SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 201
KUALITAS DAN FERTILITAS SPERMATOZOA AYAM LOKAL
DALAM PENGENCER SEMEN YANG DISUPLEMENTASI
MONOSAKARIDA DAN MINYAK ZAITUN
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Kualitas dan Fertilitas Spermatozoa Ayam Lokal dalam Pengencer Semen yang Disuplementasi Monosakarida dan Minyak Zaitun” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Khaeruddin
RINGKASAN
KHAERUDDIN. Kualitas dan Fertilitas Spermatozoa Ayam Lokal dalam Pengencer Semen yang Disuplementasi Monosakarida dan Minyak Zaitun. Dibimbing oleh CECE SUMANTRI, SRI DARWATI, dan RADEN IIS ARIFIANTINI.
Inseminasi buatan (IB) dapat meningkatkan produktivitas ayam jantan. Salah satu faktor yang dapat menentukan keberhasilan IB pada ayam adalah kualitas semen yang diinseminasikan. Kualitas semen tersebut bergantung pada proses penyimpanan (preservasi), sehingga diperlukan suatu bahan pengencer semen yang dapat menjamin keberlangsungan hidup spermatozoa selama preservasi. Tujuan dari penelitian ini adalah mencari jenis monosakarida dan level minyak zaitun terbaik dalam pengencer ringer laktat kuning telur yang dapat mempertahankan kualitas spermatozoa ayam lokal.
Penelitian ini terdiri atas 3 tahapan, yaitu (I) Pengujian jenis monosakarida pada bahan pengencer terhadap kualitas spermatozoa ayam silangan sentul kampung (SK) (II) Penentuan level/konsentrasi minyak zaitun ekstra virgin terhadap kualitas spermatozoa ayam SK (III) Uji fertilitas dan periode fertil spermatozoa ayam sentul, kampung, dan SK dengan menggunakan pengencer yang disuplementasi monosakarida dan minyak zaitun.
Semen dikoleksi menggunakan metode pemijatan. Sumber semen yang digunakan untuk penelitian tahap I dan II berasal dari ayam SK sedangkan pada tahap III berasal dari tiga jenis ayam yaitu sentul, kampung, dan SK. Penelitian tahap I menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur menggunakan jenis monosakarida (glukosa, fruktosa, xilosa, dan manosa) sebagai perlakuan. Penelitian tahap II menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur yang disuplementasi monosakarida terbaik dari penelitian tahap I, suplementasi berbagai level minyak zaitun (0%, 4%, 6%, 8%, dan 10%) dijadikan perlakuan. Penelitian tahap III menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur yang disuplementasi monosakarida terbaik pada penelitian tahap I dan level minyak zaitun terbaik pada tahap II, selanjutnya diinseminasikan ke ayam betina.
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 12 kali ulangan (tahap I dan II) dan 3 kali ulangan (tahap III). Data dianalisis ragam (ANOVA), selanjutnya apabila ditemukan perbedaan antar perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan. Parameter yang diamati pada penelitian tahap I dan II adalah motilitas dan viabilitas spermatozoa, sedangkan fertilitas dan periode fertil spermatozoa diamati pada penelitian tahap III.
karena komposisi pengencer dan monosakarida yang digunakan sudah menunjang daya hidup spermatozoa tersebut.
Hasil penelitian tahap II menunjukkan bahwa suplementasi minyak zaitun 8% menghasilkan motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK lebih baik dari yang lain selama 60 jam penyimpanan, sehingga yang menjadi acuan pada penelitian tahap III adalah penggunaan pengencer ringer laktat kuning telur yang disuplementasi fruktosa dan minyak zaitun 8%. Minyak zaitun mengandung senyawa fenolik berupa hydroxytyrosol dan oleuropein yang diduga menghambat peroksidasi lipid sehingga dapat dijadikan antioksidan spermatozoa sehingga motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK lebih tinggi dengan penambahan minyak zaitun.
Hasil penelitian tahap III menunjukkan bahwa fertilitas spermatozoa ayam SK lebih rendah (17.49%) dari fertilitas spermatozoa ayam sentul dan ayam kampung (55.88%-73.81%). Perbedaan ini kemungkinan disebabkan efek heterosis negatif yang diturunkan dari ayam sentul dan ayam kampung kepada hasil silangan keduanya. Periode fertil spermatozoa ketiga jenis ayam lokal tidak berbeda yang berada pada kisaran 12.67-15.67 hari.
Kesimpulan penelitian ini yaitu keempat jenis monosakarida dapat digunakan dalam pengencer semen ayam SK selama 60 jam penyimpanan. Suplementasi 8% minyak zaitun dalam pengencer efektif mempertahankan kualitas semen ayam SK selama 60 jam penyimpanan. Fertilitas spermatozoa ayam SK lebih lebih rendah dari kedua tetuanya, sedangkan periode fertil spermatozoa tidak berbeda dengan kedua tetuanya.
SUMMARY
KHAERUDDIN. Quality and Fertility of Local Chicken Spermatozoa in Semen Diluent Supplemented with Monosaccharide and Olive Oil. Supervised by CECE SUMANTRI, SRI DARWATI, and RADEN IIS ARIFIANTINI.
Artificial insemination (AI) can improve the productivity of a chicken. One of the factors that can determine the success of the AI in chickens are semen quality. The semen quality depends on the process of storage (preservation), therefore the need of semen diluent that can ensure the survival of spermatozoa for preservation. The aim of this study was to find the best monosaccharide and level of olive oil in ringer's lactate yolk diluent that could maintain the quality of local chicken spermatozoa.
This research consisted of three stage, namely (I) Examination different monosaccharides on semen diluent to sentul kampung crossbreed (SK) spermatozoa motility and viability, (II) Determination of the level/concentration of extra virgin olive oil on the quality of SK chicken spermatozoa, and (III) Examination spermatozoa fertility and fertile period of sentul, kampung, and SK chicken by using a ringer lactate diluent supplemented with monosaccharides and olive oil.
Semen was collected using the massage method. Source of semen was used for the first and the second stage coming from SK chicken while the third stage coming from three breeds of chicken, namely sentul, kampung, and SK. The first stage using ringer's lactate egg yolk diluent supplemented with different monosaccharides (glucose, fructose, xylose, and mannose) as a treatment. The
second stage using ringer’s lactate egg yolk diluent supplemented with the best
monosaccharides from stage I, supplementation with different levels of olive oil (0%, 4%, 6%, 8%, and 10%) used as a treatment. The third stage was fertility test of the best diluent from two previous study by artificial insemination in to hens.
This study used a completely randomized design (CRD) method with 12 repetitions (the first and the second stage) and 3 repetitions (the third stage). Data analyzed used analysis of variance (ANOVA), then if found differences between treatment continued with Duncan test. The parameters were observed in the first stage and the second stage is spermatozoa motility and viability, while fertility and fertile period spermatozoa were observed in the third stage.
The results of the first stage showed no difference on the monosaccharides; glucose, fructose, xylose, and mannose on motility and viability of SK chicken spermatozoa during 60 hours of storage. Descriptively motility and viability of
spermatozoa in ringer’s lactate supplemented with fructose higher than other.
Base on our finding on the first stage, fructose was choose as energy source for the second stage. Liquid semen was good quality in this research, it can be seem on the spermatozoa motility was stored during 60 hour between 48.3% to 55.42% with viability between 58.59% to 64.83%. The high quality of chicken liquid semen in this research was caused by the composition of the diluent and monosaccharide used could support the vitality of the spermatozoa.
diluent supplemented with fructose and 8% of olive oil was used in the third stage. Olive oil contains a phenolic compound such as hydroxytyrosol and oleuropein which was thought to inhibit lipid peroxidation that could be used as spermatozoa antioxidants, that explain why motility and viability of SK chicken spermatozoa was higher when added with olive oil.
The results of the third stage in this research showed that spermatozoa fertility of SK chicken was lower (17.49%) than sentul and kampung chicken (55.88%-73.81%). This difference was likely due to the negative heterosis effect was derived from sentul chicken and kampung chicken to the result of crosses between the two parent stocks. Spermatozoa fertile period were not different between three breed of local chicken which was in the range 12.67-15.67 days.
This research concluded that monosaccharides (glucose, fructose, xylose, and mannose) can be used for SK chicken semen diluent during 60 hours of storage. Supplementation of 8% olive oil in ringer’s lactate egg yolk diluent effectively maintain SK semen during 60 hours of storage. Fertility of SK chicken spermatozoa is lower than parent stock, but no difference on the fertile period.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
KHAERUDDIN
KUALITAS DAN FERTILITAS SPERMATOZOA AYAM LOKAL DALAM
PENGENCER SEMEN YANG DISUPLEMENTASI MONOSAKARIDA
PRAKATA
Bismillah, segala puji hanya bagi Allah Rabb semesta alam. Semoga shalawat dan salam senantiasa tercurah atas Rasulullah, beserta keluarga dan para sahabatnya, serta orang-orang yang mengambil tuntunan dengan petunjuk beliau hingga hari pembalasan. Syukur penulis ucapkan atas nikmat dan karunia Allah Subhanahu wa ta’ala sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan dengan judul yang dipilih dalam penelitian yaitu Kualitas dan Fertilitas Spermatozoa Ayam Lokal dalam Pengencer Semen yang Disuplementasi Monosakarida dan Minyak Zaitun. Jika kita melihat judul ini, sejenak kita akan teringat dengan salah satu
ayat dalam Al Qur’an yaitu surah An-Nur (24:35) yang berbunyi ; “…yang dinyalakan dengan minyak dari pohon yang diberkahi. Yaitu pohon zaitun yang tumbuh tidak di sebelah timur dan tidak pula di sebelah barat. Minyaknya saja
hampir-hampir menerangi walaupun tidak disentuh api”.
Terima kasih penulis sampaikan kepada segenap pembimbing yaitu, Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc, Dr Ir Sri Darwati, MSi, dan Prof Dr Dra R. Iis Arifiantini, MSi, serta penguji sidang yaitu drh Ni Wayan Kurniani Karja MP, PhD. Ucapan terima kasih tak lupa penulis ucapkan kepada Ibunda dan Ayahanda tercinta (Rosmaniar dan Muh Jufri) atas semua kebaikan, do’a, kasih sayang, dan motivasinya. Penulis juga mengucapkan jazakumullahu khair kepada Junaedi, beliau adalah teman sekaligus sahabat baik yang telah memberikan arahan dan semangat dalam penelitian ini, di samping itu beliau juga memberikan nasehat-nasehat dan motivasinya untuk menuntut ilmu agama sehingga dapat berpegang
teguh pada Al Qur’an dan As Sunnah. Kepada semua pihak yang telah membantu penelitian ini, penulis sampaikan ucapan terima kasih, Nu’man Hidayat, Muktakin, Pak Dadang, dan Pak Bondan beserta Staf Sekretariat Pascasarjana IPB, Staf Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi IPB, dan kepada teman-teman Mahasiswa IPB terima kasih atas segenap bantuannya.
Akhirnya, penulis mempersembahkan karya tulis ini kepada pembaca semoga bisa menambah wawasan, meskipun karya ilmiah ini dibuat dengan baik namun masih memiliki beberapa kekurangan, untuk itu kami memohon maaf atas kesalahan-kesalahan terkait karya tulis ini. Semoga Allah Subhanahu wa ta’ala mengampuni kita semua. Amiin ya Rabb.
Bogor, Agustus 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL xvi
DAFTAR GAMBAR xvii
DAFTAR LAMPIRAN xvii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 3
Manfaat Penelitian 3
Ruang Lingkup Penelitian 3
MATERI DAN METODE 4
Waktu dan Tempat Penelitian 4
Materi Penelitian 4
Metode Penelitian 4
Rancangan Percobaan 7
HASIL DAN PEMBAHASAN 8
Karakteristik Semen Segar Ayam Sentul, Kampung, dan SK 8 Kualitas Semen Ayam SK dalam Pengencer Ringer Laktat Kuning
Telur dengan Berbagai Monosakarida pada Suhu 5 oC 9 Kualitas Semen Ayam SK dalam Pengencer Ringer Laktat Kuning
Telur dengan Berbagai Level Minyak Zaitun Ekstra Virgin pada
Suhu 5 oC 14
Fertilitas dan Periode Fertil Spermatozoa Ayam Sentul, Kampung,
dan SK 20
SIMPULAN 22
DAFTAR PUSTAKA 22
DAFTAR TABEL
1 Komposisi bahan pengencer dengan berbagai monosakarida 4 2 Komposisi bahan pengencer dengan berbagai level minyak zaitun
ekstra virgin 6
3 Komposisi bahan pengencer ringer laktat kuning telur yang
disuplementasi monosakarida dan minyak zaitun 6
4 Karakteristik semen segar ayam sentul, kampung, dan SK 9 5 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen
terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 12
jam penyimpanan 10
6 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 24
jam penyimpanan 10
7 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 36
jam penyimpanan 10
8 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 48
jam penyimpanan 11
9 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 60
jam penyimpanan 11
10 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 12
jam penyimpanan 15
11 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 24
jam penyimpanan 15
12 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 36
jam penyimpanan 15
13 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 48
jam penyimpanan 16
14 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 60
jam penyimpanan 16
15 Fertilitas dan periode fertil spermatozoa ayam sentul, kampung, dan SK dengan menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur +
DAFTAR GAMBAR
1 Beberapa bentuk abnormalitas spermatozoa pada ayam SK 9 2 Grafik penurunan persentase motilitas spermatozoa selama
penyimpanan dengan berbagai monosakarida 12
3 Grafik penurunan persentase viabilitas spermatozoa selama
penyimpanan dengan berbagai monosakarida 13
4 Grafik penurunan persentase motilitas spermatozoa selama
penyimpanan dengan berbagai level minyak zaitun 17 5 Grafik penurunan persentase viabilitas spermatozoa selama
penyimpanan dengan berbagai level minyak zaitun 18
DAFTAR LAMPIRAN
1 Dokumentasi penelitian 28
2 Hasil uji T karakteristik semen segar ayam SK, sentul, dan kampung 29 3 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai
monosakarida terhadap motilitas spermatozoa ayam SK 29 4 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai
monosakarida terhadap penurunan motilitas spermatozoa ayam SK 30 5 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai
monosakarida terhadap viabilitas spermatozoa ayam SK 31 6 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai
monosakarida terhadap penurunan viabilitas spermatozoa ayam SK 32 7 Hasil uji Duncan pengaruh suplementasi berbagai monosakarida
terhadap penurunan viabilitas spermatozoa ayam SK 33 8 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai
level minyak zaitun terhadap motilitas spermatozoa ayam SK 34 9 Hasil uji Duncan pengaruh suplementasi berbagai level minyak
zaitun terhadap motilitas spermatozoa ayam SK 35
10 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai level minyak zaitun terhadap penurunan motilitas spermatozoa ayam
SK 36
11 Hasil uji Duncan pengaruh suplementasi berbagai level minyak
zaitun terhadap penurunan motilitas spermatozoa ayam SK 37 12 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai
level minyak zaitun terhadap viabilitas spermatozoa ayam SK 38 13 Hasil uji Duncan pengaruh suplementasi berbagai level minyak
zaitun terhadap viabilitas spermatozoa ayam SK 39
14 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh suplementasi berbagai level minyak zaitun terhadap penurunan viabilitas spermatozoa
ayam SK 40
15 Hasil uji Duncan pengaruh suplementasi berbagai level minyak
16 Hasil analisis ragam (ANOVA) pengaruh bangsa ayam terhadap
fertilitas dan periode fertil spermatozoa 42
17 Hasil uji Duncan pengaruh bangsa ayam terhadap fertilitas dan
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu sumber plasma nutfah yang perlu dikembangkan di Indonesia adalah ayam lokal. Ayam lokal mempunyai keanekaragaman sifat genetik yang dimunculkan secara nyata dalam penampilan fenotipenya, penampilan produksi, pertumbuhan, dan reproduksinya. Ayam kampung merupakan salah satu ayam lokal yang tersebar di berbagai wilayah di Indonesia dengan tingkat keragaman yang tinggi. Ayam sentul termasuk salah satu dari 8 rumpun ayam lokal yang diidentifikasi asli dari wilayah Jawa Barat (Soeparna et al. 2005). Ayam sentul, sebagai salah satu bangsa ayam lokal yang diternakkan secara tradisional turun temurun oleh masyarakat pedesaan di Kabupaten Ciamis mempunyai potensi untuk dijadikan salah satu calon sumber bibit ayam pedaging unggul lokal di Indonesia dengan warna bulu abu-abu dan formasi tubuh yang seragam.
Salah satu cara untuk dapat meningkatkan produktivitas ayam lokal adalah dengan program persilangan. Menurut Sheridan (1986) dan Warwick et al. (1990), persilangan adalah salah satu alternatif untuk membentuk keturunan yang diharapkan akan memunculkan efek komplementer (pengaruh saling melengkapi). Falconer (1981) menyatakan bahwa selain efek komplementer, persilangan akan membentuk efek heterosis untuk meningkatkan produktivitas. Efek heterosis tersebut nilainya bisa bersifat positif, dapat pula bersifat negatif. Efek heterosis positif yaitu rata-rata penampilan suatu karakter keturunan hasil persilangan melebihi rata-rata penampilan kedua tetuanya, sedang efek heterosis negatif adalah rata-rata penampilan suatu karakter keturunan hasil persilangan lebih rendah dari rata-rata penampilan kedua tetuanya. Johnson dan Rendel (1968)
menyatakan bahwa heterosis biasanya ditunjukkan oleh peningkatan fertilitas, laju pertumbuhan, produksi telur, dan dewasa kelamin lebih awal. Menurut Warwick
et al. (1990), semakin tinggi nilai heterosis maka semakin tinggi peningkatan
produktivitas hasil persilangan yang dapat diharapkan.
Seiring dengan meningkatnya permintaan masyarakat terhadap daging ayam lokal menyebabkan penurunan populasi ayam lokal di Indonesia. Kondisi tersebut menyebabkan perlunya dilakukan upaya pengembangan dan pelestarian ayam-ayam lokal yang ada untuk memenuhi permintaan pasar di Indonesia. Salah satunya dengan manajemen pengawinan yang baik. Saat ini ayam lokal yang dipelihara peternak umumnya dikembangbiakkan secara alami melalui pengawinan alam. Hanya sedikit campur tangan peternak pada sistem pengawinan ayam lokal. Sistem pengawinan alam pada pemeliharaan ayam menimbulkan berbagai masalah seperti peluang terjadinya inbreeding relatif tinggi sehingga dapat menurunkan performa produksi ayam tersebut, masalah lainnya adalah perbedaan bobot tubuh antara ayam jantan dan betina, dan adanya sifat pejantan yang kurang agresif. Pada pengawinan alam satu jantan hanya bisa mengawini 7-14 ekor betina (Etches 1996) dengan kualitas semen yang berbeda oleh karena itu perlu dilakukan teknologi inseminasi buatan (IB) untuk meningkatkan produktivitas ayam lokal jantan dengan cara mengoptimalkan penggunaan pejantan dalam mengawini betina.
bahan pengencer yang digunakan, dan termasuk sumber energi untuk spermatozoa. Sumber energi yang dapat digunakan secara luas pada spermatozoa adalah karbohidrat sederhana. Karbohidrat sederhana berupa monosakarida seperti glukosa, fruktosa, xilosa, dan manosa lebih efektif dalam mempertahankan motilitas spermatozoa dibandingkan disakarida.
Selama penyimpanan, spermatozoa mengalami serangan radikal bebas (oksidan) yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel, oleh karena itu dalam proses penyimpanan semen perlu ditambahkan suatu bahan yang dapat menanggulangi radikal bebas yaitu antioksidan. Menurut Feradis (2010), radikal bebas sangat reaktif dan dapat bereaksi dengan asam lemak tak jenuh. Mekanismenya dimulai dari satu atom hidrogen dilepaskan sehingga menghasilkan radikal lipid bebas yang kemudian bereaksi dengan lipid peroksida atau endoperoksida.
Membran plasma spermatozoa kaya akan asam lemak tak jenuh sehingga rentan terhadap kerusakan yang disebabkan peroksidasi lipid (Blesbois et al. 1997). Peroksidasi lipid yang berkepanjangan merusak struktur matrik lipid dan menyebabkan instabilitas pada membran. Peningkatan kerusakan pada sistem non membran juga dapat terjadi, selain itu spermatozoa tidak dapat melakukan biosintesis untuk memperbaiki kerusakan, sehingga dapat menyebabkan perubahan pada fungsi spermatozoa (Feradis 2010).
Peroksidasi lipid dapat diatasi dengan cara melindungi membran sel spermatozoa oleh antioksidan. Semen mengandung beberapa antioksidan secara alami seperti enzim glutation peroksidase, superoksida dismutase, dan katalase serta beberapa antioksidan lain seperti vitamin A, C, E, asam urat, glutation, dan karotenoid (Breque et al. 2003; Cerolini et al. 2006; Partyka et al. 2012a). Namun, aktifitas beberapa antioksidan ini berkurang selama penyimpanan, seperti aktivitas enzim katalase pada semen ayam berkurang setelah kriopreservasi hingga 14% demikian juga dengan aktifitas superoksida dismutase (Partyka et al. 2012b). Hal ini menandakan bahwa antioksidan alami tersebut tidak sepenuhnya dapat mencegah efek negatif dari peroksidasi lipid spermatozoa unggas yang terjadi selama penyimpanan, untuk mengatasi hal tersebut diperlukan penambahan antioksidan dari luar yang mampu menghambat peroksidasi lipid selama penyimpanan in vitro.
Minyak zaitun merupakan salah satu antioksidan eksogen yang memiliki banyak manfaat. Minyak zaitun mengandung gugus phenol yang terdiri atas struktur cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil. Semakin banyak gugus hidroksil yang terkandung dalam gugus phenol menunjukkan kemampuan antioksidan yang lebih baik (Vissers et al. 2004). Salah satu jenis minyak zaitun yang sering dikonsumsi adalah minyak zaitun ekstra virgin. Minyak ini berasal dari buah zaitun yang pertama kali diproses sehingga tidak banyak kandungan gizi yang hilang serta mengandung sejumlah polifenol dengan kadar yang lebih tinggi dari minyak zaitun yang telah beberapa kali diproses/refined olive oil (Vossen 2007) dengan kandungan paling sedikit dua gugus hidroksil (Vissers et al. 2004).
dilaksanakan dengan harapan dapat digunakan dalam pengembangan teknologi IB pada ayam di Indonesia.
Tujuan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan:
1. Menguji jenis monosakarida terbaik dalam pengencer yang dapat mempertahankan kualitas spermatozoa ayam lokal;
2. Menentukan level minyak zaitun yang paling baik dalam pengencer mempertahankan kualitas semen ayam lokal; dan
3. Membandingkan fertilitas dan periode fertil spermatozoa ayam silangan dengan tetuanya.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menemukan bahan pengencer baru yang dapat mengoptimalkan penyimpanan semen cair khususnya pada semen ayam di Indonesia.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi kajian pemanfaatan monosakarida sebagai sumber energi spermatozoa dalam pengencer semen ayam. Pengencer dengan monosakarida terbaik selanjutnya ditambahkan berbagai level minyak zaitun. Kombinasi monosakarida dan level minyak zaitun terbaik dalam pengencer selanjutnya digunakan untuk inseminasi buatan hingga menentukan fertilitas spermatozoa tersebut, sehingga penelitian dibagi atas 3 tahapan yaitu:
1. Tahap 1: menguji jenis monosakarida terbaik dalam pengencer ringer laktat kuning telur yang dapat mempertahankan kualitas spermatozoa ayam silangan sentul kampung (SK) selama penyimpanan.
2. Tahap 2: mencari level minyak zaitun ekstra virgin terbaik dalam pengencer ringer laktat kuning telur + monosakarida yang dapat mempertahankan kualitas spermatozoa ayam SK selama penyimpanan.
3. Tahap 3: menguji fertilitas spermatozoa ayam sentul, kampung, dan SK dalam pengencer ringer laktat kuning telur + monosakarida + minyak zaitun.
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei 2014 sampai dengan bulan September 2014 di Laboratorium Lapangan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Materi Penelitian
pada kandang individu ukuran 40 x 50 x 70 cm dan diberi pakan komplit berupa crumble untuk ayam petelur dengan kandungan protein kasar 17%, serat kasar 6%, abu 14%, fosfor 0.6%-1%, dan kalsium 3%-4.2% sebanyak 150 g ekor-1 hari-1 serta air minum diberikan ad libitum.
Tahap 1: Pengujian Jenis Monosakarida dalam Pengencer Semen Ayam terhadap Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa Ayam SKPenyiapan
Pengencer
Bahan pengencer menggunakan buffer ringer laktat (PT Widatra Bhakti) dan kuning telur 10% (RLKT). Ringer laktat kuning telur dihomogenkan menggunakan stirer selama 5 menit kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3 000 rpm. Supernatan digunakan sebagai pengencer dasar dan di-ajust dengan tris (tris hydroxymethyl aminomethane) untuk mendapatkan pH 6.8.
Tabel 1 Komposisi bahan pengencer dengan berbagai monosakarida
Unsur pokok RLKTGa RLKTF RLKTX RLKTM Komposisi monosakarida berdasarkan pengencer van Wambeke (Etches 1996).
Bahan pengencer yang digunakan ada 4 macam, yaitu RLKT+ Glukosa (RLKTG), RLKT + Fruktosa (RLKTF), RLKT + Xilosa (RLKTX), dan RLKT + Manosa (RLKTM). Komposisi pengencer disajikan pada Tabel 1.
Koleksi dan Evaluasi Semen
Koleksi semen menggunakan metode pemijatan sebanyak 3 kali seminggu. Semen yang telah dikoleksi, dievaluasi di laboratorium secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi makroskopis dilakukan terhadap volume, pH, konsistensi, dan warna.
pandang. (4) konsentrasi spermatozoa; diamati dengan menggunakan counting
chamber dan larutan formol saline. (5) persentase abnormalitas spermatozoa;
diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 10 x 100. Semen yang menunjukkan motilitas spermatozoa lebih dari 70% dengan konsentrasi spermatozoa minimal 2 500 x 106 mL-1 digunakan pada penelitian ini.
Pengolahan, Penyimpanan, dan Pengamatan Semen Cair
Semen dibagi ke dalam 4 tabung dan masing-masing diencerkan menggunakan pengencer RLKTG, RLKTF, RLKTX atau RLKTM. Semen cair selanjutnya disimpan dalam refrigerator (5 oC). Pengamatan kualitas semen cair dilakukan terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa pada jam ke-0, 12, 24, 36, 48, dan jam ke-60.
Tahap 2: Penentuan Level/Konsentrasi Minyak Zaitun Ekstra Virgin dalam Pengencer Semen Ayam terhadap Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa
Ayam SK
Penyiapan Pengencer
Prosedur pembuatan pengencer dasar sama dengan tahap 1 dengan menggunakan salah satu monosakarida sebagai sumber energi. Bahan pengencer selanjutnya ditambahkan berbagai level minyak zaitun ekstra virgin (Burcino, Turki) dengan komposisi yang disajikan pada Tabel 2.
Koleksi dan Evaluasi Semen
Koleksi dan evaluasi semen menggunakan metode yang sama dengan penelitian tahap 1.
Pengolahan, Penyimpanan dan Pengamatan Semen Cair
Semen dibagi ke dalam 5 tabung masing-masing diencerkan menggunakan pengencer P0, P1, P2, P3 atau P4. Semen cair selanjutnya disimpan dalam
refrigerator (5 oC). Pengamatan kualitas semen cair dilakukan terhadap motilitas
dan viabilitas spermatozoa pada jam ke-0, 12, 24, 36, 48, dan jam ke-60.
Tahap 3: Uji Fertilitas dan Periode Fertil Spermatozoa Ayam Lokal dengan Menggunakan Pengencer yang Disuplementasi Monosakarida dan Minyak
Zaitun.
Penyiapan Pengencer
Prosedur pembuatan pengencer dasar sama dengan tahap 1 dengan menggunakan salah satu monosakarida sebagai sumber energi dan minyak zaitun sebagai antioksidan. Komposisi pengencer disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi bahan pengencer ringer laktat kuning telur yang disuplementasi monosakarida dan minyak zaitun
Unsur pokok Jumlah
Minyak zaitun ekstra virgin (mL)a Monosakarida (g)b
Penisillin (IU mL-1) Streptomisin (mg mL-1)
* 0.201 1 000
1
Pengencer dasar (mL) ad 10
a
Level minyak zaitun yang digunakan adalah level terbaik dari tahap 2. bJenis monosakarida terbaik dari tahap 1.
Koleksi dan Evaluasi Semen
Koleksi dan evaluasi semen menggunakan metode yang sama dengan penelitian tahap 1.
Inseminasi Buatan
Semen yang telah dikoleksi dari 3 jenis ayam kemudian diencerkan menggunakan pengencer dengan komposisi pada Tabel 3. Inseminasi buatan dilakukan pada sore hari dengan menggunakan metode intra uterine menggunakan spoit 1 mL dan kateter. Ayam ras petelur yang sedang berproduksi dijadikan akseptor IB sebanyak 3 ekor sebagai ulangan per perlakuan.
Koleksi dan Penetasan Telur
Telur tetas hasil IB dikoleksi sampai hari ke-7. Telur hari pertama (1 hari setelah IB) dianggap telur infertil sedangkan telur hari kedua sampai dengan hari ke-7 dimasukkan ke dalam mesin tetas. Temperatur mesin tetas 100 oF (37.8 oC) dengan kelembaban relatif 75% hingga 80%. Telur diamati menggunakan candler pada hari keenam untuk melihat fertilitas. Telur yang fertil ditandai dengan adanya perkembangan pembuluh darah. Fertilitas telur dinyatakan dalam bentuk jumlah telur fertil, yaitu jumlah telur IB yang berhasil dibuahi oleh spermatozoa yang dihitung dengan rumus:
Fertilitas telur % =Jumlah telur tetas IB x Jumlah telur fertil %
Rancangan Percobaan
Rancangan yang digunakan untuk pengamatan semen segar adalah uji T. Bangsa ayam dijadikan perlakuan (ayam sentul, kampung, dan silangan sentul kampung [SK]) dengan 9 kali ulangan (3 individu x 3 kali penampungan) untuk ayam sentul dan kampung, serta 24 ulangan untuk ayam SK.
Tahap 1
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari perlakuan jenis pengencer (RLKTG, RLKTF, RLKTX, dan RLKTM) dengan 12 kali ulangan (3 individu x 4 kali penampungan). Data dianalisis ragam (ANOVA), selanjutnya apabila ditemukan perbedaan antar perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel dan Torrie 1994).
Tahap 2
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari perlakuan jenis pengencer (P0, P1, P2, P3, dan P4) dengan 12 kali ulangan (3 individu x 4 kali penampungan). Data dianalisis ragam (ANOVA), selanjutnya apabila ditemukan perbedaan antar perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel dan Torrie 1994).
Tahap 3
Penelitian ini menggunakan RAL yang terdiri dari 3 perlakuan bangsa ayam (sentul, kampung, dan SK) dengan 3 kali ulangan (3 individu betina yang diinseminasi masing-masing sekali). Data dianalisis sidik ragam (ANOVA), selanjutnya apabila ditemukan perbedaan antar perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel dan Torrie 1994).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Semen Segar Ayam Sentul, Kampung, dan SK Hasil uji semen segar secara makroskopis menunjukkan tidak ada perbedaan antar bangsa ayam. Ayam sentul dan ayam kampung memiliki volume semen 0.18 mL, dengan karakteristik berwarna putih susu, kental, dan pH 7.00. Ayam SK memiliki volume semen 0.16 mL dengan karakteristik berwarna putih susu, kental, dan pH 7.03 (Tabel 4). Volume semen cenderung lebih rendah dari penelitian sebelumnya yaitu 0.3 mL pada ayam sentul (Soeparna et al. 2005) dan 0.3 mL pada ayam kampung (Wiyanti et al. 2013).
spermatozoa yang didapatkan pada penelitian ini juga lebih tinggi dari Iskandar (2007) yang hanya mendapatkan sebesar 88% pada ayam sentul, tetapi hampir sama dengan yang didapatkan Wiyanti et al. (2013) sebesar 92% pada ayam kampung. Konsentrasi spermatozoa hasil penelitian ini hampir sama dengan yang dilaporkan sebelumnya pada ayam sentul yaitu antara 2.15 milyar mL-1 (Iskandar 2007) sampai dengan 3.03 milyar mL-1 (Soeparna et al. 2005), namun lebih rendah dari Wiyanti et al. (2013) yang mendapatkan sebanyak 3.13 milyar mL-1 pada ayam kampung.
Gerakan massa dan abnormalitas spermatozoa berbeda (P<0.05) antar bangsa ayam. Ayam SK memiliki gerakan massa spermatozoa yang lebih rendah dari ayam kampung. Perbedaan ini mungkin disebabkan umur ayam SK lebih muda dari ayam kampung sehingga pergerakan spermatozoa ayam SK lebih rendah dari ayam kampung. Hal ini didukung oleh hasil penelitian Long et al. (2010) yang menemukan bahwa pergerakan spermatozoa ayam yang lebih tua lebih rendah dari ayam muda.
Abnormalitas spermatozoa ayam SK pada penelitian ini lebih rendah dari ayam kampung. Hal ini juga mungkin disebabkan oleh umur ayam kampung yang lebih tua dari SK sehingga menghasilkan abnormalitas spermatozoa yang lebih tinggi. Hasil ini sejalan dengan penelitian Tabatabaei et al. (2010) yang menyatakan bahwa abnormalitas spermatozoa ayam broiler umur 45 minggu lebih tinggi dari abnormalitas spermatozoa 34 minggu demikian juga dengan abnormalitas spermatozoa ayam broiler umur 34 minggu lebih tinggi dari abnormalitas spermatozoa umur 24 minggu.
Tabel 4 Karakteristik semen segar ayam sentul, kampung, dan SK
Karakteristik semen ayam; VS: volume semen, GMS: gerakan massa spermatozoa, MS: motilitas spermatozoa, SH: viabilitas spermatozoa, KS: konsentrasi spermatozoa, KPE: konsentrasi spermatozoa per ejakulat, AS: Abnormalitas spermatozoa, dan TO: tekanan osmotik. bAngka-angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada baris yang sama menyatakan perbedaan yang nyata (P<0.05). cAyam silangan sentul kampung
Gambar 1 Beberapa bentuk abnormalitas spermatozoa pada ayam SK; a. tail
knotting, b. 180o bent tail, c. 180o bent head, dan d. head detachment.
Kualitas Semen Ayam SK dalam Pengencer Ringer Laktat Kuning Telur dengan Berbagai Monosakarida pada Suhu 5 oC
Beberapa penelitian terkait penambahan jenis karbohidrat pada bahan pengencer semen telah dilakukan sebelumnya, namun kebanyakan di antara penelitian tersebut masih diaplikasikan pada semen mamalia. Hasil penelitian tersebut di antaranya adalah; penambahan glukosa pada semen domba garut dapat meningkatkan daya hidup spermatozoa hingga 0.34% (Rizal et al. 2006), fruktosa dapat melindungi spermatozoa tikus pada penyimpanan 4 oC lebih baik dibandingkan tanpa fruktosa (Sariözkan et al. 2012), sedangkan Yildiz et al. (2000) melaporkan motilitas spermatozoa anjing setelah pembekuan lebih tinggi dengan penambahan xilosa dan fruktosa.
Salah satu contoh monosakarida yang biasa ditambahkan pada pengencer semen adalah glukosa dan fruktosa. Jika dibandingkan dengan semen sapi dan domba, semen ayam mengandung sedikit fruktosa (Garner dan Hafez 2000), sehingga diperlukan penambahan dari luar.
Tabel 5 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 12 jam penyimpanan
Jenis pengencer Motilitas spermatozoa (%) Viabilitas spermatozoa (%) RLKT + glukosaa aRLKT : ringer laktat + kuning telur
Tabel 6 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 24 jam penyimpanan
Jenis pengencer Motilitas spermatozoa (%) Viabilitas spermatozoa (%) RLKT + glukosaa aRLKT: ringer laktat + kuning telur
Tabel 7 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 36 jam penyimpanan
Jenis pengencer Motilitas spermatozoa (%) Viabilitas spermatozoa (%) RLKT + glukosaa aRLKT: ringer laktat + kuning telur
Tabel 8 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 48 jam penyimpanan
Tabel 9 Pengaruh berbagai jenis monosakarida dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 60 jam penyimpanan
Jenis pengencer Motilitas spermatozoa (%) Viabilitas spermatozoa (%) RLKT + glukosaa
RLKT : ringer laktat + kuning telur
Motilitas Spermatozoa
Motilitas spermatozoa ayam SK pada berbagai monosakarida (Tabel 5-9) tidak berbeda. Hasil ini dapat diartikan bahwa keempat monosakarida yang digunakan pada penelitian ini dapat dimanfaatkan dengan baik oleh spermatozoa. Berbeda dengan laporan Gomez-Fernández et al. (2012), yang menunjukkan bahwa motilitas spermatozoa babi yang disimpan selama 150 menit dengan penambahan fruktosa lebih rendah dibandingkan dengan glukosa. Namun penelitian ini sejalan dengan Naing et al. (2010) yang melaporkan penggunaan glukosa dan fruktosa tidak menunjukkan perbedaan motilitas spermatozoa kambing.
Motilitas spermatozoa pada jam ke-48 (Tabel 8) dengan penambahan manosa lebih tinggi dari penelitian sebelumnya pada spermatozoa kuda, seperti yang dilaporkan King et al. (2006) dengan penambahan manosa menghasilkan motilitas 42.8%, namun lebih tinggi dari penambahan fruktosa yang hanya 8.33%-20% (Hemo dan Arifiantini 2010). Motilitas spermatozoa selama penyimpanan 60 jam (Tabel 9) tidak berbeda antara penambahan glukosa dengan fruktosa, hal ini sejalan dengan penelitian Ponglowhapan et al. (2004) yang menyatakan tidak ada perbedaan kualitas spermatozoa yang disimpan selama 60 jam antara penambahan 10 mM fruktosa dan glukosa ke dalam pengencer semen.
Semen ayam pada penelitian ini disimpan dalam keadaan an aerob, hal ini sesuai dengan pendapat Lorenz (1959) bahwa untuk semen ayam, glukosa, fruktosa, dan manosa dapat digunakan serta diglikolisis lebih cepat dalam suasana an aerob. Pada kondisi an aerob, metabolisme glukosa, fruktosa, atau manosa akan menghasilkan asam laktat. Metabolisme ini menghasilkan adenosine triphospahate (ATP) yang digunakan dalam proses pergerakan (motilitas), selain itu juga digunakan untuk mempertahankan aktifitas transpor aktif pada membran sel spermatozoa (Garner dan Hafez 2000). Hasil penelitian Rigau et al. (2001) pada spermatozoa anjing menyatakan bahwa fruktosa berpengaruh terhadap pergerakan motilitas progresif sedangkan glukosa berpengaruh terhadap gerakan bergetar.
Gambar 2 Grafik penurunan persentase motilitas spermatozoa selama penyimpanan dengan berbagai monosakarida. RLKTG: RLKT (ringer laktat kuning telur) + glukosa, RLKTF: RLKT + fruktosa, RLKTX: RLKT + xilosa, dan RLKTM: RLKT + manosa.
Viabilitas Spermatozoa
Viabilitas spermatozoa pada penelitian ini juga tidak berbeda pada berbagai monosakarida yang digunakan (Tabel 5-9). Penyimpanan semen cair selama 60 jam menghasilkan viabilitas spermatozoa antara 58.59±2.87% sampai dengan 64.83±2.42% (Tabel 9). Hasil ini sejalan dengan penelitian Fernàndez-Santos (2007) bahwa penggunaan manosa, glukosa, dan fruktosa tidak menghasilkan perbedaan viabilitas spermatozoa rusa setelah thawing, dan didukung oleh laporan Yildiz et al. (2000) yang menyatakan bahwa tidak ada perbedaan antara persentase mortalitas spermatozoa anjing dengan penambahan glukosa, fruktosa, dan xilosa setelah pengenceran, equilibrasi, dan thawing.
Penurunan viabilitas spermatozoa antar pengencer terlihat pada penyimpanan jam ke-48 (Gambar 3). Penurunan paling tinggi terdapat pada spermatozoa dalam pengencer RLKTM dan penurunan paling rendah terlihat pada RLKTF. Penurunan viabilitas spermatozoa pada RLKTG dan RLKTX tidak berbeda. Penurunan viabilitas dengan penambahan fruktosa pada jam ke-24 dan 48 berurut-turut sebesar 4.91±1.15% dan 5.2±1.47% lebih baik dari yang dilaporkan oleh Hemo dan Arifiantini (2010) yaitu 17%-25% (24 jam) dan 9%-10% (48 jam) pada spermatozoa kuda.
Kualitas semen cair selama penyimpanan pada penelitian ini cukup baik hal ini terbukti dengan motilitas spermatozoa pada jam ke-60 antara 48.33±2.56% hingga 55.42±2.26% dengan viabilitas antara 58.59±2.87% sampai dengan 64.83±2.42% (Tabel 9). Daya tahan spermatozoa ayam telah diteliti sebelumnya, di antaranya dilaporkan oleh Saleh dan Isyanto (2011) yang menemukan bahwa motilitas ayam kate lokal dalam pengencer ringer laktat pada penyimpanan 5 oC selama 3 jam hanya dapat bertahan hingga 60%. Demikian juga pada semen ayam kampung dalam pengencer NaCl fisiologis pada suhu 4 oC selama 30 jam hanya menunjukkan motilitas 25.5% dan viabilitas 47.4% (Danang et al. 2012).
Al-Lama penyimpanan setiap 12 jam
Daraji (2011) melaporkan bahwa motilitas spermatozoa ayam petelur putih dalam pengencer Lake selama penyimpanan 48 jam hanya 25.8%.
Gambar 3 Grafik penurunan persentase viabilitas spermatozoa selama penyimpanan dengan berbagai monosakarida. Huruf yang berbeda di atas balok data menunjukkan perbedaan penurunan viabilitas yang nyata (P<0.05) antar pengencer. RLKTG: RLKT (ringer laktat kuning telur) + glukosa, RLKTF: RLKT + fruktosa, RLKTX: RLKT + xilosa, dan RLKTM: RLKT + manosa.
Tingginya kualitas semen cair ayam pada penelitian ini diduga karena komposisi pengencer dan monosakarida yang digunakan sudah menunjang daya hidup spermatozoa tersebut. Tekanan osmotik pengencer dalam penelitian ini berkisar antara 330 mOsmol kg-1 sampai dengan 353 mOsmol kg-1 tidak terlalu berbeda dengan tekanan osmotik semen ayam pada penelitian ini yaitu 275 mOsmol kg-1. Tekanan osmotik pengencer yang digunakan ideal untuk semen ayam sesuai pendapat Donoghue dan Wishart (2000) yaitu antara 250 mOsmol kg -1 hingga 460 mOsmol kg-1. Pada tekanan osmotik tersebut kemampuan fertilitas
spermatozoa unggas dapat dipertahankan.
Kombinasi ringer laktat dan kuning telur merupakan pengencer yang sering diaplikasikan pada semen ayam. Larutan ringer laktat terdiri dari bermacam-macam garam mineral yang memiliki daya penyangga pH (buffer) dan isotonik yang memiliki kandungan yang sama dengan unsur-unsur elektrolit dari plasma semen ayam seperti natrium, klorida, kalsium, dan magnesium. Kuning telur memberikan keuntungan selama pendinginan semen mendekati temperatur 0 oC karena kandungan lipoprotein dan lesitin yang dapat melapisi membran plasma sel sehingga mampu mempertahankan dan melindungi integritas selubung lipoprotein sel spermatozoa dari cekaman dingin (Toelihere et al. 1985) oleh sebab itu maka kuning telur dapat melindungi spermatozoa selama penyimpanan.
Ketersediaan sumber energi di dalam pengencer semen berupa karbohidrat merupakan faktor penting dalam menjamin kebutuhan spermatozoa selama penyimpanan. Sebagai substrat sumber energi, karbohidrat tersebut akan dimetabolisir melalui jalur glikolisis atau dilanjutkan dengan reaksi asam
a
Lama penyimpanan setiap 12 jam
trikarboksilat (siklus Krebs), sehingga dihasilkan energi berupa ATP yang akan dimanfaatkan oleh spermatozoa untuk bergerak dan transpor aktif membran sehingga dapat berperan dalam mempertahankan daya hidup (viabilitas) dan pergerakan (motilitas) spermatozoa.
Kualitas Semen Ayam SK dalam Pengencer Ringer Laktat Kuning Telur dengan Berbagai Level Minyak Zaitun
Ekstra Virgin pada Suhu 5 oC
Penyimpanan semen menyebabkan spermatozoa rentan mengalami serangan radikal bebas (oksidan) yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel. Membran spermatozoa unggas memiliki konsentrasi asam lemak tak jenuh ganda (PUFA) yang tinggi selama penyimpanan in vitro. Spermatozoa ayam, kalkun, angsa, bebek, dan guinea fowl kaya akan asam lemak arakidonat (20:4n-6) dan asam lemak dokosatetranoeat (22:4n-6), namun kadar asam lemak dokosatetranoeat pada spermatozoa ayam lebih tinggi dari yang lain (Surai et al. 2001) sehingga spermatozoa ayam lebih rentan terhadap peroksidasi lipid (Cerolini et al. 2006). Peroksidasi lipid menyebabkan beberapa kerusakan pada spermatozoa unggas, berupa kerusakan morfologis, penurunan motilitas, dan daya fertil (Long dan Kramer 2003), sehingga spermatozoa ayam yang disimpan memerlukan senyawa antioksidan untuk meningkatkan daya tahan hidup spermatozoa.
Senyawa fenolik yang bearasal dari buah, efektifmengikat radikal hidroksil, superoksida dan peroksil secara in vitro sehingga dapat mengurangi reactive oxygen species (ROS) (Rice-Evans 2004) yang dapat menyebabkan kerusakan pada spermatozoa, sehingga beberapa penelitian sebelumnya memanfaatkan senyawa antioksidan fenolik alami dari buah atau bagian tanaman lain sebagai antioksidan semen. Masing-masing tanaman memiliki kemampuan antioksidan yang berbeda-beda dengan berbagai level yang berbeda pula, seperti 5%-7% ekstrak pomegrana, 7%-10% ekstrak jeruk, 16% ekstrak anggur, 10% ekstrak teh hijau, 6%-9% ekstrak kayu manis, 2%-4% ekstrak bawang putih atau 4%-8% ekstrak minyak zaitun adalah level antioksidan terbaik yang dapat mempertahankan motilitas dan viabilitas spermatozoa white leghorn (Al-Daraji 2011; 2012a; 2012b; 2012c; 2013a; 2013b; 2015).
Tabel 11 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 24 jam penyimpanan berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan yang nyata (P<0.05).
Tabel 12 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 36 jam penyimpanan berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan yang nyata (P<0.05).
Penelitian tahap 1 menunjukkan bahwa glukosa, fruktosa, dan xilosa memiliki kemampuan mempertahankan kualitas spermatozoa yang terbaik, namun penambahan fruktosa cenderung menghasilkan angka motilitas dan viabilitas spermatozoa yang lebih tinggi sehingga fruktosa digunakan sebagai sumber energi dalam pembuatan pengencer tahap 2 ini.
Tabel 14 Pengaruh berbagai level minyak zaitun dalam pengencer semen terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam SK selama 60 jam penyimpanan berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan yang nyata (P<0.05).
Motilitas Spermatozoa
Motilitas spermatozoa ayam SK pada berbagai level minyak zaitun (Tabel 10-14) berbeda (P<0.05), hal ini dapat dilihat dari motilitas spermatozoa dengan suplementasi minyak zaitun lebih baik dibandingkan tanpa minyak zaitun hingga 60 jam penyimpanan. Hal ini sesuai dengan hasil yang didapat Al-Daraji (2012) bahwa suplementasi minyak zaitun menghasilkan motilitas, viabilitas, dan integritas akrosom spermatozoa lebih baik dibandingkan tanpa minyak zaitun selama 72 jam penyimpanan.
Suplementasi 8% dan 10% minyak zaitun pada 12 jam pertama (Tabel 10) menghasilkan motilitas terbaik namun pada jam ke-24, 36, 48, dan 60 dengan level 8% memberikan hasil yang lebih baik dari level 10%, 6%, dan 4%. Hal ini berbeda dengan hasil yang didapat oleh Al-Daraji (2012a) bahwa motilitas spermatozoa ayam white leghorn yang disuplementasi minyak zaitun tidak berbeda antara 4% dengan 8% selama 72 jam penyimpanan.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa peningkatan level minyak zaitun sejalan dengan peningkatan angka motilitas selama penyimpanan. Namun, suplementasi 10% minyak zaitun menghasilkan motilitas spermatozoa yang lebih rendah dari 8%. Hal ini mungkin disebabkan kadar minyak zaitun terlalu tinggi sehingga pergerakan spermatozoa terhambat oleh banyaknya molekul-molekul lemak dari minyak zaitun, atau disebabkan pH yang menurun (asam) sehingga menjadi toksik bagi spermatozoa. Hal ini disebabkan senyawa fenolik minyak zaitun kaya akan gugus hidroksil yang dapat melepaskan ion hidrogen. Pelepasan proton (H+) dari senyawa fenolik dalam larutan akan menyebabkan suasana asam (Vernmerris dan Nicholson 2006).
Gambar 4 Grafik penurunan persentase motilitas spermatozoa selama penyimpanan dengan berbagai level minyak zaitun. Huruf yang berbeda di atas balok data menunjukkan perbedaan penurunan motilitas yang nyata (P<0.05) antar pengencer. P0: pengencer RLKTF (ringer laktat kuning telur fruktosa) tanpa minyak zaitun, P1-P4 : pengencer RLKTF yang disuplementasi masing-masing 4%, 6%, 8%, dan 10% minyak zaitun.
Viabilitas Spermatozoa
Viabilitas spermatozoa ayam SK (Tabel 10-14) berbeda (P<0.05) pada berbagai level minyak zaitun. Hal ini menunjukkan viabilitas spermatozoa dengan suplementasi minyak zaitun lebih baik dibandingkan tanpa minyak zaitun hingga 60 jam penyimpanan. Hal ini sesuai dengan hasil yang didapat Al-Daraji (2012) bahwa suplementasi minyak zaitun menghasilkan viabilitas, dan integritas akrosom spermatozoa lebih baik dibandingkan tanpa minyak zaitun selama 72 jam penyimpanan.
Suplementasi 8% dan 10% minyak zaitun pada 12 jam pertama (Tabel 10) menghasilkan viabilitas terbaik namun pada jam ke-24, 36, 48, dan 60, level 8% memberikan hasil yang lebih baik dari level 10%, 6%, dan 4%. Hal ini sejalan dengan Al-Daraji (2012a) yang menemukan bahwa viabilitas spermatozoa ayam white leghorn yang disuplementasi minyak zaitun 8% lebih tinggi dari 6% dan 4% selama 72 jam penyimpanan. Suplementasi 10% minyak zaitun pada penelitian ini menghasilkan viabilitas spermatozoa yang lebih rendah dari 8%.
Perbedaan penurunan viabilitas spermatozoa antar pengencer juga terlihat pada penyimpanan 12 jam pertama dan 12 jam kedua (Gambar 5). Penurunan paling tinggi terdapat pada spermatozoa dalam pengencer tanpa minyak zaitun dan penurunan paling rendah terlihat pada penambahan minyak zaitun 0.8 mL (8%).
Penyimpanan semen ayam selama 60 jam dengan suplementasi minyak zaitun ekstra virgin pada penelitian ini menghasilkan motilitas spermatozoa hingga 18.75±1.25% dan viabilitas spermatozoaa hingga 29.13±1.13% (Tabel 10) lebih rendah dibandingkan hasil penelitian Al-Daraji (2012a) yang mendapatkan motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam white leghorn dengan suplementasi minyak zaitun pada pengencer semen yang mengandung fruktosa berada pada kisaran 60% selama 72 jam penyimpanan. Hal ini disebabkan karena Al-Daraji (2012a) menggunakan pengencer yang dilengkapi antioksidan lain selain minyak
zaitun yaitu vitamin A, C, dan E ke dalam pengencer semen sehingga motilitas dan viabilitasnya lebih tinggi dari penelitian ini. Pratt dan Hudson (1990) menyatakan bahwa kombinasi beberapa jenis antioksidan memberikan perlindungan yang lebih baik (sinergisme) terhadap oksidasi dibanding dengan satu jenis antioksidan saja (Pratt dan Hudson 1990).
Gambar 5 Grafik penurunan persentase viabilitas spermatozoa selama penyimpanan dengan berbagai level minyak zaitun. Huruf yang berbeda di atas balok data menunjukkan perbedaan penurunan viabilitas yang nyata (P<0.05) antar pengencer. P0: pengencer RLKTF (ringer laktat kuning telur fruktosa) tanpa minyak zaitun, P1-P4 : pengencer RLKTF yang disuplementasi masing-masing 4%, 6%, 8%, dan 10% minyak zaitun.
Penyimpanan semen ayam selama 60 jam dengan suplementasi minyak zaitun ekstra virgin pada penelitian ini menghasilkan motilitas spermatozoa hingga 18.75±1.25% dan viabilitas spermatozoaa hingga 29.13±1.13% (Tabel 10) lebih rendah dibandingkan hasil penelitian Al-Daraji (2012a) yang mendapatkan motilitas dan viabilitas spermatozoa ayam white leghorn dengan suplementasi minyak zaitun pada pengencer semen yang mengandung fruktosa berada pada kisaran 60% selama 72 jam penyimpanan. Hal ini disebabkan karena Al-Daraji (2012a) menggunakan pengencer yang dilengkapi antioksidan lain selain minyak zaitun yaitu vitamin A, C, dan E ke dalam pengencer semen sehingga motilitas dan viabilitasnya lebih tinggi dari penelitian ini. Pratt dan Hudson (1990) menyatakan bahwa kombinasi beberapa jenis antioksidan memberikan perlindungan yang lebih baik (sinergisme) terhadap oksidasi dibanding dengan satu jenis antioksidan saja (Pratt dan Hudson 1990).
Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat diartikan bahwa penambahan minyak zaitun sebagai antioksidan efektif dalam mempertahankan motilitas spermatozoa ayam SK selama penyimpanan. Penyimpanan semen selama 60 jam pada suhu 5 oC menyebabkan terjadinya cekaman dingin pada spermatozoa. Pursel (1979)
menyatakan bahwa cekaman dingin dapat meningkatkan kerentanan spermatozoa terhadap peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid dapat disebabkan adanya radikal bebas. Peroksidasi lipid yang berkepanjangan merusak struktur matrik lipid dan menyebabkan instabilitas pada membran (Feradis 2010). Peroksidasi lipid menyebabkan beberapa kerusakan pada spermatozoa unggas, berupa kerusakan
morfologis, penurunan motilitas, dan daya fertil (Long dan Kramer 2003). Spermatozoa ayam yang terekspos dengan udara saat diejakulasikan dapat mengalami peroksidasi lipid yang dapat menurunkan motilitas dan viabilitasnya (Surai 2003).
Minyak zaitun mengandung senyawa antioksidan fenolik. Senyawa fenolik polar mayor minyak zaitun terdiri dari 4 kelompok yaitu fenol sederhana (hydroxytyrosol, tyrosol), secoiridoids (oleuropein, aglikon ligstrosida, dan masing-masing derifat dialdehid dekarboksilasi), flavonoid (apigenin, luteolin) dan lignan [(+)-1 asetoksipinoresinol dan pinoresinol] (Kampa et al. 2009).
Oleuropein merupakan senyawa fenolik yang memegang peranan yang cukup penting sebagai antioksidan pada spermatozoa ayam selama penyimpanan, hal ini disebabkan karena oleuropein bertindak sebagai pencegah terjadinya reaksi antara radikal bebas dengan asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel spermatozoa ayam. Dari beberapa penelitian menunjukkan bahwa oleuropein bertindak sebagai pembersih (scavenger) radikal bebas dan menghambat produksi radikal bebas (Kruk et al. 2005), mengurangi level spesies oksigen reaktif karena efektif mengikat radikal hidroksil, superoksida dan peroksil secara in vitro (Rice-Evans 2004) dan dapat mengurangi jumlah protein teroksidasi pada fibroblast embrio manusia (Katsiki et al. 2007). Paiva-Martin et al. (2009) menemukan bahwa senyawa penolik pada minyak zaitun dapat mengikat spesies oksigen reaktif pada sel darah putih.
Komponen polifenol lain yang utama pada minyak zaitun adalah
hydroxytyrosol (Hty) (Goya et al. 2007) dan hydroxytyrosyl acetate (Hty-A)
(Pereira-Caro et al. 2012). Kandungan Hty dan Hty-A pada minyak zaitun yang digunakan pada penelitian turut membantu menghambat kerusakan spermatozoa dengan cara mencegah stres oksidatif pada spermatozoa ayam. Hal ini sesuai dengan pendapat Goya et al. (2007) dan Martin et al. (2010) bahwa Hty efektif mencegah sel dari stres oksidatif dengan cara mengikat radikal (radical scavenger) dan mengatur protein signal yang melibatkan induksi enzim krioprotektif, dengan demikian dapat berperan dalam mekanisme proteksi sel tambahan. Hty menjadi kemo-protektif terbaik karena mekanisme ganda yang dimilikinya dalam mencegah stres oksidatif yang dapat menyebabkan kerusakan sel, namun Hty-A lebih efisien dalam memelihara integritas membran biologis daripada Hty karena Hty-A memiliki akses ke dalam membran sel yang lebih baik. Sarria et al. (2012) menemukan bahwa Komponen alami Hty dan HTy-A pada minyak zaitun efektif melindungi sel hepatik dari kerusakan oksidatif. Menurut Visioli et al. (1998), antioksidan HT dan oleuropein lebih efektif sebagai pelindung dibandingkan BHT atau vitamin E.
Fertilitas dan Periode Fertil Spermatozoa Ayam Sentul, Kampung, dan SK
Penelitian tahap 1 menunjukkan bahwa glukosa, fruktosa, dan xilosa memiliki kemampuan mempertahankan kualitas spermatozoa yang terbaik, namun penambahan fruktosa cenderung menghasilkan angka motilitas dan viabilitas spermatozoa yang lebih tinggi, sedangkan penelitian tahap 2 menunjukkan bahwa penggunaan minyak zaitun 8% lebih efektif dalam mempertahankan kualitas spermatozoa sehingga pengencer semen yang digunakan pada penelitian tahap 3 ini adalah ringer laktat kuning telur yang disuplementasi fruktosa dan 8% minyak zaitun.
Fertilitas Spermatozoa
Persentase fertilitas spermatozoa ayam sentul, kampung, dan SK dengan menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur + fruktosa + minyak zaitun 8% (RLKTFMZ) (Tabel 15) menunjukkan bahwa fertilitas spermatozoa ayam sentul 55.88±13.19% lebih rendah dari yang diperoleh Nataamijaya et al. (2003) yaitu 73.76%, sedangkan fertilitas spermatozoa ayam kampung yang didapatkan pada penelitian ini sebesar 73.81±12.67% lebih tinggi dari yang didapatkan Sutiyono et al. (2006) dengan menggunakan ringer glukosa hanya mendapatkan fertilitas spermatozoa sebesar 56.67%.
Tabel 15 Fertilitas dan periode fertil spermatozoa ayam sentul, kampung, dan SK dengan menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur + fruktosa + minyak zaitun 8% (RLKTFMZ)
Jenis ayam Fertilitas (%)a Periode fertil (hari) Sentul
aAngka-angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan yang nyata (P<0.05). bAyam silangan sentul kampung.
Penelitian ini sejalan dengan penelitian Peter et al. (2008) pada beberapa strain ayam di Nigeria yang menyatakan bahwa strain ayam normal feathered yang disilangkan dengan ayam strain naked neck, alpha, white leghorn, black
nera menghasilkan fertilitas yang lebih rendah dari tetuanya, demikian juga
dengan ayam silangan alpha giriraja maupun resiproknya. Adeleke et al. (2012) menemukan hal yang berbeda yaitu fertilitas spermatozoa ayam broiler x lokal Nigeria tidak berbeda dengan fertilitas spermatozoa kedua ayam tetuanya.
Fertilitas spermatozoa ayam kampung menggunakan pengencer RLKTFMZ pada penelitian ini cukup baik dibandingkan penelitian sebelumnya dengan menggunakan pengencer NaCl fisiologis 0.9% hanya mampu menghasilkan fertilitas spermatozoa sebesar 70% pada ayam kampung, 56%-65.79% pada ayam buras dan 44.13%-66.67% pada ayam pelung (Sastrodihardjo et al. 1995; Sutiyono et al. 2006; Ridwan dan Rusdin 2008; Asmarawati et al. 2013). Fertilitas spermatozoa ayam kampung pada penelitian ini juga lebih baik dari penggunaan pengencer NaCl fisiologis 0.9% + kuning telur yang menghasilkan fertilitas spermatozoa sebesar 70.83% pada ayam kampung dan 66% pada ayam buras (Sastrodihardjo et al. 1995; Sutiyono et al. 2006), demikian juga dengan pengencer ringer glukosa dengan fertilitas spermatozoa sebesar 56.67% pada ayam kampung dan 71.58% pada ayam buras (Sutiyono et al. 2006; Ridwan dan Rusdin 2008). Penelitian lain menunjukkan bahwa penggunaan pengencer ringer laktat menghasilkan fertilitas spermatozoa sebesar 74.73% pada ayam buras dan 56.18% pada ayam kate (Ridwan dan Rusdin 2008; Saleh dan Isyanto 2011) hampir sama dengan fertilitas spermatozoa ayam kampung dan ayam sentul pada penelitian ini.
Fertilitas spermatozoa ayam kampung pada penelitian ini lebih baik dari fertilitas spermatozoa ayam buras dengan menggunakan pengencer natrium sitrat + kuning telur yaitu hanya mendapatkan 55% (Sastrodihardjo et al. 1995), namun lebih rendah dari fertilitas spermatozoa dengan pengencer natrium fosfat + kuning telur yaitu 83% pada ayam buras (Sastrodihardjo et al. 1995).
Periode Fertil Spermatozoa
Periode fertil spermatozoa antara ayam sentul, kampung, dan SK dengan menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur + fruktosa + minyak zaitun 8% (RLKTFMZ) (Tabel 15) tidak menghasilkan perbedaan dan berada pada kisaran 12.67±1.53 sampai dengan 15.67±0.58 hari. Hasil ini hampir sama dengan laporan Soeparna et al. (2005) yang menemukan bahwa periode fertil spermatozoa ayam sentul 14.4 hari, lebih tinggi dari yang didapatkan Solihati et al. (2006) yaitu 3.83-9.50 hari pada ayam buras. Periode fertil yang cukup lama pada penelitian ini mungkin disebabkan bahan pengencer yang digunakan cukup dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa di dalam saluran kelamin betina karena adanya kandungan sumber energi yaitu fruktosa dan antioksidan minyak zaitun di dalam bahan pengencer tersebut.
Konsentrasi spermatozoa ayam per ejakulat pada penelitian ini cukup tinggi untuk diinseminaskan pada 3 ekor betina yaitu berada pada kisaran 460 hingga 630 juta sehingga setiap ekor betina bisa mendapat lebih dari 100 juta spermatozoa per sekali IB. Etches (1996) menyatakan bahwa ketika 100-150 juta spermatozoa diinseminasikan ke ayam betina, sekitar 5-7 juta spermatozoa tersimpan dalam lipatan-lipatan tabung (tubular gland) yang berada pada bagian anterior vagina ayam betina selama beberapa jam dan hanya sekitar 4 sampai 20 spermatozoa yang berhasil melewati membran vitelin sel telur. Spermatozoa di dalam tubular gland dapat bertahan dari ancaman luar yang dapat merusak dan membunuh spermatozoa sehingga semakin lama spermatozoa di dalam tubular gland memungkinkan periode fertil semakin lama. Ayam dapat mempertahankan spermatozoa di dalam tubular gland hingga 3 minggu penyimpanan namun masih dapat membuahi sel telur (Brillard 1993; Christensen dan Bagley 1989).
SIMPULAN
Monosakarida glukosa, fruktosa, xilosa, dan manosa dapat digunakan dalam pengencer semen ayam SK selama 60 jam penyimpanan. Suplementasi 8% minyak zaitun dalam pengencer efektif mempertahankan kualitas semen ayam SK selama 60 jam penyimpanan. Fertilitas spermatozoa ayam SK menggunakan IB lebih rendah dari kedua tetuanya sedangkan periode fertil spermatozoa sama dengan kedua tetuanya.
DAFTAR PUSTAKA
Adeleke MA, Peters SO, Ozoje MO, Ikeobi CON, Bamgbose AM, Adebambo OA. 2012. Effect of crossbreeding on fertility, hatchability and embryonic mortality of nigerian local chickens. Trop Anim Health Prod. 44:505-510. Al-Daraji HJ. 2011. Effect of diluent supplementation with different levels of
green tea on roosters' semen quality during in vitro storage. IJPAES. 1(3):51-56.
Al-Daraji HJ. 2012a. Adding olive oil to rooster semen diluents for improving semen quality and storage ability during liquid storage. BJCCSB. 2:3-11. Al-Daraji HJ. 2012b. Effect of diluent supplementation with different level of
orange juice on semen quality during liquid storage of roosters’ semen. Inter J Vet Sci. 1(1):5-9.
Al-Daraji HJ. 2012c. Red wine as a diluent supplement for counteract the deleterious effects of lipid peroxidation during liquid storage of aged
rooster’s semen. Nat Sci. 10(9):64-70.
Al-Daraji HJ. 2013b. Effect of diluent supplementation with liquorice extract on quality and storage ability of rooster semen during liquid storage. WJPPS. 2(3):878-889.
Al-Daraji HJ. 2015. The use of pomegranate juice for counteract lipid
peroxidation that naturally occured during liquid storage of roosters’ semen.
Phog Commn. 5(1):70-75.
Asmarawati W, Kustono, Widayati DT, Bintara S, Ismaya. 2013. Pengaruh dosis sperma yang diencerkan dengan NaCl fisiologis terhadap fertilitas telur pada inseminasi buatan ayam lokal. Buletin Peternakan. 37(1):1-5.
Blesbois E, Lessire M, Grasseau J, Hallouis JM, Hermier D. 1997. Effect of dietary fat on the fatty acid composition and fertilizing ability of fowl semen. Biol Reprod. 56(5):1216-1220.
Breque C, Surai P, Brillard JP. 2003. Roles of antioxidants on prolonged storage of avian spermatozoa in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 66:314-323. Brillard JP. 1993. Sperm storage and transport following natural mating and
artificial insemination. Poultry Sci. 72(5):923-8.
Cassady PJ, Yung LD, Leymaster KA. 2002. Heterosis and rekombinant effects on pig reproductive traits. J Anim Sci. 20(9):2303-2315.
Cerolini S, Zainiboni L, Maldjian A, Gliozzi T. 2006. Effect of docosahexaenoic
acid and α-tocopherol enrichment in chicken sperm on semen quality, sperm lipid composition and susceptibility to peroxidation. Theriogenology. 66:877-886.
Christensen VL, Bagley LG. 1989. Efficacy of fertilization in artificially inseminated turkey hens. Poultry Sci. 68(5):724-729.
Danang DR, Isnaini N, Trisunuwati P. 2012. Pengaruh lama simpan semen
terhadap kualitas spermatozoa ayam kampung dalam pengencer ringer’s
pada suhu 4 oC. J Tern Trop. 13(1):47-57.
Deiana M, Rosa A, Corona G, Atzeri A, Incani A, Visioli F. 2007. Protective effect of olive oil minor polar components against oxidative damage in rats treated with ferric-nitrilotriacetate. Food Chem Toxicol. 45:2434-2440. Donoghue AM, Wishart GJ. 2000. Storage of poultry semen. Anim Reprod Sci.
62:213-232.
Etches RJ. 1996. Reproduction in Poultry. Wallingford (US) :CABI.
Fabiani R, Rosignoli P, de Bartolomeo A, Fuccelli R, Servili M, Montedoro GF, Morozzi G. 2008. Oxidative DNA damage is prevented by extracts of olive oil, hydroxytyrosol, and other olive phenolic compounds in human blood mononuclear cells and HL60 cells. J Nutr. 138:1411-1416.
Falconer DS. 1981. Introduction Quantitive Genetics. London (GB): Longman B Group Ltd.
Feradis. 2010. Bioteknologi Reproduksi pada Ternak. Bandung (ID): Alfabeta. Fernández-Santos MR, Martínez-Pastor F, García-Macías V, Esteso MC, Soler
AJ, de Paz P, Anel L, Garde JJ. 2007. Extender osmolality and sugar supplementation exert a complex effect on the cryopreservation of iberian red deer (Cervus elaphus hispanicus) epididymal spermatozoa. Theriogenology. 67:738-753.
