Tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma-1 yang diinduksi kalsium klorida

(1)

TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN

PADA PLATELET RICH PLASMA-1

YANG DIINDUKSI KALSIUM KLORIDA

Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN

Oleh:

SARAH ATTAUHIDAH

NIM: 1112103000065

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

(2)

(3)

(4)

(5)

KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah SWT atas nikmat yang telah diberikan, baik nikmat iman, Islam, dan nikmat sehat, penulis mampu menyelesaikan laporan penelitian ini dengan baik. Shalawat serta salam penulis ucapkan kepada Baginda Rasulullah SAW yang selalu menjadi tauladan bagi umat-Nya. Penulis menyadari bahwa tanpa bimbingan dan bantuan dari berbagai pihak, maka penelitian ini tidak akan pernah selesai. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M. Kes selaku Dekan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. dr. Witri Ardini, M. Gizi, Sp. GK selaku Ketua Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Jakarta.

3. dr. Achmad Zaki, M. Epid, Sp. OT selaku pembimbing 1. Terima kasih atas waktu, tenaga, pikiran, dan semangatnya untuk membimbing penulis dari nol hingga akhirnya penelitian ini dapat diselesaikan.

4. dr. Ahmad Azwar Habibi, M. Biomed selaku pembimbing 2. Terima kasih sudah bersedia meluangkan waktu dan membimbing penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian ini.

5. dr. Nouval Shahab, Sp.U, Ph.D, FICS, FACS selaku penanggung jawab modul riset PSPD angkatan 2012, terima kasih atas bimbingannya pada kami semua dalam menjalani penelitian ini.

6. Bu Nurlaely, M. Biomed dan Mbak Ai yang telah membimbing penulis selama penelitian di laboratorium. Terima kasih telah sabar dan penuh semangat membimbing penulis dari awal hingga selesai.

7. Rasa hormat dan terima kasih yang tak terhingga kepada kedua orangtua penulis dan keluarga, Dr. Abdurrahman, SE, MM dan Faridah, S. Pd yang selalu memberikan semangat, nasihat, dan doa restu selama penulis menjalankan pendidikan.

(6)

9. Keenam responden yang bersedia memberikan darahnya untuk sampel penelitian. Semoga kebaikan kalian dibalas oleh Allah SWT dengan balasan yang berlipat ganda.

10. Teman-teman Ikatan Senat Mahasiswa Kedokteran Indonesia (ISMKI) Wilayah 2 yang sangat mengerti agenda penulis dalam penyusunan laporan penelitian, serta tak hentinya semangat yang terus diberikan untuk penulis. 11. Teman-teman sejawat PSPD 2012, khususnya para wanita di Puri Laras II,

terima kasih kebersamaan, semangat, dan motivasinya selama ini.

Penulis menyadari laporan penelitian ini masih jauh dari bentuk yang sempurna. Segala kritik dan saran yang membangun dari berbagai pihak sangat penulis harapkan. Demikian laporan ini penulis susun, semoga bermanfaat untuk ilmu pengetahuan, agama, dunia, dan setelahnya nanti. Aamiin.

(7)

ABSTRACT

Sarah Attauhidah. Medical Education Study Program. Level of Protein Concentration in Platelet Rich Plasma-1 Induced Calcium Chloride. 2015

Platelet rich plasma (PRP) is nowadays increasingly developed to produce optimal healing therapy in various medical fields. The purpose of this study was to determine the protocol manufacture of PRP-1 induced calcium chloride (CaCl2), determine the effect of calcium chloride (CaCl2) in PRP-1, and to know

the changes of protein concentration in PRP-1 and it’s control. The sample in this study amounted to 6 healthy people who are not currently taking medications within a certain period, and did not have a history of infections in the last 1 month. The average value of the protein concentration in PRP-1 induced calcium chloride (CaCl2) increased (1.17915) compared with the average of it’s control (0.46549).

Keywords: platelet rich plasma-1, activation of calcium chloride (CaCl2). ABSTRAK

Sarah Attauhidah. Program Studi Pendidikan Dokter. Tingkat Konsentrasi Protein Pada Platelet Rich Plasma-1 yang Diinduksi Kalsium Klorida. 2015 Dewasa ini, platelet rich plasma semakin dikembangkan untuk menghasilkan terapi penyembuhan yang optimal dalam berbagai bidang medis. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui protokol pembuatan PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2), mengetahui pengaruh kalsium klorida (CaCl2) tersebut pada PRP-1, serta mengetahui perubahan konsentrasi protein pada PRP-1 terhadap kontrol negatifnya. Sampel dalam penelitian ini berjumlah 6 orang sehat yang tidak sedang mengkonsumsi obat-obatan dalam jangka waktu tertentu, dan tidak memiliki riwayat infeksi dalam 1 bulan terakhir. Nilai rerata konsentrasi protein pada PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2) mengalami peningkatan (1,17915) bila dibandingkan dengan rerata konsentrasi protein kontrolnya (0,46549).

(8)

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ... i

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... ii

(9)

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ... 5

2.1Landasan Teori ... 5

2.1.1 Platelet ... 5

2.1.2 Platelet Rich Plasma ... 8

2.1.3 Kalsium Klorida (CaCl2) ... 11

2.1.4 Absorbansi dan Konsentrasi Protein ... 11

2.2Kerangka Teori ... 15

3.4Kriteria Inklusi dan Eksklusi ... 20

3.5Besar dan Cara Pengambilan Responden ... 20

3.6Alur Penelitian ... 22

3.7Cara Kerja Penelitian ... 23

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 25

4.1Karakteristik Responden ... 25

4.2Penentuan Kadar Protein ... 26

4.3Penentuan Absorbansi Larutan Standar Protein ... 26

4.4Penentuan Persamaan Garis Regresi Linear Standar ... 26

4.5Penentuan Absorbansi Larutan Sampel ... 28

4.6Penentuan Konsentrasi Sampel ... 28

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ... 33

5.1 Kesimpulan ... 33

(10)

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Variasi hasil relative centrifugal force pada whole blood cells ... 9

Tabel 2.2 Variasi hasil pengaruh suhu pada sentrifugasi pertama PRP-1 ... 9

Tabel 4.1 Data responden sampel... 25

Tabel 4.2 Absorbansi larutan standar ... 26

Tabel 4.3 Absorbansi larutan sampel ... 28

(11)

DAFTAR GRAFIK

(12)

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Ultrastruktur trombosit ... 6

Gambar 2.2 Proses hemostasis vessel injury ... 7

Gambar 2.3 Lapisan whole blood yang telah disentrifugasi ... 10

Gambar 2.4 Prinsip dasar spektrofotometri ... 12

Gambar 2.5 Transmitans spektrofotometer ... 13

(13)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Lembar informed consent ... 37

Lampiran 2 Protokol pembuatan Platelet Rich Plasma-1 yang Diinduksi Kalsium Klorida ... 38

Lampiran 3 Surat permohonan ethical appearance penelitian ... 39

Lampiran 4 Dokumentasi penelitian ... 40

(14)

DAFTAR SINGKATAN

PRP Platelet rich plasma

PPP Platelet poor plasma

GP Glikoprotein

ACD Anticoagulant Citrate Dextrose

BSA Bovine Serum Albumine

WBC Whole blood cell

(15)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dewasa ini, platelet rich plasma (PRP) telah digunakan secara luas untuk tata laksana klinis di berbagai cabang kedokteran, seperti ortopedi, oftalmologi, dan terapi penyembuhan lainnya karena ditemukan adanya peningkatan fungsi regenerasi jaringan. Namun, ada beberapa hal mengenai studi ini yang masih meragukan dikarenakan perbedaan dari persiapan PRP yang digunakan. Hal ini menimbulkan perbedaan respon yang tidak bisa disamakan1.

Platelet atau yang biasa disebut trombosit ialah fragmen sel darah terkecil maupun teringan yang memiliki fungsi penting dalam recovery cells. Aktivasi platelet terjadi dimulai dari cedera atau rusaknya pembuluh darah yang akan mengaktivasi enzim proteolitik protrombin menjadi trombin dan fibrinogen (sebagai platelet glue) menjadi fibrin. Hasilnya akan terjadi penguatan kembali ikatan-ikatan fibrin untuk memperbaiki kerusakan2.

(16)

Platelet rich plasma mengandung bermacam-macam sitokin, seperti

interleukin, tumor necrosis factor (TNF)α, interferon (IFN)g, anti-inflammatory cytokines, chemokines (eotaxin, protein 10, monocyte chemoattractant protein 1, dan growth factors), serta komponen lainnya yang keberadaannya dapat dipresentasikan dalam konsentrasi protein4.

Di samping fungsi-fungsi yang sudah dibahas di atas, platelet-derived products dapat digunakan dengan atau tanpa aktivasi platelet sebelumnya. Beberapa penelitian menggunakan berbagai metode dalam mempersiapkan PRP, dari cara konvensional sentrifugasi sampai dengan commercial system, yaitu dengan menggunakan kolagen, kalsium, dan/atau trombin5. Menurut hasil penelitian Amable et al (2013), aktivasi PRP-2 menggunakan CaCl2 akan mengalami peningkatan jika dibandingkan dengan aktivasi PRP-2 dengan trombin. Hal tersebut dapat dilihat berdasarkan kadar growth factor yang meningkat1. Namun sampai saat ini belum ada yang menggali lebih dalam apakah efektivitas kalsium klorida pada PRP-1 lebih baik dibandingkan PRP-1 tanpa aktivasi, dengan melihat konsentrasi protein di dalamnya.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, bagaimana pengaruh induksi kalsium klorida (CaCl2) terhadap tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1)?

1.3 Hipotesis

(17)

1.4 Tujuan

1.4.1 Tujuan Umum

Mengetahui pengaruh kalsium klorida (CaCl2) yang diinduksikan pada

Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1).

1.4.2 Tujuan Khusus

-Mengetahui adanya perbedaan konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) setelah diinduksi oleh kalsium klorida (CaCl2) dan kontrol negatifnya.

-Mengetahui protokol pembuatan Platelet Rich Plasma (PRP-1) yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2).

1.5 Manfaat Penelitian

1.5.1 Bagi Peneliti

1. Mendapatkan ilmu dan pengalaman dalam hal meneliti di bidang biomedik.

2. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

1.5.2 Bagi Institusi

1. Mendapatkan referensi hasil penelitian dari pengaruh induksi kalsium klorida pada konsentrasi protein yang ada di PRP-1.

(18)

3. Hasil dari penelitian tersebut dapat digunakan peneliti lain untuk melanjutkan penelitian.

1.5.3 Bagi Masyarakat

(19)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Landasan Teori 2.1.1 Platelet

Platelet atau trombosit merupakan fragmen sel darah yang beredar di tubuh. Platelet diproduksi di sumsum tulang (bone narrow) dengan hormon trombopoietin sebagai regulator utama yang dihasilkan oleh organ hepar dan ginjal. Di bawah pengaruh hormon tersebut, myeloid stem cells berkembang menjadi megakaryocyte-colony-forming cells sebagai sel prekursor, atau yang biasa disebut megakarioblas. Selanjutnya, megakarioblas akan bertransformasi menjadi megakariosit. Megakariosit mengalami replikasi DNA tanpa pembelahan nukleus atau sitoplasma yang apabila jumlah lobus nukleus bertambah, maka volume sitoplasma menjadi dua kali lipatnya. Setelah nukleus berjumlah delapan, sitoplasma berubah menjadi granular. Dari fragmentasi ujung-ujung perluasan sitoplasma bergranul itulah terbentuknya 1.000-5.000 trombosit dalam satu megakariosit. Proses diferensiasi ini membutuhkan waktu sekitar 10 hari6.

Platelet memiliki ukuran kecil berdiameter 2-4µm dengan banyak vesicles, namun tidak memiliki nukleus. Volume rerata platelet ialah 7-11fL. Jumlah platelet normal berkisar antara 150-400x109/L dengan usia normalnya 5-9 hari. Platelet yang sudah apoptosis akan dibawa oleh makrofag dari limpa dan hepar. Gambaran ultrastruktur platelet dapat dilihat pada gambar 2.1.

(20)

Gambar 2.1 Ultrastruktur platelet Sumber: Hoffbrand AV, Moss PAH, 2013

Fungsi utama platelet ialah membentuk sumbatan platelet dan mengeluarkan faktor kimiawi pada respon hemostatik normal terhadap cedera vaskular (spasme vaskular dan proses koagulasi). Respon hemostatik normal pada saat cedera ini bergantung pada interaksi erat antara dinding pembuluh darah dan faktor koagulasi. Mekanisme respon homeostatis normal saat cedera dapat dilihat pada gambar 2.2.

(21)

Keseluruhan proses hemostasis tersebut menyebabkan penyumbatan hemostatik yang stabil6.

Gambar 2.2 Proses hemostasis antara pembuluh darah, platelet, dan proses koagulasi ketika ada kerusakan pembuluh darah

Sumber: Hoffbrand AV, Moss PAH, 2013

Seperti yang telah dijelaskan di atas, reaksi pertama platelet setelah cedera pembuluh darah ialah proses adhesi atau perlekatan. Berikut proses adhesi antar platelet yang akan menutup perdarahan di lokasi cidera:

Platelet sebagai fragmen sel terkecil dan teringan

Terdorong dari aliran darah menuju dinding pembuluh darah

Platelet saling tergulung di sepanjang permukaan endothelium

INJURY Endothelium rusak

(22)

Reaksi pertama platelet ---- Tough fibers menyelubungi dinding pembuluh darah

Menarik platelet (seperti magnet)

Terstimulasi berubah bentuk secara situasional

Menutup perdarahan2

2.1.2 Platelet Rich Plasma

Platelet yang merupakan fragmen sel darah dengan bentuk terkecil dan teringan ini, normal beredar dalam darah dengan jumlah 150.000-450.000 platelet/ml darah.

Seperti definisinya, platelet rich plasma (PRP) harus mengandung platelet dengan konsentrasi tinggi daripada baseline. Ada beberapa parameter yang dibutuhkan untuk menentukan jumlah PRP, seperti konsentrasi platelet di atas

baseline, ada atau tidaknya leukosit, apakah PRP tidak menggumpal atau tidak, dan apakah PRP membutuhkan aktivasi eksogen atau tidak. Beberapa parameter itulah yang membedakan platelet poor plasma (PPP) dan PRP. Graziani et al (2006) mengatakan bahwa konsentrasi optimal PRP adalah 2,5 x lebih tinggi dari

baseline7.

(23)

Tabel 2.1 Variasi hasil relative centrifugation force pada whole blood cells*

*satuan kecepatan RCF (g) akan dikalibrasikan ke satuan rpm

Sumber: Amable PR et al, 2013

Menurut Amable et al (2013), pada penelitiannya mengenai variasi hasil RCF (tabel 2.1), hasil terbaik dalam sentrifugasi pertama whole blood cells ialah dalam kondisi ke-11 (300 x g, 5 menit, 120C) yang merupakan satu-satunya kondisi dengan waktu sentrifugasi terendah.

Tabel 2.2 Variasi hasil pengaruh suhu pada sentrifugasi pertama

(24)

Sedangkan menurut variasi hasil suhu (tabel 2.2), variasi suhu dianggap tidak terlalu berpengaruh karena tidak ada perbedaan yang signifikan pada hasil akhir PRP-1, baik pada suhu 120C dan 180C (suhu ruangan)1, 2, 4.

Setelah menggunakan metode yang disepakati dalam pembuatan PRP-1,

whole blood (WB) akan menghasilkan 3 fraksi, yaitu lapisan bawah yang mengandung eritrosit/sel darah merah dengan jumlah setengah dari volume, lapisan tengah yang mengandung leukosit/sel darah putih (buffy coat), dan lapisan paling atas yang mengandung plasma, platelet, dan sedikit sel darah putih. Lapisan paling atas itulah yang disebut platelet rich plasma-1 (PRP-1). Tiap lapisan dapat dilihat pada gambar 2.3 di bawah ini.

Gambar 2.3 Lapisan whole blood yang telah disentrifugasi. Sumber: Sherwood, Lauralee, 2012.

Oleh karena perbedaan kandungan di tiap lapisan, cara pengambilan PRP-1 harus menggunakan pipet/mikropet untuk mencegah tercampurnya sel darah merah dan buffy coat. Dengan masih adanya leukosit pada PRP-1, beberapa studi mengatakan bahwa tingginya kadar konsentrasi leukosit pada PRP secara langsung berhubungan dengan catabolic gene expression yang mengakibatkan terganggunya proses penyembuhan jaringan13.

(25)

2.1.3 Kalsium Klorida (CaCl2)

Untuk mencapai efek yang diinginkan, platelet rich plasma (PRP) dapat diaktivasi secara eksogen oleh trombin, kalsium klorida (CaCl2), atau mekanikal trauma. Sekali PRP teraktivasi, fibrin mulai terbentuk menjadi bivalent, yaitu jaringan yang unstable. Jika PRP diaktivasi dengan cara yang lebih fisiologis, jaringan tetramolekular ini akan meningkatkan growth factors nya dalam tahap

recovery cells10.

Selain itu, pengaktivasian oleh kalsium dibutuhkan untuk mengaktifkan protrombin menjadi enzim trombin yang selanjutnya diubah menjadi fibrinogen sebagai salah satu protein darah untuk proses penyembuhan jaringan. Proses penyembuhan ini dimulai dengan pembentukan fibrin-fibrin untuk mengumpulkan platelet dan menutup perdarahan14, 15. Hal ini membuat PRP yang diaktivasi oleh kalsium klorida akan memiliki efektivitas lebih tinggi dalam proses penyembuhan dikarenakan akan meningkatkan kinerja faktor-faktor pembekuan darah, yang dapat direpresentasikan sebagai protein.

2.1.4 Absorbansi dan Konsentrasi Protein

Protein berasal dari kata proteos pada bahasa Yunani yang artinya pertama

atau utama. Sebagai komponen terpenting penyusun tubuh manusia, protein

merupakan polimer dari berbagai monomer asam amino yang dihubungkan

dengan ikatan peptida. Protein juga bersifat amfoter atau dapat bereaksi dalam

larutan asam maupun basa. Untuk mengetahui adanya ikatan protein secara

kualitatif pada suatu larutan, umumnya menggunakan uji biuret yang tergolong

mudah. Campuran antara larutan CuSO4 dan NaOH pada uji biuret ini akan

menghasilkan warna lembayung ungu jika positif terdapat ikatan proteinnya20.

Sedangkan untuk mengetahui tingkat absorbansi protein (secara kuantitatif)

pada suatu larutan, peneliti menggunakan alat spektrofotometer. Spektofotometer

adalah alat untuk mendispersikan dan menghasilkan cahaya dengan menghasilkan

range panjang gelombang cahaya. Spektofotometer secara umum mengandung 2

komponen, yaitu spektrometer dan fotometer. Spektrometer berfungsi untuk

mendispersikan dan menghasilkan cahaya dengan menghasilkan panjang

(26)

yang mengukur intensitas cahaya16. Penjelasan mengenai cara kerja

spektofotometer itu sendiri akan dijelaskan pada gambar di bawah ini:

Gambar 2.4 Prinsip dasar dari spektrofotometer Sumber: Gore, Michael, 2000.

Pertama, kollimator (lens) mentransmisikan sorotan cahaya lurus (photons)

yang akan melewati monokromator (prism) untuk memisahkannya menjadi

beberapa komponen panjang gelombang (spectrum). Kemudian selektor panjang

gelombang (split) yang akan melanjutkan transmisi cahaya tersebut dengan

panjang gelombang tertentu. Setelah panjang gelombang cahaya tersebut dapat

melewati sampel di dalam cuvette, fotometer akan mendeteksi jumlah cahaya

yang diabsorbsi dan akan mengirimkan sinyal ke galvanometer atau digital

display.

Jumlah photons yang melewati cuvette dan menuju detektor bergantung

pada panjang cuvette itu sendiri dan konsentrasi dari sampel. Intensitas cahaya

setelah cahaya tersebut melewati cuvette dapat berhubungan dengan transmitans

(T). Transmitans adalah fraksi cahaya yang melewati sampel. Transmitans dapat

(27)

It merupakan intensitas cahaya setelah photons melewati cuvette, sedangkan

Iomerupakan intensitas cahaya sebelum photons melewati cuvette17.

Selain itu, transmitans juga berhubungan dengan absorpsi dan memiliki

persamaan:

Absorbansi merupakan ukuran kuantitatif rasio logaritmik jumlah photons

yang dapat diabsorpsi. Dengan nilai absorbansi dari persamaan tersebut,

konsentrasi sampel yang tidak diketahui itu dapat ditentukan dengan

menggunakan prinsip Beer-Lambert Law seperti di bawah ini:

(28)

Gambar di atas merupakan ilustrasi transmitans cahaya yang melewati sampel. Panjang dari l dapat digunakan pada Beer-Lambert Law atau yang bisa disebut Beer’s Law. Menurut Beer’s Law, terdapat hubungan linear antara tingkat absorbansi dan konsentrasi dari suatu sampel. Namun teori ini hanya dapat diaplikasikan jika memang terdapat hubungan yang linier. Persamaan Beer’s Lawμ

A merupakan tingkat absorbansi,

ϵ

merupakan koefisien molar atau

koefisien absorpsi, sedangkan c merupakan konsentrasi. Koefisien molar

merupakan nilai konstan yang nilainya bervariasi, bergantung pada molekul yang

terkandung. Berikut persamaan linear tersebut16:

Oleh karena persamaan tersebut, penentuan konsentrasi suatu sampel

memerlukan penentuan absorbansi dan konsentrasi standar yang akan

merumuskan suatu persamaan garis regresi linear standar.

A

=

ϵ

lc

(29)

2.2 Kerangka Teori

Whole blood

Platelet Trombosit Leukosit

Eritrosit

Endogen

Dapat teraktivasi

Perubahan konsentrasi protein

Trombin Kolagen

CaCl₂ Injury

(30)

2.3 Kerangka Konsep

Whole blood

Menghasilkan 3 fraksi Sentrifugasi

Lapisan bawah Lapisan tengah Lapisan atas

Leukosit

Eritrosit Plasma&Platelet

Platelet Rich Plasma-1

(PRP-1)

Perbedaan tingkat konsentrasi Baca di spektrofotometer

Uji biuret

(31)

2.4 Definisi Operasional

No .

Variabel Definisi Pengukur Alat

(32)

(33)

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara eksperimental untuk mengetahui tingkat konsentrasi Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi oleh kalsium klorida (CaCl2).

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Tempat penelitian di Laboratorium Biokimia FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada bulan Agustus 2014-Mei 2015.

3.3 Alat dan Bahan Penelitan

Alat

1. Centrifuge 5417R dengan merek Eppendorf

2. Spektofotometer dengan merek Genesys 20 beserta cuvette

(34)

Bahan

9. Bubuk Bovine Serum Albumine (BSA) 0,2 gram

3.4 Kriteria Inklusi dan Eksklusi 3.4.1 Kriteria Inklusi

1. Responden dalam keadaan sehat dengan usia minimal 16 tahun.

2. Responden tidak menggunakan obat kortikosteroid dalam 2-3 minggu sebelumnya.

3. Responden tidak menggunakan obat NSAIDS minimal 1 minggu sebelumnya.

4. Responden tidak menggunakan obat antikoagulan minimal 5 hari sebelumnya19.

3.4.2 Kriteria Eksklusi

1. Memiliki gangguan/penyakit darah kronik (leukemia, gangguan koagulasi, dan lainnya).

2. Memiliki riwayat infeksi dalam 1 bulan terakhir.

3.5 Besar dan Cara Pengambilan Sampel

(35)

E : Error Component (10-20)

N : Jumlah individu percobaan (sampel) dalam semua kelompok (dikurang 1) B : Blocking Component (dikurang 1)  B = 0

T : Jumlah kelompok terapi (dikurang 1)

Jika N = 12 – 22 dan masing-masing dibagi menjadi 2 kelompok, maka tiap kelompok berjumlah 6 – 11 sampel. Setelah itu ditetapkan sampel terkecil, yaitu 6 sampel.

Sampel diambil secara simple random sampling dengan jumlah 6 orang dan dipastikan sesuai kriteria dengan anamnesis (identitas diri dan riwayat penyakit). Responden yang memenuhi kriteria diminta untuk mengisi lembar persetujuan informed consent.

E = N- B - T

E = N – 0 – T ≥ 10 = (N-1) – (2-1) ≥ 10 = (N-1) – 1 ≥ 11 = N – 1 ≥ 12 = N

(36)

(37)

3.7 Cara Kerja Penelitian

A. Pembuatan Sediaan NaOH 10% dan CuSO4 0,1%

1. Siapkan NaOH dan CuSO4 bubuk, aquades, neraca analitik, dan botol kosong

2. Ukur 5 gram NaOH dengan neraca analitik 3. Tambahkan 50 ml aquades

4. Tunggu hingga larut kemudian pindahkan ke botol kosong dan labeli NaOH 10%

5. Ukur 17 gram CuSO4 dengan neraca analitik 6. Tambahkan 100 ml aquades

7. Pindahkan ke botol kosong dan labeli CuSO4 0,1%

B. Pembuatan Standart

1. Siapkan BSA, aquades, tabung reaksi, gelas ukur, sendok, tip biru, mikropipet, rak tabung, dan neraca analitik

2. Ukur BSA dengan neraca analitik sejumlah 0,2 gram

3. Larutkan dengan 10 ml aquades. Beri label sebagai stock BSA 4. Masukkan 2 ml stock ke dalam tabung reaksi. Beri label Std 1

5. Lakukan dilusi standart sebanyak empat kali sehingga konsentrasi standart menjadi 0,125% dengan cara mengambil 1 ml stock dan 1 ml aquades, dan seterusnya

6. Setiap hasil dilusi diberikan label Std 2 hingga Std 5 7. Letakkan di rak tabung

C. Pembuatan Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) 1. Siapkan alat dan bahan

2. Ambil darah vena sampel sebanyak 3ml ke dalam tabung darah

(38)

4. Sentrifugasi keduanya dengan kecepatan 1.800rpm, 5 menit, dan 180C 5. Ambil 0,5-1ml lapisan paling atas dari keduanya dengan menggunakan

mikropipet, lalu masukkan ke tube dengan nama ‘(+)’ untuk kontrol positif, dan ‘(-)’ untuk kontrol negatif

6. Ambil 270 l dari tube (+) ke tube lainnya, dan tambahkan 30 l CaCl2.

Namakan tube ‘CaCl2(+)’

7. Homogenkan dengan alat vortex

8. Ambil 300 l dari tube (-) ke tube lainnya. Beri nama tube ‘CaCl2 (-)’

9. Inkubasi kontrol (+) dan kontrol (-) selama 1 jam dalam suhu ruangan 370C ke dalam inkubator

D. Uji Biuret

1. Ambil 100 l masing-masing kontrol, masukkan ke tabung reaksi

2. Tambahkan 7 tetes NaOH 10% pada tabung reaksi CaCl2 (+) maupun (-), lalu homogenkan dengan alat vortex

3. Tambahkan 7 tetes CuSO4 0,1% pada kedua kontrol sampai terlihat warna ungu lembayung, lalu homogenkan dengan alat vortex

4. Letakkan di rak tabung

5. Lakukan hal yang sama pada larutan Standar 1-5

E. Pembacaan Absorbansi protein

1. Siapkan alat spektrofotometer, cuvette, aquades, dan tissue 2. Masukkan nilai panjang gelombangnya menjadi 540

3. Baca nilai blanko (aquades), lalu dikalibrasikan menjadi 0

4. Baca nilai absorbansi protein kelima Standar dengan mencuci cuvette dengan aquades secara bergantian

5. Catat nilai Standard dan olah data Standar

6. Baca nilai absorbansi protein keenam sampel dengan mencuci cuvette dengan aquades secara bergantian, catat hasil

(39)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Responden

Responden berjumlah 6 orang, terdiri dari 2 orang laki-laki dan 4 orang perempuan dengan rerata usia 21 tahun. Data responden dalam penelitian ini tersaji dalam tabel 4.1.

Tabel 4.1 Data responden sampel penelitian Sampel Jenis Kelamin (L/P) Usia

1 L 23 tahun

2 P 20 tahun

3 P 21 tahun

4 P 20 tahun

5 P 21 tahun

6 L 19 tahun

Keenam responden telah memenuhi kriteria inklusi dan menyetujui menjadi responden dalam form informed consent yang ada di lampiran 1.

4.2 Penentuan Kadar Protein

(40)

Seperti yang telah dijelaskan di tinjauan pustaka, nilai absorbansi merupakan

jumlah photons (cahaya) yang dapat diabsorpsi. Sedangkan untuk mencari nilai

konsentrasinya memerlukan rumus dari standar yang telah ditentukan.

4.3 Penentuan Absorbansi Larutan Standar Protein

Setelah panjang gelombang maksimum ditentukan (540 ), maka selanjutnya menentukan absorbansi larutan standar yang telah dibuat untuk menentukan persamaan garis regresi linear standar. Data yang diperoleh ialah sebagai berikut:

Tabel 4.2 Absorbansi larutan standar

4.4 Penentuan Persamaan Garis Regresi Linear Standar

Analisis regresi (regression analysis) merupakan cara untuk membentuk persamaan dan menggunakan persamaan tersebut sebagai perkiraan atau prediksi. Analisis regresi diperlukan untuk mendapatkan hubungan fungsional antara dua variabel atau lebih. Hubungan fungsional antara satu variabel prediktor dengan satu variabel kriteriumnya, seperti pada penelitian ini, disebut analisis regresi sederhana (tunggal). Penentukan persamaan garis regresi linear standar dapat menggunakan rumus:

NO. DILUSI STANDAR ABSORBANSI

(41)

Y = variabel tak bebas (dependent variable) a = kemiringan kurva linier (slope)

x = variabel bebas (independent variable)

b = titik potong kurva terhadap sumbu Y (intercept)

Setelah memasukkan data absorbansi larutan standar ke dalam kurva dan diolah dengan rumus tersebut, maka penentuan kurva standar yang diperoleh, yaitu:

Gambar 4.2 Kurva standar protein

Dari pengolahan kurva standar protein tersebut dapat disimpulkan bahwa persamaan garis regresi linear standar :

(42)

Hasilnya mendekati angka 1 atau dapat di interpretasikan sebagai korelasi positif. Korelasi positif bermakna apabila terdapat perubahan pada variabel yang satu, maka akan diikuti dengan perubahan variabel lain dengan arah yang sama atau berbanding lurus.

4.5 Penentuan Absorbansi Larutan Sampel

Penentuan absorbansi larutan sampel diperoleh dengan menggunakan larutan sampel PRP-1, baik kontrol positif maupun negatif. Larutan tersebut dibaca absorbansinya melalui alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 (sama seperti penilaian absorbansi pada larutan standar). Data absobansi larutan sampel disajikan pada tabel 4.3 berikut.

Tabel 4.3 Absorbansi larutan sampel

Responden PRP 1 ABSORBANSI

Ca (-)

4.6 Penentuan Konsentrasi Sampel

Berdasarkan data absorbansi larutan sampel yang telah dituliskan pada tabel 4.3, maka konsentrasi sampel dapat ditentukan dengan memasukkan data absorbansi tersebut ke dalam persamaan garis regresi linear larutan standarnya.

(43)

Jika persamaan garis regresi linearnya adalah : y = 0,0227x + 0,1074

dan y = absorbansi sampel maka, x = y-b

a

Contoh perhitungan pada sampel 1 Ca: x = 0,144 – 0,1074

0,0227 x = 1,61233

Setelah semua data dihitung menggunakan persamaan garis regresi linear di atas, maka hasil dari konsentrasi sampel disajikan pada tabel 4.4 berikut.

Tabel 4.4 Konsentrasi protein larutan sampel

Responden PRP 1

Rata-Rata 1.17915 0.46549

(44)

Grafik 4.1 Perbandingan PRP-2 yang teraktivasi dengan konsentrasi growth factor di dalamnya

Sumber : Amable PR et al, 2013

Pada penelitian Amable et al (2013) dikatakan bahwa tingkat konsentrasi

growth factors pada PRP-2 yang diaktivasi oleh kalsium klorida (CaCl2) lebih tinggi jika dibandingkan dengan PRP-2 yang diaktivasi oleh trombin, atau kombinasi keduanya1. Hasil penelitian Amable et al tersebut semakin menguatkan hipotesis penelitian di awal mengenai efektivitas kalsium klorida (CaCl2) terhadap

(45)

Grafik tingkat konsentrasi protein pada PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2) dan kontrolnya dapat dilihat di bawah ini:

Grafik 4.2 Perbandingan konsentrasi protein pada kedua kontrol

Berdasarkan grafik tersebut, rerata perbedaan tingkat konsentrasi protein antara PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2) dan kontrolnya ialah 0,02283. Perbedaan tingkat konsentrasi protein keduanya yang tidak terlalu jauh ini (bila dibandingkan dengan jurnal rujukan) kemungkinan dikarenakan kesalahan dalam pengambilan sampel PRP-1, perbedaan tipe alat sentrifugasi yang digunakan, alat spektrofotometer yang belum pernah dikalibrasikan, dan perbedaan letak geografis darah sampel jika dibandingkan dengan sampel jurnal rujukan. Namun setelah di uji statistik dengan SPSS, hasil p value dari perbedaan konsentrasi antara kontrol positif dan kontrol negatif tersebut ialah 0,001, yang menandakan nilai tersebut cukup bermakna (p < 0,005).

Dalam mekanisme kerja PRP, platelet mengeluarkan banyak alpha granules

(46)

granules dalam menghasilkan growth factors, seperti platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth-factor beta (TGF-b), vascular endothelial growth factors (VEGF), insulin-like growth factor (IGF), epidermal growth factor

(EGF), dan epithelial cell growth factor (ECGF). Pengaruh utama PRP ialah diperoleh dari PDGF yang telah diidentifikasi sebagai protein penting dalam hard and soft-tissue healing26.

(47)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat peningkatan konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2).

2. Tingkat konsentrasi protein Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2) memiliki nilai lebih tinggi (1,17915) dibandingkan dengan kontrol negatifnya (0,46549).

3. Protokol pembuatan Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2) telah tersusun untuk mendapatkan hasil yang optimal (lampiran 2).

5.2 Saran

1. Dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai perbandingan efektifitas kalsium klorida pada PRP-1 dan PRP-2 sebagai tata laksana medis yang optimal.

2. Dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai jenis protein yang terkandung dalam PRP-1.

(48)

DAFTAR PUSTAKA

1. Amable PR et al. Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors.

Stem Cell Res. 2013: p. 1-13.

2. Cassie D. Platelets. Departement of Biostatistic & Epidemiology College of Public Health OUHSC. 2011.

3. Ferrari M, et al. A new technique for hemodilution, preparation of autologous platelet-rich plasma, and intraoperative blood salvage in cardiac surgery. Int J Artif Organs. 1987 Jan: p. 47-50.

4. Mueller TD, et al. Biochim biophys acts. 2002: p. 237-50.

5. Mazzucco L, Balbo V, Cattana E, Guaschino R, Borzini P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-kit, Plateltex, and one manual procedure. Vox Sang; 2009. p. 110-18.

6. Hoffbrand AV, Moss PAH. Kapita Selekta Hematologi, edisi 6. EGC; 2013. p. 294-304.

7. Graziani, et al. The in vitro effect of different PRP concentration on osteoblasts and fibroblasts. Clin Oral Implants Res. 2006 Apr 17: p. 212. 8. Smith C, et al. The inflammatory response to skeletal muscle injury:

illuminating complexities. Am J Sports Med. 2008: p. 947.

9. Tidball JG, Wehling HM. Machropages promote muscle membrane repair and muscle fibre growth and regeneration during modified muscle loading in mice in vivo. J Physiol. 2007 Jan 1: p. 327.

10.Dohan et al. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucoyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends in Biotechnology. 2009: p. 158-167.

11.Scott A, Khan KM, Roberts CR, et al. What Do We Mean by the Term Inflammation?. Br J Sports Med, vol. 38 no. 3. 2004: p. 372-380.

(49)

13.Sundman EA, Cole BJ, & Fartier LA. Growth Factor and Catabolic Cytokine Concentrations are Influenced by the Cellular Composition of Platelet Rich Plasma. Am J Sports Med, vol. 39 no. 10. 2011: p. 2135-2140.

14.Han B, Woodell-May J, Ponticiello M, Yang Z, Nimm M. The Effect of Thrombin Activation of Platelet Rich Plasma on Demineralized Bone Matrix Osteoinductivity. J Bone Joint Surg Am 2009: p. 1459-1470. 15.Atkins, et al. Physical Chemistry for the Life Sciences. New York: Oxford

University Press, 2006.

16.Gore, Michael. Spectrophotometry & Spectrofluorimetry. New York:

Oxford University Press; 2000.

17.Bradford, MM. A Rapid and Sensitive for the Quantitation of Microgram Quantitites of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 2006: p. 248-254.

18.Foster TE, Puskas BL, Mandelbaum BR, Gerhardt MB, & Rodeo SA. Platelet Rich Plasma: From Basic Science to Clinical Applications. Am J Sports Med 2009: p. 2259-2272.

19.Santos F, Martinez MD. Practical Guidelines for Using PRP in the Orthopaedic Office, American Academy of Orthopaedic Surgeons. US: 2010.

20.Poedjadi A. Biokimia. Jakarta: UI-Press; 2005.

21.El-Sharkawy H, Kantarci A, et al. Platelet-Rich Plasma: Growth Factors and Pro- and Anti-Inflammatory Properties. J Periodontal 2007: p. 661-669.

22.McCarrel TM, Minas T, Fortier LA. Optimization of Leukocyte Concentration in Platelet-Rich Plasma for the Treatment of Tendinopathy.

J Bone Joint Surg Am 2012: p. 1–8.

23.Sherwood, Lauralee. Fisiologi Manusia: Dari Sel ke Sistem. Jakarta: EGC; 2012.

(50)

25.Nikolidakis D, Jansen JA. The Biology of Platelet-Rich Plasma and It’s Application in Oral Surgery: Literature Review. Tissue Engineering Part B 2008: p. 249-258.

26.Yang D, Cheng J, Jing Z, Jin D. Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)-AA: A Self-Imposed Cytokine in the Proliferation of Human Fetal Osteoblasts. Cytokine 2000. P.1271-1274.

(51)

Lampiran 1 Lembar Informed Consent Formulir Informed Consent

TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA-1

(PRP-1) YANG DIINDUKSI KALSIUM KLORIDA

Setelah memperoleh kejelasan mengenai tujuan, manfaat, prosedur dan kemungkinan resiko, serta jawaban atas pertanyaan yang diberikan oleh peneliti dalam penelitian TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA-1 (PRP-1) YANG DIINDUKSI KALSIUM KLORIDA, maka saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama :

Alamat :

Jurusan :

Semester :

Dengan ini menyatakan dengan penuh kesadaran bersedia berpartisipasi dalam penelitian tersebut dan bersedia diambil darah vena sebanyak 3 ml sesuai dengan prosedur yang telah ditetapkan dalam penelitian TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA-1 (PRP-1) YANG DIINDUKSI KALSIUM KLORIDA. Selanjutnya, bila suatu ketika, dalam masa penelitian, saya merasa dirugikan karena penelitian ini, saya berhak mengundurkan diri dari keterlibatan saya, serta membatalkan persetujuan ini, tanpa sanksi apapun dan dari pihak manapun.

Jakarta, ……….. 2015

Responden Peneliti

(52)

Lampiran 2 Protokol Pembuatan Platelet Rich Plasma-1 yang Diinduksi Kalsium Klorida

Mengambil darah vena sampel sebanyak 3 ml

Memasukkannya ke tabung darah sitrat

Membagi darah sampel menjadi 2 (masing-masing 1,5ml ke tube)

Sentrifugasi tube dengan kecepatan 1.800rpm, 5

menit, dan 180C

Ambil 0,5-1ml lapisan paling atas (PRP-1) dari keduanya

dengan menggunakan mikropipet

Ambil 270 l PRP-1 dari tube 1 ke tube lainnya, tambahkan