PENGARUH PAPARAN EKSTRAK KASAR ALKALOID
DAUN PEPAYA MUDA KERING BEKU TERHADAP EMPAT
ISOLAT
Staphylococcus aureus
DAN EKSPRESI GEN
sea
RENI NOFRIANTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Pengaruh Paparan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda Kering Beku terhadap Empat Isolat
Staphylococcus aureus dan Ekspresi Gen sea adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Reni Nofrianti
RINGKASAN
RENI NOFRIANTI. Pengaruh Paparan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda Kering Beku terhadap Empat Isolat Staphylococcus aureus dan Ekspresi Gen sea. Dibimbing oleh HARSI DEWANTARI KUSUMANINGRUM dan DIDAH NUR FARIDAH.
Staphylococcus aureus menghasilkan staphylococcal enterotoxin A(SEA) yang dapat menyebabkan keracunan makanan dan bersifat tahan terhadap proses pemanasan. Keberadaan S. aureus dan SEA dalam bahan pangan dapat dideteksi
menggunakan teknik molekuler secara cepat dan akurat. Teknik molekuler dilakukan berdasarkan informasi genetik dari suatu sel. Alkaloid merupakan komponen bioaktif pada daun pepaya muda yang dapat berperan sebagai antimikroba. Proses pengeringan dan metode ekstraksi sangat mempengaruhi hasil ekstraksi alkaloid yang terdapat di dalam daun pepaya. Alkaloid sebagai antimikroba bekerja dengan cara menyusup pada dinding sel dan DNA serta mempengaruhi enzim topoisomerase dan enzim perbaikan DNA.
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh teknik pengeringan daun pepaya muda terhadap rendemen ekstrak kasar alkaloid yang dihasilkan, mengidentifikasi S. aureus penghasil toksin secara molekuler dan mengetahui
pengaruh ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda terhadap sel S. aureus dan pengukuran ekspresi relatif gen sea pada empat isolat S. aureus yang terisolasi dari pangan, yaitu susu sapi mentah (S10), telur balado (TBI), tumis usus ayam (UA13) dan sate jeroan ayam (SJI).
Pengeringan daun muda pepaya Calina dilakukan dengan oven suhu 55C dan pengeringan beku. Alkaloid diekstraksi dengan metode ultrasonikasi dan dideteksi dengan menggunakan reagen Mayer. Isolat S. aureus yang sudah
disimpan dalam bentuk ampul diuji sifat morfologinya dengan cara ditumbuhkan pada media baird parker agar (BPA) dan triptyc soy agar (TSA). Pengujian resistensi antibiotik isolat S. aureus dilakukan menggunakan antibiotik gentamisin, streptomisin, kanamisin, chloramphenicol, tetrasiklin dan oksitetrasiklin. Isolat S. aureus dideteksi secara molekuler dengan PCR konvensional. Hasil PCR disekuensing untuk melihat urutan basa pada masing-masing DNA, kemudian sekuen yang diperoleh dianalisis dengan program Basic Local Alignment Search Tool http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Pemaparan ekstrak
kasar alkaloid dengan konsentrasi 0.25 mg/ml dan 0.5 mg/ml terhadap sel S. aureus dilakukan selama 2 jam. Jumlah sel S. aureus sebelum dan setelah paparan
ekstrak kasar alkaloid selama 2 jam dihitung dengan menggunakan metode agar sebar, kemudian dilakukan pengukuran ekspresi relatif gen sea menggunakan metode quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR).
Pengeringan daun pepaya muda dengan oven menghasilkan rendemen ekstrak kasar alkaloid sebanyak 0.99±0.03%, sedangkan daun pepaya muda yang dikeringkan dengan teknik pengeringan beku menghasilkan rendemen ekstrak kasar alkaloid yang relatif lebih tinggi yaitu 1.34±0.36%, walaupun tidak berbeda nyata secara statistik. Morfologi isolat S. aureus S10, TBI, UA13 dan SJI pada
dan TBI resisten terhadap antibiotik streptomisin. Selain itu masing-masing bakteri mempunyai sensitivitas yang berbeda terhadap antibiotik gentamisin, kanamisin, chloramphenicol, tetrasiklin dan oksitetrasiklin. Pengujian isolat
dengan PCR konvensional menunjukkan bahwa semua isolat positif memiliki gen
sea dengan ukuran amplikon 120 pb. Isolat S. aureus S10, UA13 dan TBI memiliki kemiripan dengan genom Staphylococcus aureus strain RKI4 dan isolat
SJI memiliki kemiripan dengan genom Staphylococcus aureus 08BA02176
dengan E value adalah 0. Paparan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda kering beku dengan konsentrasi 0.25 mg/ml dan 0.5 mg/ml selama 2 jam dapat menurunkan jumlah sel S. aureus dengan rata-rata penurunan relatif sebesar 0.6
log CFU/ml dan 0.8 log CFU/ml secara berurutan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol yang sama sekali tidak dipapar dengan ekstrak kasar alkaloid. Penurunan ekspresi relatif gen sea berbeda pada masing-masing isolat dengan
kisaran 1.75-27 kali setelah pemaparan ekstrak kasar alkaloid 0.25 mg/ml dan 13.59-33.24 kali setelah pemaparan ekstrak kasar alkaloid 0.5 mg/ml.
SUMMARY
RENI NOFRIANTI. The Effect of Crude Alkaloid Extract Exposure Obtained from Freeze-Dried Young Papaya Leaves towards Four Isolates of
Staphylococcus aureus and sea Gene Expression. Supervised by HARSI DEWANTARI KUSUMANINGRUM and DIDAH NUR FARIDAH.
Staphylococcus aureus produces staphylococcal enterotoxin A (SEA) that causes food poisoning and resistant to the heating process. The presence of S. aureus and SEA on food could be detected by moleculer technique, its conducted
quickly and accurately. Molecular detection is based on the genetic information of cell. Alkaloids are bioactive compound in young papaya leaves that can act as antimicrobials. The drying process and extraction method are greatly affecting the total alkaloid content in papaya leaves. Alkaloids as antimicrobial can acts by intercalating into cell wall and double-stranded DNA, and affecting topoisomerase enzymes and DNA-repairing enzymes.
The aims of this research were to study the effect of drying methods of young papaya leaves to the yields of crude alkaloid extract, to identify toxin-producingof four S. aureus by molecular technique, and to identify the effect of
crude alkaloid extract exposure towards S. aureus cells and relative expression of sea gene of four S. aureus isolated from food origin, i.e. raw milk (S10), balado eggs (TBI), stir-fried chicken intestine (UA13) and chicken offal satay (SJI).
Drying of Calina young papaya leaves was conducted with the oven temperature of 55°C and freeze drying. Crude alkaloid extract were extracted by ultrasonication method and detected using Mayer’s reagent. S. aureus isolates that have been stored in ampoules were examined morphologically by growing them on baird parker agar (BPA) and triptyc soy agar (TSA) media. Antibiotic
resistance was conducted towards S. aureus isolates using gentamicin, streptomycin, kanamycin, chloramphenicol, tetracycline and oxytetracycline. S. aureus isolates were molecularly detected with conventional PCR. The PCR
results were sequenced to see the sequence of bases on each DNA, then the sequence was analyzed with Basic Local Alignment Search Tool
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Exposure of crude alkaloid extract with concentrations of 0.25 mg/ml and 0.5 mg/ml towards S. aureus was conducted for
2 hours. The cell number of S. aureus before and after 2-hour exposure was calculated using agar spread-plate method, then the relative expression of sea
gene was measured using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) method.
Papaya leaves dryed with freeze drying method contained crude alkaloid extract content of 1.34±0.36%. These results were relative higher than the oven drying method that only produced 0.99±0.03% crude alkaloid extract, although statistically they were not significantly different. S10, TBI, UA13 and SJI isolates on BPA media has round-shaped colonies, smooth, convex and gray to black in
color. The colonies’ surrounded edge was clear (with bright area). All isolates
formed a yellow pigment on TSA media. All isolates were resistant to
streptomycin. In addition, there was a different sensitivity of each bacteria toward
were positive for sea gene with the amplicon size 120 bp. S10, UA13 and TBI isolates have similarities with Staphylococcus aureus strain RKI4 and SJI isolate has similarities with S. aureus 08BA02176 genome in GenBank. Exposure of
crude alkaloid extract obtained from freeze-dried young papaya leaves at 0.25 mg/ml and 0.5 mg/ml for 2 hours slightly reduced the cell number of S. aureus for approximately 0.6 log CFU/ml and 0.8 log CFU/ml respectively compared with the control group that was not exposed to the crude alkaloid extract. The relative expression of sea gene decreased varied among isolates, in a range of 1.75 to 27.00 times after exposure with 0.25 mg/ml and in a range of 13.59 to 33.24 after exposure with 0.5 mg/ml.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Pangan
PENGARUH PAPARAN EKSTRAK KASAR ALKALOID
DAUN PEPAYA MUDA KERING BEKU TERHADAP EMPAT
ISOLAT
Staphylococcus aureus
DAN EKSPRESI GEN
sea
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
Judul Tesis : Pengaruh Paparan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda Kering Beku terhadap Empat Isolat Staphylococcus aureus dan Ekspresi Gen sea
Nama : Reni Nofrianti NIM : F251124111
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Diketahui oleh
Tanggal Ujian: 07 Agustus 2015 Tanggal Lulus: Dr Ir Harsi Dewantari Kusumaningrum
Ketua
Dr Didah Nur Faridah, STP, MSi Anggota
Ketua Program Studi Ilmu Pangan
Prof Dr Ir Ratih Dewanti, MSc
Dekan Sekolah Pascasarjana
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala yang
telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan tesis yang berjudul Pengaruh Paparan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda Kering Beku terhadap Empat Isolat Staphylococcus aureus dan Ekspresi Gen sea. Tesis ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat
untuk menyelesaikan pendidikan strata dua (S2) Program Studi Ilmu Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Harsi Dewantari Kusumaningrum dan Dr Didah Nur Faridah, STP, MSi selaku pembimbing yang telah memberikan pengarahan, bimbingan, saran, motivasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia yang telah mendanai penelitian ini melalui Hibah Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Lanjutan tahun 2014-2015. Selain itu penulis ucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Prof Dr Ir Suharsono DEA dan Dr Ir Endang Prangdimurti MSi selaku Sekretaris Program Studi Ilmu Pangan IPB, yang telah memberikan masukan pada saat ujian sidang tesis untuk membuat karya ilmiah ini menjadi lebih baik.
Ungkapan terima kasih yang tak terhingga juga penulis ucapkan kepada kedua orang tua bapak Asmadikar dan ibu Liza Yuniarti serta seluruh keluarga besar tercinta, atas segala doa, semangat, dukungan, motivasi dan kasih sayangnya selama ini. Penulis juga ingin menyampaikan terima kasih kepada semua pihak, teknisi laboratorium dan teman-teman yang telah membantu dan berbagi ilmu dalam penelitian ini. Terima kasih kepada teman-teman seperjuangan Pascasarjana Ilmu Pangan IPB. Semoga karya tulis ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan selanjutnya.
Bogor, Agustus 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vii
DAFTAR GAMBAR vii
DAFTAR LAMPIRAN vii
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Rumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Hipotesis 3
Manfaat Penelitian 3
2 TINJAUAN PUSTAKA 3
Staphylococcus aureus 3
Staphylococcal enterotoxin A (SEA) 4
Carica papaya (Pepaya) 4
Alkaloid 5
Teknik Pengeringan Daun Pepaya 6
Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) 6
Metode Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) 7
Kuantifikasi Absolut 9
Kuantifikasi Relatif 10
3 BAHAN DAN METODE 11
Waktu dan Tempat Penelitian 11 Bahan dan Alat 11 Metode Penelitian 12 Konsep Penelitian 13
Pengeringan Daun Pepaya Muda 13
Ekstraksi Alkaloid Daun Pepaya Muda 13
Deteksi Morfologi S. aureus 15
Pengujian Resistensi Antibiotik 15
Deteksi Molekuler S. aureus 15
Sekuensing Gen Penyandi 16S rRNA 16
Pemaparan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda terhadap S. aureus 17
Pengukuran Ekspresi Relatif Gen sea 17
Analisis Data 19
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 19 Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda 19 Morfologi S. aureus Penghasil Toksin Asal Pangan 20 Resistensi Antibiotik 22
Aktivitas Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda
terhadap Sel S. aureus 27 Aktivitas Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda
terhadap Ekspresi Relatif Gen sea 28
5 SIMPULAN DAN SARAN 33
Simpulan 33
Saran 33
DAFTAR PUSTAKA 33
LAMPIRAN 40
DAFTAR TABEL
1 Pelacak dalam reaksi qPCR 9
2 Konsep penelitian 14
3 Nilai sensitivitas isolat S. aureus terhadap antibiotik 22
4 Kemurnian dan konsentrasi DNA S. aureus 24 5 Hasil analisis sekuen gen penyandi 16S rRNA S. aureus UA13,
SJI, TBI dan S10 berdasarkan primer 63F dengan program BLAST 26 6 Jumlah sel S. aureus sebelum dan setelah pemaparan
ekstrak kasar alkaloid selama 2 jam 28 7 Kuantifikasi RNA S. aureus S10, UA13, SJI dan TBI 29
8 Nilai ekspresi relatif gen sea dengan metode 2-∆∆CT 30
DAFTAR GAMBAR
1 Alkaloid pada daun pepaya 5
2 Contoh kurva amplifikasi pada reaksi qPCR 8
3 Mekanisme kerja SYBR Green 10
4 Diagram alir penelitian 12
5 Tiga lapis daun pepaya muda dari pucuk 13
6 Pendeteksian alkaloid 20
7 Pertumbuhan S. aureus pada media BPA 21
8 Morfologi S. aureus pada media TSA 22
9 Genom S. aureus 24
10 Amplikon gen penyandi 16S rRNA dan gen seaS. aureus ATCC 25923, S10, UA13, SJI dan TBI dengan primer 16sF dan
16sR3 serta primer SEAF dan SEAR 25
11 Amplikon gen penyandi 16S rRNA S. aureus
UA13, SJI, TBI dan S10 dengan primer universal 63F 26 12 Contoh kurva pelelehan gen 16S rRNA S. aureus UA13
dengan paparan ekstrak kasar alkaloid 0.25 mg/ml 32 13 Contoh kurva pelelehan gen 16S rRNA S. aureus UA13
dengan paparan ekstrak kasar alkaloid 0.25 mg/ml 32
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji-t ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda 40
2 Hasil uji one-way ANOVA dan Duncan survival sel S. aureus setelah dipapar dengan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda
selama 2 Jam 40
3 Hasil uji one-way ANOVA dan Duncan pengukuran nilai CT gen
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Masalah keamanan pangan tidak terlepas dari keberadaan bakteri patogen pada bahan pangan. Salah satunya adalah Staphylococcus aureus yang menghasilkan staphylococcal enterotoxin penyebab keracunan makanan
(staphylococcal food poisoning) (Veras et al. 2007). Sekitar 70-95% strain S. aureus menimbulkan keracunan makanan karena menghasilkan enterotoksin.
Staphylococcal enterotoxin A (SEA) merupakan toksin dalam jumlah besar yang diproduksi oleh S. aureus yang sering menyebabkan keracunan makanan (Clarisse et al. 2013).
S. aureus yang mengandung SEA jika dipanaskan pada suhu 100C akan
mati, tetapi enterotoksin tetap bertahan dalam bahan pangan (Clarisse et al. 2013), sehingga berbahaya jika terkonsumsi oleh manusia. Oleh sebab itu harus dicari alternatif lain untuk menghambat pertumbuhan S. aureus dan menghilangkan
toksin SEA, yang salah satunya adalah dengan menggunakan alkaloid. Alkaloid dilaporkan memiliki kemampuan berinteraksi dengan dinding sel dan DNA (Cowan 1999). Dari penelitian Cao et al. (2007) dilaporkan juga bahwa alkaloid
efektif sebagai antimikroba dengan cara menyusup pada utas ganda DNA serta mempengaruhi enzim topoisomerase dan enzim perbaikan DNA.
S. aureus digunakan sebagai mikroba indikator keamanan produk-produk
daging olah bergaram seperti sosis, daging asap dan ikan asap (Fardiaz 1992). Daun pepaya sering digunakan dalam proses pengempukan daging karena adanya kandungan enzim papain dan chymopapain (Saran dan Choudhary 2013). Selain dapat berperan sebagai bahan pengempuk daging, daun pepaya juga dilaporkan dapat berfungsi sebagai antimikroba. Sifat antimikroba daun pepaya dihubungkan dengan adanya beberapa komponen fitokimia, yang salah satunya adalah alkaloid. Canini et al. (2007) melaporkan bahwa di dalam daun pepaya terkandung alkaloid carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I dan dehydrocarpaine II. Beberapa
penelitian menunjukkan adanya perbedaan kadar ekstrak alkaloid di dalam daun pepaya. Proses pengeringan dan metode ekstraksi sangat mempengaruhi hasil ekstraksi alkaloid yang terdapat di dalam daun pepaya (Anibijuwon dan Udeze 2009). Pengeringan beku dilaporkan dapat mempertahankan komponen bioaktif dalam sel tanaman (Ciurzynska dan Lenart 2011). Ekstraksi alkaloid dengan metode ultrasonikasi dilaporkan dapat menghasilkan rendemen alkaloid dalam jumlah tinggi (Azmir et al. 2013) seperti rendemen alkaloid yang dihasilkan dari
tanaman Hyoscyamus muticus, Datura stramonium, Ruta graveolens (Djilani et al. 2006), Nitraria schoberi (Zaree et al. 2013) dan Rhizoma coptidis (Teng dan
Choi 2013).
2
(2014) melaporkan bahwa alkaloid banyak terdapat di dalam daun pepaya muda. Oleh sebab itu, dalam ekstraksi alkaloid perlu dilakukan pemisahan terhadap daun pepaya muda dan tua sehingga didapatkan rendemen ekstrak kasar alkaloid pada kisaran nilai yang tidak terlalu jauh berbeda dan juga perlu dilakukan evaluasi terhadap teknik pengeringan sehingga didapatkan rendemen ekstrak kasar alkaloid yang lebih tinggi.
Handayani et al. (2014) telah melaporkan bahwa terjadi penurunan jumlah
sel dan ekspresi relatif gen sea setelah sel S. aureus dipapar dengan ekstrak kasar alkaloid dari campuran daun pepaya muda dan tua. Namun, hanya satu isolat yang digunakan dalam penelitian tersebut. Pada penelitian ini perlu dilakukan pengujian pengaruh ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda terhadap sel S. aureus dan ekspresi relatif gen sea pada empat jenis isolat S. aureus yang terisolasi dari pangan yaitu susu sapi mentah (S10), telur balado (TBI), tumis usus ayam (UA13) dan sate jeroan ayam (SJI). Aktivitas antimikroba dari alkaloid daun pepaya muda terhadap ekspresi relatif gen sea dapat dilihat dengan cara mengkuantifikasi gen sea melalui metode quantitative reverse transcription PCR
(qRT-PCR). Penggunaan realtime PCR (qPCR) memberikan hasil dengan tingkat sensitivitas yang tinggi sehingga penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam suatu sel menjadi akurat.
Rumusan Masalah
S. aureus menghasilkan toksin SEA yang bersifat tahan terhadap proses
pemanasan, sehingga diperlukan alternatif lain yang dapat menghambat produksi toksin SEA. Alkaloid dilaporkan dapat berperan sebagai antimikroba dengan cara menyusup pada dinding sel dan utas ganda DNA, serta mempengaruhi enzim topoisomerase dan enzim perbaikan DNA. Beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa hasil ekstraksi alkaloid di dalam daun pepaya berbeda-beda tergantung pada tingkat umur daun, metode pengeringan dan metode ekstraksi. Oleh sebab itu perlu dilakukan pengujian untuk menghasilkan alkaloid dalam jumlah yang tinggi. Pengaruh paparan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda terhadap sel S. aureus dan ekspresi gen sea harus diujikan terhadap beberapa
isolat S. aureus lainnya untuk melihat apakah ekstrak kasar alkaloid dapat
memberikan pengaruh yang konsisten terhadap sel S. aureus dan ekspresi relatif gen sea.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh teknik pengeringan daun pepaya muda terhadap rendemen ekstrak kasar alkaloid yang dihasilkan, mengidentifikasi S. aureus penghasil toksin secara molekuler dan mengetahui pengaruh ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda terhadap sel S. aureus dan
ekspresi relatif gen sea pada empat isolat S. aureus yang terisolasi dari pangan,
3 Hipotesis
1. Teknik pengeringan beku pada daun pepaya muda dapat meningkatkan rendemen ekstrak kasar alkaloid jika dibandingkan dengan pengeringan oven.
2. Deteksi S. aureus secara molekuler memberikan informasi tentang
karakteristik molekuler isolat S. aureus penghasil toksin yang berasal dari
pangan.
3. Paparan ekstrak kasar alkaloid terhadap S. aureus dapat menurunkan
jumlah sel S. aureus dan menghambat ekspresi gen sea pada empat isolat S. aureus asal pangan.
Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi tentang fungsi ekstrak kasar alkaloid dalam menghambat produksi SEA sehingga dapat membantu meningkatkan keamanan bahan dan produk pangan.
2. Memberikan informasi tentang mekanisme kerja PCR konvensional dan qPCR.
3. Mendorong masyarakat untuk meningkatkan daya guna daun pepaya muda dalam pengolahan pangan.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Staphylococcus aureus
S. aureus merupakan bakteri gram positif yang bersifat patogen karena
menghasilkan enterotoksin (Gruman et al. 2014). S. aureus termasuk dalam famili
staphylococcaceae, berbentuk bulat tunggal atau berpasangan, berukuran diameter 0,5-1,5 m dan membentuk pigmen kuning keemasan. Sifat S. aureus antara lain aerob atau anaerob fakultatif, tidak memiliki spora dan non motil. S. aureus dapat
tumbuh pada suhu 6-48°C, pH 4-10, Aw 0.83-0.99 dan lingkungan dengan konsentrasi garam < 20% (Schelin et al. 2011).
S. aureus menimbulkan staphylococcal food poisoning (SFP) yaitu suatu
penyakit yang disebabkan karena kesalahan dalam penanganan dan penyimpanan makanan sehingga terkontaminasi oleh staphylococcal enterotoxin (SE)(Veras et al. 2007). SFP ditandai dengan gejala mual, muntah, diare, dan kram pada perut yang berlangsung selama 1-2 hari dengan masa inkubasi 1-8 jam setelah mengkonsumsi makanan (Kerouanton et al. 2006). SE merupakan toksin yang memiliki berat molekul rendah yaitu 26-30 kDa (Chen et al. 2012). Menurut Hennekinne et al. (2006) dan Schelin et al. (2011), telah ditemukan 21 jenis SE
yang terdiri dari lima tipe klasik yaitu SEA, SEB, SEC, SED, SEE dan tipe non klasik seperti SE1G, SElH, SEl, SElJ, SElK, SElL, SElM, SElN, SElO, SElP, SElQ, SER, SES, SET, SElU dan SElV. S. aureus dapat memproduksi SE pada
4
S. aureus yang mengandung enterotoksin jika dipanaskan pada suhu 100C akan
mati, sedangkan enterotoksin tetap bertahan.
Pada umumnya, konsentrasi enterotoksin pada makanan bervariasi dari 0,05-20 ng/g dari makanan (Le Loir et al. 2003). Enterotoksin dengan jumlah
100-200 ng yang terkonsumsi melalui makanan dapat memicu terjadinya keracunan (Clarisse et al. 2013). Diagnosis keracunan makanan terjadi setelah mengkonsumsi >105 CFU/ml S. aureus pada makanan (Kerouanton et al. 2006).
Staphylococcal enterotoxin A (SEA)
SEA merupakan protein toksin yang terdiri dari 233 asam amino (Bhatia dan Zahoor 2007). SEA merupakan toksin dalam jumlah besar yang ditemukan pada S. aureus yang menyebabkan keracunan makanan (Clarisse et al. 2013). SEA bersifat seperti superantigen, yang dapat berinteraksi dengan banyak sel T secara non spesifik. Interaksi ini menyebabkan terjadinya pelepasan yang tidak terkontrol dari berbagai sitokin dan menyebabkan terjadinya inflamasi akut dan
shock sehingga menimbulkan gejala keracunan seperti mual dan muntah-muntah
(Proft dan Fraser 2003). Telah tercatat 75% kejadian luar biasa (KLB) disebabkan oleh SEA (Lapeyre et al. 2001).
SEA diproduksi pada akhir fase eksponensial pertumbuhan (Balaban dan Rasooly 2000). Gen sea dibawa oleh bakteriofag yang disisipkan pada kromosom
bakteri sebagai profag dan berperilaku seperti bagian dari genom bakteri. Transkripsi gen sea berkaitan dengan siklus hidup dari profag penyandi gen sea
(Schelin et al. 2011). Polimorfisme alami pada profag ditemukan mempengaruhi
jumlah SEA yang diproduksi oleh bakteri pembawa profag. Hasil analisis sekuen daerah promotor menunjukkan bahwa strain yang memproduksi SEA dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok, yaitu strain yang memproduksi SEA dalam jumlah tinggi (kelompok SEA1) dan strain yang memproduksi SEA dalam jumlah rendah (kelompok SEA2) (Borst dan Betley 1994).
Carica papaya (Pepaya)
Carica papaya (pepaya) merupakan tanaman herba berbentuk batang. Tanaman ini berasal dari dataran rendah bagian timur Amerika Tengah, Mexico, Panama, dan dapat ditemukan di semua negara tropis dan subtropis di dunia (Canini et al. 2007). Pepaya memiliki ketinggian 5-10 m dan memiliki susunan spiral daun yang terdapat pada puncak batang. Daun pepaya berukuran besar, diameter daun 20-28 inci dengan 7 lapis susunan daun (Adachukwu et al. 2013).
Karakterisasi metabolit kimia yang diekstrak dari tanaman pepaya menunjukkan keberadaan senyawa aktif dalam jaringan tanaman pepaya. Di dalam getah pepaya terdapat endopeptida, sistein, kitinase II, kitinase III, dan
glutaminyl cyclase. Pada daging buah terdapat linalool. Pada daun terdapat alkaloid carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I dan dehydrocarpaine II, papain, cystatin, tokoferol, asam askorbat, flavonoid, glukosida, sianogenik dan glucosinolates (Baskaran et al. 2012). Rehena (2010) juga melaporkan bahwa
daun pepaya mengandung senyawa alkaloid carpaine, caricaksantin, violaksantin, papain, flavonoid, polifenol, dan saponin. Adachukwu et al. (2013) melaporkan
5 flavonoid. Pada tunas terdapat kaempferol dan quercetin. Selain itu terdapat juga senyawa cyanogenic pada daun dan akar (Canini et al. 2007).
Tanaman pepaya memiliki banyak manfaat. Selain sebagai buah dan sayur, tanaman pepaya digunakan sebagai sumber obat-obatan karena komponen senyawa bioaktif yang terkandung di dalam pepaya. Daun pepaya juga sering digunakan dalam proses pengempukan daging dengan cara membungkus daging dengan daun pepaya (Saran dan Choudhary 2013). Menurut Adachukwu et al.
(2013) proses pengempukan daging dengan daun pepaya disebabkan karena adanya komponen bioaktif seperti chymopapain dan papain.
Alkaloid
Alkaloid merupakan hasil metabolit sekunder tanaman dan merupakan senyawa basa yang mengandung atom nitrogen dengan berat molekul yang rendah dan struktur heterosiklik. Pada umumnya 20% dari spesies tanaman, lebih kurang 12.000 spesies tanaman mengandung alkaloid. Selain tanaman, mikroorganisme seperti bakteri dan fungi juga menghasilkan alkaloid (Rai dan Chikindas 2011). Alkaloid yang pertama kali digunakan adalah morphine yang diisolasi pada tahun 1805 dari tanaman Papaver somniferum.
Alkaloid yang diisolasi dari tanaman memiliki sifat antimikroba (Baskaran
et al. 2012). Sifat antimikroba alkaloid dihubungkan dengan kemampuan berinteraksi dengan dinding sel dan DNA (Cowan 1999). Dari penelitian Cao et al. (2007) dilaporkan bahwa alkaloid efektif sebagai antimikroba, karena
kemampuan menyusup pada utas ganda DNA dan mempengaruhi enzim topoisomerase dan enzim perbaikan DNA. Handayani et al. (2014) melaporkan bahwa alkaloid memiliki kemampuan dalam menurunkan jumlah sel isolat S. aureus.
Daun pepaya yang berasa sepat dan pahit teridentifikasi mengandung alkaloid. Alkaloid banyak terkandung dalam daun yang muda (Boshra dan Tajul 2013, Anjum et al. 2013, Elgadir et al. 2014). Di dalam daun pepaya terdapat
alkaloid carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I dan dehydrocarpaine II (Canini et al. 2007). Keempat alkaloid ini termasuk ke dalam golongan alkaloid
piperidin karena memiliki struktur piperidin, yaitu berupa amina heterosiklik yang terdiri atas cincin karbon segi enam dengan lima jembatan metilen (-CH2-) dan
satu gugus amin. Struktur kimia alkaloid yang terdapat pada daun pepaya terlihat pada Gambar 1.
6
Beberapa penelitian menunjukkan jumlah ekstrak alkaloid yang berbeda-beda di dalam daun pepaya. Umur daun, teknik pengeringan dan metode ekstraksi sangat mempengaruhi hasil ekstraksi alkaloid yang terdapat di dalam daun pepaya (Anibijuwon dan Udeze 2009). Metode ekstraksi alkaloid dapat dilakukan dengan sonikasi (Djilani et al. 2006), soxhlet (Gonzales et al. 2014), refluks (Zaree et al. 2013) dan metode asam basa (Sudsai 2006).
Teknik Pengeringan Daun Pepaya
Pengeringan daun pepaya dapat dilakukan dengan pengeringan udara, pengeringan dengan matahari, pengeringan oven atau dengan menggunakan pengeringan beku (Atlabachew et al. 2013). Pengeringan dengan oven dan pengeringan beku merupakan teknik pengeringan yang paling sering digunakan dalam penelitian, karena suhu, waktu dan kondisi lingkungan pada alat dapat dikontrol. Pengeringan dengan oven terjadi melalui mekanisme penguapan pada suhu tinggi (Hariyadi 2013). Pengeringan dengan oven digunakan untuk bahan yang bersifat tahan panas. Pengeringan beku merupakan proses penting untuk mempertahankan materi biologi yang sensitif terhadap panas (Ciurzynska dan Lenart 2011). Pengeringan beku menghasilkan produk bermutu tinggi jika dibandingkan dengan teknik pengeringan lainnya. Pengeringan beku dimulai dari tahap persiapan sampel, diikuti proses pembekuan, pengeringan primer (sublimasi) dan pengeringan sekunder (desorpsi). Proses pembekuan dilakukan pada suhu berkisar antara -20C sampai -45C, kemudian disublimasi menggunakan tekanan vakum dan suhu dibawah titik triple point (0.00603 atm,
0.01C). Es yang terbentuk diubah menjadi bentuk gas yang dapat dikeluarkan sehingga menghasilkan komponen kering tanpa melalui fase cair. Pengeringan beku memiliki keuntungan yaitu dapat meminimalisir dekomposisi senyawa kimia, menghilangkan air tanpa panas yang berlebihan dan dapat mempertinggi stabilitas produk selama pengeringan (Nireesha et al. 2013). Satu kelemahan
teknik ini adalah membutuhkan biaya yang mahal untuk peralatan dan pemeliharaan alat serta memerlukan banyak energi dalam proses kerjanya (Ciurzynska dan Lenart 2011).
Metoda Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu metode enzimatis
untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara invitro (Weissensteiner et al. 2004). PCR mempunyai beberapa
keunggulan untuk mendeteksi patogen, terutama patogen yang diperoleh dalam jumlah yang sedikit. Metode PCR sangat sensitif, sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Dalam proses PCR dibutuhkan empat komponen utama, yaitu (1) DNA cetakan (template) yaitu fragmen DNA yang
7 terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP dan (4) enzim DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer (Yuwono 2006).
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi cetakan DNA sehingga rantai ganda DNA akan terpisah menjadi rantai tunggal. Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas (95C) selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55C sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal.
Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Suhu annealing yang biasa digunakan adalah 55C. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah (37C). Proses annealing dilakukan selama 1-2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72C selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95C. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya. Reaksi ini diulangi 25-30 siklus sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Pada umumnya konsentrasi DNA polimerase Taq menjadi terbatas setelah 25-30
siklus amplifikasi (Yuwono 2006).
Metoda Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)
Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) merupakan pengembangan metode PCR. Teknik qRT-PCR sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan kloning dan analisis, maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik. Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah yang sedikit di dalam sel. Karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA sebagai cetakan maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse transcription) terhadap molekul
RNA sehingga diperoleh cDNA (complementary DNA). Teknik qRT-PCR
memerlukan enzim transkriptase balik (reverse transcriptase) yaitu enzim DNA polimerase yang menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk mensintesis molekul cDNA yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Molekul cDNA kemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR (Sudjadi, 2008). Metode ini merupakan metode paling sensitif untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi tingkat ekspresi gen (Pfaffl et al. 2002).
8
penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan). Hal ini menawarkan beberapa keunggulan yaitu deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Hasil amplifikasi dianalisis selama proses amplifikasi dengan menggunakan pewarna DNA atau pelacak fluoresens. Pelacak fluoresens adalah reagen yang menentukan kespesifikan hasil. Penggunaan pelacak dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang tinggi. Dengan demikian, qPCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA menjadi sangat akurat. Analisis data dilakukan dalam instrumen yang sama, tanpa pemindahan sampel, tanpa penambahan sampel, dan tanpa pemisahan dengan elektroforesis (Sudjadi 2008).
Pengujian qPCR menentukan titik waktu selama siklus ketika amplifikasi produk PCR dideteksi. Hal ini ditentukan melalui angka siklus (cycle number) saat
intensitas emisi zat warna reporter berada di atas background noise. Angka siklus ini dikenal sebagai threshold cycle (CT). CT ditentukan pada fase eksponensial reaksi
PCR dan berbanding terbalik dengan jumlah kopi dari target. Semakin tinggi jumlah awal kopi target asam nukleat, semakin cepat peningkatan fluoresens sehingga semakin rendah nilai CT. Hal ini dapat dilihat pada contoh kurva
amplifikasi pada reaksi qPCR (Gambar 2). Korelasi linear antara produk PCR dan intensitas fluoresens ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah DNA cetakan pada awal reaksi (Bustin 2005).
Gambar 2 Contoh kurva amplifikasi pada reaksi qPCR (NCBI 2012)
9 dibedakan menjadi 2 kelompok yaitu fluoresens non spesifik dan molekul fluoresens spesifik seperti pada Tabel 1.
Tabel 1 Pelacak dalam reaksi qPCR (Weissensteiner et al. 2004) Pelacak fluoresens non-spesifik Pelacak fluoresens spesifik
Intercatalating dyes TaqMan TM Ampliflour TM Hybridization Quencher-labeled primers Molecular Beacons Lux TM primers Scorpions TM SYBR Green Lanthanide
ResonSense TM Angler TM Hybeacons TM
Cationic conjugated PNA Light-up TM
Eclipse TM Cyclicons TM
SYBR Green merupakan fluoresens yang sering digunakan dalam reaksi qPCR. SYBR Green bersifat murah, mudah didapatkan dan mudah dalam
pengerjaan (Kumar et al. 2012). SYBR Green bekerja dengan cara mengikat DNA
berutas ganda, sehingga membentuk fluoresens yang bisa dideteksi oleh qPCR (Gambar 3). Peningkatan sinyal yang dideteksi oleh reporter menunjukkan peningkatan jumlah produk PCR (Bustin 2000).
qPCR dalam mengkuantifikasi ekspresi gen dapat dilakukan dengan 2 metoda yaitu kuantifikasi absolut dan kuantifikasi relatif. Kuantifikasi absolut berdasarkan pada kurva standar, dengan mempersiapkan sampel yang diketahui konsentrasi DNA cetakannya. Konsentrasi sampel yang tidak diketahui dapat dilihat dari interpolasi pada sinyal PCR pada kurva standar. Kuantifikasi relatif membandingkan ekspresi gen suatu sampel yang diberi perlakuan dengan gen kontrol yang tidak diberi perlakuan. Untuk normalisasi digunakan gen referensi (Nolan et al. 2006).
Kuantifikasi Absolut
Kuantifikasi absolut sepenuhnya tergantung pada keakuratan standar (Bio-Rad 2006). Kuantifikasi absolut menghubungkan sinyal PCR jumlah salinan input dengan menggunakan kurva kalibrasi. Kurva kalibrasi didasarkan pada konsentrasi molekul DNA standar yang diketahui. Kuantitas dari sampel DNA target yang tidak diketahui, diinterpolasi dari berbagai kuantitas standar yang diketahui. Kurva standar dibuat menggunakan seri pengenceran dari DNA cetakan yang diketahui konsentrasinya. Kurva standar menunjukkan hubungan linear antara nilai CT dengan log jumlah DNA. Melalui persamaan kurva standar,
konsentrasi DNA sampel yang tidak diketahui dapat diketahui melalui nilai CT
10
virus atau bakteri pada cairan tubuh (Bustin 2005), serta untuk deteksi dan kuantifikasi jumlah mikroba patogen pada pangan, seperti kapang dan khamir (Bleve et al. 2003), S. aureus (Alarcon et al. 2006) dan Salmonella Typhimurium
(Miller et al. 2011).
Gambar 3 Mekanisme kerja SYBR Green (Bioneer 2011)
Kuantifikasi Relatif
Kuantifikasi relatif tidak memerlukan standar. Kuantifikasi relatif didasarkan pada perbandingan ekspresi gen sampel yang diberi perlakuan terhadap gen kontrol yang tidak diberi perlakuan (Bio-Rad 2006). Pada kuantifikasi relatif diperlukan gen referensi untuk normalisasi. Metode untuk menganalisis data ekspresi gen relatif adalah perbandingan nilai CT (Bio-Rad
2006). Metode ini paling sering dilakukan dan bersifat mudah. Metode perbandingan CT mengasumsikan bahwa efisiensi PCR mendekati 1 dan efisiensi
PCR dari gen sampel mirip dengan efisiensi PCR gen kontrol. Langkah pertama yang dilakukan adalah menormalkan nilai CT gen sampel dan kontrol dengan
rumus ΔCT sampel = (CT gen target – CT gen referensi) sampel dan ΔCT kontrol
=(CT gen target – CT gen referensi) kontrol. Langkah kedua adalah menormalkan
ΔCT dari sampel ke ΔCT kontrol, dengan rumus ΔΔCT= ΔCT sampel_ ΔCT kontrol,
ΔΔCT = [(CT gen target – CT gen referensi) sampel – (CT gen target – CT gen
referensi) kontrol tanpa perlakuan]. Langkah ketiga adalah kalkulasi rasio ekpresi gen, dengan nilai 2-ΔΔCTmenunjukkan berapa kali lipat perubahan ekspresi gen
sampel yang diberi perlakuan dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan (Schmittgen dan Livak 2008).
Tahap denaturasi
Tahap annealing
11
3 BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB, Balai Besar Penelitian Veteriner (BALITVET) Bogor serta Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi SEAFAST Center IPB. Penelitian telah dilaksanakan dari bulan Agustus 2014 sampai Maret 2015.
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun muda
Carica papaya varietas Calina (IPB 9) yaitu daun yang berada tiga lapis pertama
dari pucuk yang didapatkan dari Pusat Kajian Holtikultura Tropika (PKHT) Institut Pertanian Bogor, isolat bakteri S. aureus yang terisolasi dari susu sapi mentah (S10), telur balado (TBI), tumis usus ayam (UA13) dan sate jeroan ayam (SJI) (koleksi Dr. Harsi D Kusumaningrum Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB) dan isolat bakteri kontrol S. aureusAmerican type culture collection
(ATCC) 25923.
Bahan kimia yang digunakan dalam mengekstraksi alkaloid dari daun pepaya muda adalah sodium dodecylsulfate (SDS) (Merck & Co., New Jersey,
USA), kertas saring Whatman no.1, akuades, H2SO4 (Merck & Co., New Jersey,
USA) 2% (v/v), reagen Mayer (HgCl2, KI), Na2CO3 (Merck & Co., New Jersey,
USA) 5% (b/v), kloroform (Merck & Co., New Jersey, USA), Na2SO4 (Merck &
Co., New Jersey, USA) dan gas N2.
Bahan untuk pengecekan morfologi S. aureus adalah media brain heart infusion broth (BHI) (Oxoid Ltd, Hampshire, UK), baird parker agar (BPA)
(Oxoid Ltd, Hampshire, UK) dan triptyc soy agar (TSA) (Oxoid Ltd, Hampshire, UK). Bahan untuk pengujian resistensi antibiotik yaitu media mueller-hinton agar (MHA) (Oxoid Ltd, Hampshire, UK) dan antibiotik gentamisin, streptomisin, kanamisin, chloramphenicol, tetrasiklin dan oksitetrasiklin.
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA, yaitu bufer TE 1x (Tris 10 mM; 1mM EDTA pH 7.5), lisozim (Bio Basic Canada Inc., Ontario, Kanada), larutan SDS 10%, proteinase K (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), NaCl, cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) (Merck & Co, New Jersey, USA), kloroform, PCI (25:24:1) (phenol (MP Biomedicals, LCC, Illkirch, Perancis); kloroform; isoamil alkohol (Applychem, Darmstadt, Jerman)), CI (24:1) (kloroform, isoamil alkohol), isopropanol (Merck & Co., New Jersey, USA), dan etanol 70% (Merck & Co., New Jersey, USA).
Bahan untuk amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dan gen sea yaitu Dreamtaq Green PCR master mix (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts,
USA), DNA cetakan, primer 16sF dan 16sR3, primer SEAF dan SEAR, serta air bebas nuklease. Bahan untuk elektroforesis, yaitu loading dye (Thermo Fisher
Scientific, Massachusetts, USA), buffer tris asetat EDTA (TAE), agarosa (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), etidium bromida (EtBr) (Amersham BioSciences, Uppsala, Swedia), GeneRuler 100 bp DNA ladder plus (#SM0321,
12
Bahan untuk pemaparan alkaloid yaitu media tryptic soy broth (TSB) (Oxoid Ltd, Hampshire, UK) dan media TSA. Bahan-bahan yang digunakan dalam menganalisis ekspresi gen sea, antara lain bahan untuk ekstraksi RNA,
yaitu peqGOLD Bacterial RNA Kit (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Jerman) dan DNAse I, RNase free (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Bahan untuk sintesis cDNA, yaitu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), primer SEA (SEAF dan
SEAR), primer 16S rRNA (16sF dan 16sR3); serta bahan untuk reaksi qPCR, yaitu primer SEA (SEAF dan SEAR), primer 16S rRNA (16sF dan 16sR3), air bebas nuklease dan KAPA SYBR FAST qPCR Kit master mix (Kappa Biosystems, Massachusetts, USA).
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, pipet mikro 1 ml, pipet mikro 100 μl, pipet mikro 10 μl, blender, oven (VWR A143 A-143, Sheldon Manufacturing, Inc., Oregon, USA), ultrasonic bath (Bransonic
Ultrasonic Cleaner Model B8510 MTH, Branson Ultrasonic Corporation, Connecticut, USA), rotari evaporator (Butchi Rotavapor R-210, BÜCHI Labortechnik, Flawil, Switzerland), freeze dryer (Martin Christ Gamma 2-16
LSC), sentrifuge (Hermle Z383K; Hermle Labortechnik GmbH, Wehingen, Saint
Nom, Jerman), spektrofotometer UV-1800 (Shimadzu, Jepang), perangkat elektroforesis DNA (Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories Pte. Ltd, Singapore),
Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, California, USA), gel doc (Bio-Rad,
Bio-Rad Laboratories Pte. Ltd, Singapore) dan Swift Spectrum Thermal Cycler 48 (Esco Healthcare Pte. Ltd, Singapore).
Metode Penelitian
Metode penelitian secara umum disajikan dalam diagram alir seperti pada Gambar 4.
Gambar 4. Diagram alir penelitian Pengeringan Daun Pepaya Muda
Ekstraksi Alkaloid Daun Pepaya Muda
Pemaparan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda terhadap S. aureus
Pengukuran Ekspresi Relatif Gen sea dengan SYBR Green
Deteksi Morfologi S. aureus
Deteksi Molekuler S. aureus
13 Konsep Penelitian
Berdasarkan metode penelitian pada Gambar 4, maka terdapat beberapa prosedur yang harus dilakukan dalam setiap metode penelitian. Kegiatan, prosedur dan luaran yang diharapkan dari penelitian ditampilkan pada Tabel 2.
Pengeringan Daun Pepaya Muda
Daun pepaya yang digunakan adalah daun muda. Daun muda merupakan daun pepaya yang berada pada 3 lapis pertama dari pucuk daun seperti pada Gambar 5, daun berwarna hijau muda dan memiliki tangkai yang lurus.
Gambar 5 Tiga lapis daun pepaya muda dari pucuk
Daun pepaya muda utuh yang tidak terserang penyakit dikumpulkan dari pohon pepaya Calina. Daun dicuci 2-3 kali dengan air bersih. Kemudian diukur kadar air daun pepaya muda dengan metode oven (AOAC 2012). Setelah itu, daun dikeringkan dengan dua perlakuan yaitu oven pada suhu 55C selama 22 jam (Atlabachew et al. 2013) dan pengeringan beku selama 24 jam. Daun kering
dihaluskan hingga membentuk bubuk dengan menggunakan blender, dilewatkan pada saringan berukuran 40 mesh, dan disimpan pada wadah tertutup. Kemudian diukur kadar air bubuk dengan metode oven (AOAC 2012). Pengukuran kadar air daun pepaya muda dan bubuk daun pepaya muda dilakukan 3 kali ulangan.
Ekstraksi Alkaloid Daun Pepaya Muda
Sebanyak 10 gram bubuk daun pepaya disuspensikan dalam 400 ml SDS 0,2%, kemudian disonikasi selama 2,5 jam dengan suhu 25-35C dan frekuensi 40 kHz. Ekstrak disaring dengan kertas Whatman no 1. Kemudian larutan H2SO4 2%
ditambahkan ke dalam filtrat, hingga diperoleh pH 3-4. Filtrat dipresipitasi dengan 15 ml reagen Mayer. Presipitat dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2400 × g
selama 10 menit dan dilarutkan dengan Na2CO3 5% lalu diekstraksi dengan
CHCl3. Lapisan organik yang terbentuk dicuci dengan akuades hingga pH menjadi
netral dan dilewatkan pada Na2SO4. Larutan dievaporasi dengan rotari evaporator
dan dikeringkan dengan gas N2 untuk memperoleh rendemen ekstrak kasar
14
Tabel 2 Konsep penelitian
Kegiatan Prosedur Referensi Luaran
15 Deteksi Morfologi S. aureus
Isolat S. aureus dalam ampul dipindahkan ke dalam media BHI 10 ml,
kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. Setelah itu secara aseptis sebanyak 0.1 ml kultur S. aureus dengan pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7 diinokulasikan pada permukaan media BPA. Inokulum diratakan pada permukaan media dengan menggunakan batang gelas bengkok dan inokulum dibiarkan sampai terserap ke dalam media BPA kira-kira 10 menit. Bila inokulum belum terserap, cawan diletakkan dalam inkubator dengan posisi menghadap ke atas sekitar 1 jam. Cawan petri dibalik kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 45-48 jam.
Untuk membedakan ciri koloni S. aureus ATCC 25923 dengan S. aureus
yang mengandung toksin maka isolat S. aureus ditumbuhkan dalam media TSA.
Sebanyak 0.1 ml kultur S. aureus dengan pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7 diinokulasikan pada permukaan media TSA yang telah beku. Inokulum diratakan pada permukaan media, cawan petri dibalik kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 45-48 jam.
Pengujian Resistensi Antibiotik
Pengujian dilakukan di Balai Besar Penelitian Veteriner (BALITVET) Bogor. Pengujian resistensi antibiotik isolat S. aureus dilakukan menggunakan 6 jenis antibiotik yaitu gentamisin (10 g), streptomisin (10 g), kanamisin (30 g), chloramphenicol (30 g), tetrasiklin (30 g) dan oksitetrasiklin (30 g). Pengujian dilakukan dengan menggunakan metode difusi cakram (disk diffusion)
pada media MHA. Nilai sensitivitas bakteri ditentukan berdasarkan ketentuan
Clinical and Laboratory Standards Institute (2012).
Deteksi Molekuler S. aureus
Ekstraksi DNA Isolat S. aureus
Isolasi DNA S. aureus mengacu pada cara kerja Mason et al. (2001). Isolat S. aureus ditumbuhkan pada media TSB, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C
selama 18-24 jam. Sebanyak 2 ml kultur S. aureus pada media TSB disentrifugasi dengan kecepatan 21000 × g selama 1 menit. Supernatan dibuang dan pelet
diresuspensi menggunakan 560 μl bufer TE 1×. Selanjutnya, ditambahkan 100 μl lisozim (10 mg/ml) kemudian dicampurkan hingga homogen dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam (tabung dibolak-balik setiap 15 menit). Sebanyak 30 μl
SDS 10% dan 10 μl proteinase K (10 mg/ml) ditambahkan dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 1 jam (tabung dibolak-balik setiap 15 menit). Kemudian
16
isopropanol absolut dingin sebanyak 0.7 × volume supernatan. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu -20°C selama 1 jam dan disentrifugasi dengan kecepatan 21000 × g selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% lalu disentrifugasi dengan kecepatan 21000 × g selama 5 menit. Pelet DNA dikeringkan dan diresuspensi dengan 30 μl buffer TE. Hasil isolasi DNA divisualisasi pada gel agarosa 1.5% dengan elektroforesis pada tegangan 75 V selama 40 menit.
Kuantifikasi DNA S. aureus
DNA diencerkan 1:1000 menggunakan bufer TE 1×. Kemudian diukur absorbansinya (A260 dan A280). Konsentrasi DNA (ng/μl) dapat dihitung dengan
rumus A260 × 50 × faktor pengenceran (1 OD A260 = 50 ng/μl dsDNA).
Kemurnian DNA dapat ditentukan dengan mengukur rasio A260/A280.
Amplifikasi DNA S. aureus
Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan
Thermal Cycler 2720. Primer yang digunakan adalah 16sF (5’-CCG
CCTGGGGAGTACG-3’) dan 16sR3 (5’-AAGGGTTGCGCTCGTTGC -3’) (Lee
et al. 2007). Gradien temperatur yang digunakan yaitu pre denaturasi pada suhu
95oC selama 5 menit, 30 siklus PCR (denaturasi pada suhu 95oC selama1 menit,
annealing pada suhu 55oC selama 1 menit, extension pada suhu 72oC selama 1 menit) dan terminasipada suhu 72oC selama 5 menit. Campuran reaksi PCR yang
digunakan sebanyak 25 μl, terdiri dari 12.5 μl DreamTaq Greenmaster mix, 1 μl
setiap primer (10 μM), 2 μl DNA cetakan dan 8.5 μl air bebas nuklease.
Produk hasil amplifikasi divisualisasikan pada gel agarosa 2% dengan elektroforesis pada tegangan 75 V selama 40 menit. Marker yang digunakan adalah 100-bp DNA ladder plus. Gen penyandi 16S rRNA ditandai dengan terbentuknya amplikon berukuran 240 pb (Lee et al. 2007).
Identifikasi Gen sea
Gradien temperatur dan komposisi reaksi PCR yang digunakan sama seperti amplifikasi gen penyandi 16S rRNA. Primer yang digunakan adalah primer SEAF (5’-TTGGAAACGGTTAAAACGAA-3’) dan SEAR (5’ -GAACCTTCCCATCAAAAACA-3’) (Lee et al. 2007). Gen sea ditunjukkan dengan terbentuknya amplikon berukuran 120 pb (Lee et al. 2007).
Sekuensing Gen Penyandi 16S rRNA
Sekuensing dilakukan untuk mengetahui urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat S. aureus asal pangan. Sekuensing dilakukan dengan
menggunakan primer universal 63F (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) Sekuensing dilakukan di 1st Base Pte Ltd, Malaysia. Produk PCR gen penyandi 16S rRNA dikirimkan melalui PT. Genetika Science Indonesia. Sekuen yang diperoleh dianalisis dengan program Basic Local Alignment Search Tool
17 Pemaparan Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda terhadap S. aureus
Metode ini mengacu pada cara kerja Handayani et al. (2014). Bakteri S. aureus ditumbuhkan pada media BHI dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24
jam, sehingga didapatkan jumlah bakteri awal adalah 108 CFU/ml. Sebanyak 2 ml bakteri S. aureus pada media BHI disentrifus dengan kecepatan 5000 × g selama 2 menit. Pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan menggunakan buffer fosfat, kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 5000 × g selama 2 menit. Pelet yang dihasilkan dilarutkan dalam 1 ml buffer fosfat. Suspensi bakteri yang didapatkan berjumlah 106 CFU/ml. Sebanyak 5 ml media TSB ditambahkan dengan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak kasar alkaloid 0.25 dan 0.5 mg/ml. Sebagai kontrol digunakan media TSB tanpa campuran ekstrak kasar alkaloid. Sebanyak 100 μl suspensi S. aureus
penghasil SEA dan ATCC 25923 dipipet ke dalam media TSB, diinkubasi pada suhu ruang selama 2 jam, dan digoyang dengan kecepatan 735 × g. Perhitungan jumlah sel bakteri dilakukan sebelum dan setelah pemaparan ekstrak kasar alkaloid selama 2 jam dengan menggunakan metode agar sebar pada media TSA.
Pengukuran Ekspresi Relatif Gen sea
Ekspresi relatif gen sea dari bakteri S. aureus yang telah dipaparkan
dengan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda selama 2 jam dapat diketahui melalui beberapa tahapan, yaitu, isolasi RNA bakteri menggunakan peqGOLD Bacterial RNA Kit, kuantifikasi RNA, sintesis cDNA menggunakan RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, serta pengukuran ekspresi relatif gen sea
menggunakan qPCR dengan pelacak SYBR Green. Isolasi RNA
RNA diisolasi menggunakan peqGOLD Bacterial RNA Kit. Cara isolasi mRNA dengan peqGOLD Bacterial RNA Kit adalah 2 ml kultur bakteri yang telah
dipaparkan dengan ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda disentrifugasi dengan kecepatan 5000 × g selama 5 menit. Pelet bakteri diresuspensi dengan 100
l buffer TE dan 30 l lisozim (10 mg/ml). Kemudian ditambahkan 450 l RNA lysis buffer T dan diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Sampel tersebut dicampurkan dengan pipet dan diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu ruang. Sampel kemudian dipindahkan ke dalam DNA removing column yang telah
dipasangkan dengan collection tube (CT) dan disentrifugasi pada 10.000 × g selama 2 menit. DNA removing coloum dibuang, kemudian ditambahkan 550 l etanol 70%. Sebanyak 650 l sampel dipindahkan ke dalam PerfectBind RNA column yang telah dipasangkan dengan CT dan disentrifugasi dengan kecepatan
10.000 × g selama 1 menit. Residu sampel yang terdapat pada CT kembali dimasukkan ke dalam PerfectBind RNA column yang sama dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 × g selama 1 menit. Kemudian PerfectBind RNA column
dipasangkan dengan CT baru. Sebanyak 500 l RNA wash buffer I ditambahkan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 × g selama 1 menit, cairan dibuang, kemudian diberikan perlakuan DNAse 1. Cairan yang terdapat pada CT
ditambahkan 650 l RNA wash buffer II, kemudian disentrifugasi dengan
18
penambahan RNA wash buffer II kembali dilakukan dengan CT yang sama, kemudian cairan yang dihasilkan dibuang. Selanjutnya dilakukan pengeringan matriks column dengan cara PerfectBind RNA column dipasangkan dengan CT,
kemudian disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 × g. Selanjutnya PerfectBind RNA column tersebut dipasangkan dengan tabung 1,5 ml. Sebanyak 30-50 l RNA free water ditambahkan pada matriks, lalu diinkubasi selama 1 menit, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 6000 × g untuk mengelusi RNA.
Konsentrasi RNA (ng/μl) dihitung dengan rumus A260 × 40 × faktor
pengenceran (1 OD A260 = 40 ng/μl RNA). Konsentrasi RNA yang didapatkan
diseragamkan menjadi 100 ng/l sebelum diubah ke dalam bentuk cDNA. Kemurnian RNA dapat ditentukan dengan mengukur rasio A260/A280.
Sintesis cDNA
Sintesis cDNA menggunakan RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
dengan primer spesifik untuk gen sea (SEAF dan SEAR) dan gen 16S rRNA
sebagai gen referensi (16sF dan 16sR3). Sintesis cDNA dilakukan dengan cara membuat campuran reaksi terdiri atas 2 l RNA total, 2 l setiap primer (10 M), dan air bebas nuklease hingga volume 12 l. Campuran diinkubasi pada suhu 65C selama 10 menit. Selanjutnya, ditambahkan 4 l buffer reaksi 5×, 1 l
RiboLock RNAse Inhibitor (20 U/l), 2 l dNTP 10 mM dan 1 l RevertAid M-Mulv RT (200 U/l). Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 42C selama 60
menit. Reaksi dihentikan melalui pemanasan pada 70C selama 5 menit. Pengukuran Ekspresi Relatif Gen sea dengan qPCR
Reaksi qPCR dilakukan menggunakan Swift Spectrum Thermal Cycler 48
dengan menggunakan SYBR Green. Untuk menjalankan qPCR dengan SYBR Green, maka dibuat 20 l campuran reaksi yang terdiri dari 1 l cDNA sebagai
cetakan, 0,4 l setiap primer (10M), 10 l KAPA SYBR FAST qPCR Kit master mix, dan air bebas nuklease hingga volume 20 l. Kondisi PCR yang
digunakan yaitu pre-denaturasi selama 1 menit pada suhu 95C, 45 siklus amplifikasi (denaturasi 1 menit pada suhu 95C, annealing 1 menit pada suhu
55C, extention 1 menit pada suhu 72C) dan terminasi selama 5 menit pada suhu
72C. Pembacaan fluoresensi dilakukan setelah setiap tahap extension dan
dilanjutkan dengan analisis kurva pelelehan pada suhu 70-90C dengan analisa dilakukan setiap kenaikan suhu 0,5C dan waktu konstan 10 detik (Lee et al.
2007). Ekspresi gen sea dihitung relatif terhadap kontrol dengan metode
perbandingan CT (2-∆∆CT) (Schmittgen dan Livak 2008). Nilai ekspresi relatif dari
gen sea merupakan nilai 2-ΔΔCT, dengan nilai ∆∆CT diperoleh dari pengurangan
antara ∆CT gen sea dengan gen 16S rRNA bakteri yang mengalami pemaparan
ekstrak kasar alkaloid dengan ∆CT gen sea dengan gen 16S rRNA bakteri tanpa
19 Rumus perbandingan CT (2 -∆∆CT)
ΔΔCT = [(CT gen sea– CT gen 16S rRNA) S. aureus dengan paparan alkaloid –
(CT gen sea– CT gen 16S rRNA) S. aureus tanpa paparan alkaloid].
Analisis Data
Data dianalisis menggunakan one-way ANOVA dan uji-t (untuk perhitungan rendemen ekstrak kasar alkaloid) dengan software IBM SPSS
statistics 16.0. pada tingkat kepercayaan 95% (taraf signifikansi 0.05). Hasil yang
berbeda nyata dilanjutkan dengan uji Duncan.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak Kasar Alkaloid Daun Pepaya Muda
Daun pepaya Calina muda segar yang berasal dari PKHT IPB memiliki kadar air 78.93±0.54%. Daun pepaya segar kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven suhu 55C dan pengeringan beku. Daun pepaya yang dikeringkan dengan oven memiliki kadar air daun kering 6.92±0.17%, sedangkan kadar air daun kering dengan pengeringan beku adalah 5.94±0.16%. Rendemen bubuk daun pepaya kering dengan metode oven adalah 15.74% sedangkan rendemen bubuk daun pepaya kering dengan metode pengeringan beku adalah 15.95%. Menurut Anibijuwon dan Udeze (2009), perbedaan kadar air dan rendemen bubuk daun pepaya dipengaruhi oleh lokasi tumbuhnya tanaman, jenis pepaya, musim, cuaca dan waktu pemanenan.
Tahap awal ekstraksi alkaloid dilakukan dengan ultrasonikasi dengan frekuensi 40 kHz. Menurut Azmir et al. (2013) gelombang ultrasonik (20
kHz-100 MHz) dapat menyebabkan terjadinya kerusakan dinding sel sehingga komponen di dalam sel dapat keluar melalui proses difusi. Teng dan Choi (2013) melaporkan bahwa teknik ekstraksi dengan gelombang ultrasonik bersifat lebih aman, ekonomis, ramah lingkungan dan mudah dilakukan dibandingkan dengan menggunakan teknik ekstraksi modern seperti microwave, ekstraksi ion atau ektsraksi dengan cairan. Sudsai (2006) melakukan ekstraksi alkaloid dengan menggunakan metode asam basa menghasilkan rendemen ekstrak kasar alkaloid di dalam daun pepaya sebanyak 0.28%. Penelitian Zaree et al. (2013)
membanding proses ekstraksi alkaloid tanaman Nitraria schoberi menggunakan refluks dan ultrasonikasi. Metode ultrasonikasi menghasilkan rendemen alkaloid yang lebih tinggi dibandingkan dengan refluks. Dari 50 gram bubuk Nitraria schoberi dihasilkan alkaloid 612 mg dengan metode ultrasonikasi dan 601 mg dengan metode refluks. Penelitian Chin et al. (2013) membuktikan bahwa
20
Keberadaan alkaloid dideteksi dengan reagen Mayer. Reagen Mayer terdiri dari merkuri klorida dan kalium iodida. Atom merkuri akan membentuk pasangan ion dengan nitrogen yang terdapat pada alkaloid. Pasangan ion tersebut membentuk presipitat yang bersifat tidak larut. Adanya alkaloid ditandai dengan endapan berwarna kuning cream (Adachukwu et al. 2013) seperti pada Gambar 6. Endapan berwarna kuning cream kemudian diekstraksi dengan kloroform.
Alkaloid dalam bentuk bebas tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik seperti kloroform. Kloroform berfungsi memisahkan alkaloid dari pengotor, garam ammonium, dan lemak (Yubin et al. 2014), sehingga alkaloid
yang didapatkan bersih dari bahan pengotor lainnya. Daun pepaya muda yang dikeringkan dengan teknik pengeringan beku menghasilkan rendemen ekstrak kasar alkaloid berkisar 1.11%-1.76% dengan rata-rata 1.34±0.36%. Hasil ini lebih tinggi dibandingkan dengan rendemen ekstrak kasar alkaloid dari pengeringan oven yang berada pada kisaran 0.96%-1.01% dengan rata-rata 0.99±0.03%, walaupun tidak berbeda nyata secara statistik (Lampiran 1). Rendemen ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda berada pada kisaran nilai yang tidak jauh berbeda. Dari penelitian ini dapat dilaporkan bahwa di dalam 1 g daun pepaya Calina muda segar terdapat 2.14 mg ekstrak kasar alkaloid.
Kaur et al. (2014) melaporkan bahwa pengeringan dengan oven dapat
menurunkan tingkat deteksi alkaloid. Prinsip kerja pengeringan dengan oven adalah penguapan pada suhu panas. Menurut Schwarz et al. (2007), alkaloid sangat rentan terdegradasi oleh panas. Pengeringan beku merupakan proses yang penting untuk mempertahankan materi biologi yang sensitif terhadap panas dan dapat meningkatkan aktivitas komponen (Ciurzynska dan Lenart 2011). Pengeringan beku dilakukan dengan prinsip sublimasi. Bahan dibekukan pada suhu berkisar antara -20C sampai -45C, kemudian disublimasi menggunakan tekanan vakum dan suhu dibawah titik triple point (0.00603 atm, 0.01C). Es yang terbentuk diubah menjadi bentuk gas yang dapat dikeluarkan sehingga menghasilkan komponen kering tanpa melalui fase cair (Nireesha et al. 2013).
Gambar 6 Pendeteksian alkaloid (a) Deteksi alkaloid dengan reagen Mayer
(b) Ekstrak kasar alkaloid daun pepaya muda Morfologi S. aureus Penghasil Toksin Asal Pangan
Isolat S. aureus yang digunakan dalam penelitian ini merupakan hasil
isolasi dari bahan pangan yaitu susu sapi mentah (S10), telur balado (TBI), tumis usus ayam (UA13) dan sate jeroan ayam (SJI). Hasil isolasi disimpan dalam bentuk ampul. Untuk melihat morfologi dan memastikan isolat merupakan bakteri
21
baird parker agar (BPA). BPA merupakan media selektif dengan kandungan kuning telur dan telurit sebagai media penduga keberadaan S. aureus. Semua isolat S. aureus (ATCC 25923, UA13, SJI, TBI dan S10) pada media BPA
berbentuk koloni bundar, licin/halus, cembung, warna abu-abu hingga kehitaman. Sekeliling tepi koloni bening (berbentuk halo). Koloni mempunyai konsistensi berlemak dan lengket bila diambil dengan jarum inokulasi (Gambar 7). Koloni yang didapatkan sesuai dengan ketentuan BAM 2001 yang menunjukkan semua isolat merupakan bakteri S. aureus.
G G
Gambar 7 Pertumbuhan S. aureus pada media BPA
Triptyc soy agar (TSA) merupakan media yang digunakan untuk melihat pertumbuhan S. aureus dan produksi enterotoksinnya. Warna koloni S. aureus
pada media TSA dapat bervariasi antara lain putih, kuning dan oranye. Menurut Liu et al. (2005), S. aureus yang bersifat virulen memiliki karakteristik pigmen
permukaan yang berbeda dibandingkan dengan koloni S. aureus normal. S. aureus
yang mampu memproduksi pigmen berwarna oranye dan kuning lebih patogen dibandingkan dengan S. aureus yang menghasilkan pigmen putih (Haris et al.
2002 dan Purnomo et al. 2006). Gambar 8 menunjukkan bahwa S. aureus ATCC 25923 memiliki pigmen berwarna putih sedangkan isolat S. aureus UA13, SJI,
TBI dan S10 memiliki pigmen berwarna kuning. Hal ini membuktikan bahwa secara fisik S. aureus ATCC 25923 tidak mengandung enterotoksin sedangkan isolat S. aureus UA13, SJI, TBI dan S10 memproduksi enterotoksin.
Gambar 8 Morfologi S. aures pada media TSA
