27
BAB 4
METODE PENELITIAN 4.1 Jenis penelitian
Penelitian ini menggunakan jenis penelitian true experimental dan rancangan penelitian yang digunakan adalah post test control group design.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
4.2.1 Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang.
4.2.2 Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama 5 minggu dari tanggal 20 Mei sampai 25 Juni 2021.
4.3 Populasi dan Sampel
4.3.1 Populasi
Populasi yang digunakan oleh peneliti adalah tikus Rattus norvegicus Strain Wistar dengan jenis kelamin Jantan.
4.3.2 Sampel
Sampel diambil dari populasi tikus Rattus noveregicus Strain Wistar dengan jenis kelamin jantan yang memenuhi kriteria inklusi.
4.3.3 Besar Sampel
Untuk replikasi jumlah sampel menggunakan Rumus Frederer, yaitu :
(r-1)(t-1) ≥ 15 (r-1)(4-1) ≥ 15 (r-1) ≥ 15 / 3 r ≥ 5+1 r ≥ 6 Keterangan :
r : jumlah replikasi tiap kelompok
t : jumlah kelompok perlakuan
Dari rumus diatas, didapatkan jumlah replikasi tiap kelompok adalah 6. Untuk mengantisipasi adanya drop out pada proses adaptasi, ditambahkan 25% sebagai cadangan (1 ekor tikus) untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga dalam penelitian ini digunakan 28 ekor tikus. 28 ekor tikus ini akan masuk bersamaan pada proses adaptasi. Setelah proses adaptasi selesai, dilakukan pengambilan sampel sebanyak 24 ekor tikus yang akan dibagi menjadi 4 kelompok, sehingga masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor tikus. 4 ekor tikus yang telah melewati proses adaptasi tetapi tidak masuk ke dalam sampel, akan dipelihara hingga
penelitian selesai dan tidak mendapat perlakuan untuk meminimalkan penggunaan tikus dalam penelitian ini.
4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel yang dilakukan peneliti menggunakan teknik simple random sampling.
4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian
a. Kriteria Inklusi
Tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar jenis kelamin jantan dengan berat badan 180-200 gr, usia 2-3 bulan, gerak aktif, mata jernih, dan dalam kondisi sehat.
b. Kriteria Eksklusi
Tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar jenis kelamin jantan :
• Cacat sebelum perlakuan.
• Sakit sebelum penelitian.
c. Kriteria Drop Out
Tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar yang sakit selama proses penelitian atau mati selama proses penelitian.
4.4.1. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian minuman ringan berkarbonasi pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar jenis kelamin jantan yang memenuhi kriteria inklusi.
4.4.2. Variabel Terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah perubahan konsentrasi sperma tikus putih jantan(Rattus norvegicus) strain wistar.
4.5. Definisi Operasional
Tabel 4.5 Definisi Operasional Variabel penelitian No Variabel Definisi
Operasional
Instrument dan Kriteria Hasil
Ukur Skala 1 Pemberian minuman ringan berkarbonasi Minuman ringan berkarbonasi dengan carbonation level sekitar 6,2 g/l atau 3,1 dari volume CO2
Diberikan menggunakan spuit 1 ml secara per oral menggunakan sonde setiap hari selama 30 hari.
Hasil ukur : 1. Dosis I : 1/2 x 6 ml/200grBB/hari = 3 ml/200grBB/hari 2. Dosis II : 1 x 6 ml/200grBB/hari = 6 ml/200grBB/hari 3. Dosis III : 2 x 6 = 12 ml/200grBB/hari.
4. Kelompok kontrol : pemberian aquades Kategorik (ordinal) 2 Perubahan terhadap kualitas sperma tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar jenis kelamin jantan. Melihat perubahan konsentrasi sperma akibat pemberian minuman ringan berkarbonasi
Suspensi spermatozoa yang telah diperoleh terlebih dahulu dibuat homogen dengan cara digetarkan dengan tangan atau diaduk dengan hati-hati dengan gelas pengaduk. Suspensi spermatozoa dihisap sebanyak 0,005 ml
Ratio
sampel, , kemudian Suspensi
spermatozoa diteteskan dari pipet, tepat pada pinggir gelas penutup hingga menyebar. Bilik hitung hemasitometer Improved Neubauer diletakkan dibawah mikroskop dengan pembesara 400 kali. Kemudian konsentrasi spermatozoa dihitung dengan menghitung spermatozoa yang terdapat dalam 4 kotak kamar hitung Improved neubauer. jumlah spermatozoa yaitu juta/ml. Dengan kriteria sebagai berikut : - Normal : jika jumlah
spermatozoa ≥ 20 juta /ml
- Suspect : jika jumlah spermatozoa 10-20 juta/ml
- Abnormal : jika jumlah spermatozoa < 10 juta/ml
4.6. Alat dan Bahan Penelitian
4.6.1. Alat Penelitian a. Timbangan elektrik b. Kandang Tikus c. Sonde d. mikroskop e. cover glass
f. object glass
g. Kotak kamar hitung improvedneubauer
4.6.2. Bahan Penelitian
a. Tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar kelamin jantan
b. Makanan dan minuman standard (BR1) hewan percobaan
c. Minuman ringan berkarbonasi dengan dosis 3, 6, dan 12 ml/tikus/hari
d. Larutan buffer formalin 10%
e. Aquadest
f. larutan fsiologis (NaCl 0,9%),
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Proses Adaptasi
Tikus diadaptasikan di dalam kandang yang diletakkan di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang selama 7 hari agar tikus dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan baru.
Penentuanxdosisxminuman ringan berkarbonasixdilakukan berdasarkanxdosis manusiaxdengan berat badanx70 kg dikonversikan pada tikus (200 g)x menggunakan tabelkonversi Laurence-Bacharach (1964) denganxfaktor konversi 0,018. Jikaminuman ringanxberkarbonasi dalamxsatu kemasanxkaleng adalahx330 ml yangxdiperkirakan dikonsumsi manusia, denganxperkiraan beratxbadan tikusx200 g, makaxkonversi dosis minumanxringan berkarbonasi yangxdiberikan pada tikusxadalah 0,018 x 330 ml/200 g/hari = 5,9 ml/200grBB/hari dibulatkanxmenjadi 6 ml/200grBB/hari. Menurut Laurence-Bacharach (1964) volumexcairanxmaksimal yang dapat diberikanxperoral padaxtikus adalahx5 ml. xx
Pada penelitian yang dilakukan oleh Imai A, et al (2010) mengenai efek cola terhadap fertilitas, seseorang yang mengkonsumsi 1 liter minuman ringan berkarbonasi dengan jenis cola sehari dalam satu minggu dapat menurunkan nilai jumlah sel/konsentrasi sperma hingga hampir 30%. Minuman ringan berkarbonasi dengan jenis cola mengandung kadar glukosa yang tinggi setidaknya >11 gr/dl, yang dimana jika dikonsumsi berlebih dapat menimbulkan stress oksidatif yang dapat merusak DNA pada sperma. Dosis 1 liter sendiri jika dikonversikan sesuai dengan dosis untuk tikus menggunakan faktor konversi 0,018 x1000 ml/200g/hari = 18 ml/200grBB/hari. Mengingat volume cairan maksimal yang dapat diberikan pada tikus per harinya adalah 5ml akan sulit jika memberikan dosis 1 liter cola pada hewan coba.
Stres oksidatif diakibatkan oleh produksi berlebih dari Reactive Oxygen Species (ROS) atau radikal bebas dan penurunan kadar antioksidan. Stres oksidatif merupakan mediator apoptosis dan dapat menimbulkan kerusakan mitokondria yang dapat menyebabkan pelepasan sitokrom C dan mengaktifkan kaspase yang dapat
menyebabkan apoptosis. Kondisi apoptosis yang tidak terkontrol berperan penting dalam patogenesis gangguan spermatogenesis. Stress oksidatif ini menganggu proses spermatogenesis dimana peningkatan produksi ROS menyebabkan degenerasi dari sel-sel gonad yang bersifat oksidan. Rusaknya sel-sel-sel-sel sertoli mengakibatkan terganggunya proses spermiogenesis sedangkan rusaknya sel-sel leydig akan mengakibatkan terganggunya sintesis hormon testosteron dan tentu saja hal ini akan berpengaruh pada spermatogenesis
Sehingga konversi dosis yang digunakan dalam penelitian ini untuk tikus Rattus novergicus strain wistar adalah sebagai berikut:
• Dosis I: 3 ml/200grBB/hari
• Dosis II: 2 x 3ml/200grBB/hari = 6 ml/200grBB/hari • Dosis III :2 x 6 ml/200grBB/hari = 12 ml/200grBB/hari. 4.7.3. Pemberian Dosis
Dosis diberikan setiap hari selama 30 hari sebanyak 2 kali pada pukul 08.00-10.00 dan 16:00-18:00 WIB melalui peroral menggunakan sonde
4.7.4 Penentuan Kelompok
Pada penelitian ini, 24 ekor tikus dibagi menjadi 4 kelompok danmasing-masing kelompok diisi oleh 6 ekor tikus.
• Kelompok K 1: Kelompok yang diberi aquades menggunakan sonde dan tidak diberi minuman ringan berkarbonasi, digunakan sebagai kontrol negatif sebagai pembanding untuk kelompok perlakuan di statistik.
• Kelompok P1: Kelompok yang diberi dosis minuman ringan berkarbonasi 3 ml/200grBB/hari.
• Kelompok P2 : Kelompok yang diberi dosis minuman ringan berkarbonasi 6 ml/200grBB/hari.
• Kelompok P3 : Kelompok yang diberi dosis minuman ringan berkarbonasi 12 ml/200grBB/hari.
4.7.5 Pembuatan Sediaan dan Pengukuran
1. Tahap persiapan:
a. Tikus putih jantan dewasa yang memenuhi kriteria (baik umur maupun berat badan) disiapkan sebanyak 28 ekor (24 ekor sebagai sampel dan 4 ekor sebagai bahan pertimbangan drop out).
b. Melakukan adaptasi lingkungan selama 1 minggu untuk penyesuaian terhadap lingkungan dengan diberi makan yaitu pakan dan minum tikus biasa.
c. Pengelompokan tikus (3 kelompok perlakuan dan 1 kontrol dimana masingmasing terdiri dari 6 ekor tikus).
2. Tahap pelaksanaan :
a. Terminasi dan analisis kualitas spermatozoa dilakukan setelah perlakuan yaitu pemberian minuman berkarbonasi(soft drink) terhadap kualitas sperma tikus putih jantan(Rattus nivergicus) strain wistar selama 30 hari.
b. Setelah 30 hari diberi perlakuan, persiapkan tikus untuk dikorbankan. Disaiapkan peralatan bedah minor, pinset, gunting, klorofom, formalin 15% dan botol-botol tertutup untuk tempa organ tikus,
c. Hewan coba diterminasi kemudian dibedah menggunakan disecting kit untuk mengambil organ testis dan cauda epididimis. Cauda epididimis dipisahkan dari testis dengan cara memotong bagian proksimal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens
d. . Selanjutnya, cauda epididimis dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi 1 ml NaCL 0,9%, kemudian cauda epididimis dipotong-potong sampai halus dan diaduk dengan NaCL 0,9% sehingga terbentuk suspensi spermatozoa.
3. Pengukuran sediaan
Suspensi spermatozoa yang telah diperoleh terlebih dahulu dibuat homogen dengan cara digetarkan dengan tangan atau diaduk dengan hati-hati dengan gelas pengaduk. Suspensi spermatozoa dihisap sebanyak 0,005 ml sampel, kemudian Suspensi spermatozoa diteteskan dari pipet, tepat pada pinggir hematocytometer kemudian ditutup dengan cover glass hingga menyebar. Bilik hitung hemasitometer Improved
Neubauer diletakkan dibawah mikroskop dengan pembesara 400 kali. Kemudian konsentrasi spermatozoa dihitung dengan menghitung spermatozoa yang terdapat dalam 4 kotak kamar hitung Improved neubauer.
Total perhitungan disubstitusi dalam rumus penentuan konsentrasi spermatozoa dalam ml suspensi sebagai berikut
N = Jumlah total spermatozoa yang dihitung dalam 4 kotak kamar hitung Improved neubaeur.
- Normal: Jika jumlah spermatozoa lebih dari atau sama dengan 20 juta/ml
- Suspect: Jika jumlah spermatozoa10-20 juta/ml
- Abnormal: Jika jumlah spermatozoa kurang dari 10 juta/ml
4.7.6 Perlakuan Setelah Tindakan Pada Hewan Coba
1. Tikus yang telah mati dikumpulkan (tidak dibungkus)
2. Tikus dimasukkan kedalam lubang pada tanah yang kering dengan kedalaman 1 meter dan dengan jarak minimal 250 meter dari sumber air
3. Masing-masing lubang berisi tidak lebih dari sepuluh ekor tikus. Konsentrasi Spermatozoa =
4.8 Analisis Data
Padaxpenelitianxini, diawali dengan menggunakan uji normalitas dan uji homogenitas. Apabilaxsebaran data normalxdigunakan uji One WayxAnova, lalu uji PosxHoc Bonferroni. Hasil penelitian dianalisis apakah data terdistribusi normal atau tidak secara statistik dengan uji normalitas. Untuk mengukur normalitas, uji yang bisa dilakukan yaitu uji Kolmogorov Smirnov atau Shapiro-Wilk. Karena pada penelitian ini jumlah sampel ≤50 maka uji yang dilakukan adalah uji Shaphiro-Wilk. Setelah uji normalitas data, dan didapatkan data terdistribusi normal, untuk mengetahui apakah dua atau lebih kelompok data memiliki varian yang sama atau tidakxmaka dilakukan uji Levene. Apabila didapatkan data yang terdistribusi normal dan homogen maka dilanjutkan dengan uji parametrik one way ANOVA. Namun, bila tidak memenuhi syarat untuk dilakukan uji parametrik, pengujian akan menggunakan uji non-parametrik yaitu Kruskal-Wallis, hipotesis dapat dikatakan diterima ketika nilai p<0,05. Selanjutnya dilakukan analisis post-hoc Bonferroni.
4.9. Alur Penelitian
Persiapan penelitian
Aklamatisasi hewan coba
Pemeriksaan kriteria inklusi dan ekslusi
Kelompok perlakuan hewan coba K 1 P 1 P 2 P 3 Diberikan air biasa sebagai kelompok kontrol Diberikan minuman ringan berkarbonas i dosis 3 ml/200grBB /hari Diberikan minuman ringan berkarbonas i dosis 6 ml/200grBB /hari Diberikan minuman ringan berkarbonas i dosis 12ml/200gr BB/hari
Intervensi selama 30 hari, lakuakan terminasi hewancoba dan pengambilan sampel cauda epididimis untuk dilihat jumlah sel sperma
pulau Langerhans
Pembuatan sediaan dan pewarnaan sperma
Pengamatan sediaan di bawah mikroskop
