Karakter biologi dan molekuler turnip mosaic virus (TUMV) dan metode deteksi pada benih sawi hijau (Brassica juncea L.)

ARAK'I'ER BIOLOGI

DAN

MOLEKULER Turnip

Mosaic Virus

TuMV) DAN

METODE DETEKSI PADA BENIH SAW1 HlJAU

(Brassica juncea

L.)

ARAK'I'ER BIOLOGI

DAN

MOLEKULER Turnip

Mosaic Virus

TuMV) DAN

METODE DETEKSI PADA BENIH SAW1 HlJAU

(Brassica juncea

L.)

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Karakter Biologi dan Molekuler Turnip Mosaic Virus (TuMV) dan Metode Deteksi pad8 Benih Sawi

Hijau Brassica juncea

L.

adalah hasil penelitian saya sendiri dengan arahan Kornisi

bmbimbing clan belum diajlikan dalam bentuk apa pun pada perguruan tinggi lanapun. Sumber infonnasi yang b e m l atau dikutip dari karya yang diterbitkan

laupun tidak diterbitkan dari penulis lain teiah disebutkan dalam teks dan icanturnkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir setiap topik disertasi ini.

0

!i

ca

1. 0

c

-

F

Bogor, Mei 2007

P d

g p p P

ABSTRAK

ELIZA S. RUSLI. Karakter Biologi dan Molekuler Turnip Mosaic Virus 'uMV) clan Metode Deteksi pada Benih Sawi Hijau (Brmsica juncea

L).

HIDAYAT, GEDE SUASTIKA, dan UTOMO

ARTOSUWONDO.

Penyakit mosaik merupakan penyakit penting yang akhir-akhir ini banyak dari sentra-sentra pertanaman sayuran di Jawa. Penyakit tersebut disebabkan yang merupakan virus baru pada tanaman sawi hijau dan lobak di yang disebabkan oleh TuMV tersebut merupakan penyakit yang cepat dan luas karena penularannya terjadi melalui serangga

-.

Penelitian dilakukan untuk: I) Mempelajari keragaman isolat-isolat TuMV yang :rSal dari berbagai daerah di Indonesia berdasarkan variasi gejala penyakit, dan c

g 3 3 $an inang; 2) Mempelajari beberapa sifat rnolekuler TuMV yaitu melalui pengamatan

5 b J Gwah rnikroskop elektron untuk rnengamati ciriciri morfologi partikel virus, rnelalui

5 _{,a@sis SDS-PAGE untuk mengetahui ciri protein selubung virus, dan rnelalui perunutan}

a

9

Q

Sg

untuk mengetahui keragaman genetik isolat virus; 3) Mempelajari penularan TuMV a Q eglui benih sawi hijau dan kutudaun (M. persicae); 4) Mengembangkan teknik deteksi

=

2 s

J. 'c Q

I&

pada biji dan kecambah sawi hijau melalui: teknik DAS-ELISA, IC-RT-PCR, dan

-.

:

g

2.

Q

2.

2

ieidisasi f?ot Blot.

g

7 2 Hasil pengamatan di lapang menunjukkan bahwa TuMV telah menginfeksi

:@aman sawi hijau dan lobak di Jawa dan Bali. Intensifas penyakit mosaik tertinggi

3

8

iiG

63,3% terjadi di daerah Turnpangan

-

Malang diikuti oleh daerah Denpasar Selatan a

Q z e in daerah Bandungan

-

Semarang dengan intensitas penyakit berturut-turut 30,5% dan

B

'CI

;g

9,0%.

c

s 8 ? Keragarnan gejala infeksi yaig terjadi pada tanaman sawi hijau dan lobak,

a

? ~eliputi pelepuhan daun, pengerutan daun, penebalan tulang daun, penebalan atau

P

_{2. s} mucatan warna tulang daun, perubahan bentuk daun dan proliferasi. Kisaran inang N. L uMV meliputi famili Cruciferae ( kubis, brokoli, sawi hijau, lobak, kembang kol, sawi

-

u

B

m ti h, pok coy) dan famili Solanaceae (N.tabacum,

.M

benthamiana, dun N.glutinosa )

-

$

:rta famili Chenopodiaceae (C.amaranticolor). Selanjutnya diketahui bahwa

N.

5Y

osa, brokoli , kernbang kol, lobak d m sawi hijau dapat digunakan sebagai inang

8

s untuk isolat-isolat TuMV.

3

-. 0 Hasii pemurnian virus menunjukkan tingkat kernurnian yang cukup tinggi yang

Q

s Q j u k k a n dengan nilai nisbah A 2601280 = 1,56. Total virus murni yang dihasilkan dari 9

E 3 ram bahan segar sekitar 0,6 mg. Partikel virus berbentuk batang lentur berhasil

%

m a t i di bawah mikroskop elektron. Analisis protein selubung dengan SDS PAGE

fb:

z

1d2unjukkan adanya pita spesifik berukuran 33 kDalton pada sampel yang berasal dari is

I@

atas hail pemurnian virus. Fragmen DNA TuMV dengan ukuran 800 bp berhasii

b

J impli fikasi dari isolat sawi hijau asa 1 Bogor, Cipanas; Kuningan, Bandungan, Malang

aEDenpasar. Perunutan DNA hasil

RT-PCR

telah

dilakukan

untuk digunakan sebagai a s r analisis keragaman genetik. lsolat TuMV asal Bandungan, Cipanas, Bogor, laxng, dan Denpasar memiliki kesamaan lebih dari 90 %. Berdasarkan analisis Egarnan genetik rnenggunakan program PAUP 4.10, isolat Bandungan, Cipanas,

7'

(D

3

-.

Bogor, dan Denpasar mendekati kelompok isolat yang berasal dari Eropa, Jepang dan Cina, sedangkan isolat Kuningan dan Malang berada pada kelompok yang sangat berbeda. Hal tersebut menunjukkan adanya keragaman genetik pada isolat-isolat TuMV di Indonesia.

Kutudaun tidak bersayap ( aptera ) dan bersayap ( alate ) marnpu menularkan TuMV pada sawi hijau dengan kejadian penyakit yang ditimbulkannya berturut-turut 70%

-

100% dan 20%

-

50%. Kejadian penyakit cenderung rneningkat dengan bahnya jumlah kutudaun. Penyebaran TuMV melalui kutudaun tidak bersayap t cepat, setelah 14 hari dapat mencapai jarak 45 cm dari tanaman sumber inokulum. P a q

PI

x TuMV terbukti dapat menginfeksi tanaman sawi hijau sampai ke biji. Pengujian

der&an metode DAS-ELISA membuktikan bahwa sebanyak 9% benih sawi hijau lokal mezgandung TuMV, sementara benih asal produsen benih komersial terinfeksi sebanyak 4?44

Pengujian biji dan kecambah dengan teknik DAS-ELISA menunjukkan bahwa

ekgak biji dengan pengenceran hingga 1 :30 memberikan reaksi positif terhadap antibodi

T w ,

sementara ekstrak kaambah memberikan reaksi negati f, sekalipun tan pa peBenceran. TuMV yang betada pada biji dan kecarnbah berhasil terdeteksi dengan baik d e g a n teknik IC-RT-PCR hingga pengenceran 1:30. Fragmen DNA berukuran 800 bp b e g a i l teramplifikasi dari biji rnaupun kecambah.

Teknik

Hibridisasi Dot Blot terbukti me&iliki sensitifitas lebih baik, yaitu mampu mendeteksi TuMV pada biji dan kecambah

!J

IC1

b' d

g p p g

Ciuuh

g a a j

* E E

" " 3 1

3 5 5 , Q

2 n n s

s sccr A

ABSTRACT

C ' T X S f i

2

8 2 5

n a

g

t

ELlZA S. RUSLI. Biology and Molecular Character of Turnip Mosaic Hrus

%

3 c o (TuMV) and Detection Method on Cnisio Seeds ( B r m i e o j u n m

L.)

Supervised

222u2.E

C E Q Z by SFU HENDRASTUTl HIDAYAT, GEDE SUASTIKA, and UTOMO

E F g ;

,

- 5

"

_{KARTOSUWONDO.}

='a Q P

3 i p 5 :

37, Z ( P , c

P 2 2 5 ~

@

Mosaic disease has been reported fmm vegetable field crops in Java recently.

S C Q S

3 s 5 s $he disease is caused by TuMV which is considered a new disease on caisin and

a 4

st

,

Q c p,lrnip in Indonesia The disease is able to spread rapidly and extensively because

8;

2s z

g

sf5

%

~ U M V is transmitted by insect vectors or seeds.

wccr

E L 2

Q z-

( P E - .

3.

The objectives of this study are: 1) To study variability of TuMV isolates Q s., a.

3 _m

-

mllected from different geographic regions in Indonesia based on its symptom

s e g "

qariability and host range; 2) To study some of molecular characters of TuMV s

" e x

_{.&rough e l m n microscop observation to determine morphology characteristics of}

e

2

_{&e virus particles, through SDS-PAGE analysis to deterrnine virus coat protein}

n

5 %

gharacteristics, and through DNA sequencing to determine genetic diversity among

3

2 %

Girus isolates; 3) To study TuMV transmission through caisin seeds and aphids, M.

* ? f 9 ersicae; 4) To develop virus detection technique on caisin seeds and seedlings

5

q Q sting through: DAS-ELISA, IC-RT-PCR, and Dot Blot Hybridization.

% s

5' Q

$ 2

J Observation during field survey has proved that TuMV has infected caisin

g

.=

z

Bnd turnip in Java and Bali. The highest intensity of mosaic disease i.e. 63,3 %

X

_{% '&cured in Tumpangan-Malang, followed by Denpasar Selatan and Bandungan-}

P

3 5

$

k $

%ernarang with the intensity of 30,s % and 19,O %, respectively.

n

a

_{e TuMV infection causes different types of symptoms, such as : wrinkled leaf,}

8

s e

~i w blistered leaf, vein banding, vein clearing, leaf distortion, and proliferation. The host

3 ' range of TuMV involves those plants belong to Cruciferae ( cabbage, broccoli, caisin,

a

? turnip, cauliflower, chinese cabbage, pak coy ); Solanaceae (

N.

fabacum,

N.

x

_-.

g

benthamiam.

fl-

glurinosa ); and Chenopodiaceae ( C. amaranticolor ). Furthermore,

4

L

-

N. glutinosa can be used as differential host for TuMV isolates.

u

c

The result of virus purification demonstrated a high purity level with ratio

"

L

value of A 260/280=1.56. The total pure virus produced from 300 gram of fresh E

material is 0.6 rng. Flexious virus particle was observed under electron microscope.

8

E @oat protein analysis with SDS PAGE showed a specific protein band of 33 kDalton

g.

-. a o r the sample from upper layer of purified virus preparation. Specific DNA fragment Q

E

qf

800 bp was successfully amplified from caisin infected by TuMV isolate Bogor,

9

E $ipanas, Bandungan, Malang, and Denpasar. Furthermore, genetic variability

%

mnalysis was done using this DNA fragment. TuMV isolate from Bogor, Cipanas,

2

=andungan, Malang, and Denpasar have similarity more than 90%. Based on analysis

8

Ci @sing PAUP 4.10 program, isolates

from

Bandungan, Cipanas, Bogor, and Denpasar,

7 p closed related to group of isolates originated from Europe, Japan, and China; Gvhile isolates from Kuningan and Malang are in group which is very distinctive. a h e s e evidence shows the existence of genetic diversity in TuMV isolates in Edonesia.

3

-.

c

a

3

-.

P d

g p p P

ABSTRAK

ELIZA S. RUSLI. Karakter Biologi dan Molekuler Turnip Mosaic Virus 'uMV) clan Metode Deteksi pada Benih Sawi Hijau (Brmsica juncea

L).

HIDAYAT, GEDE SUASTIKA, dan UTOMO

ARTOSUWONDO.

Penyakit mosaik merupakan penyakit penting yang akhir-akhir ini banyak dari sentra-sentra pertanaman sayuran di Jawa. Penyakit tersebut disebabkan yang merupakan virus baru pada tanaman sawi hijau dan lobak di yang disebabkan oleh TuMV tersebut merupakan penyakit yang cepat dan luas karena penularannya terjadi melalui serangga

-.

Penelitian dilakukan untuk: I) Mempelajari keragaman isolat-isolat TuMV yang :rSal dari berbagai daerah di Indonesia berdasarkan variasi gejala penyakit, dan c

g 3 3 $an inang; 2) Mempelajari beberapa sifat rnolekuler TuMV yaitu melalui pengamatan

5 b J Gwah rnikroskop elektron untuk rnengamati ciriciri morfologi partikel virus, rnelalui

5 _{,a@sis SDS-PAGE untuk mengetahui ciri protein selubung virus, dan rnelalui perunutan}

a

9

Q

Sg

untuk mengetahui keragaman genetik isolat virus; 3) Mempelajari penularan TuMV a Q eglui benih sawi hijau dan kutudaun (M. persicae); 4) Mengembangkan teknik deteksi

=

2 s

J. 'c Q

I&

pada biji dan kecambah sawi hijau melalui: teknik DAS-ELISA, IC-RT-PCR, dan

-.

:

g

2.

Q

2.

2

ieidisasi f?ot Blot.

g

7 2 Hasil pengamatan di lapang menunjukkan bahwa TuMV telah menginfeksi

:@aman sawi hijau dan lobak di Jawa dan Bali. Intensifas penyakit mosaik tertinggi

3

8

iiG

63,3% terjadi di daerah Turnpangan

-

Malang diikuti oleh daerah Denpasar Selatan a

Q z e in daerah Bandungan

-

Semarang dengan intensitas penyakit berturut-turut 30,5% dan

B

'CI

;g

9,0%.

c

s 8 ? Keragarnan gejala infeksi yaig terjadi pada tanaman sawi hijau dan lobak,

a

? ~eliputi pelepuhan daun, pengerutan daun, penebalan tulang daun, penebalan atau

P

_{2. s} mucatan warna tulang daun, perubahan bentuk daun dan proliferasi. Kisaran inang N. L uMV meliputi famili Cruciferae ( kubis, brokoli, sawi hijau, lobak, kembang kol, sawi

-

u

B

m ti h, pok coy) dan famili Solanaceae (N.tabacum,

.M

benthamiana, dun N.glutinosa )

-

$

:rta famili Chenopodiaceae (C.amaranticolor). Selanjutnya diketahui bahwa

N.

5Y

osa, brokoli , kernbang kol, lobak d m sawi hijau dapat digunakan sebagai inang

8

s untuk isolat-isolat TuMV.

3

-. 0 Hasii pemurnian virus menunjukkan tingkat kernurnian yang cukup tinggi yang

Q

s Q j u k k a n dengan nilai nisbah A 2601280 = 1,56. Total virus murni yang dihasilkan dari 9

E 3 ram bahan segar sekitar 0,6 mg. Partikel virus berbentuk batang lentur berhasil

%

m a t i di bawah mikroskop elektron. Analisis protein selubung dengan SDS PAGE

fb:

z

1d2unjukkan adanya pita spesifik berukuran 33 kDalton pada sampel yang berasal dari is

I@

atas hail pemurnian virus. Fragmen DNA TuMV dengan ukuran 800 bp berhasii

b

J impli fikasi dari isolat sawi hijau asa 1 Bogor, Cipanas; Kuningan, Bandungan, Malang

aEDenpasar. Perunutan DNA hasil

RT-PCR

telah

dilakukan

untuk digunakan sebagai a s r analisis keragaman genetik. lsolat TuMV asal Bandungan, Cipanas, Bogor, laxng, dan Denpasar memiliki kesamaan lebih dari 90 %. Berdasarkan analisis Egarnan genetik rnenggunakan program PAUP 4.10, isolat Bandungan, Cipanas,

7'

(D

3

-.

Bogor, dan Denpasar mendekati kelompok isolat yang berasal dari Eropa, Jepang dan Cina, sedangkan isolat Kuningan dan Malang berada pada kelompok yang sangat berbeda. Hal tersebut menunjukkan adanya keragaman genetik pada isolat-isolat TuMV di Indonesia.

Kutudaun tidak bersayap ( aptera ) dan bersayap ( alate ) marnpu menularkan TuMV pada sawi hijau dengan kejadian penyakit yang ditimbulkannya berturut-turut 70%

-

100% dan 20%

-

50%. Kejadian penyakit cenderung rneningkat dengan bahnya jumlah kutudaun. Penyebaran TuMV melalui kutudaun tidak bersayap t cepat, setelah 14 hari dapat mencapai jarak 45 cm dari tanaman sumber inokulum. P a q

PI

x TuMV terbukti dapat menginfeksi tanaman sawi hijau sampai ke biji. Pengujian

der&an metode DAS-ELISA membuktikan bahwa sebanyak 9% benih sawi hijau lokal mezgandung TuMV, sementara benih asal produsen benih komersial terinfeksi sebanyak 4?44

Pengujian biji dan kecambah dengan teknik DAS-ELISA menunjukkan bahwa

ekgak biji dengan pengenceran hingga 1 :30 memberikan reaksi positif terhadap antibodi

T w ,

sementara ekstrak kaambah memberikan reaksi negati f, sekalipun tan pa peBenceran. TuMV yang betada pada biji dan kecarnbah berhasil terdeteksi dengan baik d e g a n teknik IC-RT-PCR hingga pengenceran 1:30. Fragmen DNA berukuran 800 bp b e g a i l teramplifikasi dari biji rnaupun kecambah.

Teknik

Hibridisasi Dot Blot terbukti me&iliki sensitifitas lebih baik, yaitu mampu mendeteksi TuMV pada biji dan kecambah

!J

IC1

b' d

g p p g

Ciuuh

g a a j

* E E

" " 3 1

3 5 5 , Q

2 n n s

s sccr A

ABSTRACT

C ' T X S f i

2

8 2 5

n a

g

t

ELlZA S. RUSLI. Biology and Molecular Character of Turnip Mosaic Hrus

%

3 c o (TuMV) and Detection Method on Cnisio Seeds ( B r m i e o j u n m

L.)

Supervised

222u2.E

C E Q Z by SFU HENDRASTUTl HIDAYAT, GEDE SUASTIKA, and UTOMO

E F g ;

,

- 5

"

_{KARTOSUWONDO.}

='a Q P

3 i p 5 :

37, Z ( P , c

P 2 2 5 ~

@

Mosaic disease has been reported fmm vegetable field crops in Java recently.

S C Q S

3 s 5 s $he disease is caused by TuMV which is considered a new disease on caisin and

a 4

st

,

Q c p,lrnip in Indonesia The disease is able to spread rapidly and extensively because

8;

2s z

g

sf5

%

~ U M V is transmitted by insect vectors or seeds.

wccr

E L 2

Q z-

( P E - .

3.

The objectives of this study are: 1) To study variability of TuMV isolates Q s., a.

3 _m

-

mllected from different geographic regions in Indonesia based on its symptom

s e g "

qariability and host range; 2) To study some of molecular characters of TuMV s

" e x

_{.&rough e l m n microscop observation to determine morphology characteristics of}

e

2

_{&e virus particles, through SDS-PAGE analysis to deterrnine virus coat protein}

n

5 %

gharacteristics, and through DNA sequencing to determine genetic diversity among

3

2 %

Girus isolates; 3) To study TuMV transmission through caisin seeds and aphids, M.

* ? f 9 ersicae; 4) To develop virus detection technique on caisin seeds and seedlings

5

q Q sting through: DAS-ELISA, IC-RT-PCR, and Dot Blot Hybridization.

% s

5' Q

$ 2

J Observation during field survey has proved that TuMV has infected caisin

g

.=

z

Bnd turnip in Java and Bali. The highest intensity of mosaic disease i.e. 63,3 %

X

_{% '&cured in Tumpangan-Malang, followed by Denpasar Selatan and Bandungan-}

P

3 5

$

k $

%ernarang with the intensity of 30,s % and 19,O %, respectively.

n

a

_{e TuMV infection causes different types of symptoms, such as : wrinkled leaf,}

8

s e

~i w blistered leaf, vein banding, vein clearing, leaf distortion, and proliferation. The host

3 ' range of TuMV involves those plants belong to Cruciferae ( cabbage, broccoli, caisin,

a

? turnip, cauliflower, chinese cabbage, pak coy ); Solanaceae (

N.

fabacum,

N.

x

_-.

g

benthamiam.

fl-

glurinosa ); and Chenopodiaceae ( C. amaranticolor ). Furthermore,

4

L

-

N. glutinosa can be used as differential host for TuMV isolates.

u

c

The result of virus purification demonstrated a high purity level with ratio

"

L

value of A 260/280=1.56. The total pure virus produced from 300 gram of fresh E

material is 0.6 rng. Flexious virus particle was observed under electron microscope.

8

E @oat protein analysis with SDS PAGE showed a specific protein band of 33 kDalton

g.

-. a o r the sample from upper layer of purified virus preparation. Specific DNA fragment Q

E

qf

800 bp was successfully amplified from caisin infected by TuMV isolate Bogor,

9

E $ipanas, Bandungan, Malang, and Denpasar. Furthermore, genetic variability

%

mnalysis was done using this DNA fragment. TuMV isolate from Bogor, Cipanas,

2

=andungan, Malang, and Denpasar have similarity more than 90%. Based on analysis

8

Ci @sing PAUP 4.10 program, isolates

from

Bandungan, Cipanas, Bogor, and Denpasar,

7 p closed related to group of isolates originated from Europe, Japan, and China; Gvhile isolates from Kuningan and Malang are in group which is very distinctive. a h e s e evidence shows the existence of genetic diversity in TuMV isolates in Edonesia.

3

-.

c

a

3

-.