1996). Dua senyawa yang terakhir ini penting untuk menempel pada sel-sel epitel usus (Tamime et al. 1995).

(121)

kon~petisi dalam penempelan pada sel epitel usus. Pada Tabel 2 disajikan beberapa

tipe produk probiotik, bakteri yang terkandung di dalamnya, serta metabolit-metabolit

yang dihasilkan.

Tabel 2.Tipe produk probiotik, mikroba yang terkandung dan senyawa antimikroba yang dihasilkan

Probiotik

I

Genus yang Digunakan

I

Metabolit dalam Produk

I

Produk susu fermentasi (yogurt, buttermilk, susu acidophillus, dll)

(susu pasteurisasi, minuman)

Lb.bulgaricus

S. _{therrtzophillus}

LC. Iactis Le. ~nesenteroides Lb. acidophillus Lb. casei Bifidobacteria spp Lb. reuteri Lb. acidophilhcs Bifidobacteria spp Lb. reuteri Lb. bulpariczcs

Laktat, asetat, diasetil, HCO3, hidrogen peroksida, bakteriosin, reuterin

galaktosidase pada tipe indigenus dan produksi metabolit.

-

I

Str. tlzernzophillus

Produk-produk farrnasi

I

Lb. acidopl~illus

I

Menyediakan

P

-

(tablet, kapsul, butiran) Lb. bulgaricus galaktosidase pada tipe

Bifidobacteria spp. indigenus dan

1

I

1

n~emproduksi metaholit

I

galaktosidase Sumber: Ray 1996

Produk makanan kesehatan (cairan, kapsul, bubuk)

Beberapa syarat yang hams dipenuhi oleh bakteri a s a n laktat sebagai

mikroba probiotik antara lain (Salminen et al. 1993; Reid 1999):

Lb. acidophillzcs Bifidobacteria spp

Beherapa jenis Lactobacillus

(1) Stabil terhadap asam (terutama asam lambung, sehingga mampu bertahan dan Tidak ada, kecuali pada produk fermentasi cair. Mampu menyediakan

P-

hidup selama melalui lambung dan usus.

(122)

bagian atas usus kecil.

(3) Memproduksi senyawa antimikroba seperti asam, hidrogen peroksida, dan bakteriosin.

(4) Mampu menempel dan mengkolonisasi sel usus manusia. Hal ini akan meningkatkan kompetisi dengan mikroba patogen dan penyebab karsinogen. (5) Tumbuh baik dan berkembang dalam saluran pencemaan

(6) Aman digunakan oleh manusia.

(7) Tahan terhadap 'vaginal inicrobicides ' dan spermicides'. Sifat ini diperlukan untuk probiotik yang ditujukan untuk mengohati infeksi saluran urinovaginal. (8) Koagregasi membentuk lingkungan mikroflora yang normal dan seimbang

Mekanisme mikroba probiotik dalam meilingkatkan lcesehatan inasih merupakan penelitian yang sampai sekarang masih dilakukan, tetapi beberapa yang dapat dikemukakan disini (Sa111zine11 et al. 1993, Sanders 2000) adalah dengan

cara :

(1) Menekan bakteri dan virus yang berbahaya bagi manusia dengan jalan menstimulir sistem imunitas dan kemampuannya untuk mengubah aktifitas metabolisme mikroba dalam saluran pencernaan.

(2) Produksi senyawa antimikroba seperti asam laktat, peroksida, bakteriosin, dan senyawa penghambat lainnya sehingga menekan pertumbuhan mikroba patogen. (3) Mekanisine lain yang melibatkan kompetisi sisi penempelan pada sel epitel

(123)

penyerapan nutrien

.

(4) Efek antimutagenik dan antigenotoxic.

(5) Pengaruhnya terhadap efektivitas enzim dan sekresi enzim.

Keuntungan Mengkonsumsi Bakteri Asam Laktat Sebagai Probiotik

Dimensi ketiga dari persepsi makanan populer sebagai makanan kesehatan (henltli food) yang dicirikan oleh kandungan gizi yang tinggi dan makanan probiotik (Salji 1992 dikutip oleh Jenie 1997). Walaupun pada awalnya ditujukan untuk palcan temak istilah probiotik saat ini juga diterapkan pada konsumsi mikroba hidup oleh inanusia sebagai bahan tambahan pangan untuk kesehatan gizi dan kehidupan (Hull et nl. 1992 dikutip oleh Jenie 1996b).

Mengkonsumsi bakteri asam laktat baik melalui produk fellnentasi susu atau sebagai sel hidup diketahui memberikan keuntungan terhadap kesehatan manusia, tem~asuk keuntungan melawan penyakit pada saluran pencemaan misalnya diare, konstipasi, kanker usus, dan lain sebagainya. Beberapa keuntungan yang diperoleh dengan mengkonsumsi bakteri asam laktat antara lain:

(1) Melawan pertumhuhan mikroflora indigenus usus yang tidak menguntungkan (Klaenhammer 2000; Rolfe 2000).

(2) Mengontrol infeksi usns yang disebabkan oleh bakteri patogen enterik (Klaenhammer 2000; Rolfe 2000).

(3) Mengontrol infeksi saluran urinogenitnl (Ray 1996; Sanders 2000).

(124)

P-galaktosidase (Ray 1996; Sanders 2000; Klaenha~nmer 2000).

(5) Mengurangi kankerltumor usus besar dan organ-organ pencemaan lai~lnya (Ray 1996; Gallaher et al. 1999; Sanders 2000; Brady et al. 2000; Klaenhammer 2000)

.

(6) Mei~gurangi kadar kolesterol darah dan gangguan jantung (Ray 1996; Sanders 2000). .

(7) Menstimulir sistem imunitas dan pergerakan usus (Ray 1996; Erickson et al. 2000; Klaenhammer 2000).

(8) Menurunkan tekwan darah pada penderita hipertensi (Sanders 2000; Klaenhammer 2000).

<>cr~''->

(125)

probiotik dalam melindungi usus dari gangguan bakteri enterik adalah : (1) Produksi senyawa-senyawa penghambat seperti asam organik, hidrogen peroksida dan bakteriosin, (2) Memblokade sisi penempelan nlelalui kon~petisi pada perrnulcaau epitel usus, (3) Kompetisi perolehan nutrisi, (4) Degradasi reseptor toksin, dan (4) Menstimulir sistem imunitas.

Laktosa intoleran pada manusia diakibatkan ketidakmampuan tubuh manusia untuk inenlproduksi 0-galaktosidase oleh sel-sel epitel usus karena kerusakan genetik. Mengkonsumsi makanan yang menganduug bakteri asam laktat terutama dari golongan Lactobacillus acidophillus dan Lactobacillus reuteri inampu meningkatkan sistem P-galaktosidase, sehingga dapat digunakan sebagai sumber P-galaktosidase pada saat dikonsumsi. Selain itu susu fermentasi yang meugandung Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus tlzernzophilltrs juga mampu mengurangi laktosa intoleran walaupun tidak seefektif kedua mikroba sebelumnya. Hal ini telah dibuktikan melalui penelitian yang telah dilakukan oleh Lin et al. (1991) dan Vesa et al, (1996 ) dengan hasil secara umum kultur starter yogurt (Strepcocus therrnophilzls dan Lactobacillus delbruechii subsp. bulgaris ) dalam keadaan normal dengall densitas sel lebih besar dari lo8 / g sangat efektif meningkatkan daya cerna laktosa pada penderita laktosa intoleran. Pengaruh dari meugkomsumsi mikroba ini lebih ditentukan oleh jumlah sel daripada jenis galur.

(126)

telah dilakukan menunjukkan bahwa beberapa galur Lactobacillus acidophillus dapat menurunkan kadar kolesterol darah terkait dengan kemampuannya mendek~njuga~i glukokholat dan atau taurokholat menjadi asam empedu, yang kemudian dibuang melalui feses. Akibat kekurangan asam empedu ini, maka Lactobacillus ucidophillzrs akan memetabolisme kolesterol dalam darah menjadi asam empedu sehingga menurunkan konsentrasi kolesterol darah (Driessen dan Boer 1989). Hipotesis yang sama juga dikemukakan oleh Gilliland et al. 1985.

Mekanisme lain dikemukakan oleh De Smet et al. (1994) yang dikutip oleh Sanders (2000) bahwa mikroba probiotik dari golongan Lactobacillus dan B~fidobacten'a memiliki kemampuan untuk mendekonjugasi asam empedu secara enzimatik. Oleh karena kolesterol merupakan prekusor dari asam empedu, maka ha1 ini dapat menurunkan kadar kolesterol dalam serum darah karena moleltul-molekul kolesterol dikonversi menjadi asam empedu.

Keuntungan lain dari konsumsi bakteri asaln laktat adalah peningkatan sistem kekebalan tubuh dan mencegah kanker usus. Lactobcillza acidophillus dan Bzfidobacteriui?~ bifidunz memiliki efek menguntungkan dalam peningkatan fungsi kekebalan tubuh dengan mekanisme yang sampai saat ini tidak begitu jelas, tetapi diduga komponen khusus dinding sel atau lapisan sel menjadi prekusor dan meningkatkan respon sistem imunitas (Erickson dan Hubbard 2000).

(127)

n~enunjukkan kemampuannya menstimulir pagositosis dari makrofag sehingga inenekan terbentuknya tumor dan kanker usus (Driessen dan Boer 1989; Ray 1996). Enzim-enzim yang berperan mengubah komponen-komponen prokarsinogen menjadi komponen karsinogen seperti P-glukosidase, P-glukoronidase, nitroreduktase, dan azoreduktase terbukti ditekan jumlahnya dengan konsumsi susu fermentasi yang mengandung Bz~dobacterium longunz dan Lactobacillus acidoplzillzis (Driessen dan Boer 1989; Goldin dan Gorbach 1984). Mekanisme pencegahan kanker lebih jelas terlihat pada Gambar 1.

Bakteri pada usu fermentasi

1

f

Bakteri hidup

I

f

Komponen dinding sel

I

Meningkatkan keseimbangan mikroflora usus

+

f

meningkatkan detoksifikasi

f

penghambatan terbentuknya menekan pem-

f

sistem kekebalan senyawa beracun komponen karsinogen busukan di usus [image:127.595.96.514.333.556.2]

(128)

METODOLOGI

Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan Pusat Antar Universitas (PAU) Pangan dan Gizi, IPB, Laboratorium Mikrobiologi Pangan Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, dan laboratorium- laboratorium lain di lingkungan Fakultas Teknologi Pertanian, IPB.

Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan adalah tempoyak yang diperoleh dari 5 daerah yang berbeda di Lampung dan sekitarnya. Medium untuk isolalsi dan identifikasi serta uji biokimia laimlya terdiri dari medium MRS (de Man Rogosa Sharpe) Agar dan Broth,

NB (Nutrien Broth), MRS semi padat, PBS (Phosphat Buffer Saline), NaCl 0,85%, Gibson's semi padat, MRS Arginine Broth, Medium basal MR-VP, Litmus Milk, berbagai jenis karbohidrat, lamtan H,O, 3%, oksgal 0.3%, heksadekana, dan bahan kimia untuk analisis.

(129)

Metode Penelitian

1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Tempoyak (Nuraida 1988;

Fardiaz 1993)

Isolasi dilakukan dengan mensuspeusikan 10 g tempoyak segar dari 111asing ~nasing tempat ke dalam 90 mi lamtan NaCl 0,85% secara aseptis. Kemudiat~ dibuat pengenceran 10.' - lo-'. Pengenceran 1W6 - 10.' diambil 1 ml dan dilakukan

pemupukan secara duplo ke cawan petri steril, kemudian ditambahkan MRS Agar cair dan diratakan. Setelah itu diinkubasi selama 2 hari pada 37°C.

Koloni yang terpisah dengan bentuk dan ukuran yang berbeda dian~bil meuggunakan j a m ose stril dan digoreskan pada MRS Agar yang telah beku dan diinkubasi pada kondisi yang sama membentuk goresan kuadran. Penggoresan dilakukan sampai diperoleh koloni yang seragam

.

Koloni yang telah murni dipilih, lalu dilakukan pewamaan gram dan uji katalase.

Koloni Gram positif dan katalase negatif diinokulasikan ke dalarn MRS Broth dan diinkubasi pada 37°C selama 2 hari. Selanjutnya kultur dipindahkan ke dalam 1 tabung MRS Broth yang meugandung 0,2% agar dan CaCO, untuk digunakan sebagai kultur stok, sedangkan kultur kerja dibuat dalam agar miring yang disimpan dalam lemari es. Kultur stok diperbaharui setiap 3 bulan.

(130)

ketahanannya terhadap asam lambung dan asam empedu, serta sifat antimikroba sebagai shining awal.

Isolat hasil shining awal kemudian diidentifikasi sampai tingkat spesies berdasarkan dan sifat biokimia ( produksi amonia dari arginine, reaksi pada medium litmus milk, produksi diasetil dan asetoin, produksi produksi gas, kemampuan tumbuh pada suhu 15°C) serta kemampuannya memfermentasi berbagai jenis karbohidrat (arabinosa, fruktosa, galaktosa, glukosa, maltosa, manitol, melibiosa, rafinosa, ramnosa, sorbitol, suhosa, dan xilosa) Prosedur pengujian dapat dilihat pada Lampiran 1. Spesies hasil identifikasi kemudian diuji potensinya sebagai probiotik, meliputi: kemampuan berkoagregasi, sifat hidrofobisitas, uji peneillpelan pada 'lempeng stainless steel (SS), serta identifikasi senyawa antimikroba. Diagram alir

(131)

Tempoyak dari 5 produsen di Lampung dan sekitarnya

I

+

Penghitungan jumlah bakteri asam laktat

Seleksi isolat tahan asam (pH 2,5) dan garam empedu (oksgal 0,3%) serta sifat antimikroba

Pengujian sampai tingkat spesies (uji biokimia dan fermentasi karbohidrat)

I

Uji potensinya sebagai probiotik

f

t

f

+

Uj i Uji sifat Uji penempelan Identifikasi

koagregasi hidrofobisitas pada lempeng senyawa antimikroba stainless steel

[image:131.595.100.490.100.551.2]

(132)

2. Ketal~anan Terhadap Asam Lambung dan Asam Empedu (Jacobsen ct nl.

1999)

Ketahanan tiap kultur bakteri diguuakan untuk mengetahui kemampuannya bertahan dalam lambung dan saluran pencemaan yang ber-pH asam serta asam empedu di bagian atas usus. Metode ini dilakukan dengan menambahltan 0,l ml suspensi bakteri dari MRSB ke dalam satu seri tabung yang berisi 2 ml larutan MRSB steril pada pH 2,5 (pH diatur dengan penambahan HC1) atau oksgal 0,3%. Kemudian diinkubasi pada 37"C, dan jumlah bakteri yang mampu bertahan dihitung dengall jmetode hitungan cawan. Pemupukan dilakukan tiap 0,4,8, dan 24 jam.

3. Pengujian Sifat Antimikroba (Schved et al. 1993)

Kultur bakteri asam laktat ditumbuhkan pada medium MRSB selatna 18 jam pada suhu 37°C. Bakteri uji diinokulasikan 1 ose ke dalam NB, diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 liari, kemudian sebanyak 0,2 ml dipindahkan ke dalau~ 100 ml nutrien agar (0,2 %), dicampur dan dipindahkan ke dalam cawan petri masing-masing sebanyak 15 ml, dan dibiarkan hingga membeku. Setelah agar membeku, selanjutnya dibuar lubang sumur dengan diameter 7 mm.

(133)

4. Uji Koagregasi (Handley et nl. 1987 dikutip oleh Vandevoorde et al. 1992)

Uji koagregasi dilakukan untuk menentukan besamya kemampuan interaksi antar kultur bakteri untuk saling menempel dalam saluran pencemaan sehingga tidak mudah tercuci keluar karena pergerakan usus. Dalarn metode ini kultur bakteri dipasangkan dan koagregasi dinyatakan dalam penurunan optical density (OD) relatif antara bakteri yang dipasangkan dan yang tidak.

Kultur bakteri dipanen dengan cara mensentrihse pada 10.000 g selama 10 menit, kemudian dicuci 2 kali dengan lamtan PBS yang megandung NaCl 8 gll, KH,PO, 0,34 gll, dan 1,21 g/l K,HPO,. Kultur kemudian disuspensikan kembali pada buffer yang sama dan kultur yang akan dipasangkan dicampur. Setelah pencampuran, 4 ml suspensi dipindahkan ke dalam kuvet dan penurunan OD hingga mencapai OD akhir 0.6 5 0.02 p ~ d a panjang gelo~nbang 600 nm diamati selama 4

jam pada suhu ruang. Pengalllatan dilakukan menggunakan spektrofotometer. Hal yang sama dilakukan untuk kontrol pada kultur bakteri yang tidak dipasangkan. Persentase koagregasi dihitung dengan rumus:

(OD.l

+

OD.2) - 2 x OD.1.2

Koagregasi (%) = x 100%

(OD.l

+

OD.2) Keterangan:

OD.l =optical density strain 1 OD.2 = optical density strain 2

(134)

5. Uji Sifat Hidrofobisitas (metode BATH: Rosenberg 1990)

Bertujuan untuk mengukur distribusi sel antara fase hidrofobik dengan air. Prinsipnya komponen-komponen yang bersifat hidrofobik akan bersatu dan terpisah dari yang non hidrofobik.

Prosedur percobaan diinulai dengan cara inemanen sel bakteri dengan sentrifugasi pada 3500 g selama 10 menit. Pelet yang diperoleh dibilas dan dilarutkan dalam Pospat Buffer Saline steril sehingga mencapai OD pada 600 nm sebesar 0,4-- 0,6 menggunakan spektronik 20. Selanjutnya 3 ml suspensi bakteri dimasukkan ke dalam tabung uji yang bersih dan ditambahkan heksadekana 150 ul. Campuran divorteks 2 kali (masing-masing 10 detik) dengan interval 5 detik. Carnpuran didiamkan selarna 10 menit agar terpisah dan diukur densitasnya pada OD 600. bakteri yang berpindah ke heksadekana dihitung dengan rumus:

Ao : Nilai OD 600 suspensi awal

A : Nilai OD 600 setelah dicampur heksadekana

6. Uji Penempelan pada Lempeng Stainless Steel (Dewanti dan Wong 1993)

Persiapan Lempeng Stainless Steel

(135)

dalam larutan detergen panas (40-45°C) selama 24 jam, kemudian dibilas dengan air panas (40-50°C) hingga tidak berbusa dan licin, kemudian dikeringanginkan.

Setelah pencucian selesai, lempeng stainless steel yang akan digunakan pada uji penempelan diberi tanda pada salah satu bagian sisinya. Kemudian lempeng disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 12loC selama 20 menit.

Uji Penernpelan Bakteri Asarn Laktat

Uji penempelan pada permukaan lempeng stainless steel dilakukan dengall cara meletakkan le~npeng ke dalam 250 ml medium pertumbuhan yang diinoltulasi dengan 1 ml kultur BAL (lo8 CFUIml) ke dalam erlenmeyer 1 liter, kemudian diinkubasi pada suhu kamar (28-30°C) dengan agitasi 70 rpm selaina 2 hari.

Densitas biofilm dianalisa pada 24 dan 48 jam dengan cara membilas lempeng dengan larutan buffer fosfat (BF), setelah itu dengan menggunakan swab pernlukaan lempeng stainless steel diseka secara merata. Swab kemudian dimasukkan ke dalam tabung ymg berisi 10 ml BF. Tabung kemudian divorteks sela~na 1 menit, lalu dilakukan seri pengenceran. Pertumbuhan koloni setelah 2 hari dihitung dan jumlah sel dinyatakan dalam CFU/cm2.

(136)

7. Identifikasi Senyawa Antimikroba

Produksi Asam (Buchta 1983 dikutip oleh Wirjantoro 1993)

Kultur bakteri asam laktat yang telah ditumbuhkan dalam MRS Broth selama 2 hari pada suhu 37'C, diinokulasi sebanyak 10% ke dalam medium sintetik. Medium ini terdiri dari 50 g/l glukosa, 0,4% urea, 0,1% KHPO,, 0,05% MgS0,.7H20, 0,001% FeS0,.7H20, 0,05% KCl, dan yeast ekstrak 0,05%. Sebelumnya sampel disentrifuse pada 3000 rpm selama 10 tnenit untuk memisahkan sel dan padatan tidak terlarut. Hasil sentrifuse diencerkan 50 kali, ke~nudian dianlbil 10 ml untuk dititrasi dengan NaOH 0,01 N indikator fenolptalein 1%. Total asam (dalam % asam laktat) dihitung dengan rumus:

mlNaOH x N NaOH x 0,09 x 100 x p

% asam laktat =

ml sampel p = pengenceran

Uji Bakteriosin (Winkowski dan Montville 1992)

(137)

37°C selama 1 hari, kemudian sebanyak 0,2 ml dipindahkan ke dalam 100 in1 nutrien agar (0,2 %), dicampur dan dipindahkan ke dalam cawan petri masing-masing sebanyak 15 ml, dan dibiarkan hingga membeku. Setelah agar membeku, selanjutnya dibuar lubang suinur dengan diameter 7 mm.

Kultur bakteri asam laktat dari MRS Broth dinetralkan dengan NaOH 0,l N sampai pH 7. Untuk memisahkan sel bakteri asam laktat dilakukan penyaringan menggunakan kertas milipore steril dengan pan-pori 2 pin. Filtrat yang telah disaring dimasukkan dalam sumur yang telah dibuat masing-masing sebanyak

50 ~11, kemudian diinkubasi pada 37°C selama 2 hari dan sebagai kontrol digunakan

(138)

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Profil Bakteri Asam Laktat dari Tempoyak

Profil bakteri asam laktat yang berhasil diisolasi dari sampel yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 3. Dari 10 sampel diperoleh 42 isolat bakteri gram positif dan katalase negatif. Berdasarkan pengamatan sifat fisiologis, morfologis dan biokimianya ke-42 isolat termasuk dalam genus Lactobacillus. Menurut Sneath et al. (1986) dan Hayakawa (1992) keloinpok bakteri asam laktat yang berbentuk batang, termasuk juga kokobasili dan batang kurus, katalase negatif, serta hasil pewarnaan grarnnya positif merupakan bakteri asam laktat dari genus Lactobacillus.

Tabel 3. Profil bakteri asam laktat dan nilai pH berdasarkan asal daerah dan umur tempoyak

(139)

Genus Lactobacillus umum ditemukan pada produk-produk fermentasi sayuran atau karbohidrat seperti saurkraut, pikel, kiinchi, gari ogi, pozol dan lain- lain (Nuraida 1988; Hong et al. 1999).

Berdasarkan Tabel di atas terlihat bahwa bakteri asam laktat hanya ditemukan pada tempoyak yang berumur kurang dari 4 minggu. Tempoyak yang berasal dari Lubuk Linggau dengan umur 12 dan lebih dari 24 minggu, Batu Raja dengan umur 8 dan 12 minggu, serta tempoyak yang berasal dari Kalianda dengan lumur 4 minggu tidak mengandung bakteri asam laktat. Total bakteri asam laktat pada tempoyak berkisar antara 5,2 x lo4 sampai 2,31 x 10' CFUIg, dan hanya ada pada tempoyak yang berasal dari Bandar Lampung, Kotabumi, dan Kalianda dengan uinur 1-3 minggu.

Nilai pH juga semakin menurun dengan bertambahnya umur tempoyak. Nilai pH berkisar antara 2,9-4,2, dengan pH tertinggi dicapai ole11 tempoyak Kotabumi dengan umur 1 minggu (4,2) dan terendah pada tempoyak Lubuk Linggau umur lebih dari 24 minggu (2,9). Rendahnya nilai pH ini berhubungan deilgan semakin lamanya umur tempoyak. Hal ini disebabkan terakumulasinya asam laktat yang diproduksi selama perturnbullan bakteri asam laktat sehingga akhimya bersifat racun bagi bakteri itu sendiri.

(140)

menggunakan sisa nutrisi dan oksigen sehingga menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk.

Pada fermentasi tradisional yang berlangsung secara spontan, mikroba yang secara alami ada di dalam bahan pangan akan tumbuh dan mengakibatkan suksesi atau pergantian mikroba yang dominan pada proses selanjutnya. Golongan Enterobacter dan bakteri aerob merupakan mikroba yang dominan pada bahan pangan segar, walaupun terkadang didapat juga bakteri asam laktat dalam jumlah yang sangat kecil yaitu 1% dari total bakteri.

Pada kondisi fermentasi yang tertutup, oksigen secara cepat habis akibat respirasi jaringan tumbuhan dan mikroba aerob. Pada tahap ini jumlah Enterobacter yang memproduksi asam semakin meningkat sehingga pH tulxn menjadi sekitar 4,4. Beberapa hari kemudian jumlah Enterobacter ditekan akibat pertumbuhan bakteri asam laktat yang memproduksi asam. Pada tahap awal bakteri asam laktat heterofermentatif seperti Leuconostoc mesenteroides dan Lactobacillus brevis menjadi dominan. Kemudian berganti dengau bakteri asam laktat homofermentatif yang memproduksi asam lebih banyak sehingga pH tuiun sekitar 3,7 bahkan lebih rendah lagi. Diantara bakteri asam laktat homofennentatif yang paling dominan adalah Lactobacillusplantavunt, walaupun terkadang terdapat juga Pediococcus ssp. Dalam jumlah tidak lebih dari 10% (Nout dan Roumbouts

2000 dala~n Lund et al. 2000).

(141)

tempoyak dengan umur lebih dari 3 minggu berkaitan langsung dengan kemampuan mikroorganisme ini mengasimilasi laktat yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat. Hal ini dapat terlihat dari penurunan pH tempoyak sampai 2,9. Pada nilai pH ini kamir dan kapang masih mampu tumbuh sedangkan bakteri asam laktat pada tempoyak yang berumur lebih dari 3 minggu mengalami fase kematian oleh beberapa sebab, antara lain ketersediaan nutrisi pada media yang berkurang, energi cadangan dalam sel habis serta penumpukan asarn dan metabolit lainnya selama proses fermentasi, sehingga hanya kapang dan khamir yang rnampu tumbuh pada kondisi tersebut.

Secara umum, pertumbuhan bakteri asam laktat terus berlangsung apabila karbohidrat, asam amino, dan nutrien lainnya tersedia, komponen penghambat atau racun dihilangkan, didegradasi, atau diencerkan serta konsentrasi ion hidrogen diatur dibawah level toleransi spesies tersebut (Hutkins dan Nannen 1993). Pada Tabel 1 terlihat bahwa jumlah karbohidrat (gula) pada durian segar (36,1%) mengala~ni penurunan setelah difermentasi menjadi tempoyak (25,7%). Penurunan ini menyebabkan rasa manis tempoyak turun dan berubah menjadi asam akibat metabolisme gula menjadi asam-asam organik (Food and Nutrition Center 1969; Hanum et a1 1997).

(142)

uinur 3 minggu hanya menghasilkan 5 isolat bakteri asam laktat. Umur tempoyak tampaknya berpengaruh terhadap mikroflora tempoyak, walaupun prinsip pembuatan tempoyak pada daerah-daerah tersebut sama, yaitu pencampuran daging buah durian dengan garam (NaC1) kemudian fermentasi dibiarkan berlangsung secara spontan.

Perbedaan jumlah isolat bakteri asanl laktat dari tempoyak salah satunya disebabkan oleh perbedaan daerah yang memproduksinya, diduga jenis bahan baku (durian) yang digunakan oleh masing-masing daerah memiliki perbedaan dari segi varietas, tingkat kematangan, serta komposisi kimianya. Tempoyak dengan umur kurang dari 1 bulan merupakan tempoyak terbaik berdasarkan kandungan ~nikrofloranya, walaupun sifat fisik dan organoleptiknya tidak berbeda dengan tempoyak berumur lebih dari 1 bulan. Selama ini, dua sifat yang terakhir merupakan pertimbangan utama konsumen dalam mengkonsumsi tempoyak tanpa mempertimbangkan kandungan mikroflora yang ada didalamnya.

Ketahanan Terhadap Asam Lambung dan Asam Empedu Isolat bakteri Asam Laktat Tempoyak

(143)

[image:143.595.80.501.96.754.2]

(144)

Nilai pH 2,s yang digunakan tampaknya memiliki sifat yang merusak pada semua isolat yang diuji. Hal ini ditunjukkan oleh penunulan jumlah sel d m tidak ada satu isolat pun yang mampu tumbuh selama inkubasi.

Hal yang serupa juga ditunjukkan ole11 Jacobsen (1999), yang menguji ketahanan asam 47 galur bakteri asam laktat dari berbagai sumber pada pH 2,5. Dari 47 galur tersebut hanya 29 galur yang mampu bertahan pada pH 2,5 dan tidal< ada satupun yang mampu tnmbuh setelah inkubasi 4 jam.

Isolat yang mengalami sedikit penurunan jumlah sel selama inkubasi pada kondisi asam, diduga memiliki mekanisme ketahanan terhadap asam. Asam lambung (HCl) termasuk asam kuat yang terdisosiasi dalam medium dan mampu menurunkan pH ekstemal tetapi tidak dapat menembus membran sel.

Asam ini menghambat pertumbuhan sel melalui efek denaturasi enzim- enzim yang ada dipermukaan sel, kerusakan lipopolisakarida, dan membran luar serta penurunan pH sitoplasma melalui peningkatan permeabilitas membran terhadap proton pada gradien pH yang sangat besar.

(145)

fosfolipid (misalnya alanil dan lysil fosfatidil gliserol) selama pH rendah (Booth dan Kroll 1987).

Ketahanan terhadap asam lambung mernpakan salah satu syarat penting mikroorganisme yang akan digunakan sebagai probiotik. Penambahan oksgal0,3% merupakan konsentrasi kritis yang disarankan oleh Gilliland et a1 (1984) dan cukup tinggi untuk menseleksi galur-galur yang resisten. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa tingkat keragaman resistensi terhadap asam empedu pada Lactobacillus sp. tidak berkorelasi dengan spesiesnya tetapi berdasarkan genusnya (Deschamps et a1 1990; Chateu et al. 1993 dikutip oleh Chateu et al. 1994).

Ketahanan isolat tempoyak terhadap asam e~npedu berkisar antara 34,8% - 100%. Berdasarkan kisaran ini terlihat bahwa isolat Bakteri asam laktat tempoyak relatif tahan terhadap asam empedu. Bahkan Isolat To 8 tidak menunjukkan penurunan selama inkubasi 24 jam. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Gilliland dan Walker (1993) serta Chateu et al. (1994) menunjukkan bahwa keragam galur- galur yang resisten terhadap asam empedu disebabkan oleh perbedaan alami dalam proses pertumbuhan tiap galur.

(146)

Sifat Antimikroba Isolat Bakteri Asarn Laktat Ternpoyak

Ke-42 kultur bakteri asam laktat hasil isolasi, memiliki efek penghambat yang beragam terhadap Staphylococcus aureus, Salirzonella typhi dan Eschericl~ia coli. Sifat antimikroba bakteri asam laktat tempoyak Bandar Lanlpung umur 1 dan 2 minggu dapat dilihat pada Gambar 3.

Pada Gambar 3 terlihat bahwa isolat bakteri asam laktat tempoyak Bandar Lampung baik yang berumur 1 atau 2 minggu tidak menghasilkan penghambatan

Gambar 3. Sifat antimikroba BAL tempoyak Bandar Lampung umur (a) 1 lninggu (b) 2 minggu

yang baik terhadap ketiga bakteri uji.

F - ~

r.

~ . ~ ~ - ~ ~

i

1 1

I

l . Z 1

Hanya 1 isolat (To 2) yang mampu menghambat ketiga bakteri uji, dengan zona penghambatan yang tidak begitu besar. Isolat-isolat lainnya hanya menghambat 1 jenis bakteri uji, bahkan isolat To 1, To 6 , dan To 40 tidak

i i

I 1.04

0.2

,

I TO1 _TO5 TW T W O

Kodc lrolat CIE. o l i IIS, typhi

i CIS nurelrs _-.j

! 6

-

B 2 - ::

TO! TO2 TO1 TO1 I ,

Kode bolal

[image:146.599.103.511.304.519.2]

(147)

menghasilkan penghambatan sama sekali. Isolat yang tidak menghasilkan penghambatan diduga tidak memproduksi senyawa antimikroba.

Hampir semua tempoyak yang diisolasi dari Kotabumi memiliki sifat antimikroba yang cukup tinggi terhadap hakteri uji (Gambar 4 dan Gambar 5).

Kade lsolat

DE. coli BS. ljplii CIS n,rr.errr

-

Gambar 4. Sifat antimikroba BAL Tempoyak Kotabumi uinur 1 minggu

[image:147.602.118.498.186.437.2]

(148)

Pada Ganbar 5 terlihat seluruh bakteri asam laktat dengan umur 2 minggu menghasilkan penghambatan yang cukup baik dengan urutan dari yang terbesar sampai terkecil berturut-tumt pada S. azcrezts (12,26 - 3,06 mm), S. @phi (3,14 -

8,2 mm) dan E. coli (3,34 - 6,3 mm).

Kode Sampel

UE. eoli .S ypBi US. n",rt<s

~~ .... ~~ ~ ~. - ~ ~-

Gambar 5. Sifat antimikroba BAL tempoyak Kotabumi umur 2 minggu

Gambar 6. menunjukkan bahwa dari 5 isolat hanya 4 yang mampu menghasilkan penghambatan terhadap ke-3 bakteri uji, sedangkan 1 isolat (To 36) tidak menghasilkan penghambatan sama sekali. Kisaran penghambatan dari yang terbesar sampai terkecil berturut-turut adalah S. nureus (1 1,44 - 4,26 mm), S. @phi

[image:148.602.121.497.185.452.2]

(149)

I TO8 TO33 TO35 _TO36 _TO38 I

I Kode lsolat

BE coli .S. rypbi OS. osrctrr

[image:149.602.145.467.82.288.2]

J

Gambar 6. Sifat antimikroba BAL tempoyak Kalianda umur 3 minggu

Sifat penghambatan yang ditunjukkan oleh isolat bakteri asam laktat tempoyak diduga disebabkan oleh asam laktat sebagai produk utama selama proses fermentasi. Hal ini sesuai dengan yang dikemukakan oleh Kluyfer dalam Jay (1997) yang menyatakan bahwa bakteri asam laktat homoferme~~tatif merupakan bakteri yang memproduksi asam laktat sebagai produk utama hasil fermentasi glukosa (95%). Metaliolisme glukosa pada bakteri asam laktat homofermentatif terjadi melalui jalur glikolisis (Embden-Meyerhof pathway).

(150)

Bakteri gram negatif mempunyai ketahanan yang lebih baik terhadap senyawa antimikroba dibandingkan bakteri granl positif. Branen dan Davidson (1993) menyatakan bah~va bakteri gram negatif memiliki sistem seleksi terhadap zat-zat asing, yaitu pada lapisan lipopolisakarida.

Menurut Pelczar dan Chang (1986) struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antimikroba untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja. Sedangkan struktur bakteri gram negatif relatif lebih kompleks, berlapis-lapis yaitu lapisan luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa polisakarida, dan lapisan dalam peptidoglikan.

Pemilihan Isolat Bakteri Asam Laktat Tempoyak Unggul

Pemilihan isolat-isolat unggul dilakukan berdasarkan seleltsi awal berdasarkan ketahanan terhadap asam lambung dan asam empedu serta sifat antimikroba.

(151)

Tabel 5. Kriteria seleksi isolat BAL tempoyak Kode isolat

To l To 2

To 3

To 4

Ketahanan terhadap asam lambung > 60%

Ketahanan terhadap asam empedu > 60%

Zona penghambatan terhadap

(152)

Identifikasi Isolat Unggul

Sembilan isolat unggul selanjutnya diidentifikasi sampai tingkat spesies (Tabel 6). Pengujian sampai tingkat spesies dilakukan berdasarkan kema~npuan isolat memfermentasi berbagai jenis karbohidrat, produksj gas, dan kema~npuan u~ltuk tumbuh pada suhu yang berbeda (Lampiran 3).

Berdasarkan kriteria tersebut, 9 isolat tergolong dala~n sub genus Streptobacteria, yang tidak memproduksi gas (homofermentatifl dan tumbub pada suhu lS°C (Hayakawa 1992). Ke-10 genus Lactobacillus ho~nofermentatif teridentifikasi sebagai Lactobacillus plantarunt, Lactobacilltrs casei dan Lactobacilltrs cory~teforn~is (Hayakawa 1992 ; Sharpe 1979)

Tabel 6. Hasil identifikasi isolat BAL tempoyak Asal dan umur

I

Kode

I

Teridentifikasi

tempoyak Tempoyak Kotabumi, umur 1 minggu - -

isolat To 25 To 26

To 31

I

L. casei

. ~

umur 2 minggu

Dari Tabel 6 terlihat bahwa masing-masing daerah dengan umur tempoyak sebagai

L. casei L. casei

Tempoyak Kotabumi,

I

To 9

I

L. plaiztarurtt

Tempoyak Kalianda, umur 3 minggu

yang berbeda menghasilkan spesies Lacfobacill~s yang berbeda pula. Tempoyak To 16

To 18 To 22

Kotabumi umur 1 minggu spesies yang teridentifikasi adalah L. casei To 25, To 26, dan To 31. Tempoyak dengan umur 2 minggu seluruh isolat yang teridentifikasi

L. plantarur71 L. plarztanii~ L. plarttaruii~ To 23

To 8

[image:152.599.116.483.384.548.2]

(153)

sebagai L. plantarunz To 9, To 16, To 18, To 22, dan To 23. Sedangkan isolat yang berhasil diidentifikasi pada tempoyak Kalianda umur 3 minggu adalah L. corynefornzis To 8.

Pada tempoyak yang bernmur 1 minggu bakteri asam laktat didominasi oleh L. casei, kemudian bernbah menjadi L. plantarunz setelah umur telnpoyak mencapai 2 minggu, terakhir bakteri asam laktat yang tumbuh di tempoyak adalah L. couynefornzis. L. plantaruin homofermentatif pada umumnya mendominasi pertumbuhan pada akhir fase fermentasi (> 6 bari), ha1 ini terjadi pada kimchi dan pozol (Nuraida 1988; Hong et al. 1999). Spesies ini bertanggung jawab terhadap produksi asam laktat yang merupakan komponen flavour utama produk-produk

.-.- _ /

felnlentasi sayuran dan bahan pangan berpat.i-:

Lactobacillus plantaruin dibedakan dari Lactobacillus casei dan Lactobacillus coryrzeforinis berdasarkan kemampuannya memfermentasi melibiose dan rafinosa, sedikit produksi asam pada susu, dan biasanya terdistribusi pada produk-produk tumbuhan seperti silase dan bahan hasil pertanian (Hayakawa 1992). Sedikit perbedaan dalam memfermentasi karbohidrat yang ditunjuklcan oleh beberapa galur menunjukkan tingkat kekerabatan yang berbeda, tetapi masih dalam satu spesies yang sama.

Uji Koagregasi

(154)

Tabel 7. Persentase koagregasi isolat BAL yang dipasangkan

Kemampuan berkoagregasi secara efektif hanya ditunjukkan oleh Lactobacillus corynefori~lis To 8, Lactobacillus plantaruln To 9, Lactobacillus plantarum To 23, Lactobacillus casei To 25, dan Lactobacillus casei To 26.

[image:154.595.89.510.128.414.2]

(155)

Hal ini menunjukkan bahwa reaksi koagregasi yang terjadi antar galur saugat spesifik, sebagaimana yang dikemukakan oleh Vandevorde et al. (1992) dengan hasil penelitian yang melibatkan 9 spesies Lactobacillus yang diisolasi dari tembolok, usus 12 jari dan usus besar ayam serta silase, menunjukkan hanya 2 spesies yang secara efektif selalu terlibat menbentuk agregat dengall isolat pasangannya. Hal ini menegaskan bahwa kemampuan herpasanga