>
=Ah?/-
KERENTANAN DAN GAMBARAN DARAH
IKAN MAS
(Cyprinus
carpio
L) YANG TERINFEKSI
KO1 HEWE? V I R S ( K H V )
ASPRIN TAMBA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Kerentanan dan Gambaran Darah Ikan Mas (Cyprinus Carpio L.) yang Terinfeksi Koi Herpes Virus (KHV) adalah karya saya sendiri dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi'mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Dafar Pustaka dibagian akhir tesis ini.
Bogor, November 2006
Asprin Tamba
ABSTRAK
ASPRIN TAMBA Kerentanan dan Gambaran Darah Ikan Mas (Cyprinus Carpio L) yang Terinfeksi Koi Herpes Virus (KHV). Dibimbing oleh DARNAS DANA dan MARTHEN MALOLE.
Analisis kerentanan dan gambaran darah ikan mas (Cyprinus carpio L) terhadap infeksi koi herpes virus (KHV) telah dilakukan untuk mengevaluasi faktor yang mempengaruhi kesehatan ikan mas. Sampel ikan mas diambil dari 10 keramba jaring apung di Waduk Cirata. Status kesehatan ikan dikategorikan menjadi 3 ~ a k n i : ikan sakit, carrier-laten dan sehat. Pengamatan gejala klinis, uji PCR dan histologi dilakukan untuk konfirmasi keberadaan KHV. Evaluasi hematologi dilakukan dengan rnengukur hematokrit, hemoglobin, jumlah eritrsoit, jumlah leukosit dan difrensial leukosit. Hasil penelitian memperlihatkan nekrosis insang me~pE+kan gejala utama serangan KHV. Respon nyata tingkat kesehatan ikan diperlihatkan oleh perbedaan parameter kesehatan ikan seperti peningkatan jumlah eritrosit, hemoglobin, hematoktit, dan trombosit dan diikuti dengan penurunan neutrofi, monosit dan limfosit. Virulensi virus memperlihatkan adanya penurunan virulensi.
ABSTRACT
ASPRIN TAMBA. Supcestibilily and Blood Features of Commot? Carp (Cyprinus carpio L) waslinfected by Koi Herpes Virus (KHV). Under direction of:
DARNAS DANA and MARTHEN MALOLE.
An analysis on szipcestibility of common carp (Cyprinus curpio L ) upon koi herpes virus (KHV) was conducted fromfebruary to august 2006. This study was aim at evaluating the factors affecting the degree of healthiness in common carp which was infected naturally by KKV. Fish samples were cultured in ten floating net cages in Cirata Lake. The cages were sampled randomly and fishes were taken purposively. The fish health status was categorized into three : sick, laten- carrier and healthy. Observation on clinical sign, PCR test, and histology were done to confirm the KHV infection. Haematolo~ical evaluation were done bv " measuring haematological parameters such as haemutocrit, haemoglobin, erithrocyte count, leucocyte count and leucocyte diffiential. The result showed the ..
gill neckrosis as the main clinical sign. Siqn~jkants respons in healthiness was detected in fish sampled and this would be accozinted for increasing huemutocrit, haemoglobin erythrocyte count, as well as decreasing of neutrophyl, leucocyte count, monocyte.
@ Hak Cipta milik lnstitut Pertanian Bogor Tahun 2006
Hak Cipta dilindungi
KERENTANAN DAN GAMBARAN DARAH
IKAN MAS
(Cyprinus carpio
L) YANG TERINFEKSI
KO1 HERPES VIRUS (KHV)
ASPRIN TAMBA
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada
Manajemen dan Teknologi Budidaya Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tesis : Kerentanan dan Gambaran Darah Ikan Mas (Cyprinus
Carpio L) yang Terinfeksi Koi Herpes Virus (KHV)
Nama Mahasiswa : AsprinTamba
NRP
: C151040051Komisi Pembimbing
Dr. Ir. harnas Dana. M.Se
Ketua
\
Dr. drh. Marthen Malole
Anggota
Diketahui,
Ketua Program Studi Ilmu Perairan
, d p
Prof. Dr. Ir. Enang Harris, MS
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan yang Maha Kuasa, atas berkat dan perlindunganNya, sehingga penulisan tesis yang berjudul " Kerentanan dan Galnbaran Darah Ikan Mas (Cyprinus curpio L) yang terinfeksi Koi Herpes Virus (KHV) " ini tepat pada waktunya.
Pada kesempatan yang berbahagia ini, penulis dengan kerendahan hati dan sukacita mengucapkan terimakasih banyak kepada semua pihak yang telah mendukung penulis dalam perkuliahan, kehidupan sehari-hari, penelitian dan penulisan tesis ini, karena dengan dukungan dan peransertanya, penulis dapat menyelesaikan studi ini. Oleh karena itu dengan rasa hormat dan kerendahan hati penulis mengucapkan terimakasih kepada :
1. Bapak Dr. Ir. Darnas Dana, MSc dan Dr. Drh. Marthen Malole sebagai ketua dan anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan didikan, perhatian, arahan dan solusi dalam pelaksanaan penelitan dan penyusunan tesis ini.
2. Dekan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menempuh pendidikan S2.
3. Ketua dan selumh jajaran Program Studi Ilmu Perairan (AIR) IPB yang telah banyak membantu penulis dalam penyediaan sarana dan kelancaran administrasi.
4. Seluruh staff pengajar Institut Pertanian Bogor yang telah memberikan Ilmu dan Pengetahuan kepada penulis selama masa studi.
5. Rektor Universitas Asahan, Dekan Fakultas Pertanian, Ketua Program Studi D-111 Perikanan dan Kelautan dan Ketua Yayasan Universitas Asahan yang telah memberikan izin, dukungan moral dan materil kepada penulis untuk melanjutkan studi
6. Pengelola BPPS-DIKTI dan Pimpinan Yayasan Damandiri Sejahtera yang telah memberikan dana beasiswa dan bantuan biaya penelitian, sehingga perkuliahan dan penelitian dapat berlangsung dengan baik.
pembudidaya ikan nias di Waduk Cirata atas penerimaan, dukungan. kemudaltan dan kesediaannya memberikan tempat, inforn~asi, sarana d m prasarana pendukung untuk pelaksanaan penelitian.
8. Kepala dan staff Balai Pengelola Waduk Cirata (BPWC) di Kabupaten Bandung, atas penyediaan data dan infonnasi yang dibutuhkan untuk kelengkapan tesis ini.
9. Kepala dan staff Laboratorium Kesehatan Ikan (LKI) IPB, atas izin penggunaan sarana dan prasaran laboratorium bagi penulis baik selama perkuliahan maupun pada saat penelitian.
10. Ayahanda M. Tamba dan Ibunda R. Br. Sitohang dana adek-adekku (Lendang, Jalinter, Nelly, Marlan, Nadya, Nurlely, Dina dan Elsi), atas cinta kasih, doa, perhatian, dukungan yang diberikan sehingga penulis dimampukan untuk menjalani masa studi
11. Keluarga Tante Lidia Tamba dan Keluarga Gibson Napitupulu, atas dukungan yang telah diberikan
12. Keluarga besar Ompu Ramsus Tamba dan Ompu Juwita Sitohang, atas semua dukungan dan semangat juang yang diberikan
13. Yang terkasih Netty Natalia Simanjuntak atas doa, dukungan dan perhatian yang terus-menerus diberikan.
14. Teman-teman PAKRI (Kak Ria, Kak Shanty, Lena, Dwi, Galung, Netti, Marlina dan Riady) atas kebersamaan dan dukungan yang diberikan
15. Teman-teman staff pegajar DIII Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Asahan atas bantuan dan dukungan yang selalu diberikan.
16. Teman-teman P12 (Bang Gosen, Dame, Heron, Bung Adrianus, Bung Simon, Alberto, Kaswanto, Bung Max, Bung Yanes, Pak Hengki, Bu Linda dan Pak Toni Ongkers, Degen, Yan, Nona, Amru, Tuah, Ivan, Ednan, Martin, Berry, Yosia, Meis, Meilin, Erika, Jack Mamangkey, dll) atas kebersamaan, sukacita dan team L A B 0 P-12.
I S . Kepada pihak-pihak lain yang belum termuat dalam tulisan ini, atas peransertanya memberikan dukungan kepada penulis.
Akhir kata, penulis menyadari bahwa isi dan cara penulisan tesis ini masih perlu penyempumaan, oleh karena itu dengan senang hati penulis menerima saran dan kritikan yang membangun demi kesempumaan tesis ini kedepan. Semoga isi dan ide yang terkandung di dalamnya berguna bagi semua pihak, secara khusus bagi lnasyarakat pembudidaya ikan di Indonesia. Terimakasih
Bogor, November 2006
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sidikalang pada tanggal 05 Februari 1978 dari pasangan berbahagia ayahanda M. Tamba dan ibunda R. Br. Sitohang. Penulis merupakan putera pertama dari sembilan bersaudara.
DAFTAR IS1
Halaman
...
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR ... vii
...
...
DAFTAR LAMPIRAN v111
PENDAHULUAN
Latar Belakang
...
1Perurnusan Hipotesis ... 3 Tujuan dan Manfaat
...
3 TINJAUAN PUSTAKAKoi Herpes Virus (KHV)
...
5. .
...
Gejala K l l n ~ s 7
Polymerase Chain Reaction
...
8...
Histologi 9
...
Hematologi 9
Sistim Pertahanan Tubuh Ikan
...
12BAHAN DAN METODE PENELITIAN
...
Waktu dan TempatBahan dan Alat
...
Rancangan Percobaan...
. .
...
Prosedur PenelltlanKarakterisasi Keberadaan Virus Berdasarkan Gejala Klinis
...
Karakterisasi Sistim Pertahanan Tubuh Ikan
...
Karakterisasi Virulensi VirusKualitas Air
...
Analisa Data...
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengamatan
...
Karakterisasi Keberadaan Virus Berdasarkan Gejala Klinis...
Pengamatan Histologi...
.
.
...
Pengamatan PCR
...
Karasteristik Hematologi Ikan ...
Karakteristik Virulensi Virus ...
Pengukuran Kualitas Air ... ...
Pembahasan
Karasteristik Keberadaan Virus Berdasarkan Gejala Klinis
...
Karasteristik Hematologi Ikan ...Karasteristik Virulensi Virus ... ... ...
SIMPULAN DAN SARAN
...
Simpulan 56
Saran ...
.
.
.
...
56DAFTAR PUSTAKA ... 57
DAFTAR TABEL
Hasil pengamatan PCR pada ikan mas (Cyprinus cnrpio) sakit Hasil pengamatan PCR pada ikan mas (Cyprinzts cnrpio) carrier- laten
...
. ... .... ... . ..
... ..
... . . .. ...
....
. .. ..
... ..
.. .
...
... . .. ... .. ... .. .. . .. ... . . . .. .. . .. .. . ..
...
Hasil pengamatan PCR pada ikan mas (Cyprinus cnrpio) sehat Pengukuran kualitas air di keramba jaring apung Waduk Cirata ...
Pengukuran kualitas air di laboratorium
Pencampuran bahan untuk uji PCR
...
Komposisi larutan formalin berpenyangga fosfat ...
DAFTAR GAMRAR
Halaman
I Gambaran patologis insang ikan mas (Cyprinus carpio) yang
terserang virus koi herpes
...
222 Gambaran klinis pada berbagai bagian sirip ikan mas yang terserang KHV ...
...
233 Gambaran klinis pada bagian tubuh ikan mas yang terserang KHV. 24 4 Histopatologi insang ikan mas (Cyprinus carpio) sakit, carrier-laten dan sehat ... 26
5 Visualisasi hasil elektroforesis pada uji PCR ikan sakit
...
286 Visualisasi hasil elektroforesis pada uji PCR ikan carrier-laten
...
297 Visualisasi hasil elektroforesis pada uji PCR ikan sehat
...
308 Rataan hemoglobin ikan setiap status kesehatan ikan mas (Cyprintts carpio)
...
3 1 9 Rataan hematokrit ikan pada setiap status kesehatan ikan mas (Cyprinus carpio)... .. ...
..
...... ... .... . .
. . ... . . . .
3 1 10 Bentuk eritrosit ikan mas (Cyprinus carpio)...
3211 Rataan eritrosit pada setiap status kesehatan ikan mas (Cyprinus carpio)
...
3312 Rataan jumlah leukosit pada setiap status kesehatan ikan mas (Cyprinus carpio)
...
3413 Bentuk neutrofil ikan yang terserang virus koi herpes
...
3514 Rataan persentase jumlah neutrofil pada ikan sakit, carrier-laten dansehat ... 36
15 Bentuk dan ukuran monosit pada ikan mas yang bersifat sakit, carrier-laten dan sehat 37 16 Rataan persentase monosit pada ikan mas ikan mas (Cyprinzrs curpio) sakit, carrier-laten dan sehat
...
3818 Rataan persentase lyrnfosit ikan mas yang bersifat sakit. carrier-
...
laten dan sehat 39
19 Bentuk dan ukuran trombosit ikan mas
...
40DAFTAK LAMPIRAN
Halaman 1 Peta Waduk Cirata dan lokasi penelitian
...
642 Petak keramba pengambilan sampel
...
65...
3 Prosedur PCR untuk KHV 66
4 Alat dan bahan PCR
...
69...
5 Prosedur pengamatan hematologi ikan 70
...
6 Perhitungan kadar hematokrit (Svobodova and Vykosova 1991) 72...
7 Pembuatan Preparat Ulas (Svobodova and Vykosova 1991) 73...
8 Metode pembuatan preparat histologi (Yuasa et a1 . 2003) 74 9 Analisis anova one-way total eritrosit pada setiap status kesehatanikan
...
7610 Analisis anova one-way total leukosit pada setiap status kesehatan ikan
...
7811 Analisis anova one-way hemoglobin pada setiap status kesehatan
ikan
...
8112 Analisis anova one-way hematokrit pada setiap status kesehatan
ikan
...
8313 Analisis anova one-way netrofil pada setiap status kesehatan ikan
mas (Cyprinus carpio)
...
8514 Analisis anova one-way limfosit pada setiap status kesehatan ikan 86
15 Analisis anova one-way monosit pada setiap status kesehatan ikan 88
16 Analisis anova one-way monosit pada setiap status kesehatan ikan 90
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kasus kematian ikan mas (Cyprinus carpio carpio) dan koi (Cyprinus carpio koi) akibat serangan Virus Koi Herpes (KHV) telah menyebar ke beberapa negara di dunia (AOTA 2001, Ronen et 01.2003 dan Pokorova et al. 2005). Kasus ini pertama kali terjadi di Israel tahun 1997 (Hedrick et al. 2005), Eropa (tahun 1997 di Jerman; tahun 1998 di Inggris; tahun 1999 di Belgia; tahun 2001 di Belanda; tahun 2002 di Denmark; tahun 2003 di Austria, Italia, Luxemburg, Swiss dan Polandia (Pokorova et al. 2005) dan Amerika Serikat serta Asia.
Di benua Asia KHV telah menyebar di Korea tahun 1998 (Cho e l al. 2005); tahun 2003 di Jepang (Ikuta et 01. 2005), tahun 2002 di Indonesia (Sunarto et al. 2005) clan tahun 2003 di Taiwan (Englesma and Heanen 2005). Di Indonesia,
KHV menyebar mulai dari Blitar, Subang dan Waduk Cirata pada tahun 2002, Lubuk Lingau Sumatera Barat pada Februari 2003 (Sunarto et al. 2005). Kasus serangan KHV telah terjadi bemlang kali di Waduk Cirata, Waduk Jatiluhur Jawa Barat, Danau Toba Sumatera Utara dan Danau Singkarak Sumatera Barat
Kematian ikan mas akibat serangan KHV secara alami dapat mencapai 80 % (Hartman 2004), bahkan pada infeksi buatan, mortalitas mencapai 82 %
dalam waktu 15 hari (Ronen et al. 2003) serta mencapai 80 - 95 % (Sunarto et al. 2005). Kasus kematian ikan mas ini sangat memgikan dan mengancam kelangsungan usaha budidaya di sentra-sentra produksi ikan mas. Kematian ikan yang mencapai 80-95 % terjadi sebagai akibat serangan KHV yang sangat menular dan virulen (Gilad et al. 2002) dan diikuti rendahnya kemampuan sistim imun yang dimiliki ikan mas. Kematian ini terutama terjadi ketika suhu perairan rendah yaitu 22-27 OC (OATA 2001).
dapat tejadi yakni : 1) mortalitas ikan, dimana proliferasi patogen menyebabkan kematian inang; 2) penyembuhan ikan, dimana sistim pertahanan tubuh mampu mengeliminasi patogen dan 3) terjadinya carrier, dimana terjadi keseimbangan antara ikan dengan penyebab penyakit. Penumnan mortalitas ini merupakan hasil interaksi antara ikan, patogen dan lingkungan, dimana ikan sebagai inang (host) kemungkinan telah terbentuk ket,ahanan atau kekebalan ikan terhadap KHV, sedangkan pada virus, kemugkinan telah te jadi penurunan vimlensi KHV.
Ikan yang terpapar organisme penyebab penyakit seperti virus dapat dapat menyebabkan ikan bersifat rentan, laten dan resisten. Plumb (1994) menyatakan "diantara populasi, strain dan individu ikan tidak selalu peka terhadap beberapa infeksi penyakit". Ini menunjukkan adanya tingkat resistensi alami terhadap infeksi penyakit. Ketahanan alami (natural resistance) menunjukkan kemampuan inang secara hereditas untuk mengalahkan patogen sehingga tidak muncul penyakit. Daya tahan alami ikan ini merupakan salah satu faktor penting untuk menghalangi infeksi penyakit. Daya tahan alami dapat diperlihatkan dengan kemampuan pagositik oleh'leukosit, makropag dan komponen serum non spesifik (interferon, komplemen dan lainnya).
kohabitasi. Parelberg er 01. (2005) menyalakan bahwa vaksin yang aman dan sesuai dapat dikembangkan dari virus KHV yang dilemahkan. Umumnya kajian ini dilakukan sebagai upaya untuk memperoleh ikan yang memiliki ketahanan alami dan menginduksi kine j a sistim imun ikan.
Informasi hematologi seperti jumlah, jenis, struktur, morfologi sel darah dan kandungan biokimia darah telah banyak digunakan sebagai protokol diangnosa kesehatan ikan. Svobodova and Vykusova (1991) menyatakan bahwa analisis darah berguna untuk tujuan diagnosis, sebagian dari tujuan ini meliputi evaluasi keberadaan substansi toxic pada ikan, evaluasi kondisi ikan, evaluasi ketahanan non-spesifik ikan, evaluasi pengaruh stres dan evaluasi kemampuan memanfaatan makanan pada ikan. Blaxhall (1973) metode hematologi membantu menyediakan bukti dan identifikasi abnormalitas dan proses te jadinya penyakit.
Kajian hubungan KHV dengan ikan mas berdasarkan karakter keberadaan virus, hematologi dan virulensi KHV di lapangan masih sedikit yang diteliti, secara khusus karakter tersebut berdasarkan perbedaan status kesehatan ikan belum diteliti. ~nformasi imunitas ikan mas dan virulensi KHV ini diharapkan dapat membantu menunjukkan peluang-peluang pengembangan proteksi, penanganan dan pengendalian serangan KHV terhadap ikan mas.
Perumusan Hipotesis
Penurunan tingkat mortalitas ikan mas dari serangan KHV tejadi akibat peningkatan kemampuan sistim imun ikan dan atau te jadinya penurunan vimlensi virus KHV
Tujuan dan Manfaat
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Untuk melakukan konfirmasi keberadaan virus KHV pada ikan yang menunjukkan gejala klinis dan tidak menunjukkan gejala klinis (bersifat carrier-laten).
2. Mengetahui karakter hematologi ikan mas pada ikan sakit, canier-laten dan sehat.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi awal karakter ikan mas yang memungkinkan dapat digunakan sebagai calon induk dan benih- benih tahan KHV melalui program pengembangbiakan ikan (breeding program)
TINJAUAN PUSTAKA
Koi Herpes Virus (KHV)
Virus herpes merupakan salah satu virus yang berbiak dalam inti sel inang dan membentuk badan inklusi yang disebut cowdry type A. Penyebaran virus dari sel ke sel melalui jembatan antar sel karena bersatunya sel-sel (cell fusion), dengan demikian tidak ada kontak antara virus dengan lingkungan di luar sel. Apabila virus herpes telah menginfeksi inang, maka sejumlah virus ini akan tetap tinggal dalam bentuk laten seumur hidup inangnya (Malole 1987). Virus herpes m e ~ p a k a n virus yang berukwan besar dibandingkan dengan virus lain. Secara morfologi, anggota virus herpes mempunyai bentuk yang serupa. Morfologi, struktur virus herpes dari arah dalam keluar terdiri dari genom DNA untai ganda linear, kapsid, lapisan tegumen dan selubung (Daili dan Makes 2002)
KHV adalah virus dsDNA herpervirus-like patogen yang terdiri atas 31 polipeptida virion dan sedikitnya 8 glikosilat protein, 12 dari polipeptidanya memiliki berat yang sama dengan molekul dari semua herpesvirus cyprinid (CHV) dan 10 peptidanya mirip dengan channel carfish virus (CCV) (Pokorova et al. 2005 dan Gilad et al. 2002). Virion mengandung kapsid bagian dalam dengan bentuh isohedral simetri berdiameter sekitar 100-1 10 nrn. Virion matang mengandung amplop, sehingga diameter keseluruhan 170-230 nm. Komponen utama amplop adalah lipoprotein berlapis ganda. Secara morfologi dan ukuran sama dengan virus famili herpesviridea. Ukuran genom KHV diperkirakan sekitar 277 kbp. Sekitar 250 kbp yang diketahui adalah anggota herpesviridea (Ronen et al. 2003).
Replikasi paling baik KHV terjadi pada kultur sel sirip koi (KF-1) yaitu pada suhu 20-25 "C namun pada suhu 30 "C atau 4 "C tidak menunjukkan pertumbuhan dan pada suhu 10 "C hanya terjadi pertumbuhan minimal (Gilad et ul. 2003 dularn Hedrick 2005). Engelsma and Haenen (2005) menyatakan umumnya KHV dideteksi dengan menggunakan PCR, baik disertai dengan atau tanpa pengamatan histopatologi insang sebagai metode konfirmasi. Di beberapa kasus KHV telah sukses dikultur pada sel epitel carp (EPC) atau sirip koi (KF-1).
menemukan reaksi serum anti-CHV (cyprinus herpes virus) terhadap antigen pada sel terinfeksi CHV. Antigen virus ditemukan pada nukleus dan sitoplasma, tetapi belum ada bukti perlekatan (binding) antar antibodi anti CHV terhadap antigen.
Pada suhu rendah aktivitas sistim imun tubuh ikan menurun, namun aktivitas imun akan meningkat bersama peningkatan suhu. Temperatur optimum untuk virus KHV berada antara 18-27" C. Sebagian besar mortalitas tejadi pada suhu 22-27°C dan tidak ada kejadian pada suhu 30°C atau diatasnya. Jadi perubahan suhu yang besar antara 18-27" C, maka serangan tejadi jika ada virus KHV (OATA 2001). Ronen et al. (2003) meyatakan meskipun penyakit sangat menular dan virulen, namun morbiditas dan mortalitas terbatas pada koi dan common carp
Diagnosa virologis terhadap KHV dilakukan melalui 2 pendekatan yaitu secara langsung dan tidak langsung (Tauhid et al. 2004). Pendekatan langsung dilakukan untuk melihat keberadaan virus atau partikel virus, meliputi isolasi dan identifikasi virus secara in vitro pada kultur jaringan dengan pengamatan citophatic effect (CPE), penggunaan mikroskop elektron untuk pengamatan partikel virus dan teknik polymerase chain reaction (PCR) untuk mendeteksi DNA virus. Sedangkan secara tidak langsung dilakukan dengan mendeteksi respon dari inang akibat infeksi virus (misalnya antibodi). Diagnosa tidak langsung dilakukan dengan metode enzim linked imrnunosorbent assay test (uji ELISA) danjlouresecent anribody tecnique (FAT)
Gejala Klinis
Menumt Hedrick et a1 (2000) penyakit KHV menyebabkan kematian yang besar dan bersifat sporadis pada ikan koi dan mas. Hasil penelitian
menggunakan mikroskop menunjukkan bahwa ikan mas yang terinfeksi memperlihatkan adanya kelainan pada insang dan organ intemal seperti ginjal, limpa, jantung dan saluran pencemaan. Pada insang tejadi hipertropi, hiperplasia dan h s i pada lamela sekunder insang. Selanjutnya Sunarto et al. (2005) menyatakan gejala klinis ikan terinfeksi adalah latergik, hilangnya keseimbangan dan megap-megap. Gejala umurn meliputi epitel terkelupas dengan kehilangan mukus dan kulit tampak kasar atau lesi mirip melepuh pada kulit, pendarahan (haemorages) pada operkulum, sirip, ekor dan perut dan beberapa kemsakan insang. Pengamatan menggunakan mikroskop elektron, menunjukkan adanya hipertropi dan perpindahan kromatin sel dan ditemukan nucleokapsid virus berbentuk hexagonal dengan diameter 110 nm. Melalui mikroskop elektron virion herpesviridea memiliki inner kapsid dengan simetri isosadektahedron berdiameter
100-1 10 nm (Hedrick et al. 2005).
Gejala eksternal serangan KHV tarnpak pada ikan sakit seperti pembengkakan dan nekrosis filamen insang, produksi mukus berlebihan atau adanya bercak wama pada kulit dan eksoptalmus. Secara internal tejadi pembesaran ginjal dan limpa ikan (Hedrick er al. 2005).
pencampuran 2mM MgC12, 1 x buffer, 400 pM deoxynukleotida triposfat, 30 pmol primer, 1 U Taq polymerase, template 70 sampai 100 mg DNA; kondisi siklus suhu awal 95 "C selama 5 menit, sikus suhu 35 kali, denaturasi 94 "C selama 1 menit, annealing 68 "C selama 1 menit, elongase 72°C selama 30 detik, dan akhir siklus 72 OC selama 7 menit. Primer foward KHV915F : 5'-
GACGACGCCGGAGACCTTGTG-3' dan primer riverse 5'-
CACAAGTTCAGTCTGTTCCTAAC-3' (Gilad el al. 2002).
Histopatologi
Histologi m e ~ p a k a n teknik yang digunakan untuk mempelajari jaringan normal, sedangkan untuk pengamatan kelainan-kelainan pada jaringan disebut teknik histopatologi. Preparasi jaringan meliputi beberapa langkah termasuk fiksasi jaringan, dehidrasi, embedding sampel, preparasi sektion, pewarnaan dan mounting jaringan (OIE 2003).
Penemuan secara histopatologi mengungkapkan masa proliferasi pada epitel insang dengan pembahan degenerasi dan nekrosis, badan inklusi intranuklear pada sel terinfeksi. Pengujian mikroskopik hati, ginjal dan limpa dan saluran pencemaan menunjukkan nekrosis sel parenkim serta sejumlah makropag pada sel bekas peninggalan virus (Pokorova et al. 2005).
Tauhid et al. (2004) menyatakan bahwa pengamatan terhadap beberapa irisan organ ikan sakit adalah ditemukannya intranuklear badan inklusi, pembesaran (hiperhopi) pada filamen insang dan nekrosis tahap lanjut. Selain itu ditemukan adanya eosinofilik inclution bodies (EICIB-like) serta intranuclear inclusion bodies di area yang mengalami nekrosis.
Hematologi
darah merah yang lebih besar dibandingkan sel darah lainnya seperti limfosit, neutrofil, monosit dan trombosit.
Anderson (1974) menyatakan bahwa pengetahuan tentang he~natologi sangat penting, karena menunjukkan morfologi, fisiologi dan biokimia darah serta jaringan pembentuk darah. Melalui analisis karasteristik sel darah menjadi petunjuk diagnosa dan prognosis situasi penyakit ikan. Ketika sampel darah diambil dengan tabung kapilari dari ikan dan disentrifus untuk memisahkan sel dengan serum, maka rasio fraksi selular terhadap total volume darah disebut hematokrit. Tes hematologi lain meliputi test hemoglobin untuk kalibrasi jumlah pigmen sel darah merah, perhitungan difrensial sel untuk memberikan informasi perbandingan jumlah dan perbedaan jenis sel darah, serta ulas darah untuk mempelajari morfologi seluler.
Teknik hematologi terrnasuk pengukuran hematokrit, jumlah eritrosit, jumlah leukosit, telah terbukti bemilai untuk biologi perikanan dalam menduga kesehatan ikan (Blaxhall 1972), monitoring respon stress, jaringan darah ikan menunjukkan tanda kondisi lingkungan dan fisiologi ikan. Akhir-akhir ini, paramater darah secara umum digunakan untuk mengamati kesehatan ikan (Omn et al. 2003), evaluasi efektivitas penggunaan pengaruh pengobatan (Ispir and Domcu 2005), evaluasi resiko ekotoksikologi yang disebabkan oleh pestisida terhadap lingkungan dan organisme (Svobodova et al. 2003), evaluasi pengaruh infeksi parasit seperti Geozia leporini (Martins et al. 2004), pengamatan kemampuan aktifitas pagositik and bakterisidal trombosit darah pada carp (Cyprinus carpio) (Stoksit et al. 2002). Svobodova and Vykosova (1991) menyatakan bahwa analisis darah periperal berguna untuk berbagai tujuan, sebagiannya untuk pengujian pengaruh substansi toksit pada ikan, evaluasi kondisi ikan, evaluasi pertahanan non spesifik dan evaluasi pengamh kondisi stress.
utama ditandai oleh ada tidaknya perbedaan wama granula pada sitoplasma. Agranulosit terdiri dari limfosit dan monosit dengan sitoplasma yang tidak bergranula. Ukuran limfosit antara 7 - 9 p, monosit 15
-
18 p, granulosit antara 5 -10 p, eosinofil8 -12 p dan basofil sekitar 10 p.
Iwama dan Nakanishi (1996) menyatakan bahwa granulosit dibagi menjadi sub devisi yakni neutrofil, eusinofil dan basofil. Neutrofil dan basofil m e ~ p a k a n bentuk umum, namun basofil sering tidak ada pada ikan. Makropag dapat diisolasi dengan mudah dari bermacam surnber termasuk saluran darah, organ limfoid dan jantung. Makropag secara fungsional mempakan perangkat sel untuk respon limfosit umumnya untuk pagositik, dapat mengekspresikan oksigen dan nitrogen radikal bebas dan dapat membunuh patogen (bakteri dan larva cacing).
Sel-sel fagositik mononuklear mempunyai 2 fungsi, yaitu pertama sebagai fagosit dengan fungsi utama menghancurkan antigen dalam fagolisosom serta melepaskan berbagai enzim dan isi granula ke luar sel yang bersama-sama dengan sitokin seperti tumor necrosis factor (TNF) dapat menyebabkan kemsakan sitotoksit pada berbagai sel sasaran dan kedua sebagai antigen presenting cells (APC) yang fungsinya menyajikan antigen kepada limfosit (Kresno 2001). Anderson (1974) menyatakan bahwa produksi antibodi mempakan fungsi utama limfosit.
Penelitian Orun et al. (2003) menunjukkan parameter hematologi ikan berdasarkan musim pada ikan Cyprinon macrotomus pada lingkungan alami yakni persentase neutrofil 7,6
+
0,44 %, limfosit 82 e , 1 6 %, monosit 9,12 f 0,s %,hemoglobin 7,96 f 0,28, hematokrit 26,40 +1,12 %. Pada carp sehat ditemukan hematokrit 28 - 40 %, total limfosit mencapai 76-97,s %, monosit 3-5 %,
neutrofil2-10 % dan eosinofil o-1 % serta basofil 0 % (Svobodova and Vykosova, 1991).
Sistim Pertahanan Tubuh Ikan
Fenner el al. (1995) menyatakan bahwa sebagai respon terhadap infeksi yang terns-menerus akibat serangan mikroorganisme dan virus, maka vertebrata membentuk sistim pertahanan tubuh yang disebut sistim imun. Menurnt Baratawidjaja (2002) sistim pertahanan tubuh terbagi atas pertahanan non spesifik dan spesifik. Selama virus masuk ke dalam tubuh, maka sistim imun akan mempengaruhi makromolekul virus tertentu (protein atau karbohidrat) sebagai benda asing yang disebut antigen.
Pertahanan non spesifik merupakan pertahanan tubuh terdepan menghadapi serangan berbagai mikoorganisme, oleh karena itu dapat memberikan respon langsung terhadap antigen, sedangkan sistem pertahanan spesifik membutuhkan waktu untuk mengenal antigen terlebih dahulu sebelum dapat memberikan responnya. Disebut pertahanan non spesifik karena tidak ditunjukkan terhadap mikroorganisme tertentu dan telah ada sejak lahir. Komponen non spesifik seperti imunitas natural atau bawaan (innate) yang prinsipnya memiliki mekanisme pagositosis yang berkaitan dengan makrofag dan leukosit bergranula seperti neutrofil yang dirangsang untuk menyerang mikroorganisme yang menginvasi kulit ikan dan mukus. Tambahan pagositik adalah faktor pelarut seperti lysozim dan komplemen yang menghancurkan patogen penyerang (Halver 2002).
antigen yang berbeda; 4) membatasi diri (self limitation) sebagai kemampuan untuk mereda kembali setelah rangsangan terhadap antigen; 5) membedakan sel dan non-self. Sel limfosit merupakan sistim imun spesifik (Kresno 2001)
Sistim fagositik-mononuklear merupakan turunan terdekat dari sel monosit yang masuk aliran darah selama beberapa hari, selanjutnya masuk ke dalam jaringan dan berkembang menjadi makrofag. Makropag pertama kali muncul pada umur 48 jam setelah fertilisasi pada ikan mas (Huttenhuis 2005). Fungsi utama sel sistim fagostitik mononuklear adalah melakukan fagositosis dan menghancurkan partikel asing dan jaringan mati atau mengolah bahan asing sehingga bahan tersebut dapat membangkitkan tanggap kebal. Disamping itu, makrofag juga dapat mengatur reaksi kebal, membuat protein dari sistem komplemen dan mengeluarkan bahan yang mempengaruhi proses pendarahan (Tizard 1988).
Respon humoral mempakan respon yang bersifat spesifik dilakukan oleh substansi yang dikenal sebagai antibodi atau imunoglobulin (Anderson 1974). Sistim imun adaptif pada carp mulai berkembang usia 4 hari setelah menetas dan secara fungsional mulai bekeja antara 1 dan 2 minggu (Huttenhuis 2005) Komponen spesifik sistim imun terdiri atas respon humoral dan yang diperantarai sel (immediate-sel) yang menyediakan memori spesifik imunologi, meskipun imun memori pada ikan umumnya kurang berkembang daripada manusia. Pada respon imun spesifik, makrofag berperan sebagai sel antigen-presenting. T limfosit terlibat dalam imunitas mediated-sel dengan merangsang difrensiasi dan proliferasi limfosit B. Ketika antibodi diproduksi terhadap patogen spesifik yang mengikat patogen sehingga dapat menghancurkannya melalui aktivasi sistim komplemen (Halver 2002). Ellis (1988) memperlihatkan bahwa kemampuan antibodi akan meningkat setelah terjadi infeksi lanjutan atau seperti booster pada
vaksinasi ikan.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat.
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium UPT Balai Pelestarian Perairan Umum dan Perikanan (BPPUP) Jawa Barat-Cirata, keramba jaring apung Waduk Cirata (Lampiran 1 dan 2), dan Laboratorium Kesehatan Ikan FPIK-IPB. Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai Agustus 2006.
Bahan dan Alat
Alat-alat yang digunakan meliputi : autoclaf, oven, lemari es, mikro tube, thermal cycler, sentrifuse, trans-illuminator, mikropipet ukuran 0,l-10 p1, 10-100 p1, 27 buah akuarium ukuran 80 x 60 x 40 cm' dan perlengkapannya, botol film, haemocytometer, alat suntik, objek glass, cover glass, mikroskop, mikrotom, water bath, satu set sahlimeter, alat bedah, kamera digital, perahu, pH meter, sechi disk, thermometer dan mortar.
Bahan-bahan yang digunakan yakni : ikan mas dengan ukuran panjang total 12,4 it 1,01 cm pada pengamatan lapangan dan ukuran 8,11 f 0,55 cm untuk uji virulensi, pakan ikan. Kid isolasi DNA ikan menggunakan genomic prep cells &
tissue DNA isolation kit yang terdiri atas larutan sel lisis, RNase, larutan pengendap protein, isopropanol, dan pelarut DNA, akuabides. Untuk PCR digunakan bahan
primer mix KHV 398 (100 pmoW pl), DNA template kontrol negatif, primer mix
KHV 398 (100 pmoW pl), DNA template kontrol negatif, DNA template, kontrol positif KHV, ddHzO PCR-grade, pureTag Ready-To-Go PCR beads merek Amersham Biosciences, 10 x sample loading buffer dye, ethidium bromida, agarose NA. Sekuen primer untuk PCR yakni F290 5'-GACACCACATCTGCAAGGAG-3'
dan R290 S'GACACATGTTACAATGGTGGC-3'. Pengamatan darah menggunakan bahan Na-citrat, hayem, turk, gyemsa, metanol, alkohol dan akuades. Bahan untuk pembuatan preparat histologi meliputi alkohol absolut, alkohol 95 %, alkohol 80 %,
yang digunakan meliputi insang ikan, larutan fisiologis, es batu, antibiotik penecilin dan streptomycin, methilen blue serta kalium petmanganat
Rancangan Percobaan
Metode yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah metode survey lapangan dan eksperimental laboratorium. Survey lapangan meliputi pengamatan lapangan, penentuan petak sampling, pelaksanaan sampling, seleksi ikan berdasarkan status kesehatan ikan, karakterisasi hematologi ikan sedangkan eksperimental laboratorium yakni karakterisasi vims melalui uji vimlensi. Keramba-keramba dijadikan sebagai unit percobaan yang dipilih secara acak sebanyak 10 unit petak keramba dari 6 kepemilikan keramba, sedangkan ikan-ikan yang terdapat di dalamnya dijadikan sebagai satuan percobaan yang disampling secara purposif. Total ikan yang akan diambil sebanyak 400 ekor. Variabel yang akan ditera dan diukur meliputi, gejala klinis, hematologi (hemoglobin, hematokrit, jumlah eritrosit, jumlah leukosit, difiensial leukosit (neutrofil, limfosit, monosit dan trombosit), hasil uji PCR, histologi, vimlensi vims dan khlitas air.
Prosedur Penelitian
Karakterisasi Keberdaan KHV Berdasarkan Gejala Klinis
Air yang digunakan untuk pengamatan di lapangan bersumber dari sumur tanah yang disedot dengan pompa air. Kemudian air ditampung dalam bak penampungan awal. Pengendapan selama 3 tahap. Pengendapan pada petak penampungan awal dan kedua dilakukan selama 10 hari, selanjutnya pada penampungan ke-3 (sebelum digunakan) diendapkan selama 4 hari. Selama pengendapan dilakukan aerasi. Sedangkan untuk pengamatan laboratorium, air diendapkan 48 jam dan diberi methilen blue sebagai treatment.
Pengambilan sampel ikan dilakukan pada 10 petak keramba jaring apung Waduk Cirata. Dan semua keramba diambil total sampel sebanyak 400 ekor ikan
insang terpisah, bagian ujung lan~ella insang putus, insang memutih, insang pucat, dan adanya perubahan wama, munculnya pendarahan, pemukaan tubuh melepuh (Hedrick et a1 2000, Tauhid et a1 2004 dan Sunarto 2005). Ikan yang menunjukkan gejala klinis dikategorikan sebagai ikan sakit, selanjutnya ikan yang tidak menunjukkan gejala klinis dikategorikan sebagai ikan carrier-laten dan sehat.
Sebanyak 300 ekor ikan yang tidak menunjukkan gejala klinis dimasukkan ke 5 unit akuarium berukuran 80 x 60 x 40 cm' (30 ekortwadah), selanjutnya dilakukan uji stressor dengan perlakuan fluktuasi suhu yaitu dari 28 "C menjadi 24 'C (AOTA 2001) selama 16 hari. Ikan yang tidak menunjukkan gejala klinis dikategorikan sebagai ikan sehat
Untuk memastikan status kesehatan ikan baik sakit, carrier-laten dan sehat maka dilakukan uji PCR. Sebayak 10 ekor dari masing-masing kategori kesehatan ikan diambil secara ecak, kemudian dilakukan uji PCR. Pelaksanaan uji PCR meliputi ekstraksi DNA ikan, siklus suhu (mencakup denaturasi, anneling dan extention), elektroforesis dan visualisasi pada sinar ultraviolet (UV) (Protokol Sentra Biosains 2004) sesuai Lampiran 3. Kemudian dari setiap status kesehatan ikan, disampling secara acak 1 ekor yang digunakan untuk pengamatan histologi (Yuasa et al. 2003) sesuai Lampiran 8
Karakterisasi Sistim Pertahanan Tubuh Ikan
Karakterisasi Virulensi Virus
Karakterisasi virulensi virus bertujuan untuk melihat tingkat vimlensi virus yakni kemungkinan KHV virulen, penurunan virulensi atau munculnya virus avirulen. Untuk memperoleh informasi tersebut, maka sebanyak 3 ekor ikan mas sakit dan 3 ekor yang carrier-laten yang positif pada pengujian PCR, diambil organ insangnya untuk diekstmksi.
Preparasi inokulum virus dilakukan dengan cara : 1) insang ikan yang positif terserang KHV dipisahkan dari tubuh dan dicuci dengan larutan fisiologis (NaC10,85
%), kemudian dicincang dan dihaluskan dengan mortar, setelah itu ditambahkan NaCl 0,85 % dengan pengenceran 10 % (wlv). 2) larutan tersebut disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm, kemudian diambil supernattan dan dipindahkan ke tabung lain. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm selama 15 menit d m ditambahkan dengan antibiotik (streptomycin sebanyak 10.000 IUIml sampel dan penecilin sebanyak 10.000 pglml sampel) untuk menghindari kontaminasi bakteri; 3)
supernattan hasil sentrifugasi merupakan larutan baku virus KHV sebagai sumber virus. Preparasi ini dilakukan pada suhu dingin.
Sebanyak 60 ekor ikan bebas KHV berukuran 8,11 k 0,55 cm diaklimatisasikan selama 2 hari di dalam akuarium pemeliharaan. Untuk memastikan bebas KHV, dilakukan dengan stessor fluktuasi suhu mencapai 24"'C. Kemudian sebanyak 5 ekor ikan dengan 3 ulangan disuntik dengan KHV yakni pada pengenceran ke lo-', 1 0 ' ~ dan 10.' sebanyak 0,l ml dibawah titer FIDso-120 jam (Ammllah, 2004). Data FIDso-120 jam, diperoleh setelah mengamati munculnya gejala klinis selama 5 hari dan dianalisis berdasarkan Reed dan Munich (dalam Amrullah 2004). Selanjutnya pengamatan gejala Minis dan mortalitas diamati 1-14 hari (Tauhid ef al. 2004).
Kualitas Air
Sedangkan parameter kualitas air yang diukur di media penampungan meliputi, kecerahan, suhu, kekeruhan, pH, oksigen terlarut., total alkalinitas, total hardeness, total klorin, klorin bebas dan warna air. Parameter kualitas air yang diukur di media uji virulensi virus meliputi oksigen terlamt pH dan suhu.
Pengukuran pH, total alkalinitas dan total hardeness dilakukan dengan cara rnencelupkan kertas indikator aguacheck ke dalam air selama 1 detik (tanpa goncangan), kemudian diangkat dan dibandingkan dengan ketentuan indikator warna, kernudian dicelupkan kembali selarna 5-10 detik, hasil yang diperoleh dibandingkan dengan warna indikator untuk menentukan konsentrasi total klorin dan klorin bebas.
Analisa Data
Variabel-variabel yang diarnati, selanjutnya diuji secara statistik degan anova one-way rnenggunakan program Minitab. Variabel yang dianalisa meliputi, kadar hematokrit, jumlah eritrosit, kadar hemoglobin, jumlah leukosit dan difrensial leukosit.
Pengamatan FIDso-120 jam dianalisa rnenggunakan rumus Reed and Munch dalam A m ~ l l a h (2004) yakni :
< 5 0 % - 5 0 %
FID,, =
< 50 %- < 50 %
Keterangan : FIDso : Fish infected dosis 50
250 : Persentase pengamatan diatas 50 %
<50 : Persentase pengamatan dibawah 50 %
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengamatan
Karakteristik Keberadaan KHV Berdasarkan Gejala Klinis
Kehadiran virus di dalam sel inang dapat diketahui dengan munculnya gejala klinis atau kelainan-kelainan pada organ inang yang terinfeksi. Kelainan tersebut dapat merupakan perubahan wama, bentuk maupun perubahan tingkah laku ikan yang terinfeksi. Sebagian infeksi dapat menunjukkan gejala spesifik yang disebabkan oleh patogen tertentu atau munculnya gejala sekunder yang merupakan pengaruh tidak langsung yang sifatnya tidak konsisten.
Gambar 1 Gambaran patdogis insang ikan mas (Cgprirrps aupw) ynng
terserang virus koi herpes
Keterangan : a msang sehat,
b,
cdan
d
terdapat gumpalan (darah) menghitampada lamella insang, e, f, g, h, i, j, k, m, n clan o m e n u n j b
permukaan insang yang memutih, pucat dan teijadiinya n e h i s
Gambar 2 Gambaran klinis pada berbagai bagian sirip ikan mas vang terserang KHV
[image:39.595.85.501.68.584.2]Gambar 3 Gambaran klinis pada bagian tubuh ikan mas vans terserane
KHV
Berdasarkan pengamatan tingkah laku ikan yang berada di kera~nba. ikan- ikan yang terserang KHV mempelihatkan pergerakan yang lambat, ikan kecendemngan bergerak ke pinggir keramba dengan kondisi lemah. Tingkah laku ikan ini sangat bewariasi berdasarkan tingkat infeksi. Ikan-ikan yang terinfeksi ringan kecenderungan bergerak aktif (agresif). berespon baik terhadap rangsangan dan pakan serta hidup berkelompok. Sedangkan ikan sekarat (moribun) bergerak sangat lemah, bukaan operkulum lambat. kecenderungan mengumpul di pinggir keramba, tidak berespon baik terhadap pakan maupun rangsangan dari luar. Ikan moribun tersebut biasanya akan mengalami kematian setelah 2 hari.
Di dalam akuarium penampungan, ikan-ikan yang menunjukkan gejala klinis insang memutih yang masih ringan kecendemngan sering melompat, pergerakan tidak terkoordinasi dan kecenderungan menyendiri di pinggir akuarium atau dekat sumber aerasi.
Pengamatan Histologi
Berdasarkan pengamatan histologi insang pada ikan mas yang terserang KHV (sakit dan carrier-laten) dan sehat, terdapat beberapa perbedaan morfologis insang ikan. Pada ikan terserang KHV tejadi kerusakan insang (nekrosis), kerusakan lemella sekunder insang, munculnya hipertropi dan adanya badan inklusi. Sano et al. (2005) menyatakan bahwa sering terjadi hiperplasia pada epitelium insang dimana tejadi nekrosis atau infiltrasi limfosit. Berikut gambar 4
Gambar 4 Hitopatologi insang ikan mas (Cyprirms c q i o ) sakit, carrier- laten dan sehat
Pengamatan PCR
Virus me~pzikan obligat intraseluler yang sulit dideteksi keberadaamya secara visual maupun mikroskopik. Metode diagnosa yang paling andal adalah melalui deteksi DNA spesifik sebagai unsur penyusun struktur virus dengan menggunakan metode pengamatanpo(vmerase chain reaction (PCR).
Untuk mernastikan (konfimasi) kebepdaan KHV pada setiap status kesehatan ikan (sakit, carrier-laten dan sehat) maka dilakukan uji PCR. Masing- rnasing 10 sampel diambil untuk mewakili setiap status kesehatan ikan selanjutnya diuji secara PCR dan diikuti pengujian template kontrol positif virus, template negatif virus dan template netral (dHzO). Berdasarkan hasil PCR diperoleh hasil sebagai berikut.
Ikan sakit
Tabel 1 Hasil pengamatan PCR pada ikan mas (Cyprinus carpio) sakit
Kode Organ Gejala Klinis Hasil
A1 lnsang Memutih pada insang, insang rusak parah, tidak ada Positir gejala pada permukaan tubuh, ikan moribund
A2 Insang memutih pada insang, insang rusak parah, positif moribund, sirip ~ s a k dan melepuh
A3 Insang Memutih pada insang, tidak terdapat gejala pada Positif permukaan tubu!!
A4 Insang Memutih pada insang, tidak terdapat gejala pada Positif permukaan tubuh
A5 Insang Insang memutih Positif
A6 Insang Melepuh pada tubuh, ikan lemah, mendekati Positif moribund, terdapat bercak putih pada insang
A7 Insang Insang memutih, melepuh pada permukaan tubuh, Positif moribund
A8 lnsang Memutih pada bagian insang Positif
A9 Insang Ikan moribund, bagian punggung melepuh, terdapat Positif haemorage pada ekor ikan
A10 Insang Ikan moribund dan memutih pada insang Positif
[image:43.599.82.503.342.786.2]Gambar 5 Visualisasi hasil elektroforesis pada uji PCR ikan sakit
Zkan Carrier-laten
Pada ikan-ikan yang tidak menunjukkan gejala klinis ditemukan adanya ikan-ikan yang positif terserang virus dengan persentase mencapai 80 %. Sunarto
et al. (2004) menyatakan bahwa kelompok herpervirus umumnya memiliki
karakter yang unik, yaitu memiliki kemampuan untuk carrier-laten dalam sel inang dalam jangka waktu yang lama, dan akan menjadi aktif kembali apabila ada pemicu seperti perubahan lingkungan atau stres yang terjadi pada inang
Tabel 2 Hasil pengamatan PCR pada ikan mas (Cyprinus carpio) carrier- laten
Kode Organ Gejala Klinis Hasil
B1 Insang Insang cerah, terdapat haemorage pada insang Positif
B2 Insang Insang normal Positif
B3 Insang Insang normal Positif
B4 Insang I n s a n g n o d Negatif
B5 Insang Insang normal Negatif
B6 Insang insang normal Positif
B7 Insang Insangnormal Positif
B8 Insang Insang normal Positif
B9 Insang Insang normal Positif
Di bawah ini merupakan gambar visualisasi hasil elektroforesis uji PCR ikan sakit.
Gambar 6 Visualisasi hasil elektroforesis pada uji PCR ikan carrier-laten
Pada ikan carrier-laten yang diamati, ditemukan 2 ekor ikan yang negatif KHV, ini menunjukkan bahwa sampel ikan carrier-laten ini 80 % positif KHV.
Ikan Sehat
Dari 10 sampel ikan mas yang digolongkan sehat, menunjukkan bahwa 90
% dinyatakan bebas KHV, namun 10 % masih positif terinfeksi KHV seperti
pads
Tabel 3 berikuttabel 3 Hasil pengamatan PCR pada ikan mas (Cyprinus carpio) sehat
Kode Organ Gejala Klinii Hasil
C1 Insang Insang normal Negatif
C2 Insang Insang normal Positif
C3 Insang Insang normal Negatif
C4 Insang h a n g normal Negatif
C5 Insang Insang normal Negatif
C6 Insang Insang normal Negatif
C7 Insang Insang normal Negatif
C8 Insang Insang normal Negatif
C9 Insang Insang normal Negatif
[image:45.595.112.478.96.363.2] [image:45.595.86.508.575.740.2]Di bawah ini merupakan gambar visualismi h a i l elektroforesis uji PCR ikan sakit.
Gambar 7 Visualisasi hasil elektroforesis pada uji PCR ikan sehat
Karakteristik Hematologi Ikan
Kadar Hemoglobin
Hemoglobin merupakan pigmen pada sel darah merah yang mengandung
zat besi untuk pengangkutan oksigen ke seluruh jaringan. Kadar hemoglobin ditentukan berdasarkan warnakepekatan inti sel darah merah. Semakin tua sel
Sakit Carrier-laten Sehat Status Kesehatan lkan
Gambar 8 Rataan hemoglobin ikan setiap status kesehatan ikan mas
(Cyprinus carpio)
Gambar 8 memperlihatkan perbedaan status kesehatan ikan diikuti oleh
perbedaan kadar hemoglobin. Rataan hemoglobin ikan sakit 5,04 k 1,7 gldl; ikan
carrier-laten 5,88
+
1,l g/dl dan pada ikan sehat 6,14+
0,s g/dl. Perbedaan hemoglobin ikan sehat dan carier-laten mencapai 16 % dan 21,8 % terhadap ikan sehat. Hasil pengarnatan ini memperlihatkan perbedaan hemoglobin, meskipun berdasarkan analisis anova one-way (P>0,05) tidak nyata.Hematokrit
Hematokrit merupakan perbandingan fraksi seluler terhadap total volume
Sakit Carrier-laten Sehat
Status Kesehatan l k a n
Gambar 9 Rataan hematokrit ikan pada setiap status kesehatan ikan mas
Gambar 9 menunjukkan kadar hematokrit darah ikan berbeda pada setiap status kesehatan ikan yakni sakit, carrier-laten dan sehat masing-masing dengan nilai 26,25
+
4,71 %; 27,6+
4,7 % dan 28,06 ?r 3,5 %. Perbedaan kadarhemoglobin antara ikan sehat dan carrier-laten mencapai 1,6 % dan sekitar 6,4 %
dengan ikan sakit, meskipun berdasarkan uji anova one-way (P>0,05) tidak menunjukkan perbedaan yang cukup nyata.
Eritrosit
[image:48.602.84.518.225.781.2]Eritrosit berperan dalam pengangkutan dan distribusi energi, oksigen ke seluruh jaringan tubuh, sekaligus sebagai sarana pengangkutan karbondioksida dari tubuh. Kenaikan maupun p e n m a n jumlah eritrosit dapat kruPakan suatu petunjuk adanya kelainan pada ikan. Rendahnya jumlah eritrosit menunjukkan ikan menderita anemia atau tejadi kerusakan ginjal (Wedemeyer and Yusatake 1977). Di bawah ini merupakan gambaran dan bentuk eritrosit yang ditemukan pada ikan mas sakit, carrier-laten dan what.
Gambar 10 Beutuk eritrosit ikan mas (Cyprinus carpio)
Gambar 10 m e ~ p a k a n gambaran variasi
ukuran
dan bentuk sel darahmerah ikan mas dengan pewarnaan gyemsa. Eritrosit
ikan
mas ini terdiri atas eritrosit muda (EM) berbentuk bulat dan eritrosit tua(ER)
berbentuk bulat lonjong. Eritrosit ikan mas yang ditemukan berkuran panjang diamater 6,7-10,57,3 pm dengan ukuran paling banyak 7.37 pm. Jumlah eritrosit muda pada ikan sakit lebih besar daripada pada ikan sehat. Tripathi et al. (2004) menyatakan bahwa eritrosit berbentuk bulat dan oval berukuran panjang 10-12 pm dan lebar 3,O-4,O pm. Berikut merupakan grafik rataan eritrosit ikan mas sakit, carrier-laten dan sehat
Sakit Carrier-laten Sehat
S t a t u s K e s e h a t a n i k a n
G a m b a r 11 Rataan eritrosit pada setiap status kesehatan ikan mas (Cyprinus carpio)
Gambar 11 menunjukkan perbedaan rataan eritrosit pada ikan mas. Eritrosit terendah berada pada ikan sakit, lebih tinggi pada ikan laten dan tertinggi pada ikan sehat yakni ikn sakit sakit berkisar 1,5143
+
9,l (xlOO sellpl); ikan carrier-laten berkisar 1,67 f 65,4 (xlOO sellpl) dan ikan sehat 1,735 f 56,s (x1O0 sellpl).. Perbedaan eritrosit ikan sehat dengan carrier laten mencapai 17 % dan 21,4 % terhadap ikan sakit, meskipun berdasarkan uji statistik anova one-way (P>0,05) tidak menunjukkan perbedaan nyata pada setiap status kesehatan ikan. Pada pengamatan Tripathi et al. (2004) diketahui eritrosit ikan koi sehat sebanyak 1,8 1+
0,2 (x 10' sellpl)Jumlah darah pada ikan sakit lebih rendah (anemia) daripada ikan canier- laten dan carrier laten lebih rendah daripada ikan sehat diduga terjadi sebagai akibat pendarahan pada insang dan permukaan tubuh ikan mas terinfeksi KHV.
hitam pada insang. Gayton and Hall (1 997) menyatakan bahwa kekurangan darah (anemia) dapat terjadi akibat kehilangan darah.
Total Leukosit
Pada vertebrata, sel darah putih (leukosit) merupakan sel utalna sistim pertahanan tubuh, sehingga salah satu cara menduga sistim imun adalah dengan menyelidiki perubahan jumlah atau gambaran 4 (empat) jenis leukosit pada sirkulasi darah (limfosit, thrombosit, granulosit dan monosit) (Tiemey et nl.
2004). Gambar dibawah merupakan rataan jumlah eritrosit ikan mas sakit, carrier- laten dan sehat.
S a k i t C a r r i e r - l a t s n S s h a t
S t a t u s K.sehmt.n I k a n
Gambar 12 Rataan jumlah leukosit pada setiap status kesehatan ikan mas
(Cyprin us carpio)
Gambar 12 mem~erlihatkan bahwa rata-rata leukosit pada ikan sakit akan mengalami penurunan setelah ikan bersifat carrier-laten dan mengalami penurunan pada ikan sehat. Rataan leukosit pada ikan sakit 386,24 ? 63,90 (x10' sell p1) ; ikan carrier carrier-laten 264
+
38,39 (x10' sew pl) dan pada ikan sehat [image:50.595.88.490.160.544.2]banyak lagi. Pada ikan salut, tubuh memproduksi lebln banyak lemoslt unrw melawan infeksi virus. Fenomena ini disebut leucoqtosis.
Difrensial Leukosit
Pengamatan difrensial leukosit menunjukkan sel netrofil, eosinofil, basofil, limfosit, monosit dan trombosit. Setiap sel leukosit memiliki ukuran dan bentuk yang bervariasi.
Persentase Netrofil
[image:51.595.107.499.348.486.2]Fungsi netrofil adalah menghancurkan bahan asing melalui proses fagositosis. Mekanisme ini terjadi melalui beberapa tingkatan yaitu kemotaksis, perlekatan, penelanan dan pencemaan (Tizard 1987). Pada penelitian ini, diketahui bentuk netrofil seperti gambar 13 berikut ini.
Gambar 13 Bentuk netrofil ikan yang terserang virus koi herpes
Tizard (1982) menyatakan bahwa netrofil merupakan garis pertahanan
pertama, yang memiliki sediaan cadangan energi yang sangat terbatas, yang tidak
Ukuran monosit pada ikan sakit, khususnya ikan sekarat (moribun) mengalami pembesaran. Secara umum ukuran lebih besar dan bentuk yang tidak
teratur. Hal ini senada dengan Tizart (1982) bahwa struktur makopag dapat berubah secara dramatik setelah tejadi tanggap kebal berperantara sel terhadap mikroorganisme tertentu. Secara khusus makropag membesar dan lisosomnya sangat bertambah jumlahnya. Dalam kondisi bahan asing bertahan dalam tubuh, maka makropaga berkumpul dalam jumlah besar di sekitar bahan asing tersebut. Makropag ini relatif berumur panjang, mengganti din dengan kecepatan sekitar 1
[image:53.599.86.495.321.699.2]% per hari kecuali jika diperlukan untuk menelan benda asing. Di bawah ini m e ~ p a k a n gambaran berbagai bentuk monosit yang ditemukan pada ikan sakit, carrier-laten dan sehat.
Respon leukosit berdasarkan persentase monosit digambarkan pada grafik berikut ini.
Sakit Carrier-laten Sehat
Status Kesehatan lkan
Gambar 16 Rataan persentase monosit pada ikan mas (Cyprinus carpio)
sakit, carrier-laten dan sehat.
Gambar 16 menunjukkan pola peningkatan jumlah monosit secara drastis pada ikan mas yang terserang KHV. Analisis chi-kwadarat (P>0,05) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nyata jumlah monosit pada setiap kesehatan ikan. Gambar 19 memperlihatkan jumlah monosit ikan sakit sekitar 40
+
16,31 %; ikancarrier-laten 11,5 ? 5,94 % dan pada ikan sehat 8,10
*
6,05 %. Peningkatan monosit dari ikan sehat mencapai 42 % dibandingkan ikan carrier-laten dan 398 %pada ikan sakit. Kemampuan tubuh untuk merangsang produksi monosit yang besar mengindikasikan peningkatan kemampuan sistim imun ikan melawam serangan KHV. Roitt (1988) menyatakan bahwa kemampuan untuk membunuh obligat intraseluler hanya tejadi ketika sel imun merangsang produksi makropag yang diperantarai makropag activaring fakror seperti pelepasan interferon. Makropag dapat mengenal virus dengan cepat dan membunuhnya.
Limfosit
[image:54.599.83.494.91.826.2]besar, produksi antibodi tampaknya menjadi fungsi utama limfosit. J k r h t hi
merupakan gambar bentuk dan ukuran limfosit yang ditemukan pada ikan mas &it, carrier-laten dan
what
Gambar 17 Bentuk dan okrlmn iimfosi? ikan mas (C. carpi01 vane benifat
sakit. carrier-late" dan seha!
Lkurzrq limfosit ikan. mas bervariasi tereaqtune Dada staQ~s kesehatan &an. Ikan vane bersifat sakit. memiliki limfosit berukuran besar lebih banvak dibandiigkan denean ikan vane bersifat carrier-laten dan sehat. Limfosit vada ~enelitian ini berdiameter 3.67 - 8.04 um. serta didominasi limfosit berdiameter 4.02
-
4.7 um. Gjxnbar 18 menuniukkan berava bentuk dan ukuran sel limfosit. Sel ini memiliki nukelus vang c u k u ~ besar berwarna aeak lebih e e l a ~ . Berikut meruoakan mafik rataan Dersentase limfosit ikan mas sakit. carrier-laten dan~ ~ h l t
Sakit Carrier-laten Sehat
Status Kesehatan lkan
[image:55.595.93.499.107.292.2] [image:55.595.85.495.339.767.2]Gambar 18 menunjukkan bahwa persentase limfosit pada ikan carrier-laten
(60,43
+
8,61 %) lebih tinggi daripada ikan sehat (54,36+
6,89 %) dan sakit(41,9 k 15,12 %). Jumlah limfosit ikan carrier-laten naik sebesar 11 % dari ikan sehat dan mengalami penurunan 22,s % pada ikan sakit. Berdasarkan analisis statistik anova one-way tidak menunjukkan perbedaan nyata.
Trombosit Ikan
[image:56.595.87.491.349.525.2]Trombosit berperan penting dalam proses pembekuan darah dan juga berfungsi mencegah kehilangan cairan tubuh pada kerusakan-kemsakan di permukaan (Nabib dan Pasaribu 1989). Anderson (1987) menyatakan bahwa trombosit ikan berukuran kecil dengan diameter sekitar 8 mikron. Secara morfologi sama dengan hukleus eritrosit. Berikut mempakan gambaran bentuk dan
ukuran
trombosit yang ditemukan pada ikan mas sakit, carrier-laten dan sehat.Gambar 19 Bentuk dan ukuran trombosit ikan mas
Sakit Carrier-laten
Status Kesehatan lkan
[image:57.595.95.481.81.277.2] [image:57.595.87.484.91.496.2]Sehat
Gambar 20 Rataan persentase trombosit pada ikan mas sakit, carrier-laten dan sehat.
Gambar 20 menunjukkan adanya kenaikan jumlah trombosit pada ikan mas seiring dengan perubahan status kesehatan ikan. Analisis anova one-way (P>0,05) memperlihatkan adanya perbedaan nyata jurnlah. trombosit pada setiap
status kesehatan ikan. Rataan trombosit pada ikan sakit 11,53 f 6,77 %; ikan
canier-laten 25,07 f 9,58 % dan pada ikan sehat mencapai 34,90 f 7,08 %.
Serangan KHV pada ikan carrier-laten menyebabkan trombosit turun 29 % dari ikan sehat, dan penurunan 67 % ketika ikan sakit.
Karakteristik Virulensi Virus
Pengamatan ini menunjukkan hahwa terjadi penurunan virulensi virus meliputi : 1) pada ikan yang menunjukkan gejala klinis terjadi penurunan virulensi menjadi titer lo6.' iml dari pengamatan Amrullah (2004) yakni titer 10~.'~/ml. 2)
6,7 .
penurunan virulensi pada ikan sakit yang menunjukkan gejala yakni 10 tlter menjadi 105.6/ml pada ikan carrier-laten.
Tejadinya penurunan mortalitas ikan mas yang dipelihara di keramba juga disebabkan terjadinya penurunan virulensi virus yang menginfeksi ikan tersehut meskipun penurunnya relatif kecil.
Pengukuran Kualitas Air Kualitas Air Keramba
[image:58.602.84.500.314.730.2]Kualitas air keramba, diukur pada saat sampling ikan sampel. Nilai parameter kualitas air terdiri atas :
Tabel 4 Pengukuran kualitas air di keramba jaring apung Waduk Cirata
Pembahasan
Karakteristik Keberadaan Virus berdasarkan Gejala Klinis
Gejala klinis muncul sebagai ekspresi perubahan dan abnormalitas organ akibat serangan KHV melalui tahapan yang panjang dalam menginfeksi jaringan dan sel-sel ikan mas. Awal infeksi dimulai dari perlekatan virus pada pemukaan tubuh maupun insang. Pada permukaan tubuh diduga virus mampu melewati pertahanan awal tubuh ikan mas berupa mukus, sisik dan epitel tubuh, sedangkan di insang virus KHV mampu melewati mukus dan epitel insang. Nat (2001) menyatakan bahwa untuk proteksi ikan terhadap invasi patogen, permukaan epitel (kulit dan insang) penting sebagai pertahanan awal. Virus juga mampu melewati komponen berbagai substansi pertahanan pada mukus. Magnadottir (2006) menyatakan bahwa mukus ikan mengandung parameter immun seperti lectin, pentraxin, lysozym, protein komplemen, peptida antibakterial dan IgM. Virus yang menempel dan masuk ke organ tubuh bisa berasal dari virus yang terdapat pada feces ikan atau perpindahan virus akibat kontak langsung (kohabitasi) dengan ik& terinfeksi (Hartman er al. 2004). Kemudian virus akan masuk ke jaringan pada ruang antar sel. Ligan pada permukaan molekul khusus virion mengikat reseptor pada membran plasma sel (Fenner et al. 1995). Virus mas& ke dalam sel melalui fusi antara glikoprotein selubung virus dengan reseptomya yang terdapat di membran plasma (Daily dan Makes 2002), proses masuknya virus terjadi dengan cara endositosis (endositosis diperantarai sel) (Fenner et al. 1995).
Selanjutnya nukleokapsid virus pindah dari sitoplasma ke inti sel, setelah kapsid NS&, genom virus dilepas ke dalam inti sel. Genom DNA yang awalnya linear segera berubah menjadi sirkuler (Daily dan Makes 2002).
menyerang dan mengubah sifat-sifat sel. Perubahan sel yang terinfeksi dapat meluas dan mengakibatkan lisisnya sel atau tejadinya transformasi malignan. Kerusakan sel yang meluas, menyebabkan kerusakan jaringan dan organ insang hingga mengalami kematian jaringan. Kemsakan jaringan diperlihatkan dengan adanya nekrosis atau memutih pada lamella primer maupun lamella sekunder insang.
Virus KHV mengambil alih peranan sel inang yang seharusnya berfungsi untuk metabolisme inang menjadi metabolime untuk keperluan virus. Sel insang yang terinfeksi akan mengalami lisis. Sel insang yang lisis akan menyebabkan terganggunya fungsi sel, yang menyebabkan terjadinya pendarahan (haemorage) sebagai akibat rusak dan terputusnya saluran darah, terjadinya penumpukan darah (menghitam) pada pangkal sel terinfeksi. Kerusakan sel secara terus menerus akan menyebabkan rusaknya jaringan insang, sehingga nekrosis semakin meluas, ha1 ini ditandai dengan insang memutih mencapai 80 %.
Kerusakan insang akan mengganggu mekanisme pertukaran gas di insang baik pengikatan oksigen dari luar maupun pelepasan karbondioksida dari dalam darah yang merupakan fungsi utama insang. Untuk mengimbangi suplai oksigen maka ikan akan meningkatkan frekwensi pergerakan operkulum. Gejala yang lebih konsisten ikan pucat dan peningkatan frekwensi pemafasan (Gray et al. 2002), pembengkakan insang, pucat pada insang dan lesi pada kulit (Oh et al. 2000). Infeksi virus yang menyebabkan nekrosis insang, awalnya dapat terjadi pada ujung dan pangkal insang. Ketika infeksi dimulai dari pangkal insang, akan menyebabkan tersumbatnya aliran darah, sehingga distribusi darah pada jaringan insang terganggu, ha1 ini ditandai dengan menumpuknya darah pada bagian tertentu dan pucat pada bagian insang. Pada kondisi sekarat yang ditandai oleh kerusakan (nekrosis) yang semakin meluas, insang pucat akan diikuti dengan penurunan produksi mukus insang dan penurunan frekwensi pergerakan operkulum. Kemsakan insang dan kurangnya suplai oksigen akan menyebabkan kematian ikan mas terinfeksi.
kulit dan insang ikan diberada di bawah kontrol neuroendokrin dan dipengaruhi oleh hormon. Ketika ikan mengalami sakit, pola pemeliharaan pigmentasi secara normal mengalami penurunan yang disebabkan respon haemostase terhadap fungsi organ-organ vital ikan. Kelainan-kelainan yang terjadi pada insang, memperlihatkan bahwa insang merupakan salah satu organ target serangan KHV. Preparat histologi (pewamaan hematoksilin dan eosin) menunjukkan ciri infeksi virus herpes, yakni tejadinya hipertropi, hiperplasia dan adanya badan inklusi (inclusion body) dalam inti sel (intranuklear inclussion). Pokorova et al, (2005) mengungkapkan bahwa pengamatan secara histologi memperlihatkan epitel insang dengan perubahan degenerasi dan nekrosis dan munculnya badan inklusi pada sel terinfeksi. (Noga 2000) menambahkan respon paling umum kerusakan insang adalah te jadinya hiperplasia atau hipertropi pada epitel sel, yang akhimya dapat menyebabkan fusi diantara lamella sekunder atau bahkan pada lemella primer. Kondisi ini akan menyebabkan penurunan pertukaran gas dan gangguan respirasi.
Nekrosis yang meluas pada insang sangat mengganggu dalam mekanisme fisiologis pada ikan. Noga (2000) menyatakan bahwa insang merupakan organ multifungsi, dengan fungsi utarna sebagai organ respirasi, merupakan bagian penting dalam ekskresi amoniak beracun serta berperan menjaga keseimbangan ionik, pertukaran gas, transpost (mono dan divalen) ion, ekskresi sisa nitrogen (amonia dan urea), pengambilan dan eksresi beberapa xenobiotik (Lawrence and Hemingway 2003). Kajian biopsi insang menjadi alat diagnosa penyakit ikan, Noga (2000) menyatakan bahwa insang sehat benvarna merah cerah, sedangkan pucat kemungkinan anemia atau kelainan pada methemoglobin.
Beberapa gejala klinis lain yang mungkin secara langsung dan tidak langsung berkaitan dengan serangan KHV yakni terjadi pendarahan pada bagian sirip atau permukaan tubuh, melepuh pada sirip maupun permukaan tubuh, mata ikan cekung dan buta, badan kurus. Hal yang sama telah diperoleh Hedrick ef al. (2000), Englesma and Heanen (2005) dan Amrullah (2004).
diungkapkan Sunarto ef a1 (2004) bahwa tingkah laku ikan terserang KHV memperlihatkan : 1) ikan terlihat megap-megap dan berenang di permukaan atau ke arah aliran air masuk, selanjutnya menjadi lemah dan berkumpul di saluran pengeluaran, dan 2) pergerakan tidak terkoordinasi, sangat lamban dan terpisah dari kelompok ikan yang sehat. Sedangkan pada ikan sehat dan carrier-laten umumnya lebih lincah dan sangat berespon terhadap rangsangan seperti cahaya dan gerakan. Pokorova et al. (2005) menyatakan bahwa menunjukkan pergerakan yang tidak menentu sampai kematian.
Ikan-ikan yang terinfeksi berat, umumnya tidak mempunyai nafsu makan. Kekurangan suplai energi dan material penyusun sel tubuh mempakan faktor yang mempercepat tejadinya kemsakan organ dan kemati
