(Piper nigrum L.) PADA TIKUS GALUR WISTAR: STUDI IN VIVO DAN IN SILICO
Disusun Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
Disusun Oleh :
ADITYA RIZQI ABDI SETYO 20120350051
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA
(Piper nigrum L.) PADA TIKUS GALUR WISTAR: STUDI IN VIVO DAN IN SILICO
Disusun Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
Disusun Oleh :
ADITYA RIZQI ABDI SETYO 20120350051
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA
iii Nama : Aditya Rizqi Abdi Setyo
NIM : 20120350051
Program Studi : Farmasi
Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Menyatakan dengan sebenarnya bahwa Karya Tulis Ilmiah yang saya tulis benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantumkan dalam daftar pustaka dibagian akhir Karya Tulis Ilmiah ini.
Apabila di kemudian hari terbukti atau dibuktikan Karya Tulis Ilmiah ini hasil tiruan, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.
Yogyakarta,5 November 2016 Yang membuat pernyataan
iv
dan (Mengerjakan) Shalat, sesungguhnya Allah beserta orang-orang yang sabar. (QS. Al-Baqarah,153)
Tindakan apa yang paling baik? Dengan menggembirakan hati manusia, memberi makan orang yang lapar, membantu para korban, meringkankan kesedihan yang
sedih, dan menghilangkan penderitaan yang terluka. (HR Bukhari)
Apabila di dalam diri seseorang masih ada rasa malu dan takut untuk berbuat suatu kebaikan, maka jaminan bagi orang tersebut adalah tidak akan bertemunya
ia dengan kemajuan selangkah pun. (Ir. Soekarno)
Never give up on what you really want to do. The person with big dream is more powerful then the one with all facts.
(Albert Einstein)
I learned that courage was not the absence of fear, but the triumph over it. The brave man is not he who does not feel afraid, but he who conquers that fear.
v
penulis kesempatan untuk menyelesaikan karya tulis ini. Karya Tulis Ilmiah ini penulis persembahkan kepada Ibunda Puji Winarti, Ayahanda Wasisto serta Adinda Septi Arsista Dwikurniasari dan Nayla Ashiya Maulidya yang tercinta. Terima kasih tidak akan pernah cukup kepada kedua orang tua, Ayah dan Ibu serta Adik yang selalu ada dengan kasih sayang dan doa yang menyertai. Semoga ini merupakan salah satu cara membanggakan mereka. Dalam kesempatan ini, penulis juga mengucapkan terima kasih kepada :
1. Widhia Restiawati, yang memberi semangat, menghibur, dan doa sehingga karya tulis ini dapat selesai.
2. Teman seperjuangan penelitian Nazila Ayu Muthmainnah, Tamam Wahyudi, Ratih Dwi Amalia, dan Indah Mutiara, yang saling membantu, bercanda tawa, dan bersama melewati suka duka selama penelitian.
3. Teman sepebimbingan, Apriadis, Annisa Rizky Setiyani, Sari Nafila, dan Hengky Wijaya Supta, terima kasih bantuan dan dukungannya.
4. Teman serumah Moch. Anugrah Firzatullah, dan Muhammad Fachriannor, terima kasih bantuan dan dukungannya.
vi
Ilmiah yang berjudul “Uji Aktivitas Antiinflamasi Isolat Alkaloid Lada (Piper
nigrum L.) pada Tikus Galur Wistar: Studi In Vivo dan In Silico”. Sebagai salah
satu syarat untuk menyelesaikan studi tingkat Sarjana pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.
Tidak lupa penulis sampaikan terimakasih kepada bapak Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt selaku dosen pembimbing yang telah membantu dan membimbing dalam mengerjakan Karya Tulis Ilmiah ini. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada semua pihak yang telah memberikan kontribusi baik secara langsung maupun tidak langsung dalam proses pengerjaan karya tulis ilmiah ini.
Tentunya ada hal-hal yang ingin penulis berikan dalam dunia kesehatan dari hasil karya ilmiah ini. Oleh karena itu diharapkan semoga karya ilmiah ini dapat menjadi hal yang berguna bagi kita bersama.
Penulis menyadari bahwa dalam karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun.
Yogyakarta,5 November 2016 Penulis
vii INTISARI ... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. ABSTRACT ... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. BAB I PENDAHULUAN ... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. A.Latar Belakang Penelitian ... Error! Bookmark not defined. B.Perumusan Masalah ... Error! Bookmark not defined. C.Keaslian Penelitian ... Error! Bookmark not defined. D.Tujuan Penelitian ... Error! Bookmark not defined. E.Manfaat Penelitian ... Error! Bookmark not defined. BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. A.Inflamasi ... Error! Bookmark not defined. B.Peranan Metabolisme Asam Arakhidonat dalam Antiinflamsi ... Error!
Bookmark not defined.
viii
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASANERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
A.Hasil Penelitian ... Error! Bookmark not defined. 1. Identifikasi Tanaman dan Preparasi Ekstrak ... Error! Bookmark not defined. 2. Pengaruh Pemberian Isolat Alkaloid Lada (Piper nigrum L.) Error! Bookmark
not defined.
3. Molecular Docking dengan Aplikasi AutoDock ... Error! Bookmark not
defined.
a. Proses Pemilihan Protein Target ... Error! Bookmark not defined. b. Preparasi Protein dan Ligan Asli (Native Ligand) ... Error! Bookmark not
defined.
c. Preparasi Ligan Uji ... Error! Bookmark not defined. d. Proses Molecular Docking dengan AutoDock .. Error! Bookmark not defined. e. Visualisasi Hasil Validasi dan Molecular Docking ... Error! Bookmark not
defined.
B.Pembahasan ... Error! Bookmark not defined.
BAB V KESIMPULAN DAN SARANERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.
ix
inflamasi akut . ... Error! Bookmark not defined. Gambar 4. Metabolisme asam arakhidonat dan mediator-mediator peradangan
... Error! Bookmark not defined. Gambar 5. Tanaman lada (Piper nigrum L.) ... Error! Bookmark not defined. Gambar 6. Struktur kimia piperin ... Error! Bookmark not defined. Gambar 7. Struktur kimia diklofenak... Error! Bookmark not defined. Gambar 8. Kerangka Konsep Keseluruhan ... Error! Bookmark not defined. Gambar 9. Kerangka Konsep Uji In Vivo ... Error! Bookmark not defined. Gambar 10. Skema Langkah Kerja Uji In Vivo ... Error! Bookmark not defined. Gambar 11. Skema Langkah Kerja Uji In Silico.... Error! Bookmark not defined. Gambar 12. Hasil Identifikasi KLT ... Error! Bookmark not defined. Gambar 13. Grafik Volume Udem Setiap Kelompok Uji .... Error! Bookmark not
defined.
Gambar 14. Preparasi Protein Reseptor ... Error! Bookmark not defined. Gambar 15. Senyawa Native Ligand Flurbiprofen Error! Bookmark not defined.
x
xi
Lampiran 5. Uji hipotesis One-Way ANOVA ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 6. Post Hoc Tests ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 7. Uji homogenitas subject ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 8. Hasil ANOVA AUC Total ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 9. Post Hoc Tests AUC Total ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 10. Uji homogenitas subject AUC Total Error! Bookmark not defined. Lampiran 11. Validasi docking ligan asli FLP pada reseptor 3PGH ... Error!
Bookmark not defined.
Lampiran 12. Validasi docking senyawa pembanding (Natrium Diklofenak)
pada reseptor 3PGH ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 13. Validasi docking senyawa ligand uji Piperine pada reseptor 3PGH
... Error! Bookmark not defined. Lampiran 14. Validasi docking senyawa ligand uji Piperamide pada reseptor
3PGH ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 15. Validasi docking senyawa ligand uji Pipericide pada reseptor 3PGH
... Error! Bookmark not defined. Lampiran 16. Validasi docking senyawa ligand uji Piperettine pada reseptor
3PGH ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 17. Validasi docking senyawa ligand uji Piperolein B pada reseptor
3PGH ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 18. Validasi docking senyawa ligand uji Isopiperolein B pada reseptor
3PGH ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 19. Validasi docking senyawa ligand uji Sarmentine pada reseptor
3PGH ... Error! Bookmark not defined. Lampiran 20. Validasi docking senyawa ligand uji Tricholein pada reseptor
xii antiinflamasi adalah lada (Piper nigrum L.).
Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antiinflamasi dari isolat alkaloid dari lada (Piper nigrum L.) terhadap enzim cyclooxygenase pada tikus
galur Wistar yang terinduksi karagenin secara in vivo dan uji in silico
menggunakan metode molecular docking. Penelitian ini menggunakan desain
eksperimental, dengan tikus jantan galur wistar sebagai hewan uji. Sebanyak 25 ekor tikus, dibagi dalam 5 kelompok. Kelompok I: tanpa perlakuan. Kelompok II: senyawa pembanding natrium diklofenak dosis 13,5 mg/kg BB. Kelompok III, IV, V: Isolat alkaloid lada dengan dosis 5; 10 dan 15 mg/kgBB. Hasil pengukuran volume udem dihitung nilai Area Under Curve (AUC) dan % daya antiinflamasi
kemudian data dianalisis untuk mengetahui perbedaan antar kelompok. Selain uji
in vivo, pada penelitian ini juga dilakukan uji in silico menggunakan metode molecular docking dengan auto dock tools pada target reseptor enzim COX-2.
Hasil penelitian antiinflamasi pada tikus pemberian isolat alkaloid dari lada (Piper nigrum L.) dosis 15 mg/KgBB tikus dapat menaikkan persen daya
antiinflamasi (50,59%) pada tikus wistar model edema kaki dengan induksi karagenin. Berdasarkan hasil uji Tukey HSD dengan taraf kepercayaan 95% menunjukkan bahwa isolat alkaloid lada dosis 15 mg/Kg BB tidak berbeda signifikan dengan kontrol positif natrium diklofenak 13,5 mg/kgBB. Isolat alkaloid lada dosis 15 mg/Kg BB memiliki kemampuan menghambat inflamasi sebanding dengan natrium diklofenak 13,5 mg/kgBB. Pada uji in silico, dari
beberapa senyawa marker lada (Piper nigrum) yang berpotensi untuk
dikembangkan sebagai agen antiinflamasi, Piperine dengan nilai binding energi
sebesar -8,0 kkal/mol bersifat lebih kuat jika dibandingkan dengan senyawa pembanding natrium diklofenak (skor docking: -6,9 kkal/mol). Hasil visualisasi
menunjukkan bahwa senyawa uji piperin dan senyawa pembanding melekat pada residu yang sama, yaitu leusin ke 352, valin 349, valin 523, dan alanin ke-527. Kesimpulan dari penelitian ini adalah isolat alkaloid dari Piper nigrum
memiliki aktivitas sebagai agen antiinflamasi diduga dapat menghambat enzim
cyclooxygenase.
xiii ABSTRACT
Inflammation occurs as the attempt of body to inactivate organisms that attack the body, removing irritants and regulate tissue repair. One of the medicinal plants used empirically as antiinflammation is the pepper (Piper nigrum L.).
This study aims to analyze the anti-inflammatory activity of isolate alkaloid of pepper (Piper nigrum L.) against to cyclooxygenase enzyme in Wistar rats that induced by carrageenin in accordance with in vivo and in silico test used molecular docking method. This study used experimental design, the strain wistar male rats as test animals. As much as 25 rats, devided into 5 groups. Group I: without treatment. Group II: Natrium Diclofenac as comparative compound dose of 13.5 mg / kgBB. Group III. IV, V: use isolate alkaloid of pepper dose of 5; 10 and 15 mg/kgBB. The measurement result of udem volume is measure the value of Area Under Curve (AUC) and % of anti-inflammatory power then the data is
analyzed to understand the differences among groups. Besides in vivo test, in silico test also apply in this research using molecular docking method with auto dock tools to the COX-2 as target receptor.
The result shows, the provision of isolate alkaloid of pepper (Piper nigrum L.) dose of 15 mg/KgBB to rats will increase the Anti-Inflammatory Power (50, 59%) in foot of edema wistar rats model that induced by carrageenin. Based on the results of Tukey HSD test with a level of 95% shows that isolate alkaloid of pepper dose of 15 mg/kgBB is not significantly different from the comparative compound natrium diclofenac dose of 13.5 mg/kgBB. Isolate alkaloid of pepper dose of 15 mg/kgBB has ability to inhibit inflammatory as well as natrium diclofenac dose 13.5 mg / kgBB. In silico test of some marker compound pepper (Piper nigrum) that have potential to be developed as an anti-inflammatory agent, Piperine with the value of binding energy of -8.0 kcal/mol is more powerful than the comparative compound natrium diclofenac (docking score: -6.9 kcal / mol). The results of visualization showed that the test compound piperine and comparative compound were bonded with the same residue, that was leucine 352, valine 349, valine 523, and alanine 527. The conclusion of this study is alcaloid isolate from Piper nigrum have activity as an anti-inflammatory agents suspected to inhibit the cyclooxygenase enzyme.
1 BAB I
PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian
Inflamasi atau radang merupakan penyakit yang kerap dijumpai dalam masyarakat, yaitu respon biologis dari reaksi kimia secara berurutan dan bertugas melindungi tubuh dari infeksi dan perbaikan jaringan yang rusak akibat trauma. Tanda-tanda yang dimiliki pada umumnya yaitu bengkak, nyeri, kemerahan, panas dan hilangnya fungsi. Respon ini berkembang bila tubuh mendapat luka secara mekanik, kimia atau proses penghancuran diri (Ward, 1993). Oleh karena itu diperlukan obat anti-inflamasi yang menghambat pembentukan mediator inflamasi sehingga dapat menekan proses inflamasi.
Sampai saat ini, selain obat-obatan yang berasal dari bahan kimia, penggunaan tanaman obat tradisional masih banyak dilakukan di kalangan masyarakat Indonesia. Hal ini disebabkan karena penggunaan obat modern memiliki efek samping yang berbahaya seperti keluhan saluran pencernaan, gangguan ginjal, alergi, toksis pada hati serta harga relatif lebih mahal (Astuti, 2002). Oleh karena itu sangat penting dilakukan pengembangan obat tradisional untuk menunjang usaha peningkatan taraf hidup masyarakat dalam bidang kesehatan.
nigrum merupakan tanaman kelompok Pyridine dan famili Piperaceae.
Adapun kandungan senyawa yang terdapat pada lada antara lain piperin 5–9 %, piperonal 2,5 %, kariofilen 8,8 % dan amilum 50 % (Claus, et al., 1970).
Kandungan senyawa yang diduga memiliki aktivitas biologi yaitu piperin (Stahl, 1985). Penelitian-penelitian farmakologi dari tumbuhan ini juga sudah pernah dilakukan. Piperin dapat digunakan sebagai anti inflamasi, anti malaria, dan pengobatan anti leukemia (Majeed, et al., 1999). Sebagai
antiinflamasi, pemberian ekstrak heksana dan etanol Piper nigrum L. terbukti
dapat menghambat prostaglandin yang merupakan mediator inflamasi yang terinduksi karagenin (Tasleem, et al., 2014). Sebagai antimalaria, kombinasi
dari kurkumin/klorokuin/piperin dapat mengurangi parasitemia Plasmodium
chabaudi yang diinfeksi pada tikus BALB/c, penambahan piperin juga dapat
meningkatkan aktivitas kurkumin yang berpotensi sebagai antimalaria (Neto,
et al., 2013). Sebagai antileukemia, piperin menghambat proliferasi sel
erythroleukemia K562 pada konsentrasi dosis di atas 20 mikromol/L. Piperin dapat menginduksi sel-sel K562 untuk berdiferensiasi menjadi makrofag/monosit (Song, et al., 2008).
Penelitian dan pengembangan obat dimaksudkan untuk mendapatkan agen yang lebih efektif dan selektif terhadap reseptornya. Pengembangan senyawa obat baru khususnya sebagai antiinflamasi yang dapat dilakukan dengan metode komputasi yaitu molecular docking. Molecular docking
(Kroemer, 2007). Dengan dilengkapi aplikasi AutoDockTools, yang
merupakan aplikasi untuk penambatan molekuler bersifat non-komersial. Aplikasi ini sangat bermanfaat dalam memprediksi ikatan antara ligan dan suatu target biomakromolekuler (Morris, et al., 2012). Berdasarkan uraian di
atas, dari isolat alkaloid lada (Piper nigrum L.), maka dilakukan pemeriksaan
efek antiinflamasi tanaman ini. Dari penelitian ini diharapkan diperoleh data dan fakta yang dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah sehingga dapat dibuktikan bahwa ekstrak tumbuhan ini benar-benar berkhasiat secara farmakologis.
Penelitian ini juga dilakukan untuk mengaplikasikan firman Allah pada surat Ar-Rahman (55): ayat 33 yang berbunyi:
“Wahai golongan jin dan manusia, jika kamu sanggup menembus
(melintasi) penjuru langit dan bumi, maka tembuslah! Kamu tidak akan
mampu menembusnya kecuali dengan kekuatan (dari
Allah Swt.)”.(Surah ar-Rahman/55:33)
akal. Akal ini harus terus diasah, diberdayakan dengan cara belajar dan berkarya. Dengan belajar, manusia bisa mendapatkan ilmu dan wawasan yang baru. Dengan ilmu, manusia dapat berkarya untuk kehidupan yang lebih baik.
Fokus penelitian ini pada uji farmakodinamik interaksi piperin dengan enzim cyclooxygenase secara in vivo dan in silico. Metode yang biasa
digunakan dalam penelitian efek antiinflamasi pada inflamasi akut adalah metode udema kaki tikus terinduksi karagenin dengan pengukuran volume udema dilakukan setiap setengah jam selama 6 jam untuk mendapat hasil pengukuran yang lebih baik. Zat aktif piperine yang diisolasi dari lada hitam
juga diketahui memiliki efek antiinflamasi pada inflamasi akut maupun inflamasi kronik masing-masing melalui metode udema kaki tikus terinduksi karagenin (Mujumdar, et al., 1990). Penelitian ini juga bertujuan untuk
mengetahui aktivitas antiinflamasi isolat alkaloid Lada (Piper nigrum L.)
dengan menggunakan metode penambatan molekul (molecular docking).
Hasilnya akan dinyatakan dalam skor penambatan dan visualisasi bentuk ikatan ligan dan reseptor pada uji in silico.
B. Perumusan Masalah
1. Apakah isolat alkaloid lada (Piper nigrum L.) memiliki efek sebagai
antiinflamasi secara in vivo dan in silico?
2. Berapakah dosis efektif isolat alkaloid lada (Piper nigrum L.) sebagai
3. Berapakah skor penambatan senyawa yang terdapat pada alkaloid lada (Piper nigrum L.) sebagai antiinflamasi secara in silico dan asam amino
apa saja yang diikat oleh piperin?
C. Keaslian Penelitian
Beberapa penelitian terkait Piper nigrum L. pernah dilakukan.
Pemberian ekstrak heksana dan etanol Piper Nigrum L. yang terinduksi
karagenin, terbukti dapat menghambat prostaglandin yang merupakan mediator inflamasi (Tasleem, et al., 2014). Piperin dalam dosis 2,5; 5 dan 10
mg/kg menunjukkan hasil 5,4; 43,8 dan 54,8% penghambatan kaki edema masing-masing kelompok perlakuan setelah tiga jam. Peningkatan prostaglandin (PGE2) meningkat setelah injeksi karagenin, secara signifikan dapat dicegah dengan preadministration dari piperin pada 5 dan 10 mg/kg tapi tidak pada piperin dosis 2,5 mg/kg. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa piperin memiliki sifat antiinflamasi yang disebabkan penghambatan pelepasan prostaglandin (Sudjarwo, 2005). Piperin menghambat ekspresi IL6 dan MMP13 dan mengurangi produksi PGE2 dalam dosis pada konsentrasi 10 sampai 100 mg/ml. Secara khusus, produksi PGE2 signifikan menghambat pada dosis 10 μg/ml dari piperin. Hasil ini menunjukkan bahwa piperin memiliki efek antiinflamasi, antinosiseptif, dan antiartritik (Bang, et al.,
2009). Sejauh ini belum pernah dilakukan penelitian tentang aktivitas antiinflamasi yang berasal dari isolat alkaloid Piper nigrum melalui
perhitungan persen daya antiinflamasi pada uji in vivo dan molecular docking
ilmiah yang dapat mendukung penelitian sebelumnya, sehingga diperoleh informasi farmakodinamik yang lebih lengkap.
D. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum :
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari aspek farmakodinamika isolat alkaloid dari lada (Piper nigrum L.) terhadap enzim cyclooxygenase pada
tikus secara in vivo dan in silico.
2. Tujuan khusus :
a. Untuk mengetahui efek antiinflamasi isolat alkaloid dari lada (Piper
nigrum L.) terhadap udema kaki tikus galur Wistar yang terinduksi
karagenin.
b. Untuk mengetahui dosis efektif isolat alkaloid dari lada (Piper nigrum
L.) sebagai antiinflamasi.
c. Untuk mengetahui skor penambatan senyawa marker dari lada (Piper
nigrum L.) sebagai antiinflamasi secara in silico dan asam amino apa
saja yang diikat oleh piperin.
E. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dan menjadi sumber informasi kepada masyarakat terhadap pemanfaatan tanaman lada (Piper
Nigrum L.) sebagai salah satu pilihan untuk membantu mengatasi nyeri. Hasil
7 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA A. Inflamasi
Inflamasi berasal dari kata inflammare yang berarti membakar,
merupakan respon protektif yang sangat diperlukan oleh tubuh dalam upaya mengembalikan ke keadaan sebelum cedera atau untuk memperbaiki diri sendiri sesudah terkena cedera. Jaringan yang mengalami inflamasi mempertahankan vitalitasnya dengan menunjukan hal-hal seperti peningkatan permeabilitas vaskuler, vasodilatasi, akumulasi sel, dan eksudasi leukosit, nyeri, demam, dan gatal. Semua hal tadi terjadi bersamaan dalam rangkaian proses yang rumit dan hasilnya terlihat sebagai tanda-tanda klasik inflamasi yaitu calor (panas), rubor (warna merah), tumor (pembengkakan), dolor
(nyeri), dan functio laesa (gangguan fungsional) (Wilmana, 1986).
Patogenesis gejala inflamasi disajikan pada gambar 1. Noksius
Kerusakan sel
Pembebasan bahan mediator
Emigrasi Proliferasi sel
Gangguan sirkulasi lokal
Eksudasi Perangsangan
reseptor nyeri
Pemerahan Panas Pembengkakan Gangguan fungsi
Nyeri
Segera setelah masuknya rangsang iritan terdapat konstriksi singkat arteriola diikuti dengan dilatasi berkepanjangan. Ini akan mengakibatkan anyaman kapiler menjadi merah dengan darah dan membukanya saluran kapiler yang tidak aktif. Aliran darah bertambah dan dapat tetap demikian atau menjadi lamban (Spector & Spector, 1993). Bila ruangannya sukar diperbesar, maka cairan eksudat dapat merangsang akhiran saraf sensorik. Akibat rangsangan ini terjadilah rasa nyeri (Spector & Spector, 1993).
Menurut Coyne (1970), respon inflamasi terjadi dalam tiga fase, yaitu (1) peningkatan permeabilitas vaskuler yang menyebabkan udema, (2) infiltrasi leukosit dan fagositosis, dan (3) ploriferasi fibrolast, sintesis jaringan penghubung baru untuk memperbaiki kerusakan. Inflamasi dapat berupa inflamasi akut atau inflamasi kronik tergantung pada sifat cedera (Spector & Spector, 1993).
1. Inflamasi akut
Pembengkakan (udema) akibat luka (injury) terjadi karena masuknya
cairan ke dalam jaringan lunak. Neutrofil muncul dalam waktu 30–60 menit setelah terjadi injury. Pada daerah injury neutrofil tampak
mengelompok sepanjang sel-sel endotel pembuluh darah. Sedangkan leukosit mulai meninggalkan pusat aliran dan bergerak ke perifer. Pengelompokan yang luar biasa dari leukosit selama masih dalam pembuluh darah disebut marginasi (Ward, 1993). Marginasi dari leukosit dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. Marginasi leukosit pada inflamasi akut (Spector &Spector, 1993)
Leukosit mulai melekat pada endothelium yang merupakan awal dari
emigrasi leukosit menuju daerah target. Leukosit bergerak seperti amuba yaitu dapat mengulurkan pseudopodia ke dalam celah yang mungkin ada di antara dua sel endotel, kemudian mendesak sedikit demi sedikit dan kejadian berlangsung secara simultan sehingga leukosit yang dikeluarkan dari aliran darah akan masuk menuju daerah peradangan dalam waktu singkat seperti terlihat pada gambar 3. (Abrams, 1995).
dengan cara memfagositosis agen berbahaya tersebut (Ward, 1993). Bertambahnya permeabilitas pembuluh sering disebabkan oleh kerusakan sel endotel yang terjadi sebagai akibat gangguan struktural terhadap dinding pembuluh kapiler dan venula (Spector & Spector, 1993).
Gambar 3. Peningkatan permeabilitas pembuluh darah dan emigrasi leukosit pada inflamasi akut (Spector & Spector, 1993).
Kerusakan langsung jenis ini menyebabkan pembuluh ini bocor oleh karena menjadi longgarnya sambungan antar sel endotel. Ini terjadi pada berbagai cedera bakar dan cedera yang disebabkan oleh toksin kimia dan radiasi (Williams, 1989).
2. Inflamasi kronik
menjadi kronik berlangsung bila inflamasi akut tidak dapat reda yang disebabkan oleh agen penyebab inflamasi yang menetap atau terdapat gangguan pada proses penyembuhan normal (Robbins & Kumar, 1995).
Inflamasi kronik ditandai dengan adanya sel-sel mononuklear yaitu makrofag, limfosit dan sel plasma (Robbins & Kumar, 1995). Makrofag dalam lokasi inflamasi kronik berasal dari monosit darah bermigrasi dari pembuluh darah. Makrofag tetap tertimbun pada lokasi radang, sekali berada di jaringan mampu hidup lebih lama dan melewati neutrofil yang merupakan sel radang yang muncul pertama kali. Limfosit juga tampak pada inflamasi kronik yang juga ikut serta dalam respon imun seluler dan humoral (Robbins & Kumar, 1995).
B. Peranan Metabolisme Asam Arakhidonat dalam Antiinflamsi
Bila membran sel mengalami kerusakan oleh suatu rangsangan kimiawi, fisik atau mekanis, maka enzim fosfolipase diaktifkan untuk mengubah fosfolipida menjadi asam arakhidonat. Asam arakhidonat disimpan dalam bentuk ester dari struktur fosfolipida dari membran sel kebanyakan jaringan, atau barasal dari ester trigliserida atau ester kolesterol (Wilmana, 1995).
Baik prostaglandin maupun leukotrien bertanggung jawab terhadap sebagian besar gejala-gejala peradangan.
C. Jalur Cyclooxygenase (COX)
Asam arakhidonat dimetabolisme melalui COX dalam prostaglandin G2 dan setelah proses peroksidasi dalam PGH2 diubah menjadi prostaglandin (PGD2, PGE2, PGF2a), prostasiklin (PGI2), dan tromboksan (TXA2) (Chandrasekharan & Simmons, 2004; Guilemany, et al., 2008). Salah satu
dari prostaglandin yang paling penting adalah PGE2, yang dapat melakukan fungsi yang berlawanan (misalnya, bronkodilatasi, bronkokonstriksi; anti-inflamasi dan proanti-inflamasi), tergantung pada reseptor di permukaan sel (EP1, EP2, EP3, dan EP4) (Vancheri, et al., 2004; Guilemany, et al., 2008).
Adanya isoform berbeda dari enzim COX, di antaranya adalah COX-1 dan COX-2. COX-1 merupakan enzim "konstitutif" yang ditemukan pada
Fosfolipid
Asam arakidonat
Asam arakidonat Asam arakidonat
Endoperoksidase Asam hidroperoksi
Tromboksan Prostaglandin Leukotrien
semua sel dengan kemampuan untuk mengendalikan beberapa proses fungsi fisiologis untuk menghasilkan prostanoids dalam kondisi basal. COX- 2 merupakan enzim induktif yang diekspresikan apabila distimulasi oleh sitokin dan growth factor (Turini & Dubois, 2002; Chandrasekharan & Simmons,
2004; Guilemany, et al., 2008).
D. Tanaman Piper nigrum L.
Kedudukan lada (Piper nigrum L.) dalam toksonomi tumbuhan adalah
sebagai berikut :
Divisi : Spermatophyta Sub Divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Piperales
Suku : Piperaceae
Marga : Piper
Jenis : Piper nigrum L.
(Backer & Van den Brink, 1965)
Nama lain dari lada adalah pedes (Sunda) dan merica (Jawa). Lada (Piper nigrum L.), famili Piperaceae sudah dikenal sebagai penyedap
makanan, mengatasi bau badan, serta pengawet daging (Septiatin, 2008). Ada dua macam lada yang dikenal masyarakat Indonesia yaitu lada hitam dan lada putih. Lada hitam diperoleh dengan memetik buah yang masih hijau, mengupasnya, difermentasi untuk menambah rasa lada, kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari, dan rasanya lebih pedas. Sedangkan lada putih diperoleh dengan memetik biji masak merah, diremas perlahan-lahan dan direndam dalam air, kulit dan daging buah dibuang sebelum dikeringkan di sinar matahari (Septiatin, 2008)
Nama daerah dari Piper nigrum L. adalah sebagai berikut: Marica, Mariyos, Mrica, Saang (Jawa); Lada, Pedes (Sunda); Sanang, Kambangsa (Madura); Koro-koro (Aceh) (Heyne, 1987). Deskripsi dari Piper nigrum L.
duduk, bersandar pada daun pelindung yang bertemu menjadi serupa mangkok, hijau, lalu menjadi merah, akhirnya hitam (Van Steenis, 2002).
Kandungan kimia dan kegunaan dari Piper nigrum L. adalah sebagai
berikut: buah Piper nigrum L. mengandung saponin, flavonoid dan minyak
atsiri yang berkhasiat sebagai obat perut kembung, obat tekanan darah tinggi, obat sesak nafas, dan peluruh keringat (Hutapea & Syamsuhidayat, 1991).
E. Isolasi Alkaloid 1. Senyawa Alkaloid
Alkaloid adalah senyawa yang bersifat basa, mengandung satu atau lebih atom nitrogen, umumnya berbentuk siklik, serta bereaksi dengan pereaksi alkaloid. Umumnya alkaloid berbentuk kristal padat dan sebagian kecil bersifat cair dan terasa pahit (Harborne, 1987). Fungsi alkaloid pada tanaman adalah sebagai bahan cadangan untuk sintesis protein, sebagai zat untuk melindungi dari serangan hewan, sebagai stimulan atau pengatur seperti hormon dan sebagai produk untuk detoksikasi. (Ikan, 1969).
2. Isolasi
fase diam dan fase gerak. Zat terlarut terdistribusi dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat melewati sistem dibandingkan dalam fase diam (Cazes & Scott, 2002).
3. Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan untuk memisahkan senyawa aktif dari campurannya, menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang sesuai dan dengan prosedur ekstraksi tertentu. Tujuan ekstraksi tersebut untuk mendapatkan komponen kimia yang dikehendaki berdasarkan perbedaan kelarutan dalam suatu bahan kasar atau dalam simplisia.
Bahan alam yang akan diekstraksi umumnya dilakukan pengeringan dan dibuat dalam bentuk serbuk. Pengeringan ini bertujuan untuk mendapatkan simplisia yang tidak mudah rusak sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lama (Harborne, 1987). Hal tersebut disebabkan karena pengeringan dapat menurunkan kadar air sehingga menurunkan reaksi enzimatik, namun dalam proses pengeringan harus tetap diawasi untuk mencegah terjadinya perubahan kimia yang berlebihan (Harborne, 1987). Sedangkan pembuatan dalam bentuk serbuk dimaksudkan untuk memperluas permukaan sehingga meningkatkan kontak dengan cairan penyari.
Secara umum prinsip ekstraksi adalah pengikatan atau pelarutan zat yang diinginkan dalam suatu simplisia berdasarkan sifat kelarutannya dengan suatu pelarut (like-dissolve-like). Pengeringan bahan akan
suatu pori-pori. Pelarut kemudian mengisi pori-pori tersebut sehingga pelarut akan kontak dengan zat aktif dalam tanaman sehingga zat-zat aktif tersebut akan melarutkan isi sel karena perbedaan konsentrasi dalam sel dan di luar sel. Zat aktif yang sudah terlarut kemudian akan keluar sel secara difusi. Proses difusi akan berkurang apabila konsentrasi pelarut mencapai kesetimbangan antara dalam sel dan di luar sel. Metode dalam ekstraksi umumnya dibedakan menjadi 2, yaitu dengan cara panas dan cara dingin. Metode cara panas misalnya adalah refluks, sokletasi, digesti, infus, dan dekok. Sedangkan cara dingin meliputi maserasi dan perkolasi (Ditjen POM, 2000). Alkaloid dapat diisolasi melalui salah satu metode ekstraksi yaitu sokletasi.
Soxhlet merupakan ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru,
umumnya dilakukan menggunakan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi konstan dengan adanya pendingin balik (kondensor). Sampel disimpan dalam alat soxhlet dan tidak dicampur langsung dengan pelarut dalam
wadah yang di panaskan, yang dipanaskan hanyalah pelarutnya, pelarut terdinginkan dalam kondensor dan pelarut dingin inilah yang selanjutnya mengekstraksi sampel.
dalam simplisia dan jika cairan penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi. Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan di sifon tidak berwarna, atau sirkulasi telah mencapai 20-25 kali.
F. Piperin
Gambar 6. Struktur kimia piperin (Epstein, et al., 1993)
Piperin merupakan alkaloid basa lemah, kristal berbentuk jarum, berwarna kuning dan rasa pedas. Hampir tidak larut dalam air (40 mg/liter, pada suhu 180C) dan protoleum eter; 1 g larut dalam alkohol, 17 ml
kloroform, 36 ml eter dan larut dalam benzena dan asam asetat (Windholz, 1981).
Piperin digunakan untuk memberikan rasa pedas pada brandy
(minuman keras) dan sebagai insektisida (Windholz, 1981). Senyawa piperonal mungkin berasal dari degradasi piperin (Sarwono, 1988). Piperine
merupakan salah satu zat aktif dari lada (Piper nigrum L.) yang mampu
menghambat enzim-enzim yang terlibat dalam biotransformasi obat.
G. Natrium Diklofenak
lebih besar lagi, mulai bekerjanya masing-masing sesudah 1 dan 0,5 jam. Kadar puncak dalam plasma dicapai setelah dua jam. Sebesar 99% terikat pada protein plasma dan waktu paruh eliminasinya antara 1–2 jam. Diklofenak mengalami metabolisme lintasan pertama, dalam hati dimetabolisme hampir sempurna. Ekskresinya berlangsung sebagian dalam kemih sebagai glukoronida dan sisanya dalam empedu dan tinja (ekskresi obat yang utuh melalui ginjal kurang dari 1%) (Tjay & Rahardja, 2002).
Efek samping yang lazim adalah mual, gastritis, eritema kulit, dan sakit kepala sama seperti semua obat AINS. Pemakaian obat ini harus berhati-hati pada penderita tukak lambung. Peningkatan enzim transminase dapat terjadi pada 15% pasien dan umumnya kembali normal. Pemakainan selama kehamilan tidak dianjurkan. Dosis orang dewasa 100 – 150 mg sehari terbagi dua atau tiga dosis (Wilmana, 1995). Struktur diklofenak disajikan pada gambar 7.
Gambar 7. Struktur kimia diklofenak (Mutschler, 1991) H. Karagenin
Karagenin yang diperoleh dari ekstrak Chondrus crispus merupakan
Karagenin akan menginduksi cedera sel dengan dilepaskannya mediator yang mengawali proses inflamasi. Pada awalnya masih terjadi adaptasi untuk melepaskan mediator inflamasi, berarti pelepasan mediator inflamasi belum maksimal. Setelah pelepasan mediator maksimal, terjadi udema maksimal dan mampu bertahan sampai beberapa jam. Udema yang disebabkan induksi karagenin dapat bertahan selama 6 jam dan berangsur berkurang dalam waktu 24 jam (Sumarny & Rahayu, 1994). Karagenin mempunyai keunggulan yaitu efeknya bisa lebih dari 4 jam walaupun butuh waktu untuk menginduksi udema (Garattinis, et al., 1964). Waktu laten pada karagenin kurang lebih 1
jam sebelum terjadi pembentukan udema dan pembentukan udema maksimal terjadi setelah 2–3 jam (Winter, 1964).
I. Penentuan Aktivitas Antiinflamasi
Model eksperimen inflamasi digunakan untuk menyelidiki mekanisme proses inflamasi dan mengevaluasi daya antiinflamasi senyawa kimia. Banyak model uji antiinflamasi in vivo telah diterapkan, beberapa model yang
lazim digunakan antara lain: udema terinduksi pada telapak kaki tikus (rat
hind paw oedema), eritema ultra violet dan atritis adjuvant (Swingle, 1974).
Model eksperimental lainnya adalah: skin testing (tes kulit), eksperimental
pleurisy (percobaan radang selaput dada), six day air pouch (injeksi udara
selama enam hari), implantasi spon polyester (implantasi bunga karang
poliester), dan cotton pellet granuloma (Sedgwick & Willoughby, 1989).
udema pada kaki tikus yang dihasilkan oleh bahan edemogen. Metode yang berdasarkan pada penghambatan udema terinduksi pada kaki tikus adalah yang paling populer. Prosedur umumnya adalah menyuntikkan sedikit suspensi atau larutan edemogen ke dalam jaringan plantar telapak kaki tikus sehingga menimbulkan pembengkakan.
Dibanding model lain, model udema pada telapak kaki tikus mempunyai banyak keuntungan seperti lebih mudah dan reprodusibel, menggunakan satu kelompok tikus, waktu terbentuknya udema dapat diselidiki serta membutuhkan biaya relatif murah (Sedgwick & Willoughby, 1989). Bahan edemogen yang paling banyak digunakan adalah karagenin. Pembengkakan kaki tikus ditimbulkan dengan menggunakan 0,1 ml suspensi karagenin 1% (Van Arman, et al., 1965). Penentuan aktivitas dilaksanakan
dengan cara: memberikan obat yang diuji secara oral, 60 menit kemudian menyuntikan suspensi karagenin 1% ke dalam jaringan plantar salah satu telapak kaki tikus dan segera menentukan ukuran volume kaki pada waktu ini (t = 0). Kemudian pengukuran volume pembengkakan kaki tersebut dilakukan setiap jam setelah penyuntikan karagenin.
J. Uji In Silico
1. Molecular Docking
Metode in silico merupakan salah satu metode penelitian secara
komputasi yang menjadi subyek penelitian intensif selama dekade terakhir (Teodore, et al., 2001). Metode tersebut dilakukan dengan penambatan
molekul atau molecular docking. Tujuan penambatan molekul ini untuk
mendapatkan konformasi yang optimal untuk protein dan ligan, sehingga dapat meminimalkan energi bebas dari sistem secara keseluruhan. Penambatan molekul membantu dalam mempelajari ligan atau interaksi reseptor dan protein dengan mengidentifikasi situs aktif yang cocok pada protein, menemukan posisi terbaik dari ligan-reseptor secara geometri dan mengkalkulasi energi interaksi dari ligan yang berbeda untuk mendapatkan ligan yang lebih efektif (Mukesh, 2011).
Molecular docking sering digunakan untuk memprediksi ikatan ligan
terhadap target proteinnya untuk memperkirakan afinitas dan aktivitas molekulnya sehingga docking berperan penting dalam desain obat yang
rasional (Mukesh & Rakesh 2011). Dua tahapan dalam melakukan penambatan molekuler, yaitu validasi metode docking dan simulasi
docking dengan ligan target. Tahap tersebut terdiri dari tahap preparasi
ligan, preparasi reseptor, dan simulasi docking. Prinsip dari penambatan
2. AutoDockTools
AutoDockTools merupakan salah satu aplikasi untuk penambatan
molekuler yang bersifat nonkomersial. Salah satu keberhasilan penggunaan AutoDockTools dalam penelitian dan pengembangan obat
adalah dalam penemuan obat raltegravir sebagai inhibitor HIV integrase (Norgan, et al., 2011).
AutoDockTools merupakan program penambatan molekuler yang
efektif, cepat dan akurat dalam memprediksi konformasi dan energi dari ikatan target dan ligan. Program utama Autodock terbagi dua yaitu
Autodock dan Autodock grid. Autodock berfungsi melakukan penambatan
molekuler protein target dan ligan dengan set grid yang telah ditetapkan. Untuk mencari informasi Autodock membutuhkan ruang atau area pencarian dalam sistem koordinat yang memprediksi posisi terikatnya ligan (Morris, et al., 2012).
Hasil dari AutoDockTools berupa skor energi interaksi untuk
menentukan konformasi yang baik maupun yang tidak baik. Skor docking
tersebut diestimasikan sebagai harga ΔG atau binding energy yang
memiliki satuan dalam kkal/mol. Konformasi yang baik diketahui dengan melihat hasil docking yang memiliki energi interaksi yang kecil pada
K. Landasan Teori
Inflamasi didefinisikan sebagai suatu respon protektif normal tubuh terhadap luka jaringan yang disebabkan oleh trauma fisik, zat kimia yang merusak, atau zat-zat mikrobiologik. Penggunaan obat-obat AINS (Antiinflamasi Non Steroid) efektif untuk pengobatan inflamasi akut, tetapi efek samping pada saluran cerna membuat obat ini kurang disukai.
Pada umumnya pemanfaatan herbal tanaman lada (Piper nigrum L.)
oleh masyarakat sebagai penambah stamina atau penyegar tubuh berdasarkan pengalaman empiris atau berdasarkan bau dan rasa dari bagian tanaman tersebut. Adapun kandungan senyawa yang terdapat pada lada antara lain piperin, piperonal, kariofilen dan amilum.
Pada penelitian sebelumnya, zat aktif piperine yang diisolasi dari lada
juga diketahui memiliki efek antiinflamasi pada inflamasi akut maupun inflamasi kronik masing-masing melalui metode udema kaki tikus terinduksi karagenin. Mekanisme piperin terebut sebagai antiinflamasi dapat
menghambat prostaglandin yang merupakan mediator inflamasi. Upaya pengembangan senyawa obat bahan alam dari isolat alkaloid lada sebagai agen antiinflamasi untuk mengatasi radang bisa dilakukan dengan menggunakan metode in vivo dan in silico yang merupakan teknik baru pada
penelitian ini dibanding penelitian sebelumnya.
Dengan penambatan molekul atau molecular docking untuk
Lada (Piper nigrum L.)
Isolat alkaloid (Piperine)
Inflamasi
Natrium Diklofenak
Lada (Piper nigrum L.)
ligan atau interaksi reseptor dan protein dengan mengidentifikasi situs aktif yang cocok pada protein untuk mendapatkan ligan yang lebih efektif sehingga
docking berperan penting dalam desain obat yang rasional.
L. Kerangka Konsep
Keterangan :
= Menginduksi
= Menghambat = Mengandung Uji In Silico
Ligan Uji
Uji In Vivo
Ligan Pembanding
(Na Diklofenak) Ligan Asli (FLP)
Pembandingan Hasil Uji In Silico dan Uji In Vivo
Gambar 8. Kerangka Konsep Keseluruhan
M. Hipotesis
Dari penelitian ini, dapat dirumuskan hipotesis bahwa:
1. Isolat alkaloid lada (Piper nigrum L.) mempunyai efek antiinflamasi
terhadap udema kaki tikus putih jantan galur Wistar secara in vivo dan in
silico.
2. Dosis efektif isolat alkaloid lada (Piper nigrum L.) sebagai antiinflamasi
secara in vivo adalah dosis yang dapat menaikan persen daya antiinflamasi
pada tikus wistar model edema kaki dengan induksi karagenin.
3. Berdasarkan analisis molecular docking, senyawa aktif pada isolat alkaloid
lada (Piper nigrum L.) berpotensi sebagai agen antiinflamasi.
27 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Desain Penelitian
Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Penelitian Hewan Uji Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta dan Laboratorium Teknologi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai bulan Februari 2016.
C. Populasi dan Sampel
D.Variabel Penelitian
Variabel Bebas : Dosis isolat alkaloid yang diberikan pada tikus yang mengalami udema dengan induksi karagenin, senyawa aktif pada Piper nigrum L, dan reseptor
COX-2
Variabel Tergantung : Penghambatan volume udema yang dinyatakan dalam % daya antiinflamasi dan skor docking.
Variabel Kendali : Galur tikus, umur tikus, berat badan tikus, jenis kelamin tikus, pakan, dan kondisi fisik tikus dan perangkat system molecular docking.
E.Instrumen Penelitian 1. Alat Penelitian
a. Alat yang digunakan untuk uji in silico:
Seperangkat Personal Computer (PC/Laptop) SAMSUNG RV409
yang dilengkapi dengan perangkat lunak seperti sistem operasi dan aplikasi pendukung. Sistem operasi yang digunakan adalah Linux Ubuntu 12.04 LTS 64-bit dan Windows 8 Pro 64-bit, dan aplikasi pendukung yang digunakan adalah Microsoft Office 2013, AutoDockTools 4.2,
AutoDock Vina, DS Visualizer, Python, Open Babel dan MarvinSketch.
b. Alat yang digunakan untuk uji in vivo:
Soxhlet, rotary evaporator, Plestimometer UGO BASILE, pipa
kapiler, alat timbang hewan uji, stopwatch, alat-alat gelas, spuit injeksi
dilengkapi piranti lunak Microsoft Excel dan SPSS for Windows versi
16.00.
2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan untuk uji in silico pada penelitian ini adalah
protein 3PGH dalam bentuk berkas (file) dengan kode protein FLP yang
diunduh dari situs resmi protein data bank (www.rcsb.org), senyawa marker
lada (Piper nigrum), dan senyawa dari natrium diklofenak dalam bentuk
berkas (file) untuk pembanding.
Bahan yang digunakan untuk uji in vivo pada penelitian ini:
a. Bahan utama
Bahan untuk pembuatan ekstrak adalah serbuk lada yang berasal dari Herbal Anugrah Alam, Mayungan RT 04, Potorono, Banguntapan, Bantul, Yogyakarta.
b. Bahan pembuatan ekstrak, isolasi dan identifikasi piperin
Pelarut etilasetat, etanol 96%, CMC 0,5%, silika gel 60 F254, etilasetat :
n-heksan (1:4), dan pereaksi Dragendorf.
c. Bahan uji antiinflamasi
Karagenin 1%, Natrium diklofenak, NaCl fisiologis dan aquades. d. Hewan uji
F. Cara Kerja 1. Uji In Vivo
a. Pengumpulan Simplisia dan Pembuatan Serbuk
Serbuk Lada Putih diperoleh dari distributor simplisia yaitu Herbal Anugrah Alam, yang berada di Mayungan RT 04, Potorono, Banguntapan, Bantul, Yogyakarta
b. Pembuatan Ekstrak 1) Metode Sokletasi
Serbuk simplisia lada sebanyak 100 mg dibungkus dengan kertas saring, kemudian dimasukkan ke dalam tabung ekstraksi pada
Soxhlet. Pelarut etilasetat sebanyak 300 ml dimasukan ke dalam labu
alas bulat. Kemudian soxhlet diletakkan di atas pemanas dan dibagian
atas dihubungkan dengan pendingin (kondensor) yang dialiri air. Proses ekstraksi dilakukan hingga pelarut yang merendam ekstrak terlihat bening selama ± 5 jam. Filtrat yang tertampung pada labu alas bulat kemudian dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator
pada suhu 50C dengan kecepatan 100 rpm. c. Isolasi Kristal Piperin
d. Identifikasi Piperin dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254 dan fase gerak
yang digunakan adalah etilasetat : n-heksan (1:4) serta pembanding
quinine. Identifikasi dengan KLT dilakukan dengan cara menotolkan
pembanding dan kristal yang telah dilarutkan dengan etilasetat pada plat dengan bantuan pipa kapiler kemudian dielusi dengan fase gerak di dalam bejana tertutup rapat yang telah dijenuhkan dengan fase gerak tersebut. Elusi dihentikan pada saat fase gerak mencapai batas yang telah ditentukan yaitu 1 cm sebelum ujung akhir plat kemudian plat dikeluarkan dari bejana. Pengamatan bercak dilakukan dengan menggunakan sinar UV 254 nm dan pereaksi Dragendorf.
e. Uji Antiinflamasi
1) Pembuatan pereaksi dan sediaan uji a) Pembuatan larutan karagenin 1%
b) Pembuatan larutan Na diklofenak
Dosis yang diberikan berdasarkan dosis harian orang dewasa 100-200 mg per hari, jika dikonversikan pada pemberian tikus adalah sebagai berikut :
150 mg x 0,018 = 2,7 mg/ 200 gram kg BB
= 13,5 mg/kg BB
Sediaan uji Natrium diklofenak diberikan dalam larutan NaCl fisologis 0,9%. Sejumlah 60 mg Na diklofenak dilarutkan dalam larutan NaCl fisiologis 0,9% sebanyak 10 mL dengan bantuan pengadukan dan vortex hingga didapatkan larutan yang homogen, sehingga didapatkan larutan 6 mg/mL.
f. Uji utama daya antiinflamasi
Metode yang dipakai adalah metode udema terinduksi pada telapak kaki tikus (rat hind paw). Hewan uji yang digunakan dalam
penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Wistar, umur 2-3 minggu, berat badan 100-150 g sebanyak 25 ekor dibagi menjadi lima kelompok masing-masing 5 ekor, yakni sebagai berikut :
1) Kelompok I (kontrol negatif) diberikan air suling 2 mL/100 g BB tikus secara oral.
2) Kelompok II (pembanding) diberikan Na diklofenak dosis 13,5 mg/Kg BB secara oral.
4) Kelompok IV diberikan isolat alkaloid lada dosis 10 mg/Kg BB secara oral.
5) Kelompok V diberikan isolat alkaloid lada dosis 15 mg/Kg BB secara oral.
Karagenin diberikan pada waktu optimal yang dapat menimbulkan efek antiinflamasi. Larutan karagenin 1% diberikan secara subplantar untuk tiap-tiap tikus. Pengukuran volume udema kaki segera dilakukan dengan mencelupkan kaki (sampai tanda) ke dalam
plestimometer, dan dicatat sebagai menit ke-0. Kemudian pengukuran
dilakukan setiap 30 menit selama enam jam. Pemberian bahan uji menggunakan rute oral karena rute yang dipilih disesuaikan dengan rute yang digunakan pada manusia.
2. Uji In Silico
a. Pengunduhan Aplikasi Autodock Vina dan Aplikasi Pendukung
Aplikasi Autodock Vina merupakan aplikasi molecular docking
yang bersifat multiplatform yang bisa didapatkan secara gratis. Untuk
melakukan kegiatan molecular docking dengan Autodock Vina,
diperlukan beberapa aplikasi seperti DS Visualizer untuk preparasi
reseptor target dan ligan yang akan diuji, dapat juga digunakan untuk visualisasi hasil molecular docking, AutodockTools untuk mengolah
reseptor target dan ligan uji agar dapat dieksekusi oleh aplikasi
dengan menggunakan bahasa pemrograman Python, YASARA untuk
preparasi reseptor target dan ligan uji, namun pada kegiatan ini digunakan untuk mengukur nilai RMSD, dan Open Babel yang
digunakan untuk mengkonversi hasil docking dari format PDBQT menjadi PDB sehingga dapat divisualisasi dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer.
b. Pengunduhan Reseptor Target
Reseptor uji yang dibutuhkan untuk melakukan molecular
docking yang dapat diunduh secara gratis pada website khusus yang
menampung basis data protein-protein www.rcsb.org. Dengan mengunjingunya dari aplikasi browser dan mengetik kode reseptor
atau nama reseptor yang diinginkan pada tombol Search. Kemudian
mengunduh reseptor tersebut dengan PDB Format untuk mendapatkan
reseptor uji dengan format PDB. Senyawa uji dibuat dalam bentuk berkas (file) dengan menggunakan aplikasi MarvinSketch pada sistem
operasi Linux.
c. Preparasi Reseptor Target dan Ligand Uji
Setelah mendapatkan reseptor target dengan format PDB, dapat dilakukan preparasi protein dengan menggunakan aplikasi DS
Visualizer dan menghapus semua ligan yang ada pada reseptor tersebut,
reseptor dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer, kemudian
menghapus residu protein dan menyisakan bagian ligan serta disimpan dengan nama ligand.pdb.
d. Konversi File Reseptor dan Ligand dalam Bentuk PDBQT
Untuk menjalankan fungsi aplikasi Autodock Vina, file reseptor
target dan ligan uji harus dikonversi terlebih dahulu dengan menggunakan aplikasi MGLTools atau nama lainnya yaitu Autodock
Tools, kemudian pilih file reseptor yang sudah dipreparasi. Setelah itu
tambahkan atom Hydrogen pada reseptor uji, kemudian simpan reseptor uji dalam bentuk PDBQT. Kemudian atur grid (bagian residu yang mana saja yang ingin dijadikan sasaran ligan untuk berinteraksi). Setelah itu konversi file ligan ke dalam bentuk PDBQT, dan disimpan dengan format ligand.pdbqt.
e. Molecular Docking denganAutodock Vina
Sebelum menjalankan fungsi docking, pastikan file reseptor.pdbqt
dan ligand.pdbqt berada pada folder yang sama, yaitu pada Drive C: >Vina. Kemudian buat file text baru dan diberi nama conf.txt. Pada file
conf.txt tersebut, mengisi form yang sesuai dan disimpan pada folder yang sama. Selanjutnya membuka Command Prompt Windows dan
masukan kode kemudian tunggu sampai prosesnya selesai. Setelah selesai, untuk memudahkan visualisasi, file output.pdbqt dibuat terpisah
beberapa file konformasi hasil docking, sehingga lebih mudah untuk
dianalisis dan divisualisasi. f. Visualisasi Hasil Docking
Hasil dari molecular docking dapat divisualisasikan untuk analisis
lebih lanjut dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer. Sebelum
visualisasi file hasil docking dengan format PDBQT dikonversikan
menjadi file PDB dengan menggunakan aplikasi Open Babel, tujuannya
agar file hasil docking dapat terbaca oleh aplikasi DS Visualizer.
g. Validasi Molecular Docking
Validasi molecular docking bertujuan untuk menentukan apakah
protein yang digunakan untuk molecular docking-nya dapat digunakan
atau tidak. Validasi molecular docking ini dilakukan dengan cara
G. Skema Langkah Kerja
25 ekor tikus putih jantan galur Wistar, umur 2-3 minggu, berat badan 100-150 gram
Kelompok
Pengukuran volume udema kaki dari menit ke-0 dilakukan setiap 30 menit selama enam jam.
Hitung
H. Analisis Hasil
Data yang diperoleh dari uji efek antiinflamasi adalah data volume kaki tikus yang diberi perlakuan.Volume udem merupakan selisih dari volume kaki sebelum dan sesudah diradangkan dengan karagenin 1%. Perhitungan dapat dilakukan dengan rumus:
Vu = Vt - Vo
Keterangan:
Vu : Volume udem kaki tikus tiap waktu t
Vt : Volume kaki tikus setelah diradangkan dengan karagenin 1% pada waktu tertentu
Vo : Volume awal kaki tikus sebelum diradangkan dengan karagenin 1%.
Uji In Silico
Instalasi Operasi Linux Aplikasi Pendukung
Senyawa Marker
Protein Target
Molecular
Docking Analisis Data
AutoDockTools
Open Babel MarvinSketch DS Visualizer
Nilai AUC (Area Under the Curve) yaitu luas daerah rata-rata di bawah
kurva yang merupakan hubungan volume udem rata-rata tiap satuan waktu dengan rumus:
AUC = Vtn−1+ Vtn
�
(t
n−
t
n−1)
Keterangan :
AUC : Area Under Curve (Luas di bawah kurva)
Vtn-1 : volume udem rata-rata pada waktu tn-1 (setengah jam
sebelumnya)
Vtn : volume udem rata-rata pada waktu ke-tn
tn : waktu
tn-1 : waktu, saat setengah jam sebelum
Hasil perhitungan AUC digunakan untuk mengetahui prosentase Daya Anti Inflamasi (%DAI). Prosentase Daya Anti Inflamasi (%DAI) dihitung dengan membandingkan AUC0-6 perlakuan terhadap kontrol, dengan rumus
sebagai berikut :
%DAI = ����−����
���� � 100%
Keterangan :
%DAI : Prosentase Daya Anti Inflamasi AUCk : Area Under Curve kelompok kontrol
AUCp : Area Under Curve kelompok perlakuan
Kolmogorov-Smirnov. Jika hasil analisis terbukti terdistribusi normal dan varian telah homogen maka analisis dilanjutkan dengan one way ANNOVA.
Apabila ada perbedaan yang bermakna antara kelompok satu dengan kelompok yang lain maka analisis dilanjutkan dengan menggunakan uji Tukey HSD, taraf kepercayaan 95%.
Pada output uji Tukey HSD akan diperoleh dua macam output yaitu
output descriptive statistic dan homogeneous subsets. Analisis dilakukan
menggunakan homogenous subsets. Perbedaan dari keduanya adalah
descriptive statistic digunakan untuk menguji kelompok mana saja yang
berbeda secara nyata, sedangkan homogenous subsets akan mencari
grup/subsets yang mempunyai perbedaan rata-rata yang tidak berbeda secara signifikan. Subsets yang nilai perbedaan rata-ratanya tidak berbeda secara signifikan pada p<0,05 akan berada dalam satu kolom/subsets dan juga sebaliknya. Jika tidak homogen dan tidak terdistribusi normal, maka analisis dilanjutkan dengan analisis non-parametrik.
Hasil uji molecular docking menggunakan aplikasi AutoDockTools 4.2
diperoleh data file dengan format *pdb. File dengan format *pdb dibuka
Uji molecular docking ini dilakukan pada senyawa marker dari isolat
alkaloid lada (Piper nigrum L.) sebagai antiinflamasi. Analisis dilakukan
dengan membandingkan energi ikatan (binding energy) dari konformasi
terbaik masing-masing senyawa marker isolat alkaloid lada dengan senyawa
pembanding yaitu natrium diklofenak dan ref ligand/ ligan referensi. Untuk
validasi hasil docking digunakan aplikasi AutoDock Vina. Hasil docking
42 1. Identifikasi Tanaman dan Preparasi Ekstrak
Identifikasi tanaman secara determinasi tidak dilakukan, tetapi menggunakan identifikasi secara kimia. Serbuk lada diambil dari Herbal Anugrah Alam, Mayungan RT 04, Potorono, Banguntapan, Bantul, Yogyakarta. Lada tersebut dibuat menjadi serbuk dengan tujuan untuk meningkatkan luas permukaan bahan baku. Dari serbuk lada yang didapat tersebut kemudian diekstraksi menggunakan metode sokletasi. Sokletasi serbuk lada menggunakan penyari etilasetat dengan perbandingan 1: 3, yaitu serbuk lada 100 mg dengan pelarut etilasetat 300 ml.
Perbandingan jumlah bahan dengan pelarut berpengaruh terhadap efisiensi ekstraksi. Jumlah pelarut yang berlebihan tidak akan mengekstrak lebih banyak, namun dalam jumlah perbandingan tersebut pelarut dapat bekerja optimal dengan cara menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam etilasetat di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di luar sel serta mendapatkan zat aktif yang lebih banyak dan murni.
aktif yang dikatalisis oleh cahaya matahari. Kristal yang terbentuk, kemudian dicuci dengan menggunakan etanol 96% secukupnya hingga diperoleh kristal berwarna kuning. Pada suhu kamar, senyawa piperin dalam bentuk kristalnya yang memang bersifat polar akan dapat melarut dalam etanol 96% yang juga bersifat polar. Ketika ditambahkan etanol sebagai pelarut, maka piperin yang ada akan melarut dalam filtratnya, sedangkan zat pengotor seperti piperin yang bersifat nonpolar atau kurang polar tidak larut dalam etanol akan tertinggal di dalam residunya.
Dari hasil sokletasi serbuk simplisia lada tersebut diperoleh kristal piperin seberat 2 gram yang berwarna kuning dan berbau khas. Identifikasi piperin dengan KLT menggunakan fase diam yaitu silika gel 60 F254 dan
Visibel UV 254 nm Dragendorf Gambar 1. Hasil Identifikasi KLT Keterangan:
Fase diam: Silika Gel 60 F254 ; Fase gerak: etilasetat : n-heksan (1:4);
P: Pembanding Quinine ; S : Isolat Alkaloid Lada Rf Quinin= 0,50 ; Rf Isolat Alkaloid Lada = 0,47
Identifikasi alkaloid dilakukan dengan pembanding quinine karena
senyawa ini merupakan senyawa golongan alkaloid. Sampel positif mengandung alkaloid jika bercak berwarna jingga sampai merah coklat pada pengamatan sinar tampak. Pengamatan pada UV254 menghasilkan bercak berwarna biru dan meredam (Robinson, 1995).
Identifikasi senyawa alkaloid dapat dilakukan dengan metoda fisika, dengan cara penyinaran kromatogram di bawah sinar ultraviolet 254 nm. Beberapa alkaloid memberikan warna fluoresensi biru atau kuning di bawah sinar tersebut, serta metoda kimia dengan menggunakan pereaksi tertentu, seperti pereaksi Dragendorf membentuk endapan jingga-merah
(Wagner, 1984; Kyle, et al., 2006). Berdasarkan hasil uji identifikasi
S
piperin menggunakan metode KLT dapat dilihat pada sinar UV dan setelah penyemprotan pereaksi Dragendorf pada ekstrak lada diduga mengandung
piperin.
2. Pengaruh Pemberian Isolat Alkaloid Lada (Piper nigrum L.)
Penelitian ini menggunakan tikus putih jantan galur Wistar, umur 2-3 minggu, berat badan ± 100-150 gram sebanyak 25 ekor dibagi secara acak menjadi lima kelompok perlakuan masing-masing 5 ekor, yakni sebagai berikut : Kelompok I (kontrol negatif), II (pembanding), dan kelompok III, IV, dan V merupakan kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak secara oral. Volume normal kaki tikus diukur dengan alat plethismometer dan dinyatakan sebagai volume dasar untuk setiap
tikus (Vo). Setelah 30 menit pemberian variasi dosis dan pembanding,
hewan percobaan diinjeksi dengan 0,1 ml suspensi karagenin 1% secara subplantar pada tiap telapak kaki kanan tikus. Kaki tikus yang telah diinduksi karagenin setiap 30 menit setelah penyuntikan sampai dengan 6 jam, diukur dengan cara dicelupkan kedalam air pada alat plethismometer (Vt), pertambahan volume kaki untuk setiap pengukuran tersebut didata
Tabel. 1 Rata-rata volume udem telapak kaki tikus masing-masing kelompok perlakuan
I = kelompok kontrol negatif air suling 2 mL/100 g BB dengan volume udem maksimal 0,216 ml di menit ke 240;
II = kelompok pembanding Na diklofenak 13,5 mg/Kg BB dengan volume udem maksimal 0,104 ml di menit ke 180;
III = kelompok isolat alkaloid lada 5 mg/Kg BB dengan volume udem maksimal 0,168 ml di menit ke 180;
IV = kelompok isolat alkaloid lada 10 mg/Kg BB dengan volume udem maksimal 0,166 ml di menit ke 180;
V = kelompok isolat alkaloid lada 15 mg/Kg BB dengan volume udem maksimal 0,124 ml di menit ke 180.
Pada kelompok kontrol, injeksi karagenin menghasilkan edema lokal, yang meningkat pada menit ke-30 dan terus meningkat sampai menit ke-240. Karagenin tersebut menginduksi cedera sel sehingga sel yang cedera akan melepaskan mediator yang mengawali proses inflamasi. Setelah pelepasan mediator tersebut, terjadi edema yang mampu bertahan selama 6 jam dan perlahan berkurang dalam waktu 24 jam setelah injeksi. Setelah injeksi karagenin, terjadi respon menyebabkan edema yang terbagi dalam dua fase. Fase awal berhubungan dengan pelepasan histamin dan serotonin. Antara fase I dan II, edema dipertahankan oleh kinin. Fase kedua berhubungan dengan pelepasan prostaglandin (PG) dan Slow
karagenin subplantar tersebut akan meningkatkan kadar COX-2 (Hidayati,
etal., 2008).
Pada kelompok pembanding, volume udem meningkat sampai menit ke-180. Volume udem kelompok perlakuan dengan kontrol positif (pembanding) lebih kecil dibandingkan dengan kontrol negatif karena AINS seperti Na-diklofenak dapat menekan respon pada fase akhir, yang juga disebut fase PG, karena kemampuan menekan migrasi leukosit mononuklear kejaringan radang (Hidayati, et al., 2008).
Gambar 2. Grafik Volume Udem Setiap Kelompok Uji
Efek antiinflamasi pembanding Na diklofenak 13,5 mg/Kg BB mempunyai kurva paling rendah dibandingkan kontrol negatif, isolat alkaloid lada dosis 5, 10 dan 15 mg/Kg BB, yang berarti kemampuannya dalam menghambat udem lebih baik dari keempat perlakuan (Gambar 13). Dari volume udem yang terbentuk kemudian dicari nilai AUC (Area
Under Curve), tiap kelompok untuk memperoleh persentase daya
antiinflamasi seperti tertera pada Tabel 2 berikut ini :
0.000
Tabel 2. Rata-rata Nilai AUC total, serta % Daya Anti Inflamasi Tiap Kelompok
Kelompok Harga AUC Total (ml/jam) (x + SE) % Daya Anti Inflamasi Kontrol negatif air suling 2 mL/100 g BB 71.400 ± 4.67
Pembanding Na diklofenak 13,5 mg/Kg BB 29.430 ± 2.94* 58.78% Isolat alkaloid lada 5 mg/Kg BB 45.87 ± 1.77* 35.76% Isolat alkaloid lada 10 mg/Kg BB 42.90 ± 1.09* 39.92% Isolat alkaloid lada 15 mg/Kg BB 35.28 ± 1.72* 50.59% Keterangan : * berbeda signifikan (p<0,05)
Harga AUC (Area Under the Curve), yaitu luas daerah di bawah
kurva antara rata-rata volume udem terhadap waktu, dianalisis statistik menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov dan diperoleh hasil data terdistribusi normal, pada Levene test didapatkan data homogen lalu
3. Molecular Docking dengan Aplikasi AutoDock
Penambatan molekul (molecular docking) merupakan penelitian dengan
metode komputasi untuk mendeteksi interaksi suatu ligan dengan suatu reseptor. Hasil dari penambatan molekul ini adalah berupa skor penambatan dan hasil visualisasi secara virtual 3D. Skor penambatan yang baik adalah
skor yang nilainya lebih kecil, karena menggambarkan senyawa yang diuji secara penambatan molekul tersebut akan melekat dengan sangat baik dengan reseptornya dan tidak membutuhkan banyak energi untuk berikatan. Setelah didapatkan skor penambatan yang baik, dilakukan visualisasi dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer.
a. Proses Pemilihan Protein Target
Sebelum dilakukan uji penambatan molekul pada senyawa isolat alkaloid piperine, protein diunduh terlebih dahulu pada situs
www.rcsb.org. Protein yang digunakan berupa berkas (file) dalam format
“.pdb”. Pada penelitian ini protein yang diunduh adalah protein
siklooksigenase dengan kode protein 3PGH. Enzim COX-2 memiliki kode PDB yaitu 6COX, 4COX, dan 3PGH. Kode protein 3PGH menghasilkan nilai RMSD paling baik diantara kode protein lainnya (Agistia, et al.,
