MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON PADA RIZOBAKTERIA
PEMACU TUMBUH
Pseudomonas
sp. CRB 19 DAN
APLIKASINYA PADA TANAMAN JAGUNG
IRENE ARIKA PUTRI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Mutagenesis dengan Transposon pada Rizobakteria Pemacu Tumbuh Pseudomonas sp. CRB 19 dan Aplikasinya pada Tanaman Jagung adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
IRENE ARIKA PUTRI. Mutagenesis dengan Transposon pada Rizobakteria Pemacu Tumbuh Pseudomonas sp. CRB 19 dan Aplikasinya pada Tanaman Jagung. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan EDI HUSEN.
Rizobakteria pemacu tumbuh tanaman (PGPR) merupakan sekelompok bakteri di rizosfer yang mampu memacu pertumbuhan tanaman dan membantu tanaman dalam menghadapi kondisi cekaman lingkungan seperti cekaman kekeringan. Pseudomonas sp. merupakan salah satu genus PGPR yang mampu menghadapi cekaman kekeringan karena memproduksi eksopolisakarida. Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi mutan Pseudomonas sp. untuk mendapatkan mutan yang tidak menghasilkan eksopolisakarida agar dapat dibandingkan dengan tipe liarnya dan diketahui efektivitasnya terhadap pertumbuhan tanaman jagung dalam kondisi cekaman kekeringan. Transposon mini-Tn5Km1 pembawa gen resisten kanamisin dalam E. coli S17-1 (λ pir) disisipkan ke genom Pseudomonas sp. CRB 19 dengan frekuensi konjugasi sekitar 4.03 x 10-7 sel per resipien. Dari 15 mutan terpilih diperoleh sebanyak tiga mutan yaitu MNM-6, MNM-7 dan MNM-13 dengan penurunan kadar eksopolisakarida tertinggi berturut-turut sebesar 56.39%, 52.61% dan 51.79%. Efektivitas inokulan pada tanaman jagung menunjukkan interaksi dengan cekaman kekeringan pada parameter berat basah akar (BBA). Dari hasil ini, hanya Pseudomonas sp. CRB 19 yang mampu meningkatkan pertumbuhan tersebut pada kondisi kering (63.2% RPTA). Sementara ketika tidak ada interaksi dengan cekaman kekeringan, formula tetap mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman jagung pada parameter tinggi, berat basah tajuk, berat kering tajuk dan berat kering akar.
Kata kunci: eksopolisakarida, formula, jagung, mutagenesis, Pseudomonas sp, transposon
ABSTRACT
IRENE ARIKA PUTRI. Mutagenesis with Transposon of Plant Growth Promoting Rhizobacteria Pseudomonas sp. CRB 19 and Its Application on Maize. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and EDI HUSEN.
Plant growth promoting rhizobacteria ( PGPR ) are group of bacteria in the rhizosphere that were able to stimulate plant growth and help plants in the face of environmental stress conditions such as drought stress. Pseudomonas sp. is one PGPR genus that was able to face drought stress because can produce exopolysaccharide. Pseudomonas sp. mutant was constructed using transposon mutagenesis to obtaine non-producing exopolysaccharide mutants. The mutants were compared with the wild type Pseudomonas sp. CRB 19 to study the effectiveness on growth promoting under drought condition. Tn5Km1-mini transposon carrying the kanamycin resistance gene in E. coli S17-1 (λ pir) was inserted into Pseudomonas sp. CRB 19 genome with conjugation frequency around 4.03 x 10-7 cell per recipient. There were three mutants, MNM-6, MNM-7 and MNM-13 that showed the highest reduction of exopolysaccharide production, respectively 56.39%, 52.61% and 51.79%. Formula showed interaction with drought stress in improving root wet weight. Pseudomonas sp. CRB 19 was able to enhance that plant growth in drought condition (63.2% WFPS). When there is no interaction with drought stress, the formula continued to increase plant growth in height, canopy wet weight, canopy dry weight and root dry weight.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON PADA RIZOBAKTERIA
PEMACU TUMBUH
Pseudomonas
sp. CRB 19 DAN
APLIKASINYA PADA TANAMAN JAGUNG
IRENE ARIKA PUTRI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Mutagenesis dengan Transposon pada Rizobakteria Pemacu Tumbuh Pseudomonas sp. CRB 19 dan Aplikasinya pada Tanaman Jagung
Nama : Irene Arika Putri NIM : G34090095
Disetujui oleh
Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi Pembimbing I
Dr Edi Husen, MSc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi Ketua Departemen
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wata’ala atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Mutagenesis dengan Transposon pada Rizobakteria Pemacu Tumbuh Pseudomonas sp. CRB 19 dan Aplikasinya pada Tanaman Jagung. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor dan Rumah Kaca Balai Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan (BBSDLP) Kementerian Pertanian Bogor, Jawa Barat.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi dan Dr Edi Husen, MSc selaku pembimbing atas arahan, bimbingan dan ilmu yang bermanfaat yang diberikan selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Sebagian penelitian ini didanai melalui Proyek Penelitian KKP3N 2013 kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi untuk itu penulis mengucapkan terima kasih. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr Rita Megia, DEA sebagai wakil dari komisi pendidikan atas sarannya sehingga karya ilmiah ini menjadi lebih baik.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Rahayu Fitriani Wangsa Putrie, MSi selaku tutor yang telah banyak memberikan saran, ilmu dan bantuan selama penelitian berlangsung. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua, adik serta keluarga besar atas do’a, dukungan, dan kasih sayang yang diberikan. Terima kasih pula kepada sahabat-sahabat (Bob, Fadhil, Mirah dan Wulan) atas motivasi dan kebersamaannya selama ini. Tak lupa terima kasih kepada teman seperjuangan Yani Mulyani, teman-teman Lab Mikrobiologi, serta teman-teman Biologi 46 atas semua kebersamaan dan dukungan yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
METODE 2
Bahan dan Alat 2
Metode Penelitian 2
Mutagenesis dengan Transposon 2
Seleksi Mutan dan Uji Kuantitatif Pengukuran Eksopolisakarida 4
Penyiapan Gambut sebagai Bahan Pembawa 4
Formulasi Inokulan ke Bahan Pembawa Gambut 4
Penyiapan Tanah dan Pengaturan Kadar Air 4
Pengujian Inokulan pada Pertumbuhan Tanaman Jagung 5
HASIL 5
Mutagenesis dengan Transposon 5
Seleksi Mutan dan Uji Kuantitatif Pengukuran Eksopolisakarida 6
Formulasi Inokulan ke Bahan Pembawa Gambut 7
Pengujian Inokulan pada Pertumbuhan Tanaman Jagung 8
PEMBAHASAN 11
SIMPULAN 14
DAFTAR PUSTAKA 14
LAMPIRAN 16
DAFTAR TABEL
1 Hasil uji kuantitatif eksopolisakarida (EPS) yang dihasilkan oleh mutan
Pseudomonas sp. CRB 19 6
2 Jumlah populasi awal inokulan bakteri pada media susu skim dan
molase 7
3 Formulasi isolat bakteri yang digunakan 8
4 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap tinggi tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda 8 5 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat basah tajuk
tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda 9 6 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat kering tajuk
tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda 9 7 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat basah akar
tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda 9 8 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat kering akar
tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda 9
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram skematik mutagenesis dengan transposon 3 2 Koloni mutan hasil mutagenesis dengan transposon pada media selektif
LA+ Rif (50 µg/mL) +Km (50 µg/mL) yang diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam selama 24 jam masa inkubasi 5 3 Perbandingan koloni yang diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam
masa inkubasi: CRB 19 (a) dan mutan MNM-6 (b) 6
4 Persentase penurunan kadar eksopolisakarida (EPS) yang dihasilkan
oleh mutan Pseudomonas sp. CRB 19 7
5 Bentuk kemasan paket formula dalam bahan pembawa gambut 7 6 Penampilan pertumbuhan tanaman jagung dengan berbagai perlakuan
formulasi inokulan. K perlakuan kering; B perlakuan basah; F1-F4 perlakuan formulasi inokulan; K0 kontrol tanpa formulasi inokulan 10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil analisis tekstur dan sifat kimia tanah vertisol 16 2 Setting tanah pot untuk kadar air dibawah kapasitas lapang (DKL)* 17
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sekitar 78% dari luas daratan Indonesia merupakan lahan kering (Mulyani et al. 2008). Lahan kering dikategorikan sebagai salah satu lahan marjinal karena kondisi kadar air berada dibawah kapasitas lapang dan dalam kondisi laju evapotranspirasi melebihi laju absorbsi air (Salisbury 1992). Disamping itu, lahan kering memiliki kandungan bahan organik relatif rendah yang dapat menyebabkan tanaman mengalami defisiensi unsur hara. Cekaman kekeringan merupakan faktor lingkungan utama yang berpengaruh terhadap menurunnya produktivitas tanaman pertanian (Vmanchanda dan Garg 2008). Oleh karena itu, diperlukan upaya untuk mengatasi hal tersebut agar lahan kering dapat dimanfaatkan sehingga produktivitas tanaman pertanian lebih optimal. Salah satu upaya itu adalah dengan menggunakan rizobakteria sebagai inokulan.
Rizobakteria pemacu tumbuh tanaman atau Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) adalah kelompok bakteri yang hidup bebas di daerah rizosfer dan berpotensi dalam memacu pertumbuhan tanaman serta sebagai agen pengendali hayati yang menguntungkan (Dey et al. 2004). Mekanisme pemacuan pertumbuhan tanaman oleh PGPR dilakukan melalui proses penambatan nitrogen, produksi antibiotik, produksi siderofor, pelarutan fosfat dan produksi zat pengatur tumbuh tanaman. Bakteri Pseudomonas sp. merupakan salah satu genus PGPR yang telah banyak diteliti karena kemampuannya dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Pseudomonas sp. mampu membantu tanaman dalam menghadapi cekaman lingkungan seperti cekaman kekeringan, limitasi nutrien serta pencemaran senyawa toksik (Marulanda et al. 2009). Hal ini karena Pseudomonas sp. menghasilkan eksopolisakarida, yaitu hasil sekresi senyawa organik ekstraseluler bakteri dalam bentuk kapsul, lendir atau mukoid. Eksopolisakarida dihasilkan sebagai upaya perlindungan diri bakteri agar tetap hidup. Disamping itu, eksopolisakarida berperan dalam mempertahankan retensi air di sekitar rizosfer dengan membentuk mikroagregat tanah yang stabil (Santi 2011). Formasi ini dapat dimanfaatkan oleh tanaman terlebih ketika berada pada kondisi cekaman kekeringan.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi mutan Pseudomonas sp. CRB 19 dengan transposon dan mengaplikasikan mutan yang dihasilkan pada pertumbuhan tanaman jagung dalam kondisi cekaman kekeringan di rumah kaca.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai Agustus 2013 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB dan Rumah Kaca Cikeuweuh, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan (BBSDLP) Kementerian Pertanian, Bogor, Jawa Barat
Bahan dan Alat
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri pemacu tumbuh dan toleran kekeringan Pseudomonas sp. CRB 19 sebagai resipien dan bakteri E. coli S17-1 (λ pir) (pUTmini-Tn5Km1) sebagai donor dalam penandaan transposon. Isolat Pseudomonas sp. CRB 19 diperoleh dari hasil penapisan bakteri toleran kekeringan terbaik pada penelitian sebelumnya (Radita 2012). Media yang digunakan meliputi media King’s B (pepton 20 g/L, K2HPO4 1.5 g/L, MgSO4.7H2O 1.5 g/L, gliserol 15 mL, dan agar 20 g/L), media luria agar (LA) (tryptone 10 g/L, NaCl 10 g/L, yeast extract 5 g/L, dan agar 15 g/L), media luria bertani broth (LB), dan media susu skim dengan molase (susu skim 20 g/L, K2HPO4 1.5 g/L, MgSO4.7H2O 1.5 g/L dan molase 15 mL). Bahan kimia yang digunakan antara lain PEG 6000, larutan etanol absolut, larutan NaCl 0.85%, larutan fenol 5%, larutan H2SO4 pekat, antibiotik kanamisin 50 µg/mL (Km), rifampisin 50 µg/mL (Rif), dan ampisilin 50 µg/mL (Amp). Benih jagung manis varietas Laksmi SD3 IPB dan bahan pembawa berupa gambut yang ditambah bahan mineral digunakan dalam uji efektivitas inokulan di rumah kaca. Alat-alat yang digunakan meliputi cawan petri, erlenmeyer, tabung reaksi dan alat-alat laboratorium lainnya.
Metode Penelitian
Mutagenesis dengan Transposon
3 biakan donor ditumbuhkan pada 50 mL media LB + Km 50 µg/mL + Amp 50 µg/mL, diinkubasi pada mesin bergoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 37°C selama 20 jam (108 sel/mL). Konjugasi dilakukan dengan perbandingan jumLah sel donor dan resipien 1:1. Kultur sel donor disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 5 menit, sementara sel resipien disentrifugasi pada kecepatan yang sama selama 10 menit. Pelet yang terbentuk dicuci sebanyak 2-3 kali dalam larutan NaCl 0.85%. Pelet sel resipien kemudian ditambahkan media LB sebanyak 40 µL. Selanjutnya suspensi sel resipien dipindahkan ke dalam tabung mikro yang berisi pelet sel donor. Suspensi campuran sel resipien dan sel donor (M) tersebut diresuspensi lalu dipindahkan ke membran filter milipore steril yang berada di atas media LA non-antibiotik. Konjugasi bakteri dilakukan selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah 24 jam, masing-masing membran filter diangkat lalu dilarutkan dalam larutan NaCl 0.85% steril sebanyak 1 mL, kemudian divorteks agar sel terlepas dari membran filter. Selanjutnya sebanyak 100 µL masing-masing suspensi disebar pada media agar cawan LA+Km 50 µg/mL + Rif 50 µg/mL lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Koloni yang muncul pada media tersebut menunjukkan Pseudomonas sp. CRB 19 mutan yang genomnya telah tersisipi oleh gen Km1 dari transposon mini-Tn5Km1. Diagram skematik mutagenesis dengan transposon disajikan pada Gambar 1.
4
Seleksi Mutan dan Uji Kuantitatif Pengukuran Eksopolisakarida
Pseudomonas sp. mutan yang tidak bermukoid atau tidak berlendir diukur kadar eksopolisakaridanya berdasarkan pada metode Dubois et al. (1956). Kultur Pseudomonas sp. mutan ditumbuhkan pada media yang ditambahkan PEG 6000 selanjutnya diinkubasi selama 72 jam. Kultur lalu disentrifugasi pada kecepatan 13 000 rpm selama 30 menit. Supernatan kemudian dipresipitasi dengan 3 mL etanol absolut selama 24 jam pada suhu 4°C lalu disentrifugasi kembali pada kecepatan 10 000 rpm selama 15 menit. Endapan yang diperoleh dilarutkan dengan akuades sebanyak 0.5 mL, diresuspensi lalu ditambahkan larutan fenol 5% sebanyak 0.5 mL dan larutan H2SO4 pekat sebanyak 2.5 mL. Selanjutnya larutan tersebut dipanaskan di dalam water bath pada suhu 40°C selama 10-15 menit lalu diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer Vis pada panjang gelombang 490 nm. Kadar eksopolisakarida ditentukan dengan membandingkan dengan hasil regresi kurva standar glukosa pada kisaran konsentrasi 0-100 ppm. Mutan dengan kadar eksopolisakarida terendah digunakan pada pengujian efektivitas terhadap pertumbuhan tanaman jagung di rumah kaca.
Penyiapan Gambut sebagai Bahan Pembawa
Bahan pembawa terdiri dari campuran gambut sebanyak 85%, fosfat alam 10%, dan kapur pertanian (kaptan) sebanyak 5%. Selanjutnya sebanyak 50 g campuran gambut dan bahan mineral tersebut dikemas ke dalam plastik tahan panas lalu disterilisasi sebanyak 2 kali pada suhu 121°C pada tekanan 1 atm selama 1 jam.
Formulasi Inokulan ke Bahan Pembawa Gambut
Isolat Pseudomonas sp. mutan terpilih ditumbuhkan ke dalam 10 mL media cair King’s B +Rif 50 µg/mL +Km 50 µg/mL pada mesin bergoyang dengan kecepatan 140 rpm pada suhu ruang selama 48 jam. Kultur kemudian ditumbuhkan kembali di dalam media produksi susu skim dengan molase pada mesin bergoyang hingga kepadatan populasi bakteri mutan mencapai 109 sel/mL. Selanjutnya sebanyak 12 mL suspensi tersebut diinokulasikan menggunakan syringe steril ke dalam 50 g gambut steril.
Penyiapan Tanah dan Pengaturan Kadar Air
5 Kadar air dibawah kapasitas lapang diperoleh dari nilai rataan RPTA kapasitas lapang dan RPTA titik layu permanen (Lampiran 2).
Pengujian Inokulan pada Pertumbuhan Tanaman Jagung
Pengujian ini dilakukan di rumah kaca dengan menggunakan kadar air tanah yang diatur secara konstan. Benih jagung steril diinokulasi secara merata dengan gambut yang berisi inokulan Pseudomonas sp. mutan terpilih. Selanjutnya benih ditanam ke dalam polybag yang berisi 3 kg tanah. Setiap polybag ditanam 2 benih jagung. Penjarangan dilakukan pada 7 hari setelah tanam (HST) dengan menyisakan 1 tanaman pada setiap polybag dengan pertumbuhan yang relatif seragam. Kekonstanan kadar air dikondisikan dengan menyiram tanaman jagung sebanyak satu kali setiap harinya sambil ditimbang hingga mencapai berat tertentu. Uji ini dilakukan selama fase vegetatif.
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 2 faktor perlakuan (kadar air dan formula bakteri) (Lampiran 3). Perlakuan kadar air terdiri atas 2 level (basah dan kering), sedangkan perlakuan formula bakteri terdiri atas 5 level (F1, F2, F3, F4 dan 1 kontrol). Masing-masing kombinasi perlakuan diulang sebanyak 5 kali. Parameter pertumbuhan jagung yang diukur meliputi tinggi tanaman, berat basah tajuk, berat kering tajuk, berat basah akar dan berat kering akar. Analisis data dilakukan menggunakan software SPSS 16.0 dengan uji Duncan pada taraf 5%.
HASIL
Mutagenesis dengan Transposon
Mutagenesis dengan transposon merupakan salah satu cara untuk mengkonstruksi mutan yang diharapkan tidak menghasilkan eksopolisakarida. Hasil mutagenesis dengan transposon mendapatkan frekuensi konjugasi sekitar 4.03 x 10-7 sel per resipien yang diperoleh selama 24 sampai 72 jam masa inkubasi. Mutan-mutan hasil konjugasi diekspresikan melalui kemampuan tumbuhnya pada media LA+Rif (50 µg/mL)+Kan (50 µg/mL) (Gambar 2). Hal tersebut menunjukkan bahwa gen resisten kanamisin telah berhasil disisipkan ke dalam genom Pseudomonas sp. CRB 19 melalui konjugasi diparental mating.
Gambar 2 Koloni mutan hasil mutagenesis dengan transposon pada media selektif LA+ Rif (50µg/mL)+Km (50µg/mL) yang diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam
6
Seleksi Mutan dan Uji Kuantitatif Pengukuran Eksopolisakarida
Seleksi mutan Pseudomonas sp CRB 19 dilakukan terhadap 15 mutan hasil mutagenesis dengan transposon. Seleksi ini didasarkan pada penampakan koloni mutan yang tidak berlendir dan cenderung lebih kering dibandingkan tipe liarnya (Gambar 3). Karakter tersebut mengindikasikan bakteri mutan diduga tidak menghasilkan eksopolisakarida. Untuk membuktikan hal tersebut maka dilakukan serangkaian uji kuantitatif pengukuran eksopolisakarida.
(a) (b)
Gambar 3 Perbandingan koloni yang diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam masa inkubasi: CRB 19 (a) dan mutan MNM-6 (b)
Dari hasil uji kuantitatif, diketahui semua mutan masih menghasilkan eksopolisakarida, namun hasil ini lebih rendah dibandingkan tipe liarnya. Kadar eksopolisakarida yang dihasilkan oleh mutan berkisar antara 0.044-0.080 mg/mL. Sementara CRB 19 memiliki kadar eksopolisakarida sebesar 0.100 mg/mL (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil uji kuantitatif eksopolisakarida (EPS) yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp. CRB 19
Kode isolat Bobot EPS
(mg/mL) Kode isolat
Bobot EPS (mg/mL) MNM-1 0.065 MNM-9 0.051 MNM-2 0.073 MNM-10 0.080 MNM-3 0.078 MNM-11 0.061 MNM-4 0.054 MNM-12 0.071 MNM-5 0.069 MNM-13 0.048 MNM-6 0.044 MNM-14 0.078 MNM-7 0.047 MNM-15 0.064 MNM-8 0.055 CRB 19 (wt) 0.100
Berdasarkan hasil uji kuantitatif eksopolisakarida, diketahui persentase penurunan kadar eksopolisakarida mutan berkisar antara 19.46-56.39% (Gambar 4). Selanjutnya sebanyak tiga mutan dengan penurunan kadar eksopolisakarida tertinggi dipilih untuk dilakukan pengujian efektivitas inokulan terhadap pertumbuhan tanaman jagung dalam kondisi cekaman kekeringan. Mutan-mutan tersebut diantaranya MNM-6, MNM-7 dan MNM-13 dengan penurunan kadar eksopolisakarida berturut-turut sebesar 56.39%, 52.61% dan 51.79%.
7
Gambar 4 Persentase penurunan kadar eksopolisakarida (EPS) yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp. CRB 19
Formulasi Inokulan ke Bahan Pembawa Gambut
Sebanyak empat isolat bakteri terpilih (CRB 19, MNM-6, MNM-7 dan MNM-13) diformulasi dalam bahan pembawa gambut. Sebelum diinokulasikan ke dalam bahan pembawa gambut, masing-masing bakteri ditumbuhkan di media produksi alternatif susu skim dan molase. Setelah ditumbuhkan di media produksi, populasi awal bakteri dihitung menggunakan metode cawan sebar. Jumlah populasi awal masing-masing bakteri sebesar 109 CFU/mL (Tabel 2). Bentuk paket formula yang dihasilkan berupa serbuk (Gambar 5).
Tabel 2 Jumlah populasi awal inokulan bakteripada media susu skim dan molase Isolat Waktu inkubasi
Gambar 5 Bentuk kemasan paket formula dalam bahan pembawa gambut
8
Dari hasil formulasi, diperoleh sebanyak empat paket formula yang dihasilkan. Masing-masing formulasi terdiri atas satu macam isolat bakteri terpilih. Paket formulasi yang dihasilkan disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Formulasi isolat bakteri yang digunakan No. Formula Isolat
1 F1 MNM-6
2 F2 MNM-7
3 F3 MNM-13
4 F4 CRB 19
Pengujian Inokulan terhadap Pertumbuhan Tanaman Jagung
Pengaruh formulasi inokulan terhadap pertumbuhan tanaman jagung pada kadar air yang berbeda ditunjukkan melalui lima parameter yaitu tinggi tanaman, bobot basah tajuk (BBT), bobot kering tajuk (BKT), bobot basah akar (BBA) dan bobot kering akar (BKA). Interaksi antara faktor kadar air dan faktor formula hanya terjadi pada parameter BBA. Interaksi ini menunjukkan bahwa pengaruh formula bergantung pada kadar air. Untuk parameter tinggi, BBT, BKT dan BKA tidak terjadi interaksi antara formula dan kadar air. Namun pada parameter pertumbuhan tersebut terdapat formula yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman. Pada parameter tinggi tanaman, formula F4 secara signifikan mampu meningkatkan tinggi tanaman (Tabel 4). Untuk parameter BBT, formula F1, F3 dan F4 berbeda nyata terhadap kontrol (Tabel 5). Pada parameter BKT hanya perlakuan formula F4 yang signifikan (Tabel 6). Pada parameter BBA terjadi interaksi antara faktor kadar air dan formula dimana dalam keadaan kadar air kering (63.3% RPTA), formula yang signifikan meningkatkan parameter BBA adalah formula F4 (ditunjukkan oleh huruf yang berbeda pada baris) (Tabel 7). Pada perlakuan BKA, diketahui formula F1 mampu meningkatkan parameter BKA (Tabel 8). Performa pertumbuhan tanaman jagung dengan berbagai perlakuan formula disajikan pada Gambar 6.
Tabel 4 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap tinggi tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda
Kadar
Rata-rata dari 5 ulangan. * Kontrol tanpa inokulan
q
9 Tabel 5 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat basah tajuk
tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda Kadar
Rata-rata dari 5 ulangan. * Kontrol tanpa inokulan
q
Dalam satu baris atau lajur,rataan yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5%, x: rata-rata perlakuan kadar air kering dan y: rata-rata perlakuan kadar air basah
Tabel 6 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat kering tajuk tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda
Kadar
Rata-rata dari 5 ulangan. * Kontrol tanpa inokulan
q
Dalam satu baris atau lajur,rataan yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5%, x: rata-rata perlakuan kadar air kering dan y: rata-rata perlakuan kadar air basah
Tabel 7 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat basah akar tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda
Kadar
Rata-rata dari 5 ulangan. Rataan diidahkan dengan Uji Duncan pada taraf 5 %
a-b membandingkan rataan dalam baris dan x-y membandingkan rataan dalam lajur. Nilai parameter yang dicetak tebal mengindikasikan nilai parameter yang berbeda nyata dengan kontrol pada tiap kelompok percobaan
Tabel 8 Pengaruh perlakuan formula (K0, F1-F4) terhadap berat kering akar tanaman jagung yang ditanam pada kadar air yang berbeda
Kadar
Rata-rata dari 5 ulangan. * Kontrol tanpa inokulan
q
Gambar 6 Penampilan pertumbuhan tanaman jagung dengan berbagai perlakuan formulasi inokulan. K perlakuan kering; B perlakuan basah; F1-F4 perlakuan formulasi inokulan; K0 kontrol tanpa inokulan
K/K0 K/F3 B/K0 B/F3 K/K0 K/F4 B/K0 B/F4
K/K0 K/F1 B/K0 B/F1 K/K0 K/F2 B/K0 B/F2
11
PEMBAHASAN
Konstruksi mutan Pseudomonas sp. CRB 19 dilakukan untuk mendapatkan mutan yang tidak menghasilkan atau menurunkan produksi eksopolisakarida melalui mutagenesis dengan transposon. Sebelum dilakukan mutagenesis dengan transposon, terlebih dahulu dilakukan mutasi spontan pada bakteri Pseudomonas sp. CRB 19 (resipien). Mutasi spontan bertujuan untuk menentukan penanda resipien Pseudomonas sp. CRB 19 agar dapat dibedakan dengan donor E. coli S17-1 (λ pir) yang memiliki transposon dengan penanda gen resisten kanamisin. Pada mutasi spontan digunakan rifampisin sebagai penanda. Antibiotik rifampisin dipilih karena hanya sedikit bakteri yang diketahui resisten terhadap antibiotik ini. Mutasi spontan ini menyebabkan bakteri Pseudomonas sp. CRB 19 resisten terhadap rifampisin. Hal ini karena terjadi mutasi pada gen rpoB yang menyandi sub unit polimerase (Nicholson dan Moughan 2002). Dari hasil tersebut antibiotik kanamisin dan rifampisin dapat digunakan sebagai marker seleksi transkonjugan mutagenesis dengan transposon. Frekuensi konjugasi yang didapatkan dari mutagenesis dengan transposon sekitar 4.03 x 10-7 sel per resipien. Frekuensi ini lebih rendah dibandingkan penelitian Panjaitan (2007) yang mendapatkan frekuensi konjugasi Pseudomonas sp CRB 17 sebesar 3.1 x 10-5 sel per resipien menggunakan galur E. coli yang sama. Frekuensi konjugasi berbeda-beda pada galur yang sama membuktikan bahwa transposisi transposon mini-Tn5Km1 terjadi secara acak (Herero et al. 1990).
Transposon mini-Tn5Km1 merupakan salah satu turunan transposon Tn5 yang digunakan untuk mutagenesis bakteri gram negatif (Lorenzo et al. 1990). Pada sel resipien, transposon yang membawa gen resisten kanamisin ini akan menyisip secara acak pada genom bakteri resipien sehingga menghasilkan transkonjugan yang resisten terhadap kanamisin (Herero et al. 1990). Oleh karena itu pada media seleksi ditambahkan antibiotik kanamisin sebagai penanda adanya penyisipan transposon. Penyisipan transposon ini bersifat stabil karena gen transposase berada di luar transposon sehingga setelah transposon menyisip ke genom bakteri resipien maka tidak akan terjadi transposisi sekunder. Disamping itu, plasmid pUTmini-Tn5Km1 dikenal sebagai plasmid bunuh diri. Plasmid ini hanya mampu bereplikasi dalam sel inang yang memiliki aktivitas protein pir. Apabila plasmid ini masuk ke dalam sel resipien yang tidak mampu memproduksi protein pir (seperti Pseudomonas sp.), maka plasmid akan terdegradasi oleh DNAase.
12
pertumbuhan tanaman jagung dalam kondisi cekaman kekeringan. Pada sel bakteri, eksopolisakarida berfungsi melindungi sel bakteri ketika berada pada kondisi cekaman kekeringan (Sandhya et al. 2009). Dengan memproduksi eksopolisakarida, bakteri akan meningkatkan retensi air di sekitar rizosfer sehingga dapat dapat mengatur difusi sumber karbon ke dalam sel bakteri (Amellal et al. 1998). Eksopolisakarida yang disekresikan berperan sebagai agen perekat dengan membentuk mikroagregat tanah yang mantap. Kandungan eksopolisakarida yang tinggi serta agregat tanah yang baik mampu menyerap air dan hara tersedia lebih banyak. Hal tersebut memungkinkan tanaman mampu mengurangi dampak cekaman kekeringan yang ada.
Media susu skim dengan molase merupakan media produksi alternatif yang mampu menggantikan peranan media standar laboratorium. Media susu skim dengan molase relatif lebih ekonomis dan memiliki kualitas yang sama dengan media standar. Susu skim yang digunakan dapat berasal dari susu kadaluarsa, sedangkan molase berasal dari hasil sampingan (limbah) industri gula. Media susu skim dengan molase merupakan media pertumbuhan terbaik bagi bakteri Bacillus sp., Pseudomonas sp. dan Bradyrhizobium japonicum dengan populasi sel berkisar 108 CFU/mL (Kristin 2010). Hal ini karena kandungan susu skim berperan sebagai sumber nitrogen dan molase berperan sebagai sumber karbon.
Bahan pembawa diperlukan untuk menginokulasikan bakteri potensial ke skala lapangan. Penggunaan gambut sebagai bahan pembawa ditujukan untuk mempermudah pada saat aplikasi di lapangan. Gambut yang digunakan berasal dari Rawa Pening, Jawa Tengah. Gambut ini merupakan bahan pembawa inokulan komersial di Indonesia yang dapat diakses untuk penggunaan jangka panjang. Kelebihan gambut sebagai bahan pembawa yaitu diantaranya memiliki kemampuan mempertahankan kadar air, memiliki kapasitas penyangga pH yang baik, dapat terdegradasi di dalam tanah, memiliki tekstur yang tidak menggumpal, memiliki pelekatan yang baik terhadap biji serta mengandung asam humat yang berperan sebagai unsur C dan N untuk meningkatkan pertumbuhan bakteri (Somasegaran dan Hoben 1994; Feng et al. 2002). Jumlah populasi awal masing-masing bakteri pada bahan pembawa gambut sebesar 109 CFU/mL. Somasegaran dan Hoben (1994) menyatakan bahwa konsentrasi minimum sel bakteri yang akan diinokulasikan ke dalam bahan pembawa adalah sebesar 5x108 sel/mL. Hal tersebut berkaitan dengan viabilitas bakteri dalam bahan pembawa serta kemampuannya untuk dapat bersaing dengan mikroorganisme indigenus lain di tanah.
13 dalam memproduksi eksopolisakarida sehingga adanya akumulasi eksopolisakarida di rizosfer mampu meningkatkan retensi air di sekitar perakaran dan dengan mudah dapat diserap oleh akar (Santi et al. 2008).
Selanjutnya pada parameter tinggi, BBT, BKT dan BKA tidak terjadi interaksi antara formula dan kadar air (Tabel 4-6, 8). Hal ini menunjukkan bahwa pada pertumbuhan tanaman jagung, kadar air tidak mempengaruhi produktivitas tanaman tersebut. Pada parameter tinggi tanaman, formula F4 secara signifikan mampu meningkatkan tinggi tanaman yang lebih baik dibandingkan kontrol. Untuk parameter BBT, formula F1, F3 dan F4 menunjukkan peningkatan pertumbuhan secara signifikan dibandingkan kontrol. Parameter BBT menunjukkan status serapan air pada sel-sel tanaman. Selanjutnya pada parameter BKT hanya formula F4 yang mampu meningkatkan parameter tersebut secara signifikan. Pada perlakuan BKA, diketahui formula F1 mampu meningkatkan parameter BKA.
Formula-formula yang berisi mutan-mutan (F1-F3) dengan penurunan kadar eksopolisakarida lebih dari 50% tidak mampu memacu pertumbuhan tanaman jagung pada kondisi kering (63.2% RPTA). Sebaliknya formula F4 yang mengandung Pseudomonas sp. CRB 19 tipe liar (wild type) mampu memacu pertumbuhan tanaman jagung pada parameter BBA dalam kondisi tercekam kering. Dari hasil ini membuktikan bahwa eksopolisakarida memegang peranan penting dalam memacu pertumbuhan tanaman dalam cekaman kekeringan. Produksi eksopolisakarida akan terus ditingkatkan seiring dengan semakin meningkatnya kondisi kekeringan (Sandhya et al. 2010).
Formula F4 berisi bakteri Pseudomonas sp. CRB 19. Isolat CRB 19 merupakan bakteri hasil penapisan toleran kekeringan terbaik dengan nilai optical density (OD) sebesar 0.563 pada tekanan osmotik terendah (-2.5 Mpa) (Radita 2012). Isolat yang mampu menghasilkan nilai OD ≥ 0.4 pada tekanan osmotik terendah merupakan bakteri potensial yang toleran terhadap cekaman kekeringan (Alikhani dan Mohamadi 2010). Menurut Marulanda et al. (2009), isolat bakteri mampu bertahan pada tekanan osmotik rendah karena mensekresikan eksopolisakarida. Pada penelitian ini kadar eksopolisakarida yang dihasilkan oleh CRB 19 sebesar 0.100 mg/mL. Bila dibandingkan dengan mutan-mutan CRB 19, kadar eksopolisakarida yang dihasilkan CRB 19 jauh lebih besar. Data tersebut mendukung kemampuan CRB 19 dalam memacu pertumbuhan tanaman jagung.
14
SIMPULAN
Transposon mini-Tn5Km1 berhasil disisipkan pada genom Pseudomonas sp. CRB 19 dengan frekuensi konjugasi sekitar 4.03 x 10-7sel per resipien dan mendapatkan tiga mutan yaitu MNM-6, MNM-7 dan MNM-13 dengan penurunan kadar eksopolisakarida berturut-turut sebesar 56.39%, 52.61% dan 51.79%. Uji efektivitas inokulan di rumah kaca menunjukkan bahwa Pseudomonas sp. CRB 19 (formula F4) dengan kemampuan menghasilkan eksopolisakarida tertinggi, signifikan menghasilkan berat basah akar jagung pada kondisi kering. Inokulan Pseudomonas sp. CRB 19 saja (tanpa pemisahan perlakuan kadar air), mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman jagung yang ditunjukkan oleh tinggi, berat tajuk dan akar, yang signifikan lebih tinggi daripada perlakuan kontrol.
DAFTAR PUSTAKA
Alikhani HA, Mohamadi L. 2010. Assesing tolerance of rhizobial lentil symbiosis isolates to salinity and drought in dry land farming condition. Di dalam: 19th World Congress of Soil Science, Soil Solutions for a Changing World; Brisbane, 1-6 Agustus 2010.
Amellal N, Burtin G, Bartoli F, Heulin T. 1998. Colonization of wheat roots by an exopolysaccharide-producing Pantoea agglomerans strain and its effect on rhizosphere oil aggregation. Appl Environ Microbiol. 64(10): 3740-3747. Dey R, Pal KK, Bhat DM, Chauhan SM. 2004. Growth promotion and yield
enhancement of peanut (Arachis hypogea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol Res. 159: 371-394.
Dubois, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956.Colorimetric methods for determination of sugars of related subtances. Anal Chem. 28: 350-356.
Feng L, Roughley J, Copeland L. 2002. Morphological changes of rhizobia in peat cultures. Appl Environ Microbiol. 68:1064-1070.
Haney RL, Haney EB. 2010. Simple and rapid laboratory method for rewetting dry soil for incubations. Soil Sci Plant Anal. 41: 1493-1501.
Herrero M, V de Lorenzo, Timmis KN.1990. Transposon vector containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 172: 6557-6567.
Husen E, Salma S, Agus F. 2013. Peat emission control by groundwater management and soil amendments: evidence from laboratory experiments. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, siap terbit.
Kristin N. 2009. Formulasi campuran rizobakteria pelarut fosfat dengan Bradyrhizobium japonicum menggunakan gambut sebagai bahan pembawa [skripsi] Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
15 Marulanda A, Barea JM, Azcon R. 2009. Stimulation of plant growth and drought tolerance by native microorganisms (AM fungi and bacteria) from dry environment: mechanisms related to bacterial effectiveness. Plant Growth Regul. 28:115-124.
Mulyani A, Abdurachman A, Dariah A. 2008. Strategi dan teknologi pengelolaan lahan kering mendukung pengadaan pangan nasional. J Litbang Pert. 27:43-49.
Nicholson WL, Moughan H. 2002. The spectrum of spontaneous rifampisin resistance mutation in the rpoB gene of Bacillus subtilis 168 spores differs from that vegetative cells and resembles that Mycobacterium tubercolosis. J Bacteriol 184: 4936-4940.
Panjaitan M. 2007. Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB 17 untuk meningkatkan produksi asam indol asetat melalui mutagenesis dengan transposon [skripsi] Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Radita R. 2012. Rizobakteria Pseudomonas sp. pemacu tumbuh toleran kekeringan dan aplikasinya pada tanaman jagung di rumah kaca [skripsi] Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Roberson EB, Firestone MK. 1992. Relationship between dessication and exopolysaccharide production in a soil Pseudomonas sp. Appl Environ Microbiol. 58:1284-1291.
Salisbury. 1992. Fisiologi Tumbuhan jilid II. Bandung (ID): ITB Pr.
Sandhya, Ali SKZ, Minakshi G, Gopal R, Venkateswarlu. 2009. Alleviation of drought stress effects in sunflower seedlings by the exopolysaccharides producing Pseudomonas putida strain GAP-P45. Biol Fertil Soils. 46:17-26. Sandhya V, Ali SKZ, Grover M, Reddy G, Venkateswarlu B. 2010. Effect of
plant growth promoting Pseudomonas spp. on compatible solutes. antioxidant status and plant growth of maize under drought stress. Plant Growth Regul. 62: 21-30.
Santi LP, Dariah A, Goenadi DH. 2008. Peningkatan kemantapan agregat tanah mineral oleh bakteri penghasil eksopolisakarida. Menara Perkeb. 76 (2): 93-103.
Santi LP. 2011. Peran bakteri penghasil eksopolisakarida dalam agregasi tanah tekstur berpasir [tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Somasegaran P, Hoben HJ. 1994. Hand Book for Rhizobia. New York (US): Spinger Verlag.
Vmanchanda I, Garg. 2008. Salinity and its effect on the functional biology of legumes. J Plant Phsyiol. 7: 1-45.
16
Lampiran 1 Hasil analisis tekstur dan sifat kimia tanah vertisol (di Laboratorium Kimia Tanah, Balai Penelitian Tanah)
17 Lampiran 2 Setting tanah pot untuk kadar air dibawah kapasitas lapang (DKL)*
DATA FISIKA
BD (ditetapkan) (g/cm3 ) 1.2 PD (ditetapkan) (g/cm3 ) 2.65 RP (ruang pori) = 1 – (PD/BD) 0.54717
Kadar Air Titik Layu Permanen (KABK-TLP)
KABK-TLP (ditetapkan 12%) 0.120 RPTA-TLP ((KABK*BD)/RP) 0.263
Kadar Air Kapasitas Lapang (KABK-KL)
KABK-KL (diukur) = (Berat Basah (BTB) – Berat kering (BTK)/ Berat
kering (BTK) 0.456
RPTA-KL (ditetapkan 100%) 1.000
Kadar Air Bawah-Kapasitas Lapang (KABK– Bawah KL)
KABK-Bawah KL 0.288
RPTA-Bawah KL (Nilai tengah dari TLP dan KL) 0.632
Hasil perhitungan KA (lihat hasil KA)
% Berat air (BA) tanah jenuh KL 32.05
% Berat tanah kering 67.95
Berat tanah jenuh masing-masing pot (KL) (gr) 4000 Berat tanah kering (BTK) (gr) 2718
Berat air (BA) (gr) 1282
KABK = (BA/BTK) 0.47167
18
Lampiran 3 Denah rancangan percobaan
B/F2-I B/F4-III B/F1-III K/F4-II B/F3-II
B/F3-V K/F3-I K/F2-V K/F4-III B/K0-II
B/F3-I K/F2-II B/F4-IV B/F4-V B/F3-IV
K/F3-II K/F1-III K/F3-III B/K0-V B/F1-1
K/K0-II B/F4-II B/F4-I K/F1-V K/F1-4
K/F1-1 K/F4-I B/F3-III B/F2-V B/F2-III
K/F4-IV B/F2-IV K/K0-I K/K0-III B/F1-V
K/F4-V K/F3-IV B/K0-IV B/K0-I K/F2-IV
K/K0-V K/F2-I K/K0-IV K/F2-III K/F3-V
B/F2-II K/F1-II B/F1-II K/F2-III B/K0-III
P A
A
Keterangan: P : Pintu A : Keran air
K : Perlakuan kadar air kering B : Perlakuan kadar air basah F : Formulasi
I-V : ulangan 1-5
P
19
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jambi pada tanggal 20 Maret 1991 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari ayah Sukartiko dan ibu Jumiati. Penulis menyelesaikan pendidikan di SMA Negeri 3 Kota Jambi pada tahun 2009. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Beasiswa Utusan Daerah (BUD) dari PT Minamas Plantation. Penulis memilih mayor Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar dan Mikrobiologi Dasar pada tahun ajaran 2012/2013. Selain itu, penulis juga aktif di lembaga kemahasiswaan Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) sebagai sekretaris divisi Bioworld periode 2010/2011, serta aktif di berbagai kegiatan kepanitiaan BIONIC, Grand Biodiversity, Pesta Sains Nasional, SPIRIT dan lain-lain.
