KOLAGENASE Bacillus licheniformis F11 ASAL PALEMBANG
DAN APLIKASINYA PADA PEMBUATAN
PEPTIDA KOLAGEN BIOAKTIF
ACE BAEHAKI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini, saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul Kolagenase Bacillus licheniformis F11 Asal Palembang dan Aplikasinya pada Pembuatan Peptida Kolagen Bioaktif adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan atau tidak diterbitkan dari penulis lain disebutkan dalam teks dan dicatumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir disertasi ini
Bogor, Juni 2012
Ace Baehaki NRP F261080091
ABSTRACT
ACE BAEHAKI. Collagenase of Bacillus licheniformis F11 from Palembang and Application to Produce Bioactive Collagen Peptide. Under guidance of MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO, SUKARNO, DAHRUL SYAH and SISWA SETYAHADI.
Collagenase is endopeptidase which can cleave helical collagen into small peptide fragments.The objective of the study was to select Bacillus licheniformis F11 which produced the best collagenase, purify collagenase dan characterize the crude and purified collagenase and apply collagenase from Indonesian Bacillus licheniformis in the production of bioactive collagen peptides which act as
antioxidant, inhibitor of ACE (angiotensin I-converting enzyme) and anti cancer. The
Bacillus licheniformis F11.1 and F11.4 were deleted gen from B. licheniformis F11,
respectively. Collagenase from B. licheniformis was selected for application to hydrolyze fish skin collagen to produce collagen peptides. B. licheniformis 11.1 produced higher protease activity as compared to B. licheniformis F11.4 when grown in LB media. The optimum production time was 15 h for B. licheniiformis F11.1 with protease activity of 0.028 U/ml or 0.909 U/mg protein.For B. licheniformis F11.4 it was between 20-35 hours of fermentation, with enzyme activity of 0.005 U/ml or 0.157 U/mg protein. When collagen was added to the Modified LB media different responses were obtained. The activity of protease from B. licheniformis F11.1 decreased from 0.028 U/ml or 0.909 U/mg protein to 0.005 U/ml or 0.172 U/mg protein while that of B. licheniformis F11.4 increased from 0.005 U/ml or 0.157 U/mg protein to 0.017 U/ml or 0.546 U/mg protein. Based on result from extracellular collagenase production and spesificities towards substrate and finger print substrate, B. licheniformis F11.4 was selected for further study. Enzyme purification was done with ammonium sulphate 50% (w/v) precipitation, followed by DEAE Sephadex A-50 column chromatography. Precipitation with ammonium sulphate resulted in 5-fold purification with a yield of 10.1%. After purification with DEAE Sephadex A-50 column, the enzyme was purified 26.3-fold with a yield of 2.6%. The relative molecular weight was estimated to be 124 and 26 kDa. The optimum activity of both crude and purified collagenase (without and with Ca2+) were observed at 500C. The crude enzyme had pH optimum at 9.0, while the purified enzyme at 7.0. The crude collagenase activity was inhibited by FeCl2(1mM) and CoCl2(1 mM) while CuCl2increased its activity. The purified collagenase activity was inhibited by CuCl2(1 mM), FeCl2(1 mM), MgCl2(1 mM) and CoCl2(1 mM). However, CaCl2 (10 mM), ZnCl2(5 and 10 mM) and CuCl2 (5 and 10 mM) increased its activity. The radical scavenging activity (as measured by DPPH) of the collagen peptide hydrolysed with purified collagenase was higher (30.28%) than that of these hydrolysed with crude collagenase (23.50%). However, ferric ion reduction activity of the collagen peptide hydrolysed with crude collagenase (2.12) was higher than that of the collagen peptide hydrolysed with purified collagenase (0.78) and these were also higher than the 2.0 mM BHT antioxidant used as control. The ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) inhibitor activity of the collagen peptide hydrolysed with crude was higher (83%) as compared to that hydrolysed with purified collagenase (74%). The antiproliferation activity towards HeLa cervix cancer cells of the collagen peptide hydrolysed with purified collagenase (39.2%) was higher than that of the collagen peptide hydrolysed with crude (23.5%).The antiproliferation activity towards HCT-116 colon cancer cells of the collagen peptide hydrolysed with crude and purified collagenase were similar, with antiproliferation activity at 88.1% at concentration of 1,000 ppm.
Keywords: collagen, collagenase, Bacillus licheniformis F11.4, antioxidant, ACE inhibitor, cancer antiproliferation
RINGKASAN
ACE BAEHAKI. Kolagenase Bacillus licheniformis F11 Asal Palembang dan Aplikasinya pada Pembuatan Peptida Kolagen Bioaktif. Di bawah bimbingan MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO, SUKARNO, DAHRUL SYAH dan SISWA SETYAHADI.
Kolagenase adalah endopeptidase yang dapat memecah kolagen. Kolagen dapat diperoleh dari berbagai sumber yaitu kulit dan tulang sapi, babi, ayam dan ikan. Bacillus licheniformis F11.1 dan F11.4 merupakan hasil mutasi dari Bacillus
licheniformis F11 asal Palembang. Tujuan penelitian ini adalah pemilahan Bacillus licheniformis F11 yang menghasilkan kolagenase tertinggi, memurnikan
dan mengkarakterisasi kolagenase ekstraselular dari B. licheniformis F11 terpilih dan mengaplikasikan enzimnya dalam pembuatan peptida bioaktif. Kedua
Bacillus ditumbuhkan pada media berkolagen untuk produksi kolagenase.
Kolagenase dari Bacillus licheniformis yang terpilih selanjutnya digunakan untuk menghidrolisis kolagen sehingga dihasilkan peptida kolagen. Peptida kolagen diuji aktivitasnya sebagai antioksidan (DPPH dan pereduksi ion ferric), inhibitor ACE (angiotensin I-converting enzyme) dan anti proliferasi sel kanker serviks (HeLa) dan sel kanker kolon (HCT-116) dengan metode MTT.
Tahap pertama penelitian bertujuan untuk memilah mutan yang menghasilkan kolagenase yang tertinggi. Hasil penelitian menunjukkan pada media Luria Bertani (LB), B. licheniformis F11.1 menghasilkan aktivitas protease yang lebih tinggi dibandingkan dengan B. licheniformis F11.4. Aktivitas tertinggi
B.licheniformis F11.1 adalah 0,028 U/ml atau 0,909 U/mg protein pada jam ke 15
dan B.licheniformis F11.4 adalah 0,005 U/ml atau 0,157 U/mg protein pada jam ke 5-40. Produksi pada media LB + kolagen 5% menghasilkan respon yang berbeda, aktivitas protease B. licheniformis F11.1 mengalami penurunan dari 0,028 U/ml atau 0,909 U/mg protein menjadi 0,005 U/ml atau 0,172 U/mg protein pada jam ke 20-35 sedangkan aktivitas protease B. licheniformis F11.4 meningkat dari 0,005 U/ml atau 0,157 U/mg protein menjadi 0,017 U/ml atau 0,456 U/mg protein pada jam ke 10-15. Hasil uji spesifitas substrat menunjukkan ketika diproduksi pada media LB, kedua protease lebih aktif pada substrat kasein dibandingkan dengan tiga protein lain (kolagen, gelatin dan fibrin). Penambahan kolagen pada media (LB + kolagen 5%) dapat menginduksi aktivitas fraksi pemecah kolagen menjadi lebih tinggi pada Bacillus licheniformis F11.4, sedangkan Bacillus licheniformis F11.1 aktivitas terhadap substrat kolagen berkurang. Hasil analisis spesifitas substrat didukung dengan hasil finger print
substrate menggunakan zimogram menunjukkan pada substrat kolagen menghasilkan pita yang lebih banyak dan intensitas pita yang lebih nyata dibandingkan dengan media LB. Berdasarkan hasil dari produksi protease ekstraselularnya, spesifitas terhadap substrat dan analisis finger print berbagai substrat, B.licheniformis F11.4 dipilih sebagai isolat untuk menghasilkan kolagenase untuk penelitian tahap selanjutnya.
Tahap kedua penelitian bertujuan untuk memurnikan dan karakterisasi enzim kolagenase. Tahap pemurnian diawali dengan penambahan 50% amonium sulfat dilanjutkan dengan kromatografi DEAE Sephadex A-50. Pengendapan dengan amonium sulfat menghasilkan tingkat kemurnian sebesar 5 kali dengan
yield kolagenase sebesar 10,1%. Pemurnian dengan kolom DEAE Sephadex A-50 memberikan tingkat kemurnian sampai 26,3 kali dengan yield sebesar 2,6%. Kolagenase murni diperkirakan berukuran 124 dan 26 kD. Enzim crude dan enzim murni (tanpa dan dengan ion Ca2+) memiliki suhu optimum yang sama yaitu 500C. Pengaruh pH terhadap aktivitas kolagenase dianalisis pada kisaran pH 2,0 sampai pH 12,0 dengan menggunakan bufer universal. Enzim crude memiliki pH optimum pada pH 9,0 dan enzim murni (tanpa dan dengan Ca2+) memiliki pH optimum pada pH 7,0. Pada pengujian pengaruh ion logam, ditemukan aktivitas kolagenase crude yang dihambat FeCl2 (1mM) and CoCl2 (1 mM) dengan
persentase penurunan masing-masing sebesar 28% dan 39%, sedangkan CuCl2
meningkatkan aktivitas kolagenase crude sebesar 60%. Aktivitas kolagenase murni dihambat oleh CuCl2(1 mM), FeCl2(1 mM), CoCl2(1 mM) dan MgCl2(1
mM) dengan persentase penurunan masing-masing sebesar 44%, 60%, 94% dan 86% sedangkan CaCl2(10 mM) meningkatkan aktivitas sebesar 109%, ZnCl2 (5
mM) meningkatkan aktivitas sebesar 66% dan ZnCl2 (10 mM) meningkatkan
aktivitas sebesar 72%. Ion logam CuCl2 (5 mM) dapat meningkatkan aktivitas
sebesar 30% dan CuCl2 (10 mM) meningkatkan aktivitas kolagenase murni
sebesar 55%.
Tahap ketiga penelitian bertujuan untuk membuat peptida kolagen dengan menggunakan kolagenase. Hidrolisis kolagen dengan menggunakan kolagenase
crude menunjukkan derajat hidrolisis tertinggi 79,41%. Hidrolisis kolagen dengan
menggunakan kolagenase murni memiliki derajat hidrolisis tertinggi sebesar 52,94%. Hasil aktivitas scavenging radikal DPPH peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (30,28%) lebih tinggi dibandingkan dengan peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase crude (23,5%). Aktivitas pereduksi ion ferric oleh peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase crude (2,12) memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan peptida yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (0,78). Aktivitas penghambatan ACE peptida kolagen yang dibuat menggunakan kolagenase crude (83%) lebih tinggi dibandingkan dengan peptida yang dibuat menggunakan kolagenase murni (74%). Hasil pengujian dengan metode MTT terhadap kemampuan proliferasi sel VERO menunjukkan peptida kolagen pada konsentrasi 100, 500 dan 1000 ppm tidak bersifat toksik terhadap sel VERO. Aktivitas penghambatan terhadap sel kanker serviks HeLa oleh peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (39,2%) sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan peptida yang dihasikan dari hidrolisis kolagenase crude (33,3%). Penghambatan proliferasi sel kanker kolon HCT-116 oleh peptida yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase crude dan murni pada konsentrasi 1000 ppm memiliki penghambatan proliferasi tertinggi dengan aktivitas penghambatan yang sama yaitu sebesar 88,1%.
Kata kunci: kolagen, kolagenase, Bacillus licheniformis F11.4, antioksidan, inhibitor ACE, antiproliferasi sel kanker
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2012 Hak cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencatumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepetingan yang wajar
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
KOLAGENASE Bacillus licheniformis F11 ASAL PALEMBANG
DAN APLIKASINYA PADA PEMBUATAN
PEPTIDA KOLAGEN BIOAKTIF
Oleh:
ACE BAEHAKI
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji pada ujian tertutup: Dr. Ir. Ferri Kusnandar, M.Sc Dr. drh. Diah Iskandriati
Penguji pada ujian terbuka: Dr. Ir. I Made Artika, M.Sc Dr. Ir. Ekowati Chasanah, M.Sc
Judul Disertasi : Kolagenase Bacillus licheniformis F11 asal Palembang dan Aplikasinya pada Pembuatan Peptida Kolagen Bioaktif
Nama Mahasiswa : Ace Baehaki
Nomor Pokok : F261080091
Program Mayor : Ilmu Pangan
Menyetujui, Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono Dr. Ir. Sukarno, M.Sc
Ketua Anggota
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr Anggota
Dr. Ir. Siswa Setyahadi, M.Sc Anggota
Mengetahui, Ketua Program Mayor
Ilmu Pangan
Dr. Ir. Ratih Dewanti Hariyadi, M.Sc.
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
PRAKATA
Puji Syukur dipanjatkan ke hadirat Allah SWT, atas rahmat dan karunia-Nya, karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian yang berjudul ”Kolagenase
Bacillus licheniformis F11 asal Palembang dan Aplikasinya pada Pembuatan
Peptida Kolagen Bioaktif” dilaksanakan dari bulan Pebruari 2010 sampai bulan Oktober 2011. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut Pertanian Bogor dan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang tinggi kepada Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono sebagai ketua komisi pembimbing yang telah mencurahkan waktu dan perhatian selama proses pembuatan proposal, bimbingan dalam penelitian, penulisan disertasi dan artikel ilmiah. Terima kasih atas fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr. Ir. Sukarno, M.Sc atas bimbingan dalam penelitian dan penulisan disertasi. Bapak telah memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc Agr atas bimbingan dalam penelitian dan penulisan disertasi. Bapak telah memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr. Ir. Siswa Setyahadi, M.Sc atas bimbingan dalam penelitian dan penulisan disertasi. Bapak telah berkenan memberikan bakteri Bacillus licehniformis F11.1 dan F11.4 yang merupakan isolat koleksi Laboratorium Teknologi Bioindustri Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT).
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Prof. Dr. Friedhelm Meinhardt dan kolageanya di University of Műster, Jerman yang telah mengkontruksi mutan Bacillus licheniformis F11.1 dan F11.4. Isolat hasil kontruksi beliau yang digunakan dalam penelitian ini.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr. Ir. Endang Prangdimurti, MS sebagai penguji luar komisi dalam ujian kualifikasi Doktor dan Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc dan Dr. drh. Diah Iskandriati dalam ujian tertutup, Dr. Ir. I Made Artika, M.AppSc dan Dr. Ir. Ekowati Chasanah, M.Sc dalam ujian terbuka atas segala masukannya dalam menyempurnakan rancangan penelitian dan penulisan disertasi.
Terima kasih kepeda Rektor Universitas Sriwijaya, Dekan Fakultas Pertanian dan ketua Program Studi Teknologi Hasil Perikanan Universitas Sriwijaya yang telah mengijinkan dan mendukung penulis dalam melanjutkan pendidikan S3 di Program Studi Ilmu Pangan. Terima kasih kepada Ketua Program Studi Ilmu Pangan, Kepala Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi dan Kepala Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata IPB.
Terima kasih kepada DIKTI Depdikbud yang telah memberikan beasiswa BPPS dan dana penelitian Hibah kerjasama luar negeri dan publikasi internasional tahun 2010 dan hibah bersaing tahun 2011-2012. Rekan-rekan dan sahabat seperjuangan di PPSHB-IPB, Program Studi Ilmu Pangan (Mursalin, Rindy Panca T, Nur Wulandari, Mega Safithri, Tuti Suryanti, Nelis Imaningsih, Lula Nadia, Rahmawati, Rijanti Rahayu M, Andi Early Febrinda, Sitti Nurmiah, Emma Rochima dan lain-lain) dan Program Studi lain di lingkungan IPB, terima kasih atas persahabatan, dorongan semangat dan bantuan selama penelitian. Terima kasih kepada Ibu Ika Malikha, S.TP, Ibu Eni Sumartini, mba Mar, mba Pepi, mba Dewi, mba Silmi dan lain-lain yang selalu siap mengulurkan tangan dalam membantu penelitian ini.
Terima kasih kepada isteri None Afriyanti, S.Si dan ketiga anakku Rifqoh Muflihah, M. Syafwan Fikri dan M. Mufid Abdulaziz yang senantiasa memberikan semangat, menyejukan, menguatkan dan sabar mendampingi penulis menjalani studi ini. Terima kasih kepada orang tua (Bapak Solihin dan Ibu Titin) dan Bapak mertua Achtab Said yang senantiasa memberikan dukungan, doa dan dorongan semangat.
Semoga Allah SWT membalas segala kebaikan yang telah diberikan dengan balasan yang lebih sempurna.
Bogor, Juni 2012 Ace Baehaki
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 9 Juni 1976 sebagai anak pertama dari lima bersaudara dari Bapak Solihin dan Ibu Titin. Tahun 2002 penulis menikah dengan None Afriyanti, S.Si dan dikaruniai tiga orang anak, Rifqoh Mufilhah Baehaki (2003), Muhamad Syafwan Fikri Baehaki (2007) dan Muhamad Mufid Abdul Aziz Baehaki (2010),
Sekolah dasar hingga menengah penulis selesaikan di Bogor. Pada tahun 1998 penulis menyelesaikan pendidikan strata satu di Jurusan Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Tahun 2001 penulis melanjutkan pendidikan S2 pada program studi Ilmu Pangan IPB dan menulis tesis dengan judul karakterisasi protease dari beberapa bakteri patogen di bawah bimbingan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, M.Si dan lulus pada tahun 2004. Tahun 2008 penulis diterima sebagai mahasiswa S3 pada Program Studi Ilmu Pangan Sekolah Pascasarjana IPB.
Sejak tahun 2001 penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya Palembang.
Daftar Publikasi
1. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Azis B. Sitanggang, Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt. 2012.“Purification and characterization of collagenase from Bacillus licheniformis F11.4” sudah terbit pada African Journal of Microbiology Research, Vol 6(10): 2373-2379 tanggal 16 Maret 2012. DOI: 10.5897/AJMR11.1379 (ISI Indexed Journal, Impact Factor 0.533)
2. Ace Baehaki, Sukarno, Dahrul Syah, Azis B. Sitanggang, Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt, Maggy T. Suhartono. ”Different expression of protease from Bacillus licheniformis F11.1 and F11.4 isolated from Palembang Indonesia” submitted pada Biocatalysis and Agricultural Biotechnology (Elsevier) 3. Ace Baehaki, Sukarno, Dahrul Syah, Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt,
Maggy T. Suhartono. “Collagen peptide with antioxidant, ACE inhibitor and anti cancer activity” submitted pada Jurnal Food Chemistry (Elsevier).
Daftar Seminar Internasional
1. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Azis B. Sitanggang, Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt. “Purification and characterization of collagenase from Bacillus licheniformis F11.4” telah diseminarkan pada seminar internasional The Council of Rector of Indonesia State University (CRISU) and The Council of University President of Thailand (CUPT) di Universitas Sriwijaya Palembang tanggal 20-22 Oktober 2011 (Oral presenter)
2. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt. “Study on the collagenase from Bacillus licheniformis F11.4 and the use for production of collagen peptides with antioxidant activity” telah diseminarkan pada International symposium on Marine Ecosystem, Natural Product and Their Bioactive Metabolites di IPB International Convention Center Bogor, tanggal 25-27 Oktober 2011. (Poster presenter)
3. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt. “The collagen peptide with antioxidant, ACE inhibitor and anti cancer activity” telah diseminarkan pada International Conference on Biomedical Science di ITB Bandung (Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati), tanggal 27 – 28 Pebruari 2012. (Oral poster presenter).
