VERIFIKASI UJI CEPAT KOMERSIAL
Escherichia coli
PADA
CONTOH RUTIN LABORATORIUM KARANTINA HEWAN
TANJUNG PRIOK
YASMINE QURROTA AYUNINA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Verifikasi Uji Cepat KomersialEscherichia coli pada Contoh Rutin Laboratorium Karantina Hewan Tanjung Priok adalah benar karya saya denganarahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
RINGKASAN
YASMINE QURROTA AYUNINA. Verifikasi Uji Cepat KomersialEscherichia coli pada Contoh Rutin Laboratorium Karantina Hewan Tanjung Priok.Dibimbing oleh TRIOSO PURNAWARMAN dan SURACHMI SETIYANINGSIH.
Laboratorium Karantina Hewan Tanjung Priok memerlukan alat diagnostik yang cepat, akurat dan dapat diandalkan untuk meningkatkan layanan laboratorium dan mempertahankan jaminan kualitas hasil pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk menilai kinerja uji cepat komersial dibandingkan dengan uji konvensional melalui proses verifikasi.
Penelitian ini menggunakan daging sapi beku dan daging ayam beku dari contoh rutin laboratorium(kelompok alami) dan kelompok inokulasi bakteri. Kelompok inokulasi bakteri dibagi menjadi kelompok bakteri rendah, kelompok bakteri sedang, kelompok bakteri tinggi dan kelompok kontrol.Keseluruhan contohakan diuji E. coli dengan metode isolasi dan identifikasi konvensional dan metode uji cepat komersialdengansembilan kali ulangan. Hasil uji E. coli dari kedua metode dihitung dengan beberapa kriteria unjuk kerja yaitu; akurasi (persentase rekoveri dan rekoveri relatif), presisi (standar deviasi relatif), sensitivitas, spesifisitas, negatif palsu, dan positif palsu.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa uji cepat komersial memiliki akurasi yang baik, terutama pada kelompok bakteri rendah dengan rekoveri danrekoveri relatif sebesar 86.64% dan86.47%. Hasil perhitungan rata-rata standar deviasi relatif sebesar 0.075 menunjukkan presisi yang baik. Sensitivitas, spesifisitas, negatif palsu dan positif palsu adalah 93.06%, 100%, 6.94% dan 0% menunjukkan uji cepat komersial memiliki kinerja yang setara dengan metode standar. Uji cepat komersial ini dapat dipertimbangkan untuk diterapkan secara rutin di laboratorium Karantina Hewan Tanjung Priok setelah diuji coba dengan menggunakan berbagai macam contoh rutin yang lebih banyak dan bervariasi.
SUMMARY
YASMINE QURROTA AYUNINA.Verification Escherichia coli Commercial Test Kit on Tanjung Priok Animal Quarantine Laboratory Routine Sample.
Supervised by TRIOSO PURNAWARMAN and SURACHMI
SETIYANINGSIH.
Tanjung Priok Animal Quarantine Laboratory need fast diagnostic tools that accurate and reliable to increase its services and quality assurance. This study was aimed to assess the performance of a commercial rapid test compared to the standard test through verification process.
This study used frozen beef and frozen chicken meat from laboratory routine field samplesand inoculated sample. Inoculated samples containing low bacteria levels group, medium bacteria level group, high bacteria level group and control group.Whole samples test was subjected to comercial rapid test method and conventional cultured method innine replicates. E. coli test result from both methods will calculated as accuracy (recoverypercentage and relative recovery), precision (relative standard deviation), sensitivity, specificity, false negative, and false positive.
The study showed that commercial kit test had good accuracy, especially at low bacteria level samples group with86.64%recoveryand 86.47% relative recovery. This comercial rapid test had good precision with 0.075relative standard deviations. Sensitivity, specificity, false negatives, and false positives scoreswere 93.06%, 100%, 6.94% and 0% indicates comparable performance with conventional cultured method. Aplication of this commercial rapid test for routine testing in Tanjung Priok Animal Quarantine Laboratory could be considered after testing trial involving bigger sample size and sample variation.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
VERIFIKASI UJI CEPAT KOMERSIAL
Escherichia coli
PADA
CONTOH RUTIN LABORATORIUM KARANTINA HEWAN
TANJUNG PRIOK
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga Tesis yang berjudul “Verifikasi Uji Cepat Komersial
Escherichia coli pada Contoh Rutin Laboratorium Karantina Hewan Tanjung
Priok” berhasil diselesaikan. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat
menyelesaikan studi di program studi Magister Sains Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilakukan selama empat bulan secara umum bertujuan untuk mengetahui unjuk kerja dan tingkat kesesuaian uji cepat komersial.
Terima kasih serta penghargaan setinggi-tingginya penulis ucapkan kepada : Bapak Dr Drh Trioso Purnawarman, MSi dan Ibu DrhSurachmi Setiyaningsih, PhD selaku pembimbing yang senantiasa memberi dorongan semangat dan mengorbankan waktu dalam memberi bimbingan bagi penulis sampai selesainya tesis ini.Ibu Prof Dr med vet Drh Hj Mirnawati B. Sudarwantoselaku penguji luar komisi yang telah meluangkan waktunya untuk menelaah tesis ini.Bapak Dr med vet Drh Denny Widaya Lukman, MSi sebagai ketua Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner yang telah banyak meluangkan waktu untuk membimbing, memberi arahan serta nasehat agar kami menjadi sebuah team work yang kuat, tangguh dan santun.
Terimakasih kepada seluruh staf pengajar Kesehatan Masyarakat Veteriner yang telah membimbing dan memberikan semangat penulis. Teman-teman analis di Laboratorium BBKP Tanjung Priok yang telah banyak membantu penulis sampai selesainya tesis ini.Kepala bidang Karantina Hewan BBKP Tanjung Priok (DrhSriyanto, PhD) yang memberikan ijin dalam tugas belajar, membantu dalam penelitian dan memberikan semangat.
Terimakasih yang tiada terkira kepada kedua orang tua penulis(Papa dan Mama) dan adik-adiku tercinta yang selalu memberikan dukungan dan doanya. Suami tercinta (Dawud Kuncoro Sakti) dan Putriku Ayunindya terimakasih atas kesabaran, dukungan serta doa kalian.
Teman-teman KMV angkatan 2013, terimakasih atas kebersamaan, semangat, dan kebahagiaan yang kita alami bersama. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penelitian ini.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih mempunyai keterbatasan.Kritik dan saran penulis harapkan dari semua pihak untuk perbaikan, dan semoga tesis ini dapat berguna.
DAFTAR ISI
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
Hipotesis 2
2 TINJAUAN PUSTAKA 3
Escherichia coli sebagai Penyakit yang Menyebar Melalui Makanan 3
Perkembangan Metode Uji Cepat Mikrobiologi 3
Validasi Metode Uji 4
Parameter Unjuk Kerja Verifikasi 5
3 MATERI DAN METODE 6
Waktu dan Tempat Penelitian 6
Alat dan Bahan Penelitian 6
Metode 7
Metode Inokulasi Bakteri Kultur Murni ... 7
Persiapan Contoh ... 7
PengujianEscherichia coli Metode Konvensional ... 8
Pengujian Escherichia coli Metode Uji Cepat Komersial ... 8
Analisis Data 9
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 9
Akurasi 9
Presisi 10
Studi Komparatif Uji Cepat dengan Uji Konvensional 11 Sentifitas, Spesifisitas serta Tingkat Positif dan Negatif Palsu 13
Kelebihan Metode Uji Cepat 14
SIMPULAN DAN SARAN 15
Simpulan 15
Saran 15
DAFTAR TABEL
1 Matriks rancangan jumlah dan jenis contoh yang
menggunakan metode uji cepat dan konvensional 8 2 Hasil persentase rekoveri dan rekoveri relatif 10
3 Hasil perhitungan standar deviasi relatif 11
4 Hasil uji komparatif uji cepat komersial dengan uji konvensional
12 5 Proporsi sampel yang diklasifikasi-silangkan 13 6 Perbandingan antara metode konvensional dan uji cepat dalam hal
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Menghadapi era perdagangan pasar bebas serta keikutsertaan Indonesia dalam perjanjian sanitary and phytosanitary (SPS) dan technical barrier to trade (TBT) maka sangat diperlukan laboratorium uji yang diakui secara internasional. Laboratorium uji mendapat pengakuan secara internasional jika menerapkan suatu standar yang ditetapkan oleh Organisasi Standar Internasional (International Organization for Standardization). Standar ISO 17025:2005 merupakan salah satu standar yang dikeluarkan organisasi ini mengenai kompetensi sebuah laboratorium uji.
Keuntungan penerapan standar ISO 17025:2005 yaitu pengakuan internasional terhadap hasil uji melalui perjanjian saling pengakuan antar badan standardisasi di berbagai negara. Laboratorium Karantina HewanBalai Besar Karantina Pertanian (BBKP) Tanjung Priok merupakan salah satu laboratorium karantina yang telah memperoleh akreditasi dari Komite Akreditasi Nasional (KAN) terhadap pelaksanaan SNI ISO 17025:2008.
Standar SNI ISO 17025:2008 merupakan perpaduan antara persyaratan manajemen dan persyaratan teknis. Salah satu persyaratan teknis yang harus dilakukan suatu laboratorium terakreditasi yaitu pelaksanaan validasi. Validasi dilakukan baik terhadap kemampuan personel, kemampuan laboratorium terhadap suatu metode uji, metode pengujian (baik yang konvensional maupun alternatif) dan terhadap peralatan yang digunakan dalam pengujian.
Arus bongkar muat barang di pelabuhan Tanjung Priok yang sangat padat dan dalam rangka pemenuhan janji layanan tiga hari maka karantina membutuhkan metode uji cepat dalam melaksanakan tugasnya. Sepuluh tahun terakhir ini mulai berkembang berbagai metode uji cepat mikrobiologi. Pengertian uji cepatsaat ini tidak hanya sebagai metode yang dapat mendeteksi lebih cepat namun kemudahan dalam proses pengujian beberapa jenis sampel sekaligus (Jasson et al. 2010). Sebagai laboratorium terakreditasi terhadap pelaksanaan ISO 17025maka validasi harus dilakukan sebelum menerapkan perangkat uji cepat atau metode alternatif sebagai uji rutin.
Menurut Feldsine et al.(2002) validasi adalah sebuah proses pembuktian suatu metode baru memilliki unjuk kerja yang sama dengan metode uji konvensional. Terdapat dua jenis validasi yaitu validasi primer dan validasi sekunder. Validasi primer adalah validasi terhadap suatu metode uji yang benar-benar baru atau modifikasi dari metode konvensional. Validasi sekunder atau verifikasi merupakan penerapan suatu metode uji yangtelah diakui pada suatu laboratorium.
2
mempengaruhi performa suatu metode uji.Parameter unjuk kerja yang wajib dibuktikan yaitu akurasi, presisi, sensitifitas, spesifisitas, tingkat positif palsu dan negatif palsu (Jasson et al. 2010; Brodsky 2013).
Bakteri Escherichia coli (E. coli) merupakan salah satu agen yang dapat terbawa oleh komoditas yang melalui pelabuhan Tanjung Priok. Bakteri E. coli selain sebagai bakteri indikator higienitas namun dapat pula bersifat patogen. Terdapat sebuah perangkat uji cepat terhadap E. coli yang perlu dilakukan verifikasi sebelum diterapkan secara rutin menggantikan uji konvensional di laboratorium Karantina Hewan BBKP Tanjung Priok.
Perumusan Masalah
Laboratorium Karantina Hewan Tanjung Priok dalam menaati janji layanan tiga hari membutuhkan teknik dan alat diagnostik yang cepat, akurat dan dapat dipertanggungjawabkan dalam pengujian. Penggunaan uji cepat menjadi suatu hal yang sangat diperlukan. Laboratorium Karantina Hewan BBKP Tanjung Priok adalah salah satu laboratorium yang telah menerapkan standar SNI ISO 17025:2008, maka sebelum menerapkan sebuah uji cepat sebagai metode uji rutin perlu dilakukan verifikasi.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkajiunjuk kerja uji cepat komersial dibandingkan dengan uji konvensional melalui proses verifikasiuntuk diaplikasikan secara rutin di laboratorium Karantina HewanBBKP Tanjung Priok.
Manfaat Penelitian
Studi verifikasi merupakan salah satu persyaratan teknis dalam SNI ISO 17025:2008, sehingga penelitian ini sebagai pembuktian unjuk kerja dan jaminan mutu hasil pengujian dari laboratorium Karantina Hewan BBKP Tanjung Priok. Penelitian ini dapat menjadi gambaran pelaksanaan verifikasi di laboratorium mikrobiologi lainnya.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama tiga bulan dengan lingkup kegiatan yaitu pemilihan contoh rutin laboratorium dan jenis uji cepat komersial yang dibuktikan unjuk kerja dan tingkat kesesuaiannya.
Hipotesis
3
2
TINJAUAN PUSTAKA
Escherichia coli sebagai Penyakit yang Menyebar Melalui Makanan
Escherichia coli merupakan mikroflora normal dalam saluran cerna hewan dan manusia.Bakteri ini terkenal sebagai bakteri indikator sanitasi.Keberadaan E. colidalam pangan mengindikasikan terdapat tahapan pengolahan yang tercemar oleh feses manusia atau hewan (CDC 2012). Cemaran bakteri ini dapat berasal dari pekerja yang tidak menerapkan higiene personal, dari bahan baku yang tercemar, atau peralatan yang tidak dijaga sanitasinya.
Bakteri ini memiliki banyak strain dan beberapa diantaranya menyebabkan penyakit pada manusia. Strain yang cukup banyak menimbulkan kasus penyakit pada manusia yaitu strain O157:H7 dan strain O121:H19. Bentuk penyakit yang muncul dari infeksiE. coli patogen dibagi menjadi lima tipe yaitu
enterohemorrhagic E. coli (EHEC) atau shigatoxin yang diproduksi oleh E.
coli(STEC), enterotoxigenicE. coli (ETEC), enteropathogenicE. coli(EPEC),
enteroaggregativeE. coli(EAEC), enteroinvasiveE. coli(EIEC) (Todar 2012). Selain strain patogen, hal yang patut diwaspadai dari E. coli yaitu sifat resistensinya terhadap antibiotik. E. coli memiliki kemampuan mentransfer gen yang resisten terhadap antibiotik ke spesies lain termasuk bakteri patogen (Madiggan et al. 2000). E. coli yang resisten terhadap antibiotik merugikan kesehatan manusia melalui keparahan penyakit yang ditimbulkan akibat kegagalan pengobatan dengan antibiotik (Ariyanti et al. 2007).
Perkembangan Metode Uji Cepat Mikrobiologi
Kurun waktu sepuluh tahun terakhir ini mulai tumbuh ketertarikan dalam pengembangan metode uji cepat. Metode uji cepat dapat didefinisikan sebagai metode atau sistem yang dapat menghemat waktu untuk mendapat hasil uji mikrobiologi (Feng 1996)
.
Metode uji cepat juga dapat diartikan kemudahan dalam penanganan beberapa jenis dan jumlah sampel yang banyak. Bermacam-macam jenis uji cepat mikrobiologi dapat dijumpai dipasaran merupakan hasil dari perkembangan dibidang bioteknologi.Saat ini terdapat beberapa metode perhitungan mikrobiologi yang digunakan secara luas diantaranya yaitu metode kultur klasik, penggunaan mesin otomatisasi sebagai metode alternatif, media isolasi kromogenik dan fluorogenik, metode kultur modifikasi, metode perhitungan berdasarkan sifat biokimia (Jasson et al. 2010). Metode kultur klasik merupakan metode konvensional perhitungan koloni bakteri dengan menggunakan media kultur spesifik. Metode ini merupakan gold standard yang dipakai oleh banyak laboratorium terutama badan regulasi.
4
kromogen (menghasilkan reaksi warna) dan fluorogen (reaksi fluoresen) atau kombinasi dari keduanya. Hasil metabolisme dari bakteri target bereaksi dengan enzim yang melepas kromogen/fluorogen. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna pada media.
Metode kultur modifikasi menggunakan prinsip hitungan koloni dan prinsip perhitungan MPN. Metode kultur modifikasi dengan prinsip hitungan koloni menggunakan lapisan plastik tipis mengandung media yang dapat larut dengan air dingin, nutrisi dan indikator berupa kromogenik subtrat (Nero et al. 2008). Metode kultur modifikasi dengan prinsip perhitungan MPN menggunakan indikator kromogen yang ditambahkan dalam media (Kampfer et al. 2008)
Perhitungan bakteri berdasarkan sifat biokimia terbagi menjadi impedansi dan biopendar adenosine triphospate (ATP). Impedansi merupakan metode mendeteksi bakteri melalui produk buangan yang dihasilkan oleh bakteri. Biopendar ATP mendeteksi bakteri melalui keberadaan ATP yang melibatkan reaksi enzim substrat antara luciferin dan luciferase (Chen dan Godwin 2006).
Jenis metode uji cepat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode kultur modifikasi. Uji cepat E. coliini berbentuk lapisan tipis yang mengandung media kultur yang dapat larut dalam air dingin, nutrisi untuk mikroorganisme dan indikator. Indikator yang digunakan yaituSalmon-glucuronic acid (6-chloro-3-indoxyl-β-D-glucuronic acid) yang akan dihidrolisis oleh β-glucuronidase yang dihasilkan E. coli. Enzim β-glucuronidasedihasilkan oleh 98% strain E.
coli(Manafi 1996). Enzim ini bereaksi dengan Salmon glucuronic acid dan
menimbulkan warna ungu kemerahan (Ushiyama dan Iwasaki 2010).Metode ini selain menghemat waktu, menghemat tempat, efisien saat pengujian dengan jumlah contoh yang banyak serta tidak membutuhkan persiapan yang rumit.
Uji cepat dengan metode kultur modifikasi selain yang digunakan dalam penelitian ini terdapat pula beberapa uji cepat komersial lain. Beberapa uji cepat komersial ini memiliki prinsip yang sama yaitu penggunaan indikator fluorogen atau kromogen dalam media kulturnya. Petrifilm E. coli yang dikembangkan oleh perusahaan 3M telah dilakukan validasi dengan menggunakan contoh daging kalkun beku, daging sapi beku, dan ikan masak dengan penyimpanan beku. Hasil validasi menunjukkan bahwa uji cepat ini setara dengan metode MPN, serta memiliki nilai repitabilitas yang sama baik dengan metode MPN (Gangar et al. 1999). Compact dry E. coli yang dikembangkan oleh Nissui telah dibuktikan setara dengan metode konvensional MPN pada tiga jenis contoh daging segar yaitu daging babi segar, daging domba segar dan daging anak sapi segar. Penelitian ini mendapatkan hasil akurasi yang baik dengan nilai faktor korelasi sebesar 0.93 (Kodaka et al. 2006).
Validasi Metode Uji
5 Penerapan suatu metode baru harus melalui serangkaian uji dan dibuktikan dengan analisis statistik bahwa metode baru tersebut memiliki performa atau kemampuan sebaik metode yang dijadikan standar. Definisi validasi menurut ISO (2003) yaitu proses suatu pembuktian suatu metode uji baru yang telah memenuhi beberapa parameter unjuk kerja untuk dapat menyamai hasil atau unjuk kerja metode uji standar.
Terdapat dua metode validasi yaitu validasi primer dan verifikasi.Validasi primer adalah validasi terhadap suatu metode uji yang benar-benar baru atau modifikasi dari metode standar/konvensional.Validasi primer dilakukan oleh badan peneliti independen yang diakui secara internasional.Salah satu badan peneliti independen yaitu Association of Analytical Communities(AOAC). Selain sebagai badan peneliti AOAC juga berperan sebagai badan selain pemerintah yang bertugas mengembangkan standar atau metode pengujian yang dapat dipertanggung jawabkan.
Verifikasi atau validasi sekunder merupakan proses pembuktian ulang melalui studi laboratorium, bahwa metode baru ini memiliki unjuk kerja yang sesuai dengan spesifikasinya, dengan metode standar yang berlaku, sertasesuai dengan kondisi yang tersedia dalam suatu laboratorium (Brodsky 2005). Menurut Sartory (2005) proses verifikasi lebih sederhana dibandingkan validasi, karena verifikasi dilakukan untuk membuktikan beberapa parameter unjuk kerja saja sesuai kebutuhan laboratorium.
Parameter Unjuk Kerja Verifikasi
Metode baru dapat dikatakan memiliki kesesuaian dengan metodekonvensionaljika dapat memenuhi parameter unjuk kerja yang sesuai dengan metode konvensional.Parameter unjuk kerja dalam verifikasi yaitu akurasi, presisi, sensitifitas, spesifisitas, tingkat positif palsu, dan negatif palsu (Jasson et al. 2010; Brodsky 2013).
Akurasi atau ketepatan adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur jumlah mikroorganisme sebenarnya yang terdapat pada contoh (SAC 2002). Akurasi dapat pula didefinisikan sebagai tingkat kedekatan hasil uji yang didapat oleh pengerjaan prosedur terhadap nilai sebenarnya. Parameter ini membandingkan jumlah bakteri E. coli yang didapat oleh metode uji cepat dan metode konvensional.
6
Presisi dalam penelitian ini menggunakan pendekatan repitabilitas. Perhitungan repitabilitas dengan merata-ratakan standar deviasi dari pengulangan di setiap tingkat konsentrasi bakteri (Mettler dan Tholen 2014). Parameter ini diukur dengan menghitung relative standard deviation (RSD). Presisi metode uji cepat komersial dikatakan baik jika hasil RSD kurang dari 10% (SAC 2002). Presisi metode pengujian mikrobiologi air minum dapat diterima jika hasil RSD kurang dari 30% (Jacangelo dan Watson 2003).
Sensitifitas adalah proporsi contoh positif E. coli yang teridentifikasi secara tepat oleh uji cepat. Spesifisitas adalah proporsi contoh negatif E. coli yang teridentifikasi secara tepat oleh uji cepat. Positif palsu adalah proporsi contoh yang negatif E. coli yang secara salah dinyatakan positif oleh uji cepat. Negatif palsu adalah proporsi contoh yang positif E. coli yang secara salah dinyatakan negatif oleh uji cepat (Nordval 2009).
3
MATERI DAN METODE
Penelitian ini merupakan percobaan laboratorium yang dirancang dalam rangka memenuhi persyaratan ISO 17025 yaitu verifikasi terhadap uji cepat komersial E. coli. Hasil verifikasi berupa saran pemakaian suatu metode uji cepat komersialsebagai pengujian rutin E. coli.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Agustus sampai Oktober 2014. Penelitian dilakukan di laboratorium Karantina Hewan BBKP Tanjung Priok.
Alat dan Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi beku dan daging ayam beku yang merupakan contoh rutin. Penelitian ini menggunakan sebuah uji cepat komersial E. coli, kultur murni E. coli berbentuk kering beku (ATCC 10799), Kultur murni Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Bahan kimia yang dperlukan dalam pengujian E. coli metode konvensional yaitu aquades, phosphat buffer saline (PBS), buffered peptone water (BPW), lauryl
sulfat tryptose broth (LSTB), E. coli broth (ECB), Levine-Eosine methylene blue
agar (L-EMBA), tryptose broth, reagen Kovacs, media methyl red-Voges
Proskauer (MR-VP), α-naftol, KOH 40%, indikator MR, plate count agar (PCA),
Simmons citrate agar (SCA).
7 Metode
Penelitian ini menggunakan daging sapi beku dan daging ayam beku yang merupakan contoh rutin di laboratorium BBKP Tanjung Priok. Daging sapi beku dan daging ayam beku masing-masing dikelompokkan berdasarkan jumlah E.
coliyang diinokulasikan menjadi lima kelompok yaitu „alami, bakteri level tinggi,
bakteri level sedang, bakteri level rendah dan kelompok kontrol‟. Setiap kelompok dilakukan pengulangan sebanyak sembilan kali. Seluruh kelompok dan ulangan diuji E. coli dengan metode konvensional dan metode uji cepat komersial. Pengelompokan contoh berdasarkan jumlah E. coli sangat membantu dalam pengukuran keakuratan suatu metode uji. Jumlah bakteri kultur murni yang diinokulasikan pada kelompok „bakteri level rendah, bakteri level sedang dan bakteri level tinggi‟ sebanyak 10-100, 100-1000 dan 1000-10000 cfu/g (Ushiyama dan Iwasaki 2010).
Metode Inokulasi Bakteri Kultur Murni
Escherichia coli yang digunakan untuk inokulasi merupakan bakteri kultur murni dalam bentuk kering beku. Bentuk padat bakteri ini kemudian dicairkan dengan PBSpH 7.4 sebanyak 3 ml. Larutan stok dibuat dari 1 ml larutan bakteri PBS ditambahkan dengan media cair brain heart infusion. Larutan stok ini diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam, kemudian dapat disimpan dalam suhu 2-4°C selama 1 bulan.
Larutan stokdiencerkan dengan mengambil sebanyak1 ml larutan stok ditambahkan dengan 9 ml BPW (10-1), lanjutkan hingga pengenceran 10-10. Setiap 1 ml pengenceran ditanam dalam PCA kemudian diinkubasikan dalam suhu 35oC selama 24 jam. Berdasarkan penghitungan jumlah bakteri dalam PCA maka pengenceran dengan jumlah bakteri berkisar 10-100, 100-1000 dan 1000-10000 cfu/gakan dipilih untuk diinokulasikan.
Staphylococcus aureus yang digunakan untuk inokulasi merupakan bakteri kultur murni yang dibiakkan dalam nutrien agar (NA) miring. Biakkan bakteri ini kemudian diambil dengan ose dan tumbuhkan kembali dalam media cair brain heart infusion.Biakkan cair ini diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam, kemudian dapat disimpan dalam suhu 2-4 °C selama 1 bulan.
Larutan stok diencerkan dengan mengambil sebanyak 1 ml larutan stok ditambahkan dengan 9 ml BPW (10-1), lanjutkan hingga pengenceran 10-10. Setiap 1 ml pengenceran ditanam dalam PCA kemudian diinkubasikan dalam suhu 35°C selama 24 jam. Berdasarkan penghitungan jumlah bakteri dalam PCA maka dapat diketahui pengenceran yang digunakan untuk diinokulasikan dalam kelompok „kontrol‟ .
Persiapan Contoh
Contoh direbus terlebih dahulu untuk mematikan mikroorganisme yang ada sebelum diinokulasi dengan bakteri kultur murni. Kelompok „alami‟ merupakan kelompok contoh yang langsung diuji tanpa direbus dan tanpa inokulasi bakteri. Hal ini untuk membandingkan kemampuan metode uji cepat komersial dengan metode konvensional dalam mendiagnosa secara tepat E. coli
strain lapang. Kelompok „kontrol‟ merupakan kelompok contoh yang direbus dan
8
Kelompok „bakteri level rendah‟ diinokulasikan E. coli sebanyak 10-100 cfu/g, kelompok „bakteri level sedang‟diinokulasikan E. coli sebanyak 100-1000 cfu/g dan kelompok „bakteri level tinggi‟ diinokulasikan E. coli sebanyak 1000-10000 cfu/g.Matriks rancangan jumlah dan jenis contoh dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Matriks rancangan jumlah dan jenis contoh yang menggunakan metode uji cepat dan konvensional
Kelompok contoh Jenis contoh Uji
cepat Konvensional
Pengujian yang dilakukan untuk menghitung jumlah Escherichia coli dalam bahan pangan dengan mengacu pada BSN (2008a). Pengujian dilakukan dengan uji pendugaan, uji penegasan dengan metode most probable number (MPN) E. coli. Uji MPN menggunakan tabung fermentasi berseri dalam media cairs pesifik dilanjutkan penanaman dalam media padat spesifik dan dilanjutkan dengan uji biokimia. Uji biokimia yang dapat dilakukan untuk mengidentifikasi E. coliyaitu uji indol, uji Voges-Proskauer, uji methyl red dan uji sitrat. Seluruh tahapan uji dapat diakses dalam dokumen SNI 2897:2008.
Pengujian Escherichia coli Metode Uji CepatKomersial Tahapan pengujian menggunakan metode ini, yaitu;
Larutan NaCl 0.9% dibuat sebagai larutan pengencer, lalu diautoklaf 15 menit pada suhu 121 °C.
Sebanyak 10 g daging contoh ditimbang secara aseptik, kemudian dimasukkan dalam plastik steril. Larutan NaCl 0.9% ditambahkan 90 ml dan dihomogenkan dengan stomacher selama 1-2 menit.
Sebanyak 1 ml contoh diinokulasikan ke dalam lembar uji cepat komersialE. coli, hal ini dilakukan sebanyak dua replikat (duplo),lalu diinkubasikan selama 24 jam dalam 35±1 °C.
9 Analisis Data
Perhitungan parameter akurasidapat dilakukan dengan menghitung persentaserekoveridanrekoveri relatif. Persentase rekoveri yaitu derajat kesamaan hasil yang didapat antara metode alternatif dengan jumlah bakteri yang diinokulasikan, sedangkan rekoveri relatif yaitu derajat kedekatan hasil perhitungan bakteri antara metode uji cepat komersialdengan metodekonvensional(SAC 2002; Brodsky 2005).
Perhitungan parameterpresisi dilakukan dengan menghitung standar deviasi relatif (relative standard deviation-RSD)di setiap kelompok bakteri (Mettler dan Tholen 2014). Berikut ini adalah rumus perhitungan simpangan baku relatif (SAC 2002)
Keterangan: a = lembar uji cepat komersial replikat 1 b = lembar uji cepat komersial replikat 2 xi = rata-rata replikat 1 dan 2
p = jumlah contoh
Perhitungan parameter sensitifitas, spesifisitas, tingkat positif palsu dan negatif palsu dilakukan dengan membandingkan hasil positif dan negatif yang diperoleh dengan dua metode uji ini(SAC 2002;Brodsky 2005).
Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan membandingkan jumlah E. coliyang didapat dengan menggunakan metode konvensional dan metode uji cepat. Data jumlah E. colidari contoh dianalisis dengan pairedt student testuntuk membandingkan rata-rata ulangan yang dilakukan oleh dua metode dan membuat asumsi dasar bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara nilai rata-rata dari dua kelompok data (Dahlan 2011).
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Akurasi
Akurasi atau kecermatan adalah ukuran yang menunjukan derajat kedekatan hasil jumlah mikroorganisme yang didapat dengan jumlah mikroorganisme sebenarnya (SAC 2002).Terkadang masalah dalam menentukan akurasi adalah ketidaktahuan terhadap nilai yang sebenarnya, oleh karena itu dilakukan inokulasi bakteri kultur murni pada jumlah yang telah diketahui pada contoh.Jumlah bakteri diketahui menggunakan metode yang diujikan sehinggaakurasi dari metode tersebut dapat diketahui. Terdapat dua pendekatan perhitungan akurasi dalam metode mikrobiologi yaitu dengan persentase rekoveri dan rekoveri relatif(Parshionikar et al. 2009)
10
hasil perhitungan jumlah E. coli antara metode konvensional dengan metode uji cepat komersial. Jenis perhitungan ini dikatakan relatif karena metode konvensional belum tentu menunjukkan jumlah bakteri yang sebenarnya (Parshionikar et al. 2009). Hasil perhitungan persentase rekoveri dan rekoveri relatif dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil persentase rekoveri dan rekoveri relatif
Kelompok contoh Rekoveri (%) Rekoveri relatif (%)
Bakteri level rendah 86.64 86.47
Bakteri level sedang 105.44 110.55
Bakteri level tinggi 96.19 113.31
Berdasarkan Tabel 2 kelompok bakteri level tinggi dan bakteri level rendah memiliki persentase rekoveri atau ketepatan yang mendekati jumlah bakteri yang sebenarnya. Kelompok bakteri level sedang memiliki persentase rekoveri diatas 100%, hal ini dapat disebabkan oleh tingginya jumlah bakteri yang terbaca pada uji cepat komersial dibandingkan dengan jumlah yang diinokulasikan.
Perbandingan relatif antara hasil metode konvensional dan metode uji cepat komersial pada Tabel 2 menunjukkan bahwa bakteri level rendah memiliki hasil yang mendekati hasil dari metode konvensional. Besarnya persentase rekoveri relatif pada kelompok bakteri level sedang dan tinggi menunjukkan bahwa hasil dari metode konvensional lebih kecil dibandingkan hasil yang didapat dengan metode uji cepat komersial.
Presisi
Presisi adalah derajat kesamaan nilai beberapa hasil pengujian yang berulang-ulang. Presisi dibagi menjadi dua bagian yaitu repitabilitas dan reprodusibilitas. Repitabilitas atau keterulangan yaitu kemampuan untuk menghasilkan kesamaan hasil uji dari penggunaan berulang prosedur dalam periode singkat, menggunakan laboratorium, peralatan dan analis yang sama. Reprodusibilitas atau ketertiruan yaitu kemampuan untuk menghasilkan kesamaan hasil uji dari penggunaan berulang prosedur dalam periode singkat, menggunakan laboratorium, peralatan dan analis yang berbeda (SAC 2002). Penelitian ini menggunakan prosedur yang berulang dalam periode singkat serta dilakukan di laboratorium dengan peralatan dan analis yang sama, sehingga presisi yang dihitung dalam penelitian ini adalah repitabilitas.
11 Tabel 3 Hasil perhitungan standar deviasi relatif
Jenis
RSD: relative standard deviation; CV: coefficient of variation
Berdasarkan Tabel 3 diketahui bahwa nilai RSD semakin kecil pada kelompok dengan tingkat jumlah bakteri yang tinggi. Contoh dengan jumlah bakteri yang rendah (daging sapi beku alami, level rendah dan daging ayam beku level rendah) didapatkan nilai presisi diatas 10% namun masih dibawah 30%. Secara keseluruhan metode uji cepat komersial ini memiliki presisi yang baik karena memiliki rata-rata sebesar 0.075.Hasil analisis repitabilitas yang dilakukan Belloti et al.(2003)menunjukkan metode uji cepat komersial memiliki nilai presisi yang lebih baik dibandingkan dengan metode MPN.
Hal yang sama disebutkan dalam penelitian Morita et al. (2003) serta Ushiyama dan Iwasaki (2010) metode uji cepat komersial pada inokulasi bakteri level rendah memiliki nilai RSD yang lebih tinggi dibandingkan inokulasi bakteri level tinggi dan sedang. Hal ini dapat disebabkan olehnilai RSD dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu selisih, rata-rata jumlah E. coliserta keseluruhan jumlah ulangan yang dapat dihitung. Jika terdapat hasil negatif pada salah satu duplikasi maka ulangan tersebut tidak dapat masuk dalam perhitungan dan memperbesar nilai RSD.
Studi Komparatif Uji Cepat dengan Uji Konvensional
12
Tabel 4 Hasil uji komparatif uji cepat komersial dengan uji konvensional Kelompok contoh Metode uji Rata-rata ± standar deviasi
(log cfu/g) p
Alami Konvensional 1.45 ±0.643
0.052 Uji cepat 1.71 ±0.764
Bakteri level rendah Konvensional 1.27 ± 0.406
0.085 Uji cepat 1.10 ±0.243
Bakteri level sedang Konvensional 2.21 ±0.442
0.246 Uji cepat 2.35 ±0.098
Bakteri level tinggi Konvensional 2.98 ±0.145
0.000a Uji cepat 3.37 ±0.023
Kontrol (S.aureus) Konvensional -
-
Uji cepat -
p: nilai probabilitas; anilai p< 0.05 menunjukkan berbeda nyata
Berdasarkan hasil uji t pada Tabel 4 diketahui bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara nilai rata-rata dari dua metode (konvensional dan uji cepat komersial) pada kelompok alami, bakteri level rendah dan bakteri level sedang. Menurut Gangar et al. (1999) secara statistik tidak terdapat perbedaan rata-rata jumlah E. coli antara kedua metode pada jenis contoh daging dalam tiga tingkat inokulasi bakteri (rendah, sedang dan tinggi). Pengujian yang dilakukan oleh Lauer et al. (2007) menunjukkan secara statistik (uji t) tidak terdapat perbedaan rata-rata jumlah E. coli antara metode uji cepat komersial dengan metode konvensional MPN pada daging mentah, daging ham, kalkun dan dada kalkun beku, namun berbeda nyata pada contoh daging babi tanpa tulang, sosis fermentasi, daging ayam, susu mentah, dan susu bayi.
Tabel 4 juga menunjukkan terdapat perbedaan yang signifikan pada kelompok bakteri level tinggi. Rata-rata jumlah E. coli pada kelompok bakteri level tinggi dengan metode uji cepat menunjukkan jumlah yang sesuai dengan kisaran jumlah bakteri yang diinokulasikan pada bakteri level tinggi yaitu 3-4 log cfu/g. Rata-rata jumlah E. coli yang didapat dengan metode konvensional jumlahnya dibawah kisaran bakteri yang diinokulasikan.
Pengujian yang dilakukan oleh Morita et al. (2003) mendapatkan hasil yang hampir sama yaitu terdapat perbedaan yang nyata pada inokulasi bakteri 100-250 cfu/g dan 1000 cfu/g (bakteri level sedang dan tinggi). Penelitian Ushiyama dan Iwasaki (2010) menunjukkan bahwa pada bakteri level tinggi, rata-rata jumlah E. coli dengan metode konvensional secara signifikan lebih rendah dibanding metode uji cepat komersial terutama pada contoh daging sapi beku, daging babi beku dan daging babi segar.
13 mikroorganisme atau berinteraksi dengan media cair, serta gagalnya uji peneguhan dan pelengkap mengidentifikasi organisme karena tabung durham dilingkupi oleh substrat padat dari homogenat contoh sehingga gas tidak mampu terperangkap (Corry et al. 2011). Selain itu waktu pengerjaan yang lebih lama (lima hari) dapat meningkat peluang kesalahan dalam perhitungan.
Metode konvensional maupun uji cepat memberikan hasil negatif pada kelompok kontrol yang diinokulasi dengan bakteri Staphylococcus aureus. Hal ini menunjukkan bahwa metode uji cepat komersial sama halnya dengan metode konvensional tidak bereaksi silang dengan bakteri lain. Hasil penelitian dari Ushiyama dan Iwasaki (2010) mendapatkan bahwa uji cepat komersial ini tidak bereaksi positif dengan bakteri Gram positif seperti S.aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus hirae, serta tidak bereaksi positif pada beberapa bakteri Gram negatif seperti Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens,dan Edwardsiella tarda.
Sentifitas, Spesifisitas serta Tingkat Positif dan Negatif Palsu
Sensitifitas adalah proporsi contoh positif E. coli yang teridentifikasi secara tepat oleh uji cepat. Data yang digunakan untuk menghitung sensitifitas biasanya didapat dari pengujian berulang contoh yang telah diinokulasikan dengan bakteri kultur murni. Spesifisitas adalah kemampuan metode uji cepat komersial dalam membedakan antara organisme target dengan organisme lain. Positif palsu adalah proporsi contoh yang negatif E. coliyang secara salah dinyatakan positif oleh uji cepat. Negatif palsu adalah proporsi contoh yang positif E. coliyang secara salah dinyatakan negatif oleh uji cepat (Parshionikar et al. 2009).
Menurut Thusrfield (2005) selain parameter di atas, nilai kappa juga dapat memperlihatkan keseuaian dua buah metode. Sensitifitas, spesifitas, tingkat positif dan negatif palsu serta nilai kappa dapat dihitung berdasarkan data pada Tabel 5.
Tabel 5 Proporsi contoh yang diklasifikasi-silangkan Metode uji
Hasilnya diketahui bahwa sensitifitas dan spesifitas dari uji cepat komersial E. coli mencapai 93.06% dan 100% dengan tingkat kepercayaan 95%. Berdasarkan Tabel 5 diketahui pula tingkat positif dan negatif palsu yaitu sebesar 0% dan 6.94%. Nilai sentifitas dan spesifisitas tinggi maka akan menurunkan angka negatif palsu dan positif palsu. Nilai sensitifitas dan spesifitas yang tinggi menunjukkan bahwa metode uji cepat komersial E. coli ini memiliki sensitifitas yang tinggi serta sangat spesifik dalam mendiagnosa bakteri E. coli.
14
terhadap metode konvensional ini masuk dalam kategori bagus sekali (Nordval 2009).
Kelebihan Metode Uji Cepat
Metode uji cepat banyak dikembangkan karena laboratoriumbadan regulasi dan industri membutuhkan metode yang memberikan hasil yang cepat, akurat, mudah diaplikasikan, dapat dipercaya, ekonomis, efisien dalam waktu, serta penyimpanannya. Perbandingan antara metode uji cepat dan konvensional dalam pengujian E. colidari sisi ekonomis, kebutuhan peralatan, serta lamanya waktu pengujian dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6 Perbandingan antara metode konvensional dan uji cepat dalam hal biaya, lama pengujian dan jumlah alat yang digunakan
Metode Uji Biaya
(100 sampel)
Waktu pengujian
(max) Jumlah alat Metode
konvensional 15 juta 5-7 hari
210 tabung 35 erlemeyer
Metode uji cepat 3 juta 2 hari 5 buah erlemeyer
Biaya yang dibutuhkan oleh metode konvensional jauh lebih mahal dibandingkan dengan metode uji cepat. Analisis ini dibuat dengan catatan seluruh sampel positif dan membutuhkan uji lanjut, sehingga memakai beberapa macam media. Harga tersebut juga berdasarkan tarif pengujian E. coli yang paling mahal di beberapa tempat pelayanan diagnostik mikrobiologi.
Analisis waktu yang dibutuhkan, menunjukkan metode uji cepat dapat memberikan hasil yang lebih cepat dibandingkan metode konvensional. Metode konvensional mensyaratkan jika pada inkubasi 24 jam hasil pembacaan masih negatif maka harus diperpanjang menjadi 48 jam, selain itu jika hasil positif harus dilanjutkan dengan uji biokimia. Waktu yang dibutuhkan oleh metode uji cepat cukup singkat yaitu hanya dua hari, karena hanya membutuhkan satu hari persiapan dan pengujian serta satu hari untuk inkubasi. Menurut Schönenbrücheret al. (2008) media spesifik yang ditambah enzim substrat florogenik/kromogenik tidak membutuhkan tahap untuk subkultur dan uji biokimia.
Kebutuhan alat dan bahan dapat juga menjadi pertimbangan dalam memilih metode uji. Alat dan bahan yang diperlukan dalam pengujian metode konvensional sangat banyak dan membutuhkan tempat yang cukup besar untuk penyimpanan media serta tempat untuk inkubasi. Metode uji cepat memiliki kelebihan berupa bentuk yang tipis dan kecil sehingga tidak membutuhkan tempat yang besar untuk inkubasi ataupun penyimpanan media.
15 tidak membutuhkan ruang yang banyak saat inkubasi, serta memiliki masa simpan yang lebih lama dibandingkan dengan media kultur agar.
Uji cepat komersial ini selain memiliki kelebihan juga memiliki kelemahan. Penelitian Bottini et al.(2011) membuktikan bahwa uji cepat komersial memiliki sensitifitas uji hingga 100%. Hal ini akan meningkatkan jumlah positif palsu, sehingga untuk meyakinkan hasil yang didapat adalah betul positif E. coli maka perlu dilakukan uji lanjut dengan uji konvensionalnya yaitu uji isolasi dan identifikasi.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Hasil analisis beberapa parameter unjuk kerja seperti akurasi, presisi dan uji t menunjukkan bahwa uji cepat komersial memiliki unjuk kerja analitik yang baik pada contoh uji daging sapi beku dan daging ayam beku. Uji cepat komersial memiliki unjuk kerja yang baik pada contoh daging sapi beku dan daging ayam beku dengansensitifitas sebesar 93.06% dan spesifisitas sebesar 100%.
Saran
Pemakaian uji cepat komersial sebagai alternatif dari metode konvensional sebaiknya selalu disertai dengan verifikasi. Verifikasi dilakukan untuk mengetahui uji cepat ini menunjukkan unjuk kerja sesuai spesifikasinya atau tidak dan kesesuaiannya dengan metode konvensional.
Berdasarkan hasil uji t diketahui uji cepat komersial memiliki kesesuaian dengan uji konvensional sehingga bisa dipertimbangkan penggunaannya dalam pengujian rutin di laboratorium BBKP Tanjung Priok.
Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai salah satu bahan pertimbangan bagi badan karantina dalam penggunaan metode uji cepat E. coli yang sama di seluruh laboratorium karantina. Penggunaan uji cepat komersial dilingkup laboratorium diagnostik karantina sebaiknya diseragamkan agar tidak terjadi perbedaan hasil antara laboratorium karantina satu dengan yang lain. Sebelum diterapkan diseluruh laboratorium karantina sebaiknya uji cepat ini dikaji unjuk kerjadan kesesuiannya dengan berbagai macam contoh yang rutin datang ke laboratorium karantina.
DAFTAR PUSTAKA
16
Puslitbang Peternakan. hlm 207-211; [diunduh 2014 Agustus 10]. Tersedia pada: http://peternakan.litbang.pertanian.go.id/fullteks/lokakarya/pbadan07-29.pdf?secure=1.
Belloti V, Souza JA, Barros MAF , Nero LA, Matos MR, Gusmao VV, Moraes LB. 2003. Evaluation of petrifilm™ EC and HS for total coliforms and Escherichia coli enumeration inwater. BrazJ Microbiol. 34(4):301-304. Bottini G, Losito F, De Ascentis A, Priolisi FR, Mari A, Antonini G. 2011.
Validation of the micro biological survey method for total viable count and E. coli in food sample. American J Food Technol. 6(11):951-962.
Brodsky M. 2005. Verification and validation of methods in an accreditation environment. A microbiological prespective FPAC July 20, 2005. [Internet].[diunduh pada 2014 Mei 19]. Tersedia pada:http://www.flworkshop.com.
Brodsky M. 2013. Methode validation and verification APEC-PTIN project. [Internet].[diunduh pada 2014 Mei 19]. Tersedia pada: http://
http://ifstl.jifsan.umd.edu/files/2014/02/DeAnnBenesh_Verification-Validation.pdf.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008. SNI 17025:2008tentangpersyaratan umum kompetensi laboratorium pengujian dan laboratorium kalibrasi. Jakarta (ID): BSN.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008a. SNI 2897:2008 tentang metode pengujian cemaran mikrobia dalam daging, telur dan susu serta hasil olahannya. Jakarta (ID): BSN.
Budiharta S,Suardana IW. 2007. Buku Ajar Epidemiologi dan Ekonomi Veteriner.Denpasar(ID):Udayana Pr.
[CDC] Centers for Disease Control and Prevention (US). 2012. Escherichia coli General Information. [Internet].[diunduh pada 2014 April 06]. Tersedia pada: http://www.cdc.gov/ecoli/general/index.html.
Chen FC, Godwin SL. 2006. Comparison of ATP rapid bioluminescence assay and standard plate count methods for assessing microbial contamination of consumers refrigerators. J FoodProt. 69:2534-2538.
Dahlan MS. 2011. Statistik untukKedokteran dan Kesehatan. Jakarta(ID): Salemba Medika.
[FDA] Food and Drug Administration (US). 2002. Bacteriological analytical manual chapter4enumeration of Escherichia coli and the coliformbacteria. [Internet]. [diunduh pada 2014 Feb 22]. Tersedia pada: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm0649 48.htm.
Feng P. 1996. Emergence of rapid methods for identifying microbial pathogen in foods. J AOAC Int. 79:809-812.
Feldsine P, Abeyta C, Andrews WH.2002. AOAC international methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis. J AOAC Int. 85(5):1187-1200. Gangar V, Curiale MS, Lindberg K, Gambrel-Lenarz S. 1999. Dry rehydratable
17 Glyn B, Lahiff S, Wernecke M, Barry T, Smith TJ, Meher M. 2006. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int J Dairy Technol. 59:126-139.
Indriani DK. 2010. Perbandingan metode pengujian E. coli secara konvensional dan cepat pada contohuji air [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. [ISO] International Organization for Standardization (CH). 2003. Microbiology of
food and animal feeding stuffs protocol for the validation of alternative methods 16140.[Internet].[diunduh pada 2012 Maret 06]. Tersedia pada: http://www.sinofood.com.
Jacangelo J, Watson M. 2003. Protocol for equipment verification testing for inactivation of microbiological contaminants: requirements for all studies. Di dalam: Malley J, editor. Environmental Technology Verification Protocol. [Internet]. [Waktu dan tempat pertemuan tidak diketahui]. Ann Arbor (US): NSF. hlm 1-33; [diunduh 2014 Agus 10]. Tersedia pada: http://www.epa.gov/etv/pubs/039204epadwctr.pdf.
Jasson V, Jacxsens L, Luning P, Rajkovic A, Uyttendaele M. 2010. Alternative microbial methods: an overview and selection criteria. JFoodMicrobiol. 27:710-730.
Kampfer P, Nienhuser A, Packroff G, Wernicke F, Mehling A, Nixdorf K, Fiedler S, Kolauch C, Esser M. 2008. Molecular identification of coliform bacteria isolated from drinking water reservoir with traditional method and the Colilert-18 system.Int J Hyg Environ Health. 211:374-384.
Kodaka H, Mizuochi S, Teramura H, Nirazuka T. 2006. Comparison of compact dry EC with the most probable number method (AOAC official method 966.24) for enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria in raw meats. J AOACInt.89(1):100-115.
Lauer WF, Martinez FL, Patel A. 2007. Validation of rapid E. colifor enumeration and differentiation of Escherichia coli and other coliformbacteria in selected foods.J AOAC Int.90(5):1284-315.
Manafi M, Kneifel SB. 1991. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics: microbiological reviews.AmericSoc Microbiol. 55(3):335-348.
Manafi M. 1996. Fluorogenic and chromogenic enzyme substrates in culture media and identification tests. Int JFood Microbiol. 31:45-58.
Manafi M. 2000. New development in chromogenic and fluorogenic culture media.IntJ Food Microbiol. 60:205-218.
Mettler D, Tholen D. 2014. Guidelines for estimating uncertainty for microbiological counting methods. American association for laboratory accreditation (AALA).[Internet].[diunduh pada 2014 November 05]. Tersedia pada:http://www.a2la.org/guidance/MU_for_Micro_labs.pdf.
Morita H, Ushiyama M, Aoyama S, Iwasaki M. 2003. Sensitivity and specifity of the sanita–kun aerobic count: internal validation and independent laboratory study. J AOAC Int. 86(2):355-366.
Nero LA,Rodrigues LD,Vicosa GN, Ortolani MBT. 2008. Performances of petrifilmaerobic count plates on enumeration of lactic acid bacteriain fermented milks. J Rapid Method Automat Microbiol.16:132-139.
18
National Veterinary Institute of Norway. [Internet]. [diunduh pada 2014 April
20]. Tersedia pada: http://
http://www.sva.se/upload/Redesign2011/Pdf/Om_SVA/NRL/CRL/workshop20 09/2/Validation%20of%20alternative%20microbiological%20methods.%20As a%20Rosengren.pdf.
Parshionikar S, Hunt ME, Genthner F, Lincoff A, Haugland RA, Cottrill M, Harris S, Pfaller S,Sahnks O, Grimm A, Oshiro RK, Sivaganesan M. 2009. Method validation of U.S. environmental protection agency microbiological methods of analysis. Di dalam: Borchdart M, Di Giovanni G, Chambers Y, Landy R, Asbolt N, Miller C, Sinclair J, Brinkman N, editor. EPA Forum on
Environmental Measurements (FEM) [Internet]. 2009 Okt 7 [Tempat
pertemuan tidak diketahui]. Springfield (US): FEM. hlm 1-107; [diunduh 2014 Agus 10]. Tersedia pada: http://www.epa.gov/fem/pdfs/final_microbiology_ method_guidance110409.pdf .
[SAC] Singapore Accreditation Council (SG). 2002. Method validation of microbiological methods. SAC–SINGLAS 002. [Internet].[diunduh pada 2014 Maret 17]. Tersedia pada: http://www.sac-accreditation.gov.sg.
[SAC] Singapore Accreditation Council (SG). 2010. Requirements for the aplication of ISO 17025. SAC–SINGLAS 002. [Internet].[diunduh pada 2014 Maret 10]. Tersedia pada: http://www.sac-accreditation.gov.sg.
Sartory DP. 2005. Validation, verification, and comparison: adopting new methods in water microbiology. Water SA. 31(3):393-396.
Schönenbrücher V, Mallinson ET, Bülte M. 2008. A comparison of standard cultural methods for detection of foodborne Salmonella species including three new chromogenic plating media. Int J Food Microbiol.123:61-66.
Todar K. 2012. Pathogenic E. coli. Todar‟s online textbook of bacteriology.
[diunduh pada 2014 April 06]. Tersedia pada:
http://www.textbookofbacteriology.net/E. coli_4.html.
Thursfield M. 2005. Veterinary Epidemiology. Ed ke-3.London(GB):Blackwell Scientific.
19
