AKTIVITAS ANTIOBESITAS EKSTRAK SIRIH MERAH
(
Piper crocatum
) TERHADAP OBESITAS YANG DIINDUKSI
PAKAN TINGGI LEMAK PADA TIKUS
HUSNAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Aktivitas Antiobesitas Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) Terhadap Obesitas yang Diinduksi Pakan Tinggi Lemak pada Tikus” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Husnawati
RINGKASAN
HUSNAWATI. Aktivitas Antiobesitas Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) Terhadap Obesitas Yang Diinduksi Pakan Tinggi Lemak Pada Tikus. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI.
Obesitas merupakan permasalahan yang mendapat perhatian serius di dunia kesehatan saat ini, karena kondisi obesitas dapat menjadi faktor pencetus penyakit-penyakit lain yang dapat membahayakan jiwa, seperti penyakit-penyakit jantung, diabetes mellitus tipe 2, stroke dan kanker. Angka kejadian obesitas menunjukkan peningkatan di sebagian besar wilayah Indonesia dan di dunia.
Beberapa studi yang meneliti tentang efek antiobesitas dari tanaman-tanaman obat menunjukkan bahwa tanaman-tanaman tersebut sebagian besar mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, dan saponin. Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu tanaman tradisional Indonesia yang telah banyak diteliti dan dimanfaatkan sebagai tanaman obat. Ekstrak air daun sirih merah mengandung flavonoid, tanin, dan alkaloid.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekstrak sirih merah memiliki khasiat yang berkaitan dengan penyakit-penyakit degeneratif, seperti efek antioksidan, antihiperglikemik, mencegah kenaikan kadar lipid darah, serta berpotensi sebagai antikanker. Ekstrak sirih merah hingga dosis 2 g/kg bobot badan tidak bersifat toksik secara in vivo. Berdasarkan efek tersebut, ekstrak sirih merah diduga memiliki kemampuan untuk memperbaiki kondisi obesitas dan kejadian sindrom metabolik.
Obat-obatan yang digunakan secara klinis untuk terapi DM tipe 2 (seperti metformin dan glitazon), mampu menurunkan kadar gula dalam darah melalui mekanisme aktivasi enzim AMP-activated protein kinase (AMPK). Mekanisme ini tidak tergantung pada jalur sinyal insulin, sehingga menjadikan AMPK sebagai target terapi yang menjanjikan pada pengobatan DM dan obesitas. Aktivasi enzim AMPK yang terfosforilasi akan menyebabkan inhibisi terhadap enzim acetyl co-A carboxylase (ACC), enzim pertama yang berperan dalam biosintesis asam lemak. Aktivasi AMPK secara tidak langsung juga mengakibatkan inhibisi enzim fatty acid synthase (FAS) yang berperan dalam lipogenesis.
Penelitian ini ingin melihat apakah ekstrak sirih merah memiliki efek antiobesitas melalui penurunan bobot badan dan kadar lipid hati, serta pengaruh aktivitas enzim yang berperan dalam metabolisme lipid melalui aktivasi AMP-activated protein kinase (AMPK), serta inhibisi acetyl-CoA carboxylase (ACC) dan
fatty acid synthase (FAS) pada hati tikus obes. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi sumbangan ilmu pengetahuan tentang mekanisme biomolekular efek antiobesitas tanaman sirih merah, serta pemanfaatannya dapat diaplikasikan oleh masyarakat sebagai tanaman obat tradisional yang mampu menurunkan bobot badan.
menggunakan kit spektrofotometri dari BiovisionTM, dan kadar enzim metabolik
hati (pAMPK, ACC, FAS) menggunakan ELISA kit dari CusabioTM.
Hasil analisis menunjukkan bahwa kelompok tikus yang diberi ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB merupakan satu-satunya kelompok yang menghasilkan penurunan bobot badan yaitu -4,52%, dengan kadar trigliserida, asam lemak dan ACC paling rendah yaitu 47,69 mg/g, 3,78 mg/g dan 9,13 ng/g jaringan hati, walau tidak berbeda secara signifikan dengan kelompok yang lain, serta kadar FAS paling rendah yaitu 360,68 ng/g yang berbeda nyata secara statistik (p < 0,05). Kadar pAMPK pada kelompok perlakuan tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak sirih merah tidak mampu mengaktivasi enzim AMPK, tetapi mampu menghambat kadar ACC dan FAS di jaringan hati.
SUMMARY
HUSNAWATI. Antiobesity Activity of Red Betel (Piper crocatum) Extract against High Fat Diet-Induced Obesity in Rats. Supervised by MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI.
Obesity is a problem that gets serious attention in the medical world today, because the condition of obesity can be a trigger factor for other diseases that can be life threatening, such as heart disease, type 2 diabetes mellitus, stroke and cancer. The incidence of obesity showed an increase in most parts of Indonesia and in the world.
Several studies that examine the antiobesity effects of medicinal plants showed that the plants mostly contain flavonoids, tannins, alkaloids, and saponins. Red betel (Piper crocatum) is one of Indonesia's traditional crops that have been widely studied and used as a medicinal plant. Water extract of Piper crocatum leaves contain flavonoids, tannins, and alkaloids.
Some studies showed that the extract of Piper crocatum has properties associated with degenerative diseases, such as antioxidant effect, anti-hyperglycemic, preventing the increase in blood lipid levels, and potential as anticancer. Extract of Piper crocatum up to dose 2 g/kg body weight not toxic in vivo. Based on these effects, the extract of Piper crocatum believed to have the ability to improve the condition of obesity and the incidence of metabolic syndrome. Drugs which used clinically for the treatment of type 2 diabetes (such as metformin and a glitazone), capable of lowering blood sugar levels through the mechanism of activation of the enzyme AMP-activated protein kinase (AMPK). This mechanism does not depend on insulin signaling pathway, making AMPK as a promising therapeutic target in the treatment of diabetes and obesity. Activation of AMPK phosphorylated enzyme would lead to inhibition of acetyl co-enzyme A carboxylase (ACC), the first enzyme involved in fatty acid biosynthesis. AMPK activation also indirectly result in inhibition of fatty acid synthase (FAS), which plays a role in lipogenesis.
This study aimed to see the antiobesity effects of Piper crocatum extract through a reduction in body weight and liver lipid levels, as well as response to the enzymes activity involved in lipid metabolism through activation of AMP-activated protein kinase (AMPK), as well as inhibition of acetyl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FAS) in the liver of obese rats. Results of this research is expected to contribute knowledge about the mechanisms of biomolecular antiobesity effects of Piper crocatum plant, as well as utilization can be applied by the public as a traditional medicinal plant which can reduce body weight.
This study using 24 male Sprague Dawley rats were divided into four groups (n = 6), the normal group (N), control obesity (KO), Piper crocatum extract dose 1260 mg/kgBW (SMA), and Piper crocatum extract dose 1890 mg/kgBW (SMB). Body weight changes of the rats was monitored and analyzed every week. Measurement of liver fat content is done by using spectrophotometric kit from BiovisionTM, and metabolic liver enzyme levels (pAMPK, ACC, FAS) using ELISA
kit from CusabioTM.
gain is -4.52%, with the lowest levels of triglycerides, fatty acids and ACC (47,69 mg/g; 3,78 mg/g and 9,13 ng/g liver tissue) although the values were not significant, and also the lowest level of FAS (360,68 ng/g) which was statistically significant (p <0.05). pAMPK levels in the treatment group was not significantly different from the control group. This shows that the extract of Piper crocatum can not activated AMPK enzyme, but it is able to inhibit the level of ACC and FAS in liver tissue.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
AKTIVITAS ANTIOBESITAS EKSTRAK SIRIH MERAH
(
Piper crocatum
) TERHADAP OBESITAS YANG DIINDUKSI
PAKAN TINGGI LEMAK PADA TIKUS
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tesis : Aktivitas Antiobesitas Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) Terhadap Obesitas yang Diinduksi Pakan Tinggi Lemak pada Tikus Nama : Husnawati
NIM : G851130081
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua Dr Mega Safithri SSi MSi Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Biokimia
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2014 hingga Februari 2015 ini ialah antiobesitas, dengan judul Aktivitas Antiobesitas Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) Terhadap Obesitas yang Diinduksi Pakan Tinggi Lemak pada Tikus.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr drh Maria Bintang MS dan Ibu Dr Mega Safithri SSi MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberi saran, arahan dan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini dengan baik. Terima kasih pula kepada Departemen Kesehatan (Depkes) RI untuk bantuan dana penelitiannya melalui program Riset Pembinaan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran (Risbin Iptekdok) tahun 2014. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Inda Setyawati MSi, Galih Tridarna Poetra Ssi, Pamungkas Rizki Ferdian dan Martini Hudayanti Ssi selaku tim peneliti Risbin Iptekdok yang telah membantu selama proses penelitian dan pengumpulan data.
Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada suami tercinta Agung Nugraha SPsi, ayahanda Syaiful Amri STK, ibunda Darfitri SPd, Hj. Anih Rosidah, serta anak-anakku tercinta (Azka, Arfah, Fatih) atas segala doa, kasih sayang, motivasi dan kesabaran yang telah diberikan kepada penulis selama ini. Ungkapan terima kasih tak lupa penulis sampaikan juga kepada rekan-rekan S2 Biokimia angkatan 50 atas kebersamaan dan dukungan selama masa studi berlangsung.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat tidak hanya bagi penulis tetapi juga bagi pengembangan tanaman obat di Indonesia.
Bogor, Agustus 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Hipotesis Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
METODE 3
Waktu dan Tempat 3
Bahan dan Alat 3
Prosedur Penelitian 3
Pengeringan Daun Sirih Merah 3
Pengukuran Kadar Air 3
Pembuatan Ekstrak Air Daun Sirih Merah 4
Hewan Percobaan 4
Nekropsi, Pengambilan Sampel dan Fiksasi Hati Tikus 5
Pengukuran Profil Lipid Organ Hati 5
Pengukuran Enzim Metabolik Homogenat Hati Tikus 5
Analisis Data 6
HASIL 6
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah 6
Bobot Badan Tikus 6
Kadar Lipid Organ Hati 8
Kadar Enzim pAMPK, ACC dan FAS Homogenat Hati Tikus 9
PEMBAHASAN 10
SIMPULAN DAN SARAN 18
Simpulan 18
Saran 19
DAFTAR PUSTAKA 19
LAMPIRAN 23
DAFTAR TABEL
1 Pembagian kelompok tikus percobaan 5
2 Hasil pengukuran kadar air dan rendemen ekstrak air daun sirih merah 6
3 Perbandingan bobot badan tikus SD 8
4 Perubahan bobot badan tikus tiap kelompok 8
DAFTAR GAMBAR
1 Perkembangan bobot badan tikus selama masa induksi obes 7
2 Perbandingan kadar lipid hati tikus 9
3 Perbandingan kadar enzim metabolik hati 10
4 Metabolisme lipid dalam tubuh 15
5 Mekanisme aktivasi AMPK serta pengaruhnya terhadap regulasi
metabolisme karbohidrat dan lipid 16
6 Proses sintesis asam lemak di dalam sel melalui jalur glikolisis 17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Bagan alir penelitian 23
2 Diagram alir pembuatan ekstrak air daun sirih merah 24
3 Kadar air daun sirih merah 25
4 Contoh perhitungan rendemen ekstrak daun sirih merah 25 5 Data hasil penilaian indeks Lee minggu ke-12 26 6 Kurva standar pengukuran kadar trigliserida teknik spektrofotometer
pada panjang gelombang 574 nm 27
7 Absorbansi pengukuran kadar trigliserida jaringan hati dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 574 nm 27 8 Kurva standar pengukuran kadar kolesterol teknik spektrofotometer
pada panjang gelombang 573 nm 29
9 Absorbansi pengukuran kadar kolesterol jaringan hati dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 573 nm 29 10 Kurva standar pengukuran kadar asam lemak bebas dengan teknik
spektrofotometer pada panjang gelombang 573 nm 30 11 Absorbansi pengukuran kadar asam lemak bebas di jaringan hati
dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 573 nm 30 12 Kurva standar pengukuran kadar AMPK dengan metode ELISA pada
panjang gelombang 450 nm 31
13 Absorbansi pengukuran kadar AMPK di jaringan hati dengan metode
ELISA pada panjang gelombang 450 nm 31
14 Kurva standar pengukuran kadar ACC dengan metode ELISA pada
15 Absorbansi pengukuran kadar ACC di jaringan hati dengan metode
ELISA pada panjang gelombang 450 nm 32
16 Kurva standar pengukuran kadar FAS dengan metode ELISA pada
panjang gelombang 450 nm 33
17 Absorbansi pengukuran kadar FAS di jaringan hati dengan metode
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Obesitas merupakan permasalahan yang mendapat perhatian serius di dunia kesehatan saat ini, karena kondisi obesitas dapat menjadi faktor pencetus penyakit-penyakit lain yang dapat membahayakan jiwa. Banyak studi membuktikan bahwa obesitas dapat mengarah pada kondisi sindrom metabolik dan menjadi prekursor intermediet pada penyakit jantung, diabetes mellitus tipe 2, stroke, dan kanker (Cornier et al. 2008; Eckel et al. 2004; Field et al. 2001). Data WHO menyatakan bahwa 1,6 miliar orang dewasa memiliki berat badan berlebih (overweight) dan 400 juta diantaranya mengalami obesitas atau kegemukan (WHO 2011). Prevalensi obesitas di Indonesia berdasarkan data Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007 menunjukkan bahwa obesitas umum pada penduduk berusia ≥ 15 tahun adalah 10,3 % (Depkes RI 2009).
Obesitas terjadi karena adanya akumulasi lemak di tubuh atau jaringan adiposa yang berlebih atau abnormal. Akumulasi lemak ini umumnya diakibatkan oleh kalori yang keluar lebih sedikit daripada kalori yang masuk. Angka kejadian obesitas meningkat dengan pesat akibat pola hidup tidak aktif, selain karena faktor genetik. Energi dari aktivitas fisik sehari-hari yang digunakan berkurang seiring globalisasi dan kemajuan teknologi. Ketidakseimbangan energi yang masuk dari makanan dengan energi yang dikeluarkan tubuh, jika terjadi dalam waktu lama (kronis) dapat menyebabkan obesitas (Mushtaq et al. 2011).
Beberapa studi yang meneliti tentang efek antiobesitas dari tanaman-tanaman obat telah banyak dilakukan (George dan Nimmi 2011; Hasani-Ranjbar et al. 2013). Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu tanaman tradisional Indonesia yang telah banyak diteliti dan dimanfaatkan sebagai tanaman obat. Ekstrak air daun sirih merah mengandung flavonoid, tanin, dan alkaloid. Kandungan tanin dan alkaloid dari ekstrak air daun sirih merah jumlahnya lebih banyak daripada ekstrak etanol 30% (Suhermanto 2013). Menurut George dan Nimmi (2011), tanaman obat yang memiliki efek antiobesitas sebagian besar mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, dan saponin.
Penelitian Safithri (2012) membuktikan bahwa ekstrak sirih merah memiliki efek antihiperglikemik, yaitu pada dosis optimum 1260 mg/kgBB yang ditandai dengan penurunan kadar glukosa darah yang signifikan pada tikus Sprague dawley
diabetes yang diberi streptozotosin, juga dapat mencegah kenaikan kadar lipid darah, serta tidak bersifat toksik pada hati dan ginjal tikus hingga dosis 1890 mg/kgBB selama 1 bulan pemberian. Berdasarkan efek tersebut, ekstrak sirih merah diduga memiliki kemampuan untuk memperbaiki kondisi obesitas dan kejadian sindrom metabolik. Hutchinson et al. (2008) menemukan bahwa obat-obatan yang digunakan secara klinis untuk terapi DM tipe 2 (seperti metformin dan glitazon), mampu menurunkan kadar gula dalam darah melalui mekanisme aktivasi enzim
AMP-Activated Protein Kinase (AMPK). Mekanisme ini tidak tergantung pada jalur sinyal insulin, sehingga menjadikan AMPK sebagai target terapi yang menjanjikan pada pengobatan DM dan obesitas.
2
dalam biosintesis asam lemak (Gybina dan Prohaska, 2008). Aktivasi AMPK secara tidak langsung juga mengakibatkan inhibisi enzim Fatty Acid Synthase (FAS) yang berperan dalam lipogenesis (Lim 2010).
Perumusan Masalah
Selama ini belum pernah dilakukan penelitian mengenai efek antiobesitas dari ekstrak air daun sirih merah yang didapat melalui metode refluks. Kandungan tanin, flavonoid dan alkaloid pada ekstrak sirih merah diduga mampu memberi efek antiobesitas. Aktivitas antiobesitas ekstrak sirih merah serta analisisnya terhadap kadar lipid dan enzim metabolik hati perlu diuji secara in vivo untuk mengetahui pengaruhnya terhadap penurunan bobot badan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengevaluasi perbaikan kondisi obesitas tikus melalui penurunan bobot badan, mengukur kadar lipid hati (trigliserida, kolesterol, asam lemak bebas) dan mengukur kadar enzim yang berperan dalam metabolisme lipid (pAMPK, ACC, FAS) di hati tikus obes, setelah pemberian ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB dan 1890 mg/kgBB.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat memberi manfaat dari sisi teoritikal dan praktikal. Secara teoritikal, hasil penelitian ini dapat memberikan informasi tentang mekanisme biomolekular efek antiobesitas terkait aktivitas enzim AMPK, ACC dan FAS oleh tanaman sirih merah. Secara praktikal, hasil penelitian ini dapat diaplikasikan oleh masyarakat sebagai tanaman obat tradisional yang mampu menurunkan berat badan.
Hipotesis Penelitian
Ekstrak air daun sirih merah mampu menurunkan bobot badan tikus, meningkatkan AMP-activated protein kinase yang terfosforilasi (pAMPK), menghambat Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) dan Fatty Acid Synthase (FAS), serta menurunkan kadar trigliserida, kolesterol dan asam lemak bebas di hati tikus obes.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini terdiri atas tiga tahapan, yaitu (1) pembuatan ekstrak air daun sirih merah dengan menggunakan metode refluks; (2) masa induksi obes pada tikus
3
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Mei 2014 hingga Februari 2015. Pemeliharaan hewan coba dilakukan di Rumah Sakit Hewan (RSH) IPB, sedangkan pengujian sampel dilakukan di Laboratorium Departemen Biokimia FMIPA IPB.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun sirih merah (Piper crocatum), 24 ekor tikus Sprague dawley, pakan tinggi lemak yang terdiri atas 1% kolesterol, 5% kuning telur, 1% minyak kelapa, 10% lemak kambing dan 83% pakan standar. Analisis sampel organ hati menggunakan reagen kit dari BioVision (trigliserida, total kolesterol, dan asam lemak bebas), serta kit ELISA dari Cusabio: rat phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase (pAMPK) (CSB-E11337r), rat acetyl-coA carboxylase 1(ACC) (CSB-EL001119RA), dan rat fatty acid synthase (FAS) (CSB-E16440r).
Alat-alat yang digunakan adalah oven, pengayak 40 mesh, kertas Whatman 90 mm, waterbath, penangas air, rotary vacuum evaporator, desikator, kuvet, spektrofotometer Spectrostar Nano BMG Labtech, alat vortex, kandang tikus, tissue homogenizer (Pyrex), sentrifusa berpendingin berkecepatan tinggi Beckman, ELISA reader Biorad.
Prosedur Penelitian
Pengeringan Daun Sirih Merah (Suhermanto 2013)
Sampel daun sirih merah diambil secara acak lalu dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan. Daun sirih merah kemudian ditimbang bobotnya dan dikeringkan selama 5 hari dalam oven 50 °C. Daun yang sudah kering kemudian dihancurkan dengan blender dan diayak pada saringan dengan ukuran 40 mesh. Hasil pengayakan diperoleh serbuk yang disebut sebagai simplisia.
Pengukuran Kadar Air (Suhermanto 2013)
4
(Bobot cawan + isi) – (Bobot cawan kosong)
% Bobot kering (BK) = X 100%
Bobot Simplisia % Kadar air = 100 % - % BK
Pembuatan Ekstrak Air Daun Sirih Merah (Modifikasi Metode Depkes 2000)
Serbuk kering daun sirih merah sebanyak 100 g kemudian diekstraksi dengan 1 L air (1:10) selama 2 jam pada suhu 100 °C secara refluks. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dengan kertas saring. Ekstraksi diulang tiga kali. Hasil ekstrak dikeringkan dengan menggunakan rotary vacuum evaporator suhu 50 oC sehingga
diperoleh ekstrak kasar daun sirih merah. Rendemen ekstrak dihitung dengan menggunakan rumus:
% rendemen = Bobot ekstrak X 100 % Bobot simplisia terkoreksi
Hewan Percobaan
24 ekor tikus Sprague dawley (SD) usia 5 minggu yang diperoleh dari laboratorium hewan coba FKH IPB, diadaptasi selama 2 minggu pada kondisi ruang dengan suhu 24 ± 1º C, siklus terang/gelap selama 12 jam, kelembaban berkisar 55-75%, serta diberi pakan standar dan air bersih (OECD Guideline for the testing of chemicals 1995). Penelitian ini dilakukan dibawah pengawasan Komisi Etik Hewan RSH IPB.
Tikus kemudian dibagi secara acak menjadi dua kelompok, yaitu 6 ekor di kelompok normal (N) yang hanya diberi pakan standar hingga akhir perlakuan, sedangkan 18 ekor sisanya diberi pakan tinggi lemak selama 12 minggu, lalu diperiksa tingkat obesitasnya. Tikus dinyatakan obes jika nilai indeks obesitas Lee > 0,3 (Campos et al. 2008) atau menunjukkan perbedaan bobot badan lebih dari 50 % dibandingkan dengan tikus kontrol.
= ( () )
(Campos et al. 2008)
5 setiap hari dengan menggunakan sonde, sesuai bobot badan tikus dan tidak lebih dari 2 ml/100 g bobot badan (OECD 1995).
Tabel 1. Pembagian kelompok tikus percobaan
Jenis Tikus Perlakuan Jumlah (n)
Kontrol Normal (N) Pakan standar + cekok akuades 6 Kontrol Obes (KO) Pakan standar + cekok akuades 6 Obesitas Sirih Merah dosis A
(SMA) Pakan standar + cekok ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB 6 Obesitas Sirih Merah dosis B
(SMB) Pakan standar + cekok ekstrak sirih merah dosis 1890 mg/kgBB 6
Nekropsi, Pengambilan Sampel dan Fiksasi Hati Tikus (Harlan 2008)
Perlakuan diakhiri dengan cara terminasi tikus menggunakan Ketamine 80 mg/kgBB dan xylazine 10 mg/kgBB. Tikus yang sudah tidak sadar lalu dibedah dengan melakukan sayatan sepanjang toraks sampai pubis, kemudian organ hati dinekropsi. Organ dicuci dengan aquades berulang-ulang hingga bersih dari darah, kemudian dilanjutkan dengan mencuci organ dengan NaCl 0,9 % (b/v) dingin. Organ hati lalu ditiriskan di atas kertas saring, kemudian dimasukkan dalam pot berisi larutan NaCl fisiologis untuk proses fiksasi.
Pengukuran Profil Lipid Organ Hati (Biovision 2014)
Lipid yang dianalisis dari organ hati adalah trigliserida, kolesterol, dan asam lemak bebas dengan menggunakan kit kolorimetrik dari Biovision (Katalog # K622-100, K603-100, K612-100). Sampel jaringan hati terlebih dahulu diekstraksi menggunakan homogenizer, kemudian disentrifus selama 2-5 menit menggunakan mikrosentrifus berpendingin. Sampel homogenat hati tikus yang digunakan untuk pengukuran kadar trigliserida dan asam lemak bebas adalah 10 µl, sedangkan untuk kolesterol adalah 5 µl.
Larutan standar dan sampel dipipet ke dalam tiap sumuran plat, lalu diencerkan dengan buffer kit hingga 50 µl. Tiap sumuran kemudian direaksikan dengan 50 µl reagen kit dan diinkubasi di suhu 37 oC selama 1 jam. Warna yang
terbentuk diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer Spectrostar Nano BMG Labtech pada panjang gelombang 570 nm.
Pengukuran Enzim Metabolik Homogenat Hati Tikus (Cusabio 2014)
Pengukuran kadar enzim AMPK, ACC, dan FAS dilakukan dengan menggunakan kit ELISA dari Cusabio, Sampel diambil dari homogenat hati tikus yang dibuat dengan cara membilas 100 mg jaringan hepar dengan 1 ml PBS dan disimpan selama 18 jam pada suhu -20 oC. Sampel disentrifus selama 5 menit pada
kecepatan 5000 g, pada suhu 2-8 oC sesaat sebelum digunakan.
Larutan standar dan sampel dipipet ke dalam tiap sumuran plat, lalu diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 oC. Cairan dalam tiap sumur lalu dibuang,
6
dimana pada setiap tahap penambahan dilakukan pengambilan cairan, pencucian dan inkubasi pada suhu 37 oC. Stop solution sebanyak 50 µl ditambahkan pada tiap
sumuran untuk menghentikan reaksi. Warna yang muncul diukur absorbansinya dengan ELISA Reader BioRad pada panjang gelombang 450 nm.
Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis secara statistik sesuai metode Rancangan Acak Lengkap (RAL). Pengaruh perbedaan perlakuan antar kelompok dianalisis menggunakan uji ANOVA satu arah dengan tingkat kemaknaan (Level of Significancy) α = 0,05. Jika hasil uji ANOVA menunjukkan adanya pengaruh perbedaan perlakuan terhadap respon yang diamati, dilakukan uji lanjut Tukey untuk melihat signifikansi perbedaan dari masing-masing kelompok perlakuan.
HASIL
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Penilaian kadar air dilakukan untuk menentukan keberhasilan proses pengeringan daun sirih merah melalui pemanasan di oven. Kadar air yang didapat akan dipakai pada proses perhitungan rendemen. Penentuan kadar air juga bertujuan untuk mengetahui keamanan daya simpan simplisia.
Analisis kadar air daun sirih merah dilakukan sebelum tahap ekstraksi. Hasil pengeringan dengan oven didapatkan kadar air simplisia sebesar 6,12 % (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa simplisia sudah berada dalam keadaan kering dan aman disimpan sebelum digunakan untuk ekstraksi karena kadar air dibawah 12 % dapat mencegah terjadinya proses enzimatik dan kerusakan oleh mikroba (Manoi 2006).
Rendemen ekstrak adalah perbandingan bobot ekstrak suatu bahan dengan bobot simplisia. Rendemen ekstrak yang tinggi menunjukkan bahwa jumlah zat yang tersari dari simplisia tinggi. Hasil perhitungan persen rendemen ekstrak air daun sirih merah yang dibuat dengan metode refluks pada suhu 100 oC didapatkan
sebesar 12,68 % (Tabel 2).
Tabel 2 Hasil pengukuran kadar air dan rendemen ekstrak air daun sirih merah
Parameter Nilai (%)
Kadar air simplisia daun sirih merah 6,12 Rendemen ekstrak air daun sirih merah 12,68
Bobot Badan Tikus
7 hanya diberi pakan standar (Gambar 1). Perbedaan bobot badan ini mulai terlihat setelah minggu ke-8 pemberian pakan tinggi lemak. Hasil pengukuran didapat rerata bobot badan tikus kelompok normal adalah 260,4 g sedangkan rerata bobot badan tikus yang diberi pakan obes adalah 390,8 g. Perbedaan rerata bobot badan antara kelompok normal dengan kelompok obes mencapai lebih dari 50 %.
Indeks obesitas Lee menunjukkan nilai < 0,3 pada tikus kelompok N sedangkan tikus kelompok KO, SMA, dan SMB berhasil mencapai indeks Lee > 0,3. Hasil indeks Lee tersebut menunjukkan bahwa kelompok tikus KO, SMA dan SMB telah mencapai kondisi obes. Penilaian secara statistik menunjukkan
perbedaan bobot badan yang signifikan antara kelompok normal dengan kelompok tikus obes (p < 0,001).
Gambar 1 Perkembangan bobot badan tikus selama masa induksi obes
Tikus yang telah dinyatakan obes lalu dibagi menjadi 3 kelompok yaitu kelompok KO, SMA, dan SMB. Pembagian dilakukan sedemikian rupa sehingga bobot badan ketiga kelompok tidak berbeda nyata (Tabel 3). Kelompok tikus obes tidak langsung diberi perlakuan tetapi dialihkan pakannya dari pakan tinggi lemak ke pakan standar. Periode ini disebut masa “Washing Out” (WO) yang berlangsung selama 4 minggu. Tujuannya adalah untuk melihat pengaruh perubahan pakan tanpa disertai perlakuan tambahan. Hasil yang diperoleh adalah terjadi penurunan bobot badan pada tikus obes, tetapi perubahan ini tidak lebih dari 3 % (Tabel 4). Perbedaan bobot badan kelompok normal dan obes di masa WO masih signifikan secara statistik (p < 0,05).
Penimbangan bobot badan terakhir dilakukan setelah 2 minggu perlakuan pencekokan. Kelompok N dan KO dicekok akuades, sedangkan kelompok SMA dan SMB dicekok dengan ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB dan 1890 mg/kgBB, sehingga stresor yang diterima tiap kelompok adalah sama. Hasil pengukuran bobot badan akhir didapatkan adanya penurunan bobot badan hanya pada kelompok SMA dengan rerata bobot badan 370,7 gram, lebih rendah daripada kelompok normal dengan rerata 385,7 g sedangkan rerata bobot badan kelompok KO adalah yang paling tinggi (418,03 g). Analisa secara statistik menunjukkan bahwa bobot badan akhir semua kelompok sudah tidak memiliki perbedaan yang signifikan (p > 0,05).
Pemberian pakan tinggi lemak minggu
8
Tabel 3 Perbandingan bobot badan tikus SD
Perlakuan Bobot Badan Tikus (g)
a
aAngka-angka pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Tukey)
Hasil pengukuran bobot badan tikus dari awal hingga akhir perlakuan menunjukkan bahwa ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB memiliki kemampuan menurunkan bobot badan tikus hingga hingga di bawah bobot badan kelompok normal, yaitu sebesar 4,52 % (Tabel 4). Kelompok tikus N, KO, dan SMB menunjukkan peningkatan bobot badan dengan nilai 46,7 %, 6,5 %, dan 2,9 % pada akhir perlakuan.
Tabel 4 Perubahan bobot badan tikus tiap kelompok
Perlakuan Persen perubahan BB tikus antar periode (%) Awal – WO WO – akhir Awal – Akhir
Pengukuran kadar lipid organ hati bertujuan untuk mengetahui perbandingan kadar trigliserida, kolesterol dan asam lemak bebas antar kelompok perlakuan. Hasil pengukuran secara spektrofotometri dan analisa statistik menunjukkan bahwa kadar trigliserida, kolesterol dan asam lemak bebas di hati tikus antar kelompok tidak berbeda nyata (p > 0,05), tetapi secara deskriptif terlihat bahwa kadar trigliserida kelompok tikus yang diberi ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB merupakan yang paling rendah dibandingkan kelompok lainnya (Gambar 2), yaitu sebesar 47,69±24,56 mg/g sedangkan kadar trigliserida kelompok normal, kontrol obes, dan ekstrak sirih merah dosis 1890 mg/kgBB berturut-turut adalah 51,98±17,73; 58,05±26,70; dan 52,77±16,96 mg/g jaringan hati.
9 Hasil pengukuran kadar lipid hati menunjukkan kesesuaian dengan hasil pengukuran bobot badan akhir, dimana kelompok sirih merah dosis 1260 mg/kgBB (SMA) memiliki bobot badan dan kadar trigliserida yang paling rendah dibandingkan kelompok lainnya. Hal ini disebabkan adanya hambatan pada metabolisme lipid yang mengakibatkan penyimpanan lipid dalam tubuh menjadi terganggu.
Gambar 2 Perbandingan kadar lipid hati tikus. Huruf yang sama di atas balok menunjukkan bahwa data yang diperoleh tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (Tukey)
Kadar Enzim pAMPK, ACC dan FAS Homogenat Hati Tikus
Pengukuran kadar enzim pAMPK, ACC dan FAS dengan metode ELISA bertujuan untuk mengetahui perbandingan kadar enzim-enzim tersebut antar tiap kelompok. Kadar pAMPK antara semua kelompok secara statistik tidak berbeda nyata (p>0,05). Kadar tertinggi adalah pada kelompok normal sebesar 8,42 ng/g, sedangkan nilai paling rendah adalah pada kelompok sirih merah dosis 1260 mg/kgBB yaitu 7,21 ng/g. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak sirih merah tidak mampu mengaktivasi AMPK menjadi pAMPK dengan kadarnya yang justru lebih rendah daripada kelompok normal.
Kadar ACC antara semua kelompok secara statistik juga tidak berbeda nyata (p>0,05), tetapi secara deskriptif dapat dilihat pada Gambar 3, bahwa kadar ACC paling rendah adalah pada kelompok yang diberi ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB (SMA) dengan rerata 9,13 ng/g. Hasil ini menunjukkan adanya penghambatan terhadap enzim ACC oleh ekstrak sirih merah.
Kadar FAS paling rendah juga didapatkan pada kelompok SMA dengan rerata 360,68 ng/g yang berbeda nyata dengan kelompok kontrol obes (p<0,05). Hasil ini
10
jika dihubungkan dengan bobot badan tikus di akhir perlakuan adalah sesuai, karena kelompok SMA memiliki bobot badan paling kecil dibandingkan kelompok lainnya.
(a)
(b) (c)
Gambar 3 Perbandingan kadar enzim metabolik hati: (a) AMPK; (b) ACC; (c) FAS. Tanda (*) menunjukkan bahwa nilai pada kelompok tersebut berbeda nyata dibandingkan dengan kelompok yang lain
PEMBAHASAN
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Sampel dari tanaman segar sebelum diekstraksi harus dikeringkan terlebih dahulu untuk menghilangkan air bebas maupun terikat secara fisis pada sampel agar terhindar dari aktivitas mikroba. Penentuan kadar air dilakukan setelah proses pengeringan untuk mengetahui jumlah kandungan air pada sampel. Perbedaan cara pengeringan berpengaruh terhadap perbedaan kadar air suatu simplisia (Manoi (2006). Cara pengeringan yang sering dilakukan untuk menghasilkan simplisia tanaman adalah pengeringan dengan diangin-anginkan, matahari, oven maupun kombinasi antara keduanya. Ekstrak sirih merah pada penelitian ini dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 50 oC selama 5 hari. Cara ini dipilih karena
11 mempertimbangkan kondisi cuaca saat penelitian dimulai. Kadar air yang diperoleh yaitu 6,12% telah memenuhi standar Depkes (2008) yang menyatakan bahwa sampel dengan kadar air kurang dari 10% memiliki ketahanan simpan yang baik dan aman dari cemaran mikroba.
Ekstraksi simplisia daun sirih merah dilakukan menggunakan metode refluks dengan pelarut air. Pemilihan metode refluks dengan pelarut air didasari oleh kebiasaan masyarakat dalam penggunaan daun sirih merah sebagai tanaman obat tradisional yaitu dengan pemanasan melalui proses perebusan. Pemilihan pelarut didasari oleh aturan BPOM (2004) yang menyatakan bahwa pelarut yang diperbolehkan dan aman untuk pangan adalah air dan etanol 30%. Penelitian Suhermanto (2013) terkait ekstraksi daun sirih merah dengan metode refluks menunjukkan bahwa kandungan tanin dan alkaloid dari ekstrak air daun sirih merah jumlahnya lebih banyak daripada ekstrak etanol 30%, karena itu pelarut yang dipilih pada penelitian ini adalah air.
Hasil pengukuran rendeman ekstrak diperoleh sebesar 12,68 %. Nilai ini sedikit lebih besar daripada nilai rendemen ekstrak air pada penelitian Suhermanto (2013) yaitu 11,94 %. Nilai rendemen yang tidak terlalu berbeda diperkirakan akan memberi hasil senyawa fitokimia yang tidak jauh berbeda pula, karena itulah pada penelitian ini tidak dilakukan lagi uji fitokimia, mengingat metode ekstraksi yang dilakukan sama dengan penelitian Suhermanto (2013).
Menurut Voigt (1995) proses ekstraksi terdiri atas dua fase yaitu fase pembilasan dan fase ekstraksi. Fase pembilasan merupakan fase kontak langsung antara pelarut dengan sel-sel yang rusak atau tidak utuh lagi dari simplisia sehingga komponen di dalam sel akan berpindah ke dalam pelarut. Serbuk simplisia yang semakin halus menghasilkan proses pembilasan yang lebih optimal. Fase ekstraksi merupakan fase dimana cairan pelarut menembus membran sel yang masih utuh sehingga terjadi pembengkakan pada sel dan disolusi komponen sel ke cairan pelarut yang berhasil masuk, dengan adanya perbedaan konsentrasi antara pelarut di dalam sel dan di luar sel maka akan terjadi difusi. Ukuran partikel padatan menjadi salah satu faktor yang penting dalam proses ekstraksi. Ukuran partikel yang semakin kecil akan memiliki luas permukaan kontak yang lebih luas, sehingga akan memaksimalkan kesempatan pelarut untuk mengekstraksi simplisia.
Ekstrak yang diproduksi dengan teknik dan jenis pelarut yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan zat aktif yang terlarut, baik secara jenis maupun jumlah. Ekstraksi daun sirih merah dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain teknik maserasi menggunakan etanol 70% (Alfarabi et al. 2010; Dewi et al. 2014), ekstraksi dengan metanol (Wicaksono et al. 2009), dan metode refluks dengan pelarut air (Safithri 2012) dan etanol 30% (Suhermanto 2013; Suci 2014). Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian-penelitian tersebut, perbedaan teknik ekstraksi tersebut menghasilkan senyawa metabolit yang sama, yaitu flavonoid, tanin dan alkaloid, tetapi dengan kadar yang berbeda-beda.
Bobot Badan Tikus
12
hanya dalam 2 minggu perlakuan. Hal inilah yang merupakan efek antiobesitas yang diharapkan pada penelitian ini, bahwa kombinasi pakan normal dengan pemberian ekstrak sirih merah mampu menurunkan bobot badan hingga di bawah kelompok normal.
Terdapat beberapa jenis tikus yang dapat digunakan untuk penelitian obesitas, yaitu tikus yang obes secara genetik (misalnya tikus Zucker) dan tikus yang obes karena diinduksi pakan tertentu (misalnya Sprague dawley, Wistar). Penelitian ini menggunakan tikus Sprague dawley karena model yang diperlukan pada penelitian ini adalah model hewan yang obes karena diet (diet induced obese, DIO) yang merupakan penyebab terbesar kejadian obesitas pada manusia, bukan obesitas karena genetik. Studi pustaka diperoleh bahwa Cedernaes et al. (2013), Davidson
et al. (2010) dan Wang et al. (2012) juga menggunakan model tikus ini dalam penelitiannya dan menunjukkan peningkatan bobot badan yang signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok obes.
Berdasarkan penelitian Davidson et al. (2010) tikus Sprague dawley jantan yang diberi pakan tinggi lemak selama 32 minggu menghasilkan perubahan bobot badan yang berbeda signifikan dengan kelompok tikus yang diberi pakan standar dan perbedaan bobot badan mulai tampak pada minggu keempat pemberian pakan tinggi lemak dan terus bertahan hingga minggu ke-32. Hasil yang sedikit berbeda dengan penelitian ini karena kelompok tikus yang diberi pakan tinggi lemak baru menunjukkan perbedaan bobot badan setelah 8 minggu pemberikan pakan tinggi lemak. Perbedaan ini dikarenakan perbedaan usia tikus saat dimulainya penelitian. Davidson et al. (2010) menggunakan tikus SD berusia 12 minggu, sedangkan pada penelitian ini usia tikus saat dimulai pemberian pakan tinggi lemak adalah 6-7 minggu, tetapi jika dilihat usia tikus ketika mulai mengalami perbedaan bobot badan dengan kelompok kontrol adalah sama pada kedua penelitian ini, yaitu pada saat tikus berusia 15-16 minggu. Hal ini mungkin dikarenakan bahwa penumpukan lemak dari konsumsi pakan tinggi lemak baru mulai terjadi pada saat tikus berusia lebih dari 15 minggu. Tikus yang berusia di bawah 15 minggu masih menggunakan lemak untuk proses pertumbuhannya. Hasil ini sesuai dengan penelitian Sanguino
et al. (2004) yang menyatakan bahwa tikus Sprague dawley menunjukkan banyak gejala sindrom metabolik ketika mereka menjadi tua, salah satunya adalah obesitas.
Penelitian Davidson et al. (2010) juga menunjukkan bahwa rerata tekanan darah arterial, insulin serum puasa, kadar leptin, asam lemak bebas dan kadar adiponektin di serum meningkat signifikan pada tikus yang diberi pakan tinggi lemak dibandingkan dengan tikus yang diberi pakan standar. Kadar kolesterol dan trigliserida serum menunjukkan tren peningkatan pada kelompok tikus yang diberi pakan tinggi lemak, tetapi tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol. Berdasarkan hasil-hasil tersebut, pemberian pakan tinggi lemak pada tikus Sprague dawley terbukti dapat meningkatkan bobot badan, kadar lipid, dan faktor-faktor yang berperan dalam proses obesitas.
13 obesitas (Geer dan Shen 2009). Hormon seks steroid (estrogen, progesteron, androgen) memiliki peran utama dalam metabolisme, regulasi dan distribusi jaringan adiposa. Distribusi normal lemak tubuh akan terjadi jika terdapat hormon seks steroid (Canoy 2008). Hal inilah yang dapat mengganggu tindakan perlakuan obesitas pada hewan coba betina karena memiliki hormon seks steroid yang lebih banyak daripada jantan.
Ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk membuat hewan coba menjadi obes, antara lain pemberian pakan tinggi lemak atau High Fat Diet (HFD) (Cedernaes et al. 2013, Davidson et al. 2010, Wang et al. 2012), pakan tinggi karbohidrat atau gula (High Carbo Diet, HCD) umumnya yang digunakan adalah fruktosa karena mampu menginduksi proses De Novo Lipogenesis (DNL) (Lustig 2010), pakan tinggi energi yang mengkombinasikan lemak dan gula (High Fat and Sugar Diet, HFSD) (Hansen et al. 2011), perlakuan pada hormon Leptin yaitu dengan membuat model defisiensi leptin atau resistensi leptin (Chagnon dan Bouchard 1996, Nakagawa et al. 2003). Pemberian pakan HFD paling banyak digunakan karena prosesnya lebih cepat dan lebih signifikan hasilnya, selain itu tikus yang diberi pakan tinggi lemak umumnya akan mengalami resistensi leptin (Nakagawa et al. 2003).
Karakteristik fisiologis pada model tikus yang obes karena makanan (DIO) adalah adanya resistensi insulin, toleransi glukosa terganggu, dislipidemia dan peningkatan deposisi lemak (Tschop dan Heiman 2001). Peningkatan jaringan adiposa pada penderita obesitas akan menyebabkan akumulasi makrofag dan menyebabkan peningkatan sintesis dan pengeluaran molekul biologis aktif seperti adiponektin, resistin, plasminogen activator inhibitor-1, tumor necrosis factor
(TNF)-α, dan interleukin-6 yang kemudian menyebabkan inflamasi sistemik dan disfungsi endotel pada pembuluh darah arteri (Wang dan Nakayama 2010). Mekanisme inilah yang menghubungkan obesitas sebagai faktor resiko penyakit kardiovaskular. Davidson et al. (2010) juga menemukan bahwa terjadi peningkatan kadar superoksida di aorta, serta peningkatan penanda stres oksidatif di serum pada tikus yang diberi pakan tinggi lemak. Adanya stres oksidatif yang bersifat sistemik merupakan faktor predisposisi terjadinya disfungsi mikrovaskular dan neural, sehingga menyebabkan terjadinya aterosklerosis (Wang dan Nakayama 2010).
Kadar Lipid Organ Hati
Analisis kuantitatif kadar lipid hati didapatkan kadar trigliserida yang lebih rendah pada kelompok tikus yang diberi ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB, walau tidak berbeda secara statistik. Penelitian Poetra (2015) yang mengukur kadar trigliserida, kolesterol, dan asam lemak bebas di serum darah menunjukkan perbedaan yang nyata antara tikus kelompok kontrol dengan tikus yang diberi ekstrak sirih merah. Berdasarkan hal ini dapat dikatakan bahwa pemberian pakan tinggi lemak selama 12 minggu dapat menyebabkan peningkatan kadar lipid darah tetapi belum terlalu mempengaruhi kadar lipid di hati.
14
banyak dan atau lebih besar agar dapat menyimpan kelebihan lipid dalam tubuh. Sel-sel ini dapat mengakibatkan pembentukan lemak secara cepat sehingga dapat terkena obesitas di kemudian hari. Jika jumlah lipid dalam tubuh berkurang, sel-sel adiposa tersebut akan mengecil ukurannya, tetapi akan tetap berada di tempatnya (Walther dan Farese 2012), karena itulah anak yang banyak mendapat asupan lemak memiliki kecenderungan mengalami obes lebih tinggi daripada anak yang mendapat makanan dengan kadar lemak normal.
Sebagian besar makanan yang mengandung lipid umumnya berada dalam bentuk trigliserida, dengan beberapa asam lemak bebas, kolesterol dan jenis sterol yang lain. Tidak seperti diet karbohidrat yang mengandung gula monomerik seperti glukosa dan fruktosa yang diabsorbsi secara langsung ke dalam darah melalui traktus gastrointestinal, lipid masuk ke dalam darah terutama melalui sistema limfatik dalam bentuk partikel lipoprotein kilomikron (Muoio dan Newgard 2006). Setelah masuk ke dalam sirkulasi, kilomikron berinteraksi dengan enzim lipoprotein lipase yang terletak di permukaan luminal dari sel endotel kapiler, menghasilkan hidrolisis trigliserida menjadi asam lemak dan gliserol. Hasil hidrolisis trigliserida ini akan digunakan untuk oksidasi di sel otot menghasilkan energi dalam bentuk ATP, jika tidak digunakan atau jumlahnya berlebih maka akan mengalami sintesis ulang dan disimpan di sel adiposa (Gambar 4).
Selain jaringan adiposa, organ hati memiliki kapasitas yang besar untuk menyimpan lipid. Jaringan adiposa dan hati bertindak sebagai pengendali organ untuk disregulasi metabolik sistemik pada pengaturan kelebihan gizi dan obesitas di hewan dan manusia. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa mediator utama yang berperan pada peningkatan lipid akibat respon inflamasi adalah makrofag yang berada dalam jaringan hati dan adiposa (Arkan et al. 2005; Wellen dan Hotamisligil 2005; Yuan et al. 2001), karena itu penelitian terkait obesitas umumnya menggunakan organ hati sebagai organ yang dianalisis kandungannya.
Jaringan adiposa selain berperan sebagai tempat penyimpanan lemak, juga merupakan organ endokrin penting yang berfungsi memberikan informasi ke otak dan jaringan periferal tentang perubahan status energi tubuh (Muoio dan Newgard 2006). Salah satu substansi vasoaktif yang diproduksi oleh sel adiposa adalah leptin yang merupakan regulator penting pada asupan makan suatu organisme (Wang dan Nakayama 2010). Normalnya ketika cadangan lemak dalam tubuh sudah cukup, sel adiposa akan mengeluarkan leptin yang berfungsi untuk menurunkan nafsu makan. Namun pada penderita obesitas terjadi kondisi defisiensi dan atau resistensi leptin. Pemberian leptin eksogen terbukti mampu menurunkan bobot badan tikus obes melalui mekanisme penurunan nafsu makan (Nakagawa et al. 2003). Tikus-tikus yang diberi ekstrak sirih merah pada penelitian ini mengalami penurunan nafsu makan yang paling tinggi di antara kelompok yang lain.
Kadar Enzim pAMPK, ACC, dan FAS Homogenat Hati Tikus
15 kelompok lain. Ekstrak sirih merah dalam dua tingkatan dosis (1260 dan 1890 mg/kgBB) tidak mampu mengaktivasi enzim AMPK yang ditandai oleh jumlah pAMPK yang tidak berbeda nyata secara statistik, bahkan nilainya lebih rendah dari kelompok normal dan kelompok kontrol obes. Hal ini tidak sesuai dengan hipotesis awal yang mengharapkan adanya efek aktivasi AMPK oleh ekstrak sirih merah seperti yang terjadi pada obat-obat antihiperglikemik.
16
AMP-activated protein kinase (AMPK) merupakan enzim metabolik yang berperan sebagai sensor terhadap status energi selular. Keadaan resistensi insulin, diabetes, sindrom metabolik, dan obesitas merupakan bentuk gangguan keseimbangan energi, disinilah sistem AMPK berperan sebagai regulator utama keseimbangan energi, mulai dari tingkat seluler hingga seluruh tubuh (Hardie 2007).
AMPK yang teraktifasi akan menyebabkan aktifnya jalur katabolik (produksi ATP) dan menonaktifkan jalur anabolik (konsumsi ATP). Mekanisme inilah yang menjadikan AMPK sebagai target terapi pada penyakit-penyakit degeneratif seperti diabetes, kanker, dan sindrom metabolik (Hardie et al. 2012). Ketika AMPK teraktivasi menjadi AMPK yang terfosforilasi (phospho-AMPK/p-AMPK) akan menghambat aktivitas acetyl-coA carboxylase (ACC) dan 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase). Terhambatnya aktivitas ACC menyebabkan peningkatan oksidasi asam lemak dan mengurangi sintesis asam lemak melalui penghambatan fatty acid synthase (FAS), sedangkan terhambatnya aktivitas HMG-CoA reductase dapat mengurangi sintesis kolesterol (Gambar 5). Hal ini menyebabkan kadar trigliserida, asam lemak bebas dan kolesterol di dalam darah menurun (Hu et al. 2010).
Gambar 5 Mekanisme aktivasi AMPK serta pengaruhnya terhadap regulasi metabolisme karbohidrat dan lipid (↓ = stimulasi langsung; ┴ =
17 Aktivasi AMPK merupakan salah satu target strategi yang dilakukan untuk mencegah dan mengobati beberapa penyakit degeneratif seperti diabetes dan kanker (Russo et al. 2013). Beberapa obat yang digunakan secara klinis untuk terapi DM tipe 2 (seperti metformin dan glitazone), menunjukkan adanya aktivasi AMPK. Mekanisme ini tidak tergantung pada jalur sinyal insulin, sehingga menjadikan AMPK sebagai target terapi yang menjanjikan pada pengobatan DM dan obesitas (Hutchinson et al. 2008).
Acetyl-CoA carboxylase (ACC) adalah enzim yang berfungsi mengkatalisis karboksilasi asetil-koA menjadi malonil-koA (Munday 2002), sedangkan fatty acid synthase (FAS) berperan mengkatalisis malonil-koA menjadi asam lemak (Gambar 6). Penghambatan pada kedua enzim ini mengakibatkan penurunan kadar lipid di dalam tubuh, yang merupakan salah satu target terapi pada penanganan obesitas (Shi dan Burn 2004).
Gambar 6 Proses sintesis asam lemak di dalam sel melalui jalur glikolisis (Menendez & Lupu 2007)
18
(2014), flavonoid berperan sebagai antioksidan melalui netralisasi efek dari oksigen dan nitrogen reaktif, sehingga bertindak sebagai agen pelindung terhadap beberapa penyakit. Hasil penelitian mereka menunjukkan bahwa aktivitas antiobesitas dari flavonoid yang diisolasi diperoleh dari adanya aktivitas enzim lipase dan alfa amilase.
Dosis ekstrak sirih merah yang digunakan pada penelitian ini berasal dari penelitian Safithri (2012). Hasil penelitian menunjukkan bahwa efek penurunan bobot badan dan kadar lipid hati serta inhibisi enzim ACC dan FAS pada kelompok dosis 1260 mg/kgBB memberikan hasil yang lebih baik daripada kelompok dosis 1890 mg/kgBB. Hasil tersebut sesuai dengan hasil yang didapat pada penelitian Safithri yang menunjukkan bahwa ekstrak sirih merah dosis 1260 mg/kgBB memiliki efek anti hiperglikemia, yang ditandai oleh penurunan kadar glukosa darah, yang lebih baik dibandingkan kelompok dosis yang lebih tinggi (1890 mg/kgBB) dan dosis lain yang lebih rendah (630 mg/kgBB).
Menurut Mukherjee dan Houghton (2009) senyawa bioaktif dari tanaman obat dan rempah, pada perbandingan tertentu dapat bersifat sinergis dan apabila terlalu besar akan bersifat antagonis. Hal inilah yang diduga terjadi pada hasil penelitian ini. Dosis yang lebih tinggi (1890 mg/kgBB) ternyata tidak menghasilkan efek yang lebih baik daripada dosis yang lebih rendah (1260 mg/kgBB) dikarenakan efek sinergis optimum adalah pada dosis 1260 mg/kgBB. Peningkatan dosis menjadi 1890 mg/kgBB mengakibatkan efek yang diharapkan justru menurun.
Mekanisme antiobesitas tanaman obat terjadi antara lain melalui pengurangan penyerapan lemak lewat penghambatan enzim lipase, mengurangi ambilan energi dengan cara menekan nafsu makan, meningkatkan pengeluaran energi, menghambat diferensiasi dan proliferasi adiposit, serta berperan dalam pengaturan metabolisme lipid (Yun 2010). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air daun sirih merah dosis 1260 mg/kgBB mampu menurunkan bobot badan melalui mekanisme pengaturan metabolisme lipid, yaitu inhibisi terhadap enzim ACC dan FAS yang berperan dalam anabolisme lipid. Berdasarkan penelitian-penelitian sebelumnya, kemampuan ekstrak sirih merah sebagai antiobesitas diduga disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain kemampuannya dalam menurunkan nafsu makan (Rhemalia 2014) ataupun melalui aktivitas antioksidan (Alfarabi et al.
2008) dan penghambatan enzim lipase oleh kandungan flavonoid di dalamnya (Dzomba dan Musekiwa 2014).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
19 tetapi tidak mampu mengaktivasi AMPK. Pemberian ekstrak sirih merah mampu menurunkan aktivitas enzim FAS yang berbeda signifikan dengan kelompok kontrol obes (p < 0,05).
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjut dengan menggunakan kelompok kontrol yang diberi pakan tinggi lemak hingga akhir perlakuan. Kombinasi dengan tanaman obat tradisional lain yang memiliki efek antiobesitas dengan mekanisme yang berbeda perlu diteliti lebih lanjut agar didapatkan ramuan antiobesitas yang lebih baik.
DAFTAR PUSTAKA
Alfarabi M, Bintang M, Suryani, Safithri M. 2010. The comparative ability of antioxidant activity of Piper crocatum in inhibiting fatty acid oxidation and free radical scavenging. Hayati J. Biosci. 17(4): 201-204.
Arkan MC, Hevener AL, Greten FR, Maeda S, Li ZW, Long JM, Wynshaw-Boris A, Poli G, Olefsky J, Karin M. 2005. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nature Medicine. 11(2): 191–198. DOI: 10.1038/ nm1185.
Batra P, Sharma AK. 2013. Anti-cancer potential of flavonoids: recent trends and future perspectives. Biotech. 3: 439-459.
[BioVision]. 2014. Cholesterol/Cholesteryl Ester Quantification Colorimetric/ Fluorometric Kit. California (US): BioVision Incorporated.
[BioVision]. 2014. Free Fatty Acid Quantification Colorimetric/Fluorometric Assay Kit. California (US): BioVision Incorporated.
[BioVision]. 2014. Triglyceride Quantification Colorimetric/Fluorometric Kit. California (US): BioVision Incorporated.
BPOM RI. 2005. Ketentuan Pokok Pengawasan Pangan Fungsional. Peraturan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia No HK 00.05.52.0685.
Campos KE, Volpato GT, Calderon IMP, Rudge MVC, Damasceno DC. 2008. Effect of obesity on rat reproduction and on the development of their adult offspring. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 41(2): 122– 125. DOI: 10.1590/S0100-879X2008005000001.
Canoy D. 2008. Distribution of body fat and risk of coronary heart disease in men and women. Current Opinion in Cardiology. 23(6): 591–598.
Cedernaes J, Alsio J, Vastermark A, Riserus U, Schioth HB. 2013. Adipose tissue stearoyl-CoA desaturase 1 index is increased and linoleic acid is decreased in obesity-prone rats fed a high-fat diet. Lipids in Health and Disease. 12(2): 1-11. DOI: 10.1186/1476-511X-12-2.
Chagnon YC, Bouchard C. 1996. Genetics of obesity: advances from rodent studies.
20
Cornier MA, Dabelea D, Hernandez TL, Lindstrom RC, Steig AJ, Stob NR, Van Pelt RE, Wang H, Eckel RH. 2008. The metabolic syndrome. Endocrine Reviews. 29(7): 777–822. DOI: 10.1210/er.2008-0024.
[Depkes] Departemen Kesehatan. 2000. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta (ID): Depkes RI.
[Depkes] Departemen Kesehatan. 2008. Riset Kesehatan Dasar (Laporan Nasional 2007). Jakarta (ID): Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan.
Davidson EP, Coppey LJ, Calcutt NA, Oltman CL, Yorek MA. 2010. Diet induced obesity in Sprague dawley rats causes microvascular and neural dysfunction.
Diabetes Metab Res Rev. 26(4): 306–318. DOI:10.1002/dmrr.1088.
Dewi YF, Anthara MS, Dharmayudha AAGO. 2014. Efektifitas ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap penurunan kadar glukosa darah tikus putih jantan (Rattus novergicus) yang di induksi aloksan. Buletin Veteriner Udayana.
6(1): 73-79.
Dzomba P, Musekiwa C. 2014. Anti-obesity and antioxidant activity of dietary flavonoids from Dioscorea steriscus tubers. Journal of Coastal Life Medicine. 2(6): 465-470. DOI: 10.12980/JCLM.2.201414B8.
Eckel RH, York DA, Rössner S, Hubbard V, Caterson I, St Jeor ST, Hayman LL, Mullis RM, Blair SN. 2004. American Heart Association: Prevention conference VII obesity, a Worldwide epidemic related to heart disease and stroke: executive summary. Circulation. 110(12): 2968–2975. DOI: 10.1161/01.CIR.0000140086. 88453.9A.
Field AE, Coakley EH, Must A, Spadano JL, Laird N, Dietz WH, Rimm E, Colditz GA. 2001. Impact of overweight on the risk of developing common chronic diseases during a 10-year period. Arch Intern Med. 161(13): 1581 –1586. DOI: 10.1001/archinte.161.13.1581.
Geer EB, Shen W. 2009. Gender differences in insulin resistance, body composition, and energy balance. Gender Medicine. 6(1): 60–75.
George P, Nimmi OS. 2011. Cent percent safe centum plants for antiobesity.
International Journal Of Innovative Technology & Creative Engineering. 1(3): 1-19. [Internet]. [diunduh 2014 Sep 14]. Tersedia pada: http://ia601207.us.archive.org/34/items/IJITCE/IJITCE_Mar4.pdf
Gybina AA, Prohaska JR. 2008. Copper deficiency results in AMP-activated protein kinase activation and acetylCoA carboxylase phosphorylation in rat cerebellum. Brain Research. 1204: 69 – 76. DOI: 10.1016/j.brainres.2008.01.087. Hansen G, Jelsing J, Vrang N. 2011. Effects of liraglutide and sibutramine on food
intake, palatability, body weight and glucose tolerance in the gubra DIO-rats.
Acta Pharmacologica Sinica. 33(11): 194–200. DOI: 10.1038/aps.2011.168. Hardie DG. 2007. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome
and in heart disease (minireview). FEBS Letters. 582(11): 81-89. doi:10.1016/j.febslet.2007.11.018.
Hardie DG, Ross FA, Hawley SA. 2012. AMP-activated protein kinase: a target for drugs both ancient and modern. Chemistry & Biology. 19(10): 1222-1236. DOI: 10.1016/j.chembiol.2012.08.019.
21 Hasani-Ranjbar S, Jouyandeh Z, Abdollahi M. 2013. A systematic review of
anti-obesity medicinal plants - an update. Journal of Diabetes & Metabolic Disorders. 12(1): 28-37. DOI: 10.1186/2251-6581-12-28.
Hu GX, Chen GR, Xu H, Ge RS, Lin J. 2010. Activation of the AMP activated protein kinase by short-chain fatty acids is the main mechanism underlying the beneficial effect of a high fiber diet on the metabolic syndrome. Medical Hyphotheses. 74(1): 123-126. DOI: 10.1016/j.mehy.2009.07.022.
Hutchinson DS, Summers RJ, Bengtsson T. 2008. Regulation of AMP-activated protein kinase activity by G-protein coupled receptors: Potential utility in treatment of diabetes and heart disease. Pharmacology & Therapeutics. 119(5): 291–310. DOI:10.1016/j.pharmthera.2008.05.008.
Lim CT, Kola B, Korbonits M. 2010. AMPK as a mediator of hormonal signalling.
Journal of Molecular Endocrinology. 44: 87–97. DOI: 10.1677/JME-09-0063. Lustig RH. 2010. Fructose: metabolic, hedonic, and societal parallels with ethanol.
J Am Diet Assoc. 110(9):1307-21. DOI: 10.1016/j.jada.2010.06.008.
Manoi F. 2006. Pengaruh cara pengeringan terhadap mutu simplisia sambiloto.
Buletin Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. 17(1): 1 – 5.
Menendez JA, Lupu R. 2007. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nature Reviews Cancer. 7(10): 763-777. DOI: 10.1038/ nrc2222.
Mushtaq MU, Gull S, Mushtaq K, Shahid U, Shad MA, Akram J. 2011. Dietary behaviors, physical activity and sedentary lifestyle associated with overweight and obesity, and their socio-demographic correlates, among Pakistani primary school children. International Journal of Behavioral Nutrition and Physical Activity. 8(1): 30-42. DOI: 10.1186/1479-5868-8-130.
Munday MR. 2002. Regulation of mammalian acetyl-CoA carboxylase.
Biochemical Society Transactions. 30(6): 1059-1064. [Internet]. [diunduh 2015 Jan 13]. Tersedia pada: http://www.biochemsoctrans.org/bst/030/1059/0301059.pdf. Muoio DM, Newgard CB. 2006. Obesity - related derangements in metabolic regulation. Annual Review of Biochemistry. 75: 367–401. DOI: 10.1146/annurev. biochem.75.103004.142512.
Nakagawa T, Ogawa Y, Ebihara K, Yamanaka M, Tsuchida A, Taiji M, Noguchi H, Nakao K. 2003. Antiobesity and antidiabetic effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent models of leptin resistance. International Journal of Obesity. 27: 557–565. DOI:10.1038/sj.ijo.0802265.
OECD. 1995. Guideline For The Testing Of Chemicals Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents. Paris (FR): OECD.
Poetra GT. 2015. Kadar biomarker darah tikus obesitas yang diberi ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Rhemalia CF. 2014. Pengaruh ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum
linn.) Terhadap penurunan berat badan tikus putih jantan [skripsi]. Surabaya (ID): Universitas Katolik Widya Mandala.
Russo GL, Russo M, Ungaro P. 2013. AMP-activated protein kinase: a targated for old drug against diabetes and cancer. Biochemical Pharmacology. 86(3):339-350. DOI: 10.1016/j.bcp.2013.05.023.
22
Sanguino E, Bejarano R, Alegret M, Sa´nchez RM, Va´zquez-Carrera M, Laguna JC. 2004. Sexual dimorphism in lipid metabolic phenotype associated with old age in Sprague–Dawley rats. Experimental Gerontology. 39(7): 1295–1306. DOI:10.1016/j.exger.2004.06.007.
Shaw RJ. 2012. AMPK signaling pathway. Cell Signaling Technology. [Internet]. [diunduh 2014 Mar 13]. Tersedia pada: http://www.cellsignal.com/contents/science-cst-pathways-cellular-metabolism/ampk-signaling-pathway/pathways-ampk?Ntt= AMPK&fromPage=search
Shi Y, Burn P. 2004. Lipid metabolic enzymes: emerging drug targets for the treatment of obesity. Nature Reviews. 3(8): 695-710. DOI:10.1038/nrd1469. Suhermanto. 2013. Profil flavonoid, tanin, dan alkaloid dari ekstrak daun sirih
merah (Piper crocatum) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Suci DAP. 2014. Potensi antikanker ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap sel HeLa [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Tschop M, Heiman ML. 2001. Rodent obesity models: an overview. Expt Clin Endocrinology Diabetes. 109: 307–319.
Thompson TE. 2007. Lipid - biochemistry. Encyclopædia Britannica Online. [Internet]. [diunduh 2014 Mar 12]. Tersedia pada: http://www.britannica.com/ science/lipid/Cholesterol-and-its-derivatives
Voigt R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
[WHO] World Health Organization. 2010. World Health Statistics. Geneva (CH): WHO Pr.
Walther TC, Farese RV. 2012. Lipid droplets and cellular lipid metabolism. Review in Advance. Annual Review of Biochemistry. 81(3): 28.1–28.28. DOI: 10.1146/ annurev-biochem-061009-102430.
Wang L, Meng X, Zhang F. 2012. Raspberry ketone protects rats fed high-fat diets
against nonalcoholic steatohepatitis. Journal of Medicinal Food. 15(5): 495–503. DOI: 10.1089/jmf.2011.1717.
Wang Z, Nakayama T. 2010. Inflammation, a link between obesity and cardio-vascular disease. Mediators of Inflammation. DOI:10.1155/2010/535918 Wellen KE, Hotamisligil GS. 2005. Inflammation, stress, and diabetes. The Journal
of Clinical Investigation. 115(5):1111–1119. DOI: 10.1172/JCI25102.
Wicaksono BD, Handoko YA, Arung ET, Kusuma IW, Yulia D, Pancaputra AN, Sandra F. 2009. Antiproliferative effect of the methanol extract of Piper crocatum ruiz & pav leaves on human breast (T47D) cells in-vitro. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 8(4): 345-352.
Yuan M, Konstantopoulos N, Lee J, Hansen L, Li ZW, Karin M, Shoelson SE. 2001. Reversal of obesity and diet-induced insulin resistance with salicylates or targeted disruption of Ikkbeta. Science. 293(5535): 1673-1677. DOI: 10.1126/ science.1061620 293:1673–77.
Yun JW. 2010. Possible anti-obesity therapeutics from nature – A review.
23 Lampiran 1 Bagan alir penelitian
24 tikus Sprague Dawley umur 5 minggu
Adaptasi selama 1 minggu pada kondisi suhu konstan (24 ± 1 oC), dengan
siklus gelap / terang selama 12 jam dan diberi air bersih dan makanan
6 tikus kontrol
kelompok KO kelompok SMA6 tikus kelompok SMB6 tikus
“Wash out” selama 4 minggu (evaluasi perubahan BB)
Diberi pakan
Evaluasi perubahan BB selama 2 minggu
24
Lampiran 2 Diagram alir pembuatan ekstrak air daun sirih merah
Daun sirih merah segar
Dibersihkan, dirajang dan dikeringkan dalam oven 50 oC
selama 5 hari Daun sirih merah kering
Dihaluskan dengan blender Simplisia
100 g simplisia 2 g simplisia
Direfluks selama 2 jam suhu 100 oC, disaring,
dan filtrat (ampas) dididihkan kembali (2x pengulangan)
Dikeringkan dalam oven 105 oC
selama 3 jam, dilakukan 3x
Ekstrak air Simplisia kering
Serbuk ekstrak air daun sirih
merah
Ditentukan kadar airnya Dikeringkan dengan
alat rotary evaporator
suhu 50 oC
25 Lampiran 3 Kadar air daun sirih merah
No Ulangan Simplisia Bobot
Lampiran 4 Contoh perhitungan rendemen ekstrak daun sirih merah
No Keterangan Nilai
1.
2. Bobot simplisia yang diekstrak Bobot ekstrak yang didapat 100,12 g 13,92 g Bobot simplisia terkoreksi = Bobot simplisia – kadar air
26
Lampiran 5 Data hasil penilaian indeks Lee minggu ke-12
Kelompok Ulangan BB minggu ke-12 (g) Naso-anal (mm) index Lee
Normal 1 245,1 181,0 0,27
2 245,1 176,0 0,28
3 271,2 181,0 0,29
4 271,2 183,0 0,28
5 271,9 201,0 0,26
6 273,1 178,0 0,29
Obes 1 401,2 192,0 0,33
2 399,2 183,0 0,35
3 398,1 187,0 0,34
4 389,1 193,0 0,32
5 398,3 203,0 0,31
6 379,2 193,0 0,32
7 388,1 211,0 0,30
8 387,2 181,0 0,34
9 378,2 183,0 0,34
10 386,2 191,0 0,33
11 392,1 197,0 0,32
12 391,2 211,0 0,30
13 378,2 169,0 0,36
14 390,2 203,0 0,31
15 399,1 203,0 0,31
16 401,7 209,0 0,30
17 398,2 204,0 0,31
27 Lampiran 6 Kurva standar pengukuran kadar trigliserida teknik spektrofotometri
pada panjang gelombang 574 nm
Lampiran 7 Absorbansi pengukuran kadar trigliserida jaringan hati dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 574 nm
28
Contoh perhitungan kadar trigliserida jaringan hati :
Konsentrasi sampel = (Absorbansi terkoreksi – Intersep) nmol/sumur Slope
= 0,964 – 0,00202381 nmol/sumur
0,128978571
= 7,4584 nmol/sumur
No. Keterangan Nilai
1. 2. 3. 4.
Volume sampel yang dimasukkan ke dalam sumur Berat molekul (BM) trigliserida
Volume total ekstrak yang diencerkan (Vtot)
Jumlah pengenceran yang dilakukan (FP)
10 µL 885,4 g/mol
500 µL 10
Jumlah trigliserida per gram sampel (mg/g)
= Kons. sampel x FP x Vtot x BM x 1 x 1 mol x 1000 mg/g
Vol sampel Bobot hati 109 nmol
= 7,458 (nmol) x 10 x 500 µL x 885,4 g/mol x 1 x 1 mol x 1000 mg/g
10 µL 0,050 g 109 nmol
29 Lampiran 8 Kurva standar pengukuran kadar kolesterol teknik spektrofotometri
pada panjang gelombang 573 nm
Lampiran 9 Absorbansi pengukuran kadar kolesterol jaringan hati dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 573 nm
Sampel Absorbansi terkoreksi Konsentrasi (µg/sumur) sampel (g) Bobot hati Jumlah kolesterol per gram sampel (mg/g)
Hepar N 2a 0,177 0,3883 0,0113 1,375
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
30
Lampiran 10 Kurva standar pengukuran kadar asam lemak bebas dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 573 nm
Lampiran 11 Absorbansi pengukuran kadar asam lemak bebas di jaringan hati dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 573 nm
31 Lampiran 12 Kurva standar pengukuran kadar AMPK dengan metode ELISA pada
panjang gelombang 450 nm
Lampiran 13 Absorbansi pengukuran kadar AMPK di jaringan hati dengan metode ELISA pada panjang gelombang 450 nm
Sampel Absorbansi terkoreksi Konsentrasi (pg/ml) sampel (g) Bobot hati gram sampel (ng/g) Jumlah AMPK per
32
Lampiran 14 Kurva standar pengukuran kadar ACC dengan metode ELISA pada panjang gelombang 450 nm
Lampiran 15 Absorbansi pengukuran kadar ACC di jaringan hati dengan metode ELISA pada panjang gelombang 450 nm
Sampel Absorbansi terkoreksi Konsentrasi (pg/ml) Bobot hati sampel (g) gram sampel (ng/g) Jumlah ACC per
