i
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK TETUA DAN HASIL
PERSILANGAN ANGGREK HITAM
(
Coelogyne pandurata
Lindl.)
DISERTASI
Disusun Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Gelar Doktor Program Doktor Ilmu Pertanian
Oleh
SRI HARTATI
NIM T. 651108006
PROGRAM DOKTOR ILMU PERTANIAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
ii
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK TETUA DAN HASIL
PERSILANGAN ANGGREK HITAM
(
Coelogyne pandurata
Lindl)
DISERTASI
Oleh SRI HARTATI NIM T 651108006
Tim Penguji
Jabatan Nama Tanda Tangan
Ketua Sekretaris Anggota Penguji
Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.S. NIP 195707071981031006 Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, MS
NIP 196107171986011001 Prof. Dr. Ir. Bambang Pujiasmanto, MS NIP 195602251986011001
Dr. Ir. Supriyadi, M.S. NIP 195813081985031003 Prof. Dr. Ir. Nandariyah, M.S. NIP 195408051981032002 Prof. Dr.Ir. Ahmad Yunus, M.S. NIP 196107171986011001 Dr. Ir. Djati Waluyo Djoar, M.S.
NIP 195102021980031003 ………
Dr. Ir. Parjanto, M.P. NIP 196203231988031001
Dr. Ir. Widyatmani Sih Dewi, M.P. NIP 196311231987032002
Prof. Dr. Ir. Y. Purwanto, DEA NIP 196102181985031003
………
………
Telah dipertahankan di depan penguji pada sidang Ujian Disertasi dan dinyatakan telah memenuhi syarat
pada tanggal 26 Maret 2015 Mengetahui
Rektor
Universitas Sebelas Maret Surakarta Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.S.
iii
PERNYATAAN KEASLIAN DISERTASI DAN PUBLIKASI
DISERTASI
Saya menyatakan sebenar-benarnya bahwa :
Disertasi yang berjudul “Analisis Keragaman Genetik Tetua Dan
Hasil Persilangan Anggrek Hitam (Coelogyne pandurata Lindl.)” ini
adalah karya ilmiah saya sendiri dan tidak terdapat isi karangan yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang digunakan sebagai acuan yang disebutkan sumbernya, baik dalam naskah karangan dan daftar pustaka. Apabila ternyata dalam naskah disertasi ini dapat dibuktikan terdapat unsur-unsur plagiasi, maka saya bersedia menerima sangsi dan diproses sesuai dengan peraturan perundangundangan yang berlaku (UU No. 20 Tahun 2003 pasal 25 ayat 2 dan pasal 70). Publikasi sebagian atau keseluruhan isi disertasi pada Journal atau frum ilmiah harus menyertakan tim promotor sebagai author dan PPs UNS sebagai institusinya. Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini, maka saya bersedia mendapatkan sangsi akademik yang berlaku.
Surakarta, Maret 2015
Mahasiswa,
Sri Hartati
NIM T. 651108006
iv
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur senantiasa penulis panjatkan kepada Allah SWT atas Rahmat dan HidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan disertasi yang berjudul “ANALISIS KERAGAMAN GENETIK TETUA DAN HASIL PERSILANGAN ANGGREK HITAM (Coelogyne pandurataLindl.)”.
Sejak dimulainya penelitian, hingga selesai penulisan disertasi ini penulis banyak mendapatkan bantuan baik berupa bimbingan, bantuan moral material, gagasan yang kesemuanya sangat bermanfaat bagi penulis.
Terima kasih yang mendalam penulis ucapkan kepada yang terhormat:
1. Prof. Dr. Ravik Karsidi, MS. selaku Rektor Universitas Sebelas Maret sekaligus sebagai ketua tim penguji ujian terbuka.
2. Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, MS, Direktur Pascasarjana merangkap ko-promotor yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran penelitian sampai penyelesaian disertasi ini.
3. Prof. Dr. Ir. Bambang Puji Asmanto, MS, Dekan Fakultas Pertanian yang telah memberikan ijin belajar dan tim penguji.
4. Prof. Dr. Ir. Nandariyah, MS, selaku Promotor yang dengan penuh kearifan telah memberikan bimbingan, nasehat, petunjuk arahan sejak dari perencanaan dan selama pelaksanaan penelitian sampai penyelesaian disertasi ini,
5. Dr. Ir. Djati Waluyo Djoar, MS, selaku ko-promotor yang dengan penuh kesabaran, pengertian dan ketulusan telah banyak memberikan bimbingan dan, dorongan moral yang sangat berguna dalam pelaksanaan penelitian sampai selesainya penulisan disertasi ini,
6. Dr. Ir. Supriyadi, MS selaku Ketua Program Studi S3 Ilmu Pertanian dan tim penguji.
v
8. Prof (Riset) Dr. Ir. Y. Purwanto DEA, dari Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor selaku penguji yang banyak memberikan masukan berharga.
9. Dr. Ir. Parjanto MP selaku tim penilai dan penguji
10.Ir. Susilo Hambeg Poromarto MSi., PhD. selaku tim penilai 11.Prof. Dr. Ir. Edi Purwanto MSc selaku penilai seminar hasil. 12.Kepala Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI Bogor,
13.Koordinator Kebon Anggrek Kebon Raya LIPI Bogor Ir. Dwi Murti Puspitaningtyas, MSi dan Dr. Ir. Joko Ridho atas fasilitas kebun dan materi yang disediakan. Sdr. Ponco Yulianto, Bu Yuniar, Pak Supardi, Bu Yupi, Bu Liza, Bu Sutini yang telah banyak membantu pelaksanaan di lapang.
14.Kepala Laboratorium Genetika Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor Dr. Ir. Yuyu S. Poerba, Teknisi Lab Genetika LIPI Bogor: Bu Tri, Mbak Herlina, Bapak Fajar, dan Pak Hafid (Lab Sitologi –LIPI Bogor).
15.Prof. Sobir dan mbak Sulasih dari Pusat Kajian Hortikultura dan Tropika IPB Bogor atas ijin pemakaian Laboratorium Molekuler.
16.Teman-teman kuliah S3 Ilmu Pertanian angkatan 2011: Ir. Sukaya, MS., Ir. Edi Tri Haryanto, MP., Ir. Endang Setyo Mulyo, MSi., Ir. Dwi Harjoko, MP., Dra. Farida Yuliani, MS., Ir. Priyono, MP., Ir. Catur Sulistyorini, MM. yang telah memberi dukungan dan semangat untuk menyelesaikan disertasi ini.
17.Sdr. Thithin, Riya, Linda, Hespriawan mahasiswa Agroteknologi Fakultas Pertanian UNSyang telah ikut membantu pelaksanaan penelitian.
18.Penghormatan dan ucapan terima kasih yang khusus disampaikan kepada suami tercinta Prof. Dr. Ir. Ongko Cahyono, M.Sc dan semua anakku Doan Perdana ST, MT dan istrinya Imas Nurliah, dr. Febrian Dwi Cahyo Sp.An. M. Kes. dan istrinya dr. Hanindia Riani Prabaningtyas serta Adiptya Cahya Mahendra S. Ked. Atas semua pengorbanan dukungan moril dan matertiil serta kasih sayang yang tulus selama kuliah S3 Ilmu Pertanian di Pasca Sarjana UNS.
vi
karena kesempurnaan itu hanya milik Allah SWT sehingga saran dan kritik yang bersifat membangun dalam menyempurnakan disertasi ini sangat penulis harapkan.
Akhirnya penulis berharap disertasi ini dapat dapat bermanfat untuk perkembangan anggrek di Indonesia.
(Sri Hartati)
vii
ABSTRAK
Anggrek hitam (Coelogyne pandurata Lindl.), merupakan salah satu anggrek langka Kalimantan Timur yang memiliki kekhasan bunga besar, berwarna hijau dengan lidah berwarna hitam. Anggrek ini perlu dilestarikan melalui persilangan dengan spesies lain.
Penelitian ini bertujuan untuk (1) mendapatkan informasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp dan menentukan kedekatan genetik antara anggrek hitam dengan spesies lain dalam genus Coelogyne berdasarkan karakter morfologi dan molekuler RAPD (Random Amplified Polymorphic DN. (2) mendapatkan metode persilangan yang kompatibel antara C. pandurata dengan tetua terpilih. (3) mendapatkan informasi karakter sitologi (kromosom) dan tingkat ploidi pada F1 hasil persilangan antara C. pandurata dengan tetua terpilih. (4) mendapatkan informasi besarnya keragaman baru pada F1 hasil persilangan C. pandurata berdasarkan penanda molekuler RAPD dan ISSR (InterSimple Sequence Repeats).
Bahan yang digunakan adalah tanaman anggrek koleksi Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI Bogor yaitu Coelogyne spp. meliputi: C. pandurata, C. massangeana, C. mayeriana, C. asperata, C. celebensis dan C. rumphii.
Penelitian dilakukan dalam lima kajian yaitu: (1) Identifikasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp berdasarkan penanda morfologi. Identifikasi dilakukan secara deskriptif dengan menggunakan 45 karakter; (2) Identifikasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp berdasarkan penanda molekuler RAPD. Identifikasi dilakukan dengan menggunakan 11 macam primer; (3) Teknik hibridisasi untuk menambah ragam genetic anggrek hitam meliputi tiga metode: crossing (♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii), reciprocal (♀ C. rumphii x ♂ C. pandurata) dan selfing yaitu polinia ditransfer ke dalam stigma pada satu bunga dalam satu tanaman; (4) Identifikasi hasil persilangan anggrek C. pandurata. dengan C. rumphii berdasarkan analisis sitologi menggunakan metode Squasing dan flow cytometry menggunakan alat Partec CyFlow space (Partec GmbH); (5) Identifikasi hasil persilangan anggrek C. pandurata dengan C. rumphii berdasarkan molekuler RAPD dan ISSR menggunakan 6 primer RAPD dan 4 primer ISSR
Analisis data dilakukan sebagai berikut. skoring data morfologi dilakukan dari hasil deskripsi menjadi data biner. Data molekuler diamati dengan menentukan skor berdasarkan ada atau tidaknya pita DNA. Pita DNA diterjemahkan dalam data biner, jika ada nilai 1 dan jika tidak ada nilai 0. Analisis klaster/gerombol dilakukan dengan program NTSYSpc versi 2.02i dengan metode UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Arithmatic Average) fungsi SimQual (Rohlf , 2000).
Hasil penentuan keragaman baik secara morfologi maupun secara molekuler dari enam spesies anggrek dari genus Coelogyne spp diperoleh karakter yang beragam secara morfologi antara 2% – 22% dan secara
viii
molekuler menggunakan 11 primer RAPD antara 45% – 69%. Dari enam spesies tersebut, C. rumphii merupakan spesies yang memiliki keragaman paling rendah atau memiliki hubungan kekerabatan paling dekat dengan C. pandurata, yakni secara morfologi memiliki kemiripan 93% dan secara molekuler memiliki kemiripan berkisar 50%. Dengan demikian hasil penelitian ini merokemendasikan C. rumphii untuk dipilih menjadi tetua untuk disilangkan dengan C. pandurata.
Persilangan antara C. pandurata dan C. rumphii adalah kompatibel penuh dengan tingkat keberhasilan persilangan mencapai 100% pada semua metode persilangan yang digunakan. Metode crossing memiliki resiko buah rontok tertinggi hingga 50%, dibanding metode yang lain yang hanya mencapai 25%. Namun metode crossing menghasilkan buah lebih cepat masak yakni 158 hari, sedangkan pada metode reciprocal mencapai 191 hari dan metode selfing mencapai kisaran antara 155 – 201 hari.
Hasil analisis kromosom menunjukkan tetua C. pandurata memiliki jumlah kromosom 2n=36 dan tetua C. rumphii 2n=72 sedangkan F1 hasil persilangan memiliki jumlah kromosom 2n=54. Hasil analisis ploidi dengan flow cytometry diperoleh hasil keturunan F1 yang mempunyai susunan kromosom triploid 2n=3x dari persilangan C. pandurata diploid (2n=2x) dan C. rumphii tetraploid (2n=4x).
Penelitian ini berhasil mendapatkan keragaman baru pada F1 hasil persilangan antara C. pandurata dan C. rumphii. F1 hasil persilangan ♂ C. pandurata x ♀ C. rumphii terdapat ragam baru sebesar 6% (RAPD) dan 11% (ISSR). Sedangkan untuk F1 dari persilangan ♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii terdapat ragam baru sebesar 10% (RAPD dan 3% (ISSR).
Kata kunci: Anggrek Hitam, Flow Cytometry, ISSR, morfologi, RAPD,
Sitologi,
ix
ABSTRACT
Black orchid (Coelogyne pandurata Lindl.) is one of the endangered orchids from East Kalimantan hving very exciting large green flowers with a unique black tongue. This orchid should be conserved by crossing with other species.
The research aims (1) to assess information of the genetic diversity of the members of Coelogyne genus based on morphological characters and molecular RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) and to select one species that having the closest genetic relationship to C, pandurata, (2) to assess the most compatible crossing method for crossing of C. pandurata, (3) to assess information of the cytology characters (chromosomes) and ploidy of the F1 hybrid (off springs of the cross) of C. pandurata and (4) to assess the genetic diversity of the F1 hybrids of C. pandurata based on molecular RAPD and ISSR (Inter Simple Sequence Repeats).
The orchids used as experimental materials were six species of
Coelogyne genus, C.pandurata, C.massangeana, C. mayeriana, C.
asperata, C. celebensis and C. rumphii. Those species are taken from the collection of The Bogor Plant Conservation Centre (Kebun Raya Bogor).
The research was done in five experiments: (1) Identification of genetic diversity of Coelogyne spp based on morphological markers. Identification was done descriptively using 45 characters; (2) Identification of the genetic diversity of Coelogyne spp based on molecular RAPD markers. Identification was carried out by in 11 different primers; (3) Hybridization methods to increase genetic diversity of C. pandurata.. The hybridization was conducted in three methods, which were: crossing (♀C. pandurata x ♂C. rumphii), reciprocal (♀C. rumphii x ♂C.pandurata) and selfing (pollinia transferred to the stigma of the one flower in one plant; (4) Identification of the F1 hybrids of C. pandurata. x C. rumphii based on cytology analized using squashing and flow cytometry using a Partec CyFlow space (Partec GmbH); (5) Identification of the F1 hybrids of C. pandurata. x C. rumphii based on molecular diversity using the 6 primers RAPD and 4 primers ISSR.
Data analysis was done as follow: morphological data were converted from the descriptive data into binary data. Molecular data were determined using a score based on the presence or absence of DNA bands. The DNA bands were translated into binary data, which was 1 for a value and 0 for no value. The cluster analysis was done using the NTSYSpc program version 2.02i with UPGMA method (Unweighted Pair Group Method of arithmetic Average) function SimQual (Rohlf, 2000). Shape of chromosomes were analyzed further by the relative asymmetry index.
Study on morphological identification as well as molecular identification found that there were diversity among the six members of the Coelogyne genus. The morphological characters varied from 2% to 22%, while molecular character showed wider diversity, which was from 45% to 69%. This study found that among the six members of Coelogyne genus,
x
C. rumphii performed the lowest diversity compared to C.pandurata. These two species showed closed genetic relationship which was 93% in morphological similarity and 50% in molecular similiratity. The result recommending that C. rumphii should be selected as a parent for crossing with C. pandurata.
This study confirmed that the crossing of C. pandurata x C. rumphii was fully compatible with crossover success percentage was 100% for all crossing methods, crossing, resiprocal and selfing. Crossing method (♀ Coelogyne pandurata x ♂ Coelogyne rumphii) performed better result compared to the other methods (reciprocal and selfing) in term of fruit rippening and protocorm emergence. Fruit of orchids rippened at 158 days after pollination (dap) using crossing method, 191 dap using reciprocal method, and 155 – 201 dap using selfing method. However crossing method had higher risk for fruit fall before rippening, 50%.
The study showed that C. pandurata had a chromosome number of 2n=36, C. rumphii had a chromosome number of 2n=72 and the hybrid had a number of chromosomes of 2n=54. The flow cytrometry analysis found that the parent of C. pandurata had diploid (2n=2x), C. rumphii had tetraploid (2n=4x), and the F1 hybrids had triploid (2n=3x),
The identification of the F1 hybrid based on the molecular RAPD showed that the crossing of ♂ C. pandurata x ♀ C. rumphii created the F1 hybrid having a new diversity of 6% (RAPD) and 11% (ISSR). While the crossing of ♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii created the hybrid having new diversity of 10% (RAPD) and 3% (ISSR).
Keyword: Black Orchid, Cytology, Flow Cytometry, ISSR, Morphology,
RAPD,
xi
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ……….. i
HALAMAN PENGESAHAN ………. ii
PERNYATAAN KEASLIAN DESERTASI DAN PUBLIKASI DISERTASI ... iii
KATA PENGANTAR ……… iv
ABSTRAK ….………. vii
ABSTRACT ……… ix
DAFTAR ISI ……….. xi
DAFTAR TABEL ……….. xiii
DAFTAR GAMBAR ………. xiv
DAFTAR LAMPIRAN ………. xvi
BAB I. PENDAHULUAN ………. 1
A. Latar Belakang ………. B. Perumusan Masalah ……….. C. Tujuan Penelitian ……….. D. Manfaat Penelitian ……….. 1 4 4 5 BAB II. LANDASAN TEORI ……….. 6
A. Tinjauan Pustaka ……….. 6
B. Kerangka Berpikir ……… 13
C. Hipotesis ……….. 16
D. Kebaharuan (Novelty) ………. 16
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ……….. 17
A. Tempat Penelitian ……… 17
B. Waktu Penelitian ………. 17
C. Tatalaksana Penelitian ………. 17 1. Identifikasi keragaman genetik anggrek
Coelogyne spp berdasarkan penanda morfologi …. 17
xii
molekuler RAPD ………. 18
3. Teknik Hibridisasi untuk menambah ragam genetik Anggrek Hitam (Coelogyne pandurata) ...…... 20
4. Identifikasi hasil persilangan anggrek Coelogyne pandurata dengan Coelogyne rumphii berdasarkan sitologi dan flow cytometry ... 21
5. Identifikasi hasil persilangan anggrek hitam mengunakan marka molekuler RAPD dan ISSR ... 23
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ……….... 26
A. Hasil Penelitian .………..… 26
1. Identifikasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp berdasarkan penanda morfologi ... 26
2. Identifikasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp berdasarkan marka molekuler RAPD ..……… 31
3. Teknik Hibridisasi untuk menambah ragam genetik Anggrek Hitam (Coelogyne pandurata ) ... 38
4. Identifikasi hasil persilangan anggrek Coelogyne pandurata secara sitologi dan flow cytometry ..….. 45
5. Identifikasi hasil persilangan anggrek hitam menggunakan marka molekuler RAPD dan ISSR .. 55
B. Pembahasan Umum ……….. 70
BAB V. KESIMPULAN, IMPLIKASI DAN SARAN ………..…… 80
A. Kesimpulan ..………... 80
B. Implikasi ………..……… 81
C. Saran ………. 82
DAFTAR PUSTAKA ……….. 83
LAMPIRAN ……….. 94
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Jenis primer dan urutan nukleotida penyusunnya …………... 19
2. Bentuk kromosom berdasarkan rasio lengan kromosom ... 22
3. Bahan tanaman berdasarkan asal dan ketinggian tempat... 27
4. Matrik kemiripan berdasarkan penanda morfologi... 28
5. Primer, pita polimorfisme dan persentase polimorfisme dengan RAPD... 35
6. Matrik kemiripan Coelogyne spp berdasarkan RAPD dengan 11primer ... 36
7. Rata-rata persentase keberhasilan persilangan, tingkat kompatibilitas dan saat buah terbentuk ... 40
8. Rata-rata persentase buah rontok, umur buah masak dan saat terbentuk protokorm ... 43
9. Jumlah, ukuran dan bentuk kromosom tetua dan hybrid anggrek Coelogyne pandurata dan Coelogyne rumphii ... 48
10. Urutan Primer, pita polimorfisme dan persentase polimorfisme pada analisis RAPD ... 59
11. Urutan Primer, pita polimorfisme dan persentase polimorfisme memenggunakan marka molekuler ISSR ... 66
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Diagram alur penelitian ... 15
2. Bahan penelitian tanaman anggrek Coelogyne spp ... 18
3. Dendogram pengelompokan Coelogyne spp berdasarkan penanda morfologi ... 29
4. Dendrogram pengelompokan Coelogyne spp berdasarkan penanda RAPD menggunakan 11 primer ... 36
5. Metode Polinasi terhadap persentase buah rontok ... 42
6. Metode polinasi terhadap umur buah masak anggrek ... 43
7. Metode polinasi terhadap saat terbentuk protokorm ... 44
8. Jumlah kromosom a). Tetua Coelogyne pandurata 2n=36, b). Tetua Coelogyne rumphii 2n=72, c). hybrid Coelogyne pandurata sebagai tetua jantan 2n=54,serta d). hybrid Coelogyne pandurata sebagai tetua betina 2n=54 ... 49
9. Kariotipe a) Tetua Coelogyne pandurata, b) Tetua Coelogyne rumphii, c) hybrid Coelogyne pandurata sebagai tetua jantan serta d) hybrid Coelogyne pandurata sebagai tetua betina ... 52
10. Histogram hasil flow cytometry A:C. pandurata, B:C. rumphii, C:♀C. pandurata x ♂C. rumphii, D:C. pandurata x ♀C. rumphii... 53
11. Hasil amplifikasi DNA dengan primer OPA 02 ... 60
12. Hasil amplifikasi DNA dengan primer OPA 07 ... 61
13. Hasil amplifikasi DNA dengan primer OPB 12... 61
14. Hasil amplifikasi DNA dengan primer OPB 17... 62
15. Hasil amplifikasi DNA dengan primer OPB 18 ... 62
16. Hasil amplifikasi DNA dengan primer OPD 11... 63
17. Dendrogram hasil persilangan ♂ C. pandurata dan ♀ C. rumphii.. 64
18. Dendrogram hasil persilangan ♀ C. pandurata dan ♂ C. rumphii... 64
xv
21. Hasil amplifikasi DNA dengan primer UBC 807... 68 22. Hasil amplifikasi DNA dengan primer UBC 810... 68 23. Dendrogram hasil persilangan ♂ C. pandurata dan♀ C. rumphii... 69 24. Dendrogram hasil persilangan ♀ C. pandurata dan ♂ C. rumphii... 69
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Study on Morphological Characteristics of Different Species of
Coelogyne Orchid ……… 94
2. Genetic Diversity of Orchid Coelogyne spp by Molecular
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Markers ………… 103 3. Hybridization Technique Of Black Orchid (Coelogyne
pandurata) Toenrich The Genetic Diversity and To Rescue The Genetic Extinction ……… 113 4. Cytological Studies On Black Orchid Hybrid ……… 123 5. Identification Hybrid Coelogyne pandurata Based On
Molecular RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
and ISSR ………. … 132
6. Hasil pengamatan karakterisasi morfologi Coelogyne spp ... 142 7. Hasil amplifikasi anggrek Coelogyne spp menggunakan
11 primer RAPD ... 148 8. Interpretasi amplifikasi DNA anggrek Coelogyne spp
dengan 11 primer... 150 9. Ukuran dan bentuk kromosom C. pandurata ... 152 10.Ukuran dan bentuk kromosom tetua C. rumphii ... 153 11.Ukuran dan bentuk kromosom F1 ♂ C. pandurata x ♀ C. rumphii ... 154 12.Ukuran dan bentuk kromosom F1 ♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii ... 155 13.Idiogram C. pandurata, C. rumphii dan F1 ... 157 14.Matriks kemiripan F1 ♂ C. pandurata x ♀ C. rumphii
berdasarkan RAPD ... 158 15.Matriks kemiripan F1 ♀ C. pandurata dan ♂ C. rumphii
berdasarkan RAPD ... 160 16.Matriks kemiripan F1 ♂ C. pandurata x ♀ C. rumphii
berdasarkan ISSR ... 161 17.Matriks kemiripan F1 ♀ C. pandurata dan ♂ C. rumphii
berdasarkan ISSR ... 162
1
BAB I. PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Indonesia memiliki sumber plasma nutfah tanaman anggrek dan lebih dari 5.000 spesies anggrek atau sekitar seperlima dari total anggrek yang ada di dunia terdapat di Indonesia (Handoyo dan Prasetya, 2006). Tanaman anggrek merupakan salah satu jenis tanaman hias yang dinikmati keindahan bunganya karena setiap jenis bunga anggrek memiliki bentuk, corak, warna dan wangi yang khas sehingga semua orang tidak jenuh untuk menikmatinya. Keunggulan tanaman anggrek ditentukan oleh warna, ukuran, bentuk, susunan, jumlah kuntum bunga pertangkai, panjang tangkai dan daya tahan kesegaran bunga (Widiastoety et al., 2010). Keragaman warna dan bentuk bunga anggrek merupakan faktor penting yang menentukan keindahannya.
Anggrek merupakan tanaman hias yang sangat potensial sebagai penghasil devisa, semakin unik dan langka tanaman anggrek semakin tinggi nilai ekonominya (Handoyo dan Prasetya, 2006). Permasalahan yang ada selama ini produksi bunga anggrek masih jauh dari permintaan pasar, meskipun Indonesia merupakan sumber plasma nutfah anggrek. Bahkan kebutuhan dalam negeri masih banyak didatangkan dari luar negeri. Negara pensuplai anggrek antara lain dari Thailand. Data BPS 2012 menunjukkan bahwa terjadi kesenjangan antara nilai ekspor dan impor anggrek di Indonesia. Produksi dan nilai impor anggrek Indonesia mengalami fluktuasi dari tahun ke tahun. Nilai ekspor anggrek tahun 2008 sebesar $ 740.751 Tahun 2009 nilai ekspor anggrek mengalami peningkatan menjadi $ 1.040.544, namun pada tahun 2010 hingga tahun 2012 mengalami penurunan hingga $ 668.956. Sedangkan nilai impor anggrek tahun 2008 sebesar $ 78.265. Tahun 2009 nilai impor anggrek mengalami peningkatan sebesar $ 434.071 dan tahun 2010 turun hingga mencapai 40.154, tahun 2011 dan tahun 2012 mengalami peningkatan hingga sebesar $ 49.272. Walaupun terjadi fluktuasi dari data ekspor impor dapat dikatakan terjadi
surplus bagi Indonesia. (Dirjen Hortikultura, 2012). Hal inilah yang mendorong penelitian-penelitian anggrek untuk peningkatan kualitas, meningkatkan ragam genetik dengan menambah jenis-jenis baru yang bernilai ekonomis, melakukan persilangan antara anggrek dan kuantitas anggrek.
Salah satu genus anggrek yang terkenal adalah genus Coelogyne Lindl. Terdiri dari 200 spesies yang tersebar di seluruh Asia Tenggara dengan pusat keragaman utama di Kalimantan, Sumatra, dan Himalaya. Genus ini tumbuh epifit di daerah tropis dataran rendah dan pegunungan terutama di hutan-hutan. Anggrek hitam (Coelogyne pandurata Lindl), merupakan salah satu jenis anggrek langka dari dari genus Coelogyne yang dilindungi pemerintah di Indonesia. Ciri khas dari C. pandurata adalah bunga besar berwarna hijau dengan lidah hitam. Warna hitam merupakan sifat langka yang dibutuhkan oleh para ahli pemuliaan tanaman untuk menghasilkan silangan baru dengan corak warna bunga yang lebih menarik. Anggrek Coelogyne yang lain antara lain C. rumphii yang mempunyai bunga kecil warna kuning dengan lidah coklat.
Untuk menambah keragaman genetik baru perlu dilakukan persilangan anggrek hitam dengan jenis lainnya. Dalam program persilangan anggrek tahap awal yang dilakukan adalah memilih tetua yang memiliki kedekatan hubungan genetik, sebagai salah satu faktor yang berpengaruh terhadap keberhasilan persilangan. Kedekatan genetik antara tetua dapat didekati dengan metode identifikasi dan pengelompokan anggrek Coelogyne baik secara morfologi dan secara molekuler. Setelah dapat diketahui kedekatan genetiknya maka dapat dilakukan persilangan.
Dalam penelitian ini yang dimaksud identifikasi morfologi adalah proses yang digunakan untuk mengetahui karakter fenotip dari suatu tanaman, dengan mengamati daun, batang, bunga, buah, akar dan lain sebagainya yang mencakup seluruh morfologi tanaman dan mengetahui hubungan kekerabatan antara spesies. (Susantidiana et al., 2009; Purwantoro et al., 2005). Adanya kelemahan dalam identifikasi secara morfologi dapat diatasi dengan identifikasi molekuler.
Marka molekuler merupakan marka yang efektif dalam analisis genetik (Yunus, 2007) karena sifat genetik cenderung stabil pada perubahan lingkungan dan tidak dipengaruhi oleh umur sehingga marka genetik dapat memberikan informasi yang relatif lebih akurat (Julisaniah et al., 2008). Teknik identifikasi molekuler yang digunakan pada penelitian
ini adalah penggunaan marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dan marka ISSR (InterSimple Sequence Repeats).
Teknik RAPD merupakan metode analisis pada tingkat DNA yang menggunakan primer acak yang dapat digunakan untuk menetapkan hubungan kekerabatan antar spesies tanaman (Arya et al., 2011; Vural et al., 2009; Das et al., 2009; Verma et al., 2009). Hasil pengelompokan didapatkan tetua-tetua yang dapat digunakan sebagai bahan persilangan. Intersimple Sequence Repeats (ISSR) banyak digunakan untuk
mengidentifikasi spesies, kultivar ataupun populasi suatu spesies dan sangat berguna sebagai alat pendeteksi keragaman genetik suatu spesies tanaman yang mempunyai variasi genetik yang sangat luas (Romeida et al., 2012).
Perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan tetua yang mempunyai kedekatan genetik dengan anggrek hitam (C. pandurata Lindl.) dengan melakukan identifikasi anggrek Coelogyne spp. secara morfologi yang didukung penanda molekuler RAPD. Selanjutnya dilakukan penelitian persilangan anggrek hitam (C. pandurata Lindl.) dengan tetua terpilih. Persilangan dilakukan secara bolak-balik untuk mengetahui daya kompatibilitas dan daya fertilitasnya. Daya kompatibilitas adalah persentase kemampuan membentuk buah. Daya fertilitas adalah kemampuan terjadinya fertilisasi/ pembuahan (Widiastoety, 2003).
Selain identifikasi morfologi dan molekuler di atas juga diperlukan identifikasi hasil persilangan secara sitologi dengan mengamati kromosom meliputi jumlah, bentuk, ukuran dan susunan kromosom (kariotipe) serta identifikasi secara molekuler (RAPD, ISSR).
diidentifikasi berdasarkan analisis sitologi, flow cytometry dan molekuler (RAPD, ISSR).
B. Perumusan masalah
Penggunaan karakter morfologi secara fenotipik merupakan metode yang mudah namun terkadang dapat berubah-ubah karena pengaruh faktor lingkungan dan membutuhkan sampel yang banyak. Oleh karena itu, perlu adanya proses penentuan hubungan kekerabatan berbagai spesies tanaman anggrek yang dapat dilakukan secara fenotipik dan genotipik. Hubungan kekerabatan secara fenotipik dilakukan berdasarkan pengamatan morfologi. Sedangkan secara genotipik dapat dilakukan secara sitologi dan molekuler. Persilangan dilakukan dengan berbagai metode persilangan yaitu crossing, reciprocal dan selfing. Untuk mendeteksi keturunan hasil persilangan dari
tetua terpilih perlu dilakukan identifikasi yang dalam penelitian ini digunakan metode dengan analisis sitologi, flow cytometry dan molekuler (RAPD, ISSR).
Dari uraian diatas perlu perumusan masalah sebagai berikut:
1. Belum diketahui keragaman dan kedekatan genetik (kekerabatan) antara anggrek hitam (Coelogyne pandurata) dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp yang dapat digunakan sebagai tetua persilangan.
2. Belum diketahui metode persilangan yang mempunyai tingkat keberhasilan yang tinggi dalam persilangan antara Coelogyne pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp.
3. Belum diketahui keragaman hasil persilangan anggrek hitam berdasarkan sitologi (kromosom) dan flow cytometry (tingkat ploidi). 4. Belum diketahui besarnya keragaman baru hasil persilangan Coelogyne
pandurata berdasarkan penanda molekuler RAPD dan ISSR
(InterSimple Sequence Repeats).
C. Tujuan penelitian
1. Mendapatkan informasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp dan menentukan kedekatan genetik antara anggrek hitam (Coelogyne
pandurata) dengan spesies lain dalam genus Coelogyne yang dapat
digunakan sebagai tetua berdasarkan karakter morfologi dan molekuler RAPD.
2. Mendapatkan metode persilangan yang kompatibel (crossing, reciprocal dan selfing) antara anggrek hitam dengan tetua terpilih.
3. Mendapatkan informasi karakter sitologi (kromosom) dan tingkat ploidi pada F1 hasil persilangan antara anggrek hitam dengan tetua terpilih. 4. Mendapatkan informasi besarnya keragaman baru pada individu F1 hasil
persilangan anggrek hitam berdasarkan penanda molekuler RAPD dan ISSR (InterSimple Sequence Repeats).
D. Manfaat Penelitian
1. Diperoleh pengelompokan genus Coelogyne spp berdasarkan hubungan kekerabatan.
2. Diperoleh metode persilangan yang kompatibel antara anggrek hitam (Coelogyne pandurata ) dengan tetua terpilih.
3. Diperoleh varian anggrek baru hasil persilangan anggrek hitam.
6
BAB II. LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka
1. Morfologi Tanaman Anggrek
Anggrek genus Coelogyne spp, terdiri dari 200 spesies yang tersebar di seluruh Asia Tenggara dengan pusat keragaman utama di Kalimantan, Sumatera, dan Himalaya. Kebanyakan tumbuh di daerah tropis dataran rendah dan hutan. (Butzin, 1992 dalam Gravendeel et al., 2001).
Klasifikasi anggrek Coelogyne sebagai berikut: Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Orchidales Famili : Orchidaceae Genus : Coelogyne
Anggrek Coelogyne spp mempunyai tipe pertumbuhan epifit, bentuk daun ellipticus, perbungaan muncul diantara 2 ketiak daun dengan bentuk daun lanseolatus (Musa et al., 2013). Empat tipe tanaman anggrek berdasarkan tempat tumbuhnya menurut Sumardi dan Prabowo (2010); Syukur et al., 2012 yaitu: (a). Anggrek epifit tumbuh menunpang pada batang atau cabang lain. Contoh: anggrek bulan, Dendrobium sp., Cattleya sp. (b). Anggrek terestrial juga disebut anggrek tanah adalah anggrek yang tumbuh di tanah dan membutuhkan cahaya matahari langsung. Contoh: Vanda sp., Arachnis sp. (c). Anggrek Litofit adalah anggrek yang tumbuh pada batu-batuan atau tanah berbatu dan tahan terhadap cahaya matahari penuh. Anggrek ini mengambil makanan dari air hujan, udara, humus. Contoh: Cytopedium, Paphiopedilum. (d). Anggrek saprofit tumbuh pada media yang mengandung humus atau daun-daun kering serta membutuhkan sedikit cahaya matahari. Contoh: Calanthe, Gooddyera sp.
Tipe pertumbuhan tanaman anggrek epifit menurut Sutopo (2009) yaitu (a). Monopodial, yakni anggrek yang hanya memiliki satu batang dan satu titik tumbuh. Batang utama terus tumbuh dan tidak terbatas
panjangnya. Bentuk batangnya ramping dan tidak berumbi. Tangkai bunga akan keluar di antara dua ketiak daun. Anggrek jenis ini dapat diperbanyak dengan cara stek, batang dan biji. Contoh genus Aerides, Arachnis, Vanda, Phalaenopsis, Renanthera dan lain-lain. (b). Simpodial adalah anggrek
yang memiliki batang utama yang tersusun oleh ruas-ruas tanaman. Batang utama berhenti tumbuh pada akhir musim, dan akan menghasilkan pertumbuhan baru pada musin berikutnya. Anggrek tipe simpodial mempunyai batang yang berumbi semu (pseudobulb) yang berfungsi sebagai cadangan makanan, yang tumbuh pada setiap akhir musim pertumbuhan, seringkali dilanjutkan dengan fase berbunga. Akar anggrek tumbuh dari risom, bentuknya silindris, menebal, berbentuk benang atau bercabang dan biasanya panjang seperti Aerides.
Bunga anggrek berkelamin dua (hermaprodit), yaitu pollen dan putik terdapat di dalam satu bunga, sedangkan karakter kelaminnya adalah monoandrae yaitu kelamin jantan dan betina terletak pada satu tempat (Syukur et al., 2012). Pada umumnya bunga anggrek tersusun dalam bentuk lateral inflorescence seperti Cymbidium, Oncidium, Odontoglossum, Lycaste dan Phaius. Tetapi adapula bunga yang muncul dari bagian dasar
atau samping pseudobulb, tumbuh pada pseudobulb pendek tanpa daun-daun atau muncul langsung dari risom diantara pseudobulb (Sutopo, 2009). Bunga anggrek tersusun dalam karangan bunga. Jumlah kuntum bunga pada satu karangan dapat terdiri dari satu sampai banyak kuntum. Karangan bunga pada beberapa spesies letaknya terminal, sedangkan pada sebagian besar letaknya aksilar (Ayu et al., 2012). Menurut Comber (2001), bunga anggrek memiliki beberapa bagian utama yaitu sepal (daun kelopak), petal (daun mahkota), stamen (benang sari), pistil (putik) dan ovarium (bakal buah). Sepal anggrek berjumlah tiga buah. Sepal bagian atas disebut sepal dorsal, sedangkan dua lainnya disebut sepal lateral. Anggrek memiliki tiga buah petal. Petal pertama dan kedua letaknya berseling dengan sepal. Petal ketiga mengalami modifikasi menjadi
labellum (bibir). Pada labellum terdapat gumpalan-gumpalan yang
anggrek sangat bervariasi dan berfungsi untuk menarik serangga hingga pada bunga untuk mengadakan polinasi (penyerbukan).
Colum (tugu) yang terdapat pada bagian tengah bunga merupakan tempat alat reproduksi jantan dan alat reproduksi betina. Pada ujung columnya terdapat anter atau kepala sari yang merupakan gumpalan serbuk sari atau polinia. Polinia tertutup dengan sebuah cap (anther cap). Stigma (kepala putik) terletak di bawah rostellum dan menghadap ke labellum. Ovarium bersatu dengan dasar bunga dan terletak di bawah colum, sepal, dan petal.
Biji anggrek tidak mengandung endosperm. Oleh karena itu, perkecambahannya dilakukan menggunakan media kultur jaringan.Biji pada tanaman anggrek diperoleh melalui proses penyerbukan (polinasi) yang diikuti dengan pembuahan. Persilangan pada tanaman anggrek tidak bisa terjadi secara alami kecuali pada jenis anggrek tertentu, oleh karena anggrek memiliki struktur bunga yang khas dengan kepala putik yang terletak di dalam maka sulit terjangkau serangga. Penyerbukan alami dengan bantuan angin juga jarang terjadi. Salah satu cara adalah penyerbukan dengan bantuan manusia (Andayani, 2007).
Bentuk dan ukuran buah anggrek yang disebut dengan capsule sangat bervariasi, dari yang berukuran kecil seperti pada Dendrobium
canaliculatum sampai berukuran besar pada Catlleya. Bentuk buah
umumnya lonjong dengan sedikit variasi, ada yang bulat gemuk, dengan kulit buah licin, ada yang memiliki semacam rambut dan sebagainya (Sutopo, 2009)
2. Studi Keragaman DNA dengan Penanda RAPD dan ISSR
Karakter genotipik dapat dilakukan secara sitologi dan molekuler (Fatchiyah et al., 2011). Seiring berkembangnya teknologi ada beberapa teknik dan penanda untuk menganalisis hubungan kekerabatan dengan penanda molekuler. Penanda molekuler tersebut antara lain RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism), RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeat), ISSR (InterSimple
Sequence Repeat). RAPD adalah suatu metode yang dapat digunakan untuk
mempelajari keragaman antar spesies, dalam satu spesies dan antar populasi. Profil konstruksi RAPD memiliki beberapa keunggulan, seperti kecepatan proses, biaya rendah dan penggunaan sejumlah kecil bahan tanaman antara lain pada tanaman Trichodesma indicum (Verma et al., 2009). RAPD merupakan dasar dari metoda pendeteksian aksesi-aksesi anggrek yang dijadikan tetua maupun hasil persilangannya, misalnya untuk identifikasi kultivar Dendrobium, penanda RAPD mampu membedakan tetua dalam persilangan antar atau intra-sectional dan diperoleh hibrida (Inthawong et al., 2006).
Beberapa penelitian menggunakan teknik RAPD antara lain, keragaman genetik pada tanaman hias antara lain anggrek Doritis (Katengam dan Padcharee, 2008), pada tanaman anggrek Aerides (Sivanaswari et al., 2011), identifikasi analisis genetik pada anggrek Vanda (Tanee et al., 2012), karakterisasi anggrek Phalaenopsis (Niknejad et al., 2009), interspesifik hibridisasi Begonia (Chen dan Mii, 2012), variasi genetik spesies Iris (Azimi et al., 2012). Selain itu studi keragaman genetik pada tanaman pangan dan lainnya lainnya misalnya perbedaan genetik interspesifik dan analisis kekerabatan genus Jatropha (Sudheer, 2009), evaluasi keragaman genetik Pisum sativum (Gowhar et al., 2010) dan identifikasi keragaman genetik salak Jawa (Nandariyah, 2007).
Metode RAPD dapat menunjukkan perbedaan dari masing-masing jenis anggrek yang diidentifikasi. Hal ini dapat dilihat dengan adanya pola-pola keragaman anggrek (Sulistianingsih et al., 2010; Parab dan Krishnan, 2008; Susantidiana et al., 2009). Tanaman anggrek merupakan tanaman
hias yang memiliki pola keragaman yang tinggi (Maiti et al., 2009; Xue et al., 2010; Khosravi et al., 2009). Tanaman ketumbar (Coriandrum sativum)
memiliki pola pita polimorfisme dengan persentase 43.24%, (Nisha et al., 2011) lebih tinggi dari Dacydium pierrei 33,3% dan Cathaya argrophylla (32%) (Wang et al., 2009).
Marka ISSR dihasilkan oleh amplifikasi DNA dengan PCR yang menggunakan primer tunggal. Intersimple Sequence Repeats (ISSR) digunakan untuk membentuk hubungan kekerabatan Grevillea, tanaman asli Australia (Pharmawati et al., 2004), penentuan kekerabatan strawberry (Fragaria ananassa Duch) yang diambil dari Fruit Breeding Departmen’s, Research Institute of Pomologi and Floriculture, Polandia (Kuras et al.,
2004), keragaman genetik gandum di Cina Barat (Hou et al., 2005).
Intersimple Sequence Repeats (ISSR) memiliki reproduksibilitas
tinggi dari pada RAPD pada beberapa tanaman (Guo et al., 2009), karena penggunaan primer yang lebih panjang (16-25) basa nukleotida) dibandingkan primer RAPD (10 basa nukleotida), yang menggunakan suhu annealing yang tinggi (45-600 C). Intersimple Sequence Repeats (ISSR) kebanyakan tersegregasi sebagai marka yang dominan mengikuti penurunan Hukum Mendel (Astarini, 2009). Penanda bersifat dominan, yaitu tidak dapat membedakan individu yang homozigot dan heterozigot, sedangkan penanda kodominan dapat membedakan individu yang homozigot dan heterozigot. Sampai saat ini informasi mengenai keragaman genetik hasil persilangan tanaman anggrek yang dapat digunakan untuk perbaikan karakter belum banyak tersedia.
3. Persilangan Anggrek
Hibridisasi atau persilangan adalah metode dalam menghasilkan kultivar tanaman baru yaitu dengan cara menyilangkan dua atau lebih tanaman yang memiliki konstitusi genetik berbeda dengan tujuan untuk menggabungkan karekter-karakter baik dalam satu tanaman, menambah keragaman genetik, memperluas variabilitas genetik tanaman melalui rekombinasi gen, dan untuk mendapatkan hibrid vigor. Pemilihan tetua
atau kombinasi hibrid merupakan hal yang sangat penting dalam pemuliaan tanaman dan hal tersebut sangat menentukan keberhasilan atau kegagalan program pemuliaan (Poehlman dan Quick 1983 dalam Damayanti 2006).
Persilangan anggrek ditujukan untuk mendapatkan varietas baru dengan warna dan bentuk yang menarik, mahkota bunga kompak dan bertekstur tebal sehingga dapat tahan lama sebagai bunga potong, jumlah kuntum banyak dan tidak ada kuntum bunga yang gugur dini akibat kelainan genetis serta produksi bunga tinggi (Hadi, 2005). Menurut Andayani (2007) persilangan pada anggrek dapat dilakukan melalui perlakuan penyerbukan sendiri atau penyerbukan silang. Penyerbukan sendiri artinya putik satu bunga diserbuki dengan benangsari (polen) berasal dari bunga yang sama. Penyerbukan silang artinya putik pada satu bunga diserbuki dengan menggunakan serbuksari yang berasal dari bunga pada tanaman lain tetapi masih satu jenis tanaman.
Pemilihan tetua merupakan tahap awal yang sangat penting dalam menentukan keberhasilan suatu program hibridisasi. Menurut Widiastoety et al. (2010) dalam pemilihan induk jantan dan betina yang akan
disilangkan harus disertai penguasaan sifat-sifat kedua induk tersebut, termasuk sifat dominan seperti ukuran bunga, warna dan bentuk bunga yang akan muncul pada turunannya. Agar persilangan berhasil, sebaiknya dipilih induk betina yang mempunyai kuntum bunga yang kuat, tidak cepat layu atau gugur, mempunyai tangkai putik dan bakal buah yang lebih pendek agar tabung polen dapat mudah mencapai kantong embrio yang terdapat pada bagian bawah bakal.
Persilangan bisa dikatakan berhasil apabila 3-4 hari setelah persilangan tangkai kuntum bunga induk betina masih segar atau berwarna kehijauan. Beberapa hari kemudian kelopak dan mahkota bunganya layu, kering dan akhirnya rontok, kemudian muncul calon buah yang berbentuk bulat telur dan berwarna hijau (Iswanto, 2005). Setelah terjadi fertilisasi, zigot akan terbentuk yang selanjutnya tumbuh dan berkembang menjadi embrio di dalam biji. Setelah terbentuk, zigot dapat dikecambahkan atau
ditumbuhkan secara in vitro. Proses tersebut dapat berlangsung apabila ada kecocokan antara pollen dan ovum (Darmono, 2006).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam menyilangkan anggrek adalah persilangan sebaiknya dilakukan pada pagi hari. Persilangan akan berhasil bila dilakukan sehari atau dua hari setelah bunga mekar atau minggu pertama sampai minggu kelima sejak bunga mekar (Darmono, 2003 cit. Hartati, 2006). Mekarnya kuncup-kuncup bunga merupakan suatu tanda bahwa putik telah masak dan siap untuk menerima serbuk sari yang akan disilangkan (Darjanto dan Siti, 1990 dalam Hartati, 2008). Melalui persilangan menyebabkan munculnya genotip - genotip baru yang dapat menambah karakter tanaman. Menurut Chaudari (1971) dalam Rostini (2005), walaupun persilangan tidak menghasilkan gen-gen baru, namun rekombinasi genetik dari gen-gen yang dimiliki kedua tetua memungkinkan diperolehnya variasi atau kombinasi gen-gen baru. Penelitian Tanee et al. (2012) pada tanaman hybrid Vanda dibandingkan dengan tetuanya, dengan analisis RAPD dapat membedakan anggrek liar, hibrida, spesies pada tiga kelompok yang berbeda.
4. Sitologi Anggrek
penampilannya. Hal ini dikarenakan ukuran kromosom dan posisi sentromernya berbeda.
Ramesh dan Renganathan (2013a) menyatakan bahwa spesies
Coelogyne corymbosa memiliki kromosom 2n=26 dan Coelogyne
fimbriata 2n=22, dan disebut sebagai diploid sedangkan pada penelitian
sebelumnya menyatakan bahwa spesies tersebut memiliki kromosom 2n=44. Pada anggota Orchidaceae, menunjukkan variasi kromosom somatik yang dipelajari dari 2n=10 sampai 40. Spesies yang memiliki kromosom somatik 30 yaitu Coelogyne breviscapa 2n=32 dan Coelogyne cristata 2n=26 dianggap sebagai triploid.
Anggrek yang memiliki jumlah kromosom n=19 lebih banyak dari pada yang memiliki jumlah kromosom n=20. Terdapat sekitar 280 spesies anggrek memiliki jumlah kromosom n=19, sedangkan yang memiliki jumlah kromosom n=20 sekitar 274 spesies. Anggrek Phalaenopsis pinlong cinderela dan Phalaenopsis Joane Killeup June memiliki jumlah kromosom 2n=40 (Hartati, 2010). Anggrek alam tetua Paraphalaeonopsis serpentilingua memiliki jumlah kromosom 2n=40, hasil persilangannya menunjukkan jumlah kromosom 2n=38. Anggrek tetua Rhyncostiles gigantea common memiliki jumlah kromosom 2n=40, hasil persilangannya
2n=40. Tetua Paraphalaeonopsis labukensis memiliki jumlah kromosom 2n=40, hasil persilangannya 2n=38 (Hartati, 2011). Penelitian Balanos et
al. (2008), membuktikan bahwa kromosom induk Phalaenopsis sp
mempunyai 2n=38 tetapi pada keturunannya Doritaenopsis memberikan hasil jumlah kromosom yang berbeda 2n=76.
B. Kerangka Berpikir
Indonesia memiliki kekayaan ragam plasma nutfah anggrek yang bernilai ekonomis dan belum semua teridentifikasi. Salah satu anggrek yang mempunyai nilai ekonomis tinggi adalah anggrek hitam (Coelogyne pandurata) yang berasal dari Provinsi Kalimantan Timur. Anggrek hitam
mempunyai karakter bunga yang unik yakni berukuran besar, berwarna hijau dengan lidah hitam tersusun pada rangkaian tandan dengan panjang
15-20 cm dan jumlah bunganya mencapai 14 kuntum per tandan. Warna hitam pada lidah bunga merupakan sifat yang langka, yang dibutuhkan oleh para ahli pemuliaan tanaman untuk menghasilkan silangan baru..
Oleh karena di habitat aslinya jenis ini sudah sukar ditemukan, maka usaha pembudidayaan dan peningkatan ragam genetik harus dilakukan, salah satunya adalah dengan melakukan persilangan dengan jenis lain.
Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan persilangan pada tanaman anggrek adalah kedekatan hubungan kekerabatan. Tanaman anggrek yang berkerabat dekat akan meningkatkan peluang keberhasilan. Oleh karena itu untuk melakukan persilangan pada Coelogyne pandurata perlu dilakukan seleksi tetua yakni spesies lain dari genus Coelogyne spp
Untuk mengetahui keragaman dan hubungan kekerabatan pada tanaman anggrek dapat dilakukan dengan karakterisasi menggunakan penanda morfologi dan karakterisasi menggunakan penanda molekuler. Karakterisasi menggunakan penanda morfologi biasanya dipengaruhi lingkungan. Penanda molekuler dapat memberikan gambaran yang lebih akurat, karena analisis deoxyribo nucleid acid (DNA) sebagai materi genetik tidak dipengaruhi lingkungan. Penanda molekuler RAPD merupakan salah satu yang dimanfaatkan dalam kegiatan pemuliaan anggrek. Hasil karakterisasi menggunakan penanda morfologi dan molekuler RAPD digunakan untuk menyeleksi tetua yang mempunyai kedekatan genetik dengan anggrek hitam (Coelogyne pandurata).
Tetua terpilih tersebut akan digunakan sebagai bahan persilangan. Metode persilangan yang digunakan juga dapat menentukan keberhasilan persilangan. Untuk itu persilangan antara Coelogyne pandurata dengan tetua terpilih perlu diuji dengan menggunakan metode crossing, reciprocal dan selfing.
Keragaman pada hasil persilangan anggrek dapat diketahui dengan menggunakan analisis sitologi, flow cytometry, molekuler RAPD dan ISSR. Dengan analisis tersebut akan dapat diprediksi apakah F1 dari hasil persilangan anggrek menghasilkan karakter baru yang berbeda dari
induknya.
Upaya memecahkan permasalahan kelangkaan anggrek hitam Coelogyne pandurata di atas maka penelitian ini dilaksanakan melalui alur
penelitian yang tersaji pada Gambar 1 berikut.
C. Hipotesis
1. Terdapat keragaman dan kedekatan genetik (kekerabatan) Coelogyne pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp.
2. Terdapat persilangan yang kompatibel antara Coelogyne pandurata dengan dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp.
3. Terdapat varian baru pada F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp. berdasarkan sitologi (kromosom dan tingkat ploidi)
4. Terdapat varian baru pada F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp. berdasarkan penanda molekuler RAPD dan ISSR (InterSimple Sequence Repeats).
D. Kebaharuan (Novelty)
Kebaharuan (novelty) yang telah didapatkan dari beberapa kajian yang dilakukan adalah:
1. Metode persilangan yang kompatibel antara Coelogyne pandurata dengan Coelogyne rumphii.
2. Teridentifikasi susunan kromosom anggrek Coelogyne pandurata diploid (2n=2x=36) dan Coelogyne rumphii tetraploid (2n=4x=72) 3 Diperoleh varian baru F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dan
Coelogyne rumphii berdasarkan analisis sitologi yang mempunyai susunan kromosom triploid 2n=3x=54
4 Diperoleh varian baru F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dan Coelogyne rumphii berdasarkan analisis molekuler.
17
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat Penelitian
Karakterisasi morfologi dan persilangan dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI Bogor, Analisis flow cytrometry, Analisis molekuler dilakukan di Laboratorium Pusat Kajian Hortikultura dan Tropika IPB Bogor dan Laboratorium Genetika Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor, Analisis Sitologi dilakukan di Laboratorium Sitologi Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor.
B. Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan April 2012 sampai Nopember 2014
C. Tatalaksana Penelitian
Tahap-tahap kegiatan penelitian meliputi lima kajian
1. Identifikasi keragaman anggrek Coelogyne spp berdasarkan karakter morfologi.
Penelitian dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI Bogor Jawa Barat.
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian merupakan koleksi tanaman di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebon Raya LIPI Bogor meliputi 6 spesies anggrek dari genus Coelogyne spp yaitu C. pandurata, C. massangeana, C. mayeriana, C. asperata, C. celebensis dan C. rumphii.
Identifikasi karakter morfologi dilakukan secara deskriptif berdasarkan pengamatan langsung dan pendokumentasian bagian-bagian tanaman anggrek Coelogyne spp, meliputi 45 karakter (Gravendeel and Voogel, 2000), terdapat pada lampiran 6.
UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Arithmatic Average) fungsi SimQual (Rohlf, 1998).
Coelogyne pandurata Coelogyne massangeana
Kalimantan Timur Sumatra Barat
Coelogyne mayeriana Coelogyne asperata
Kalimantan Barat Kalimantan
Coelogyne celebensis Coelogyne rumphii
Sulawesi Selatan Sulawesi Selatan
Gambar 2. Bahan penelitian tanaman anggrek Coelogyne spp.
2. Identifikasi keragaman genetik anggrek Coelogyne spp berdasarkan penanda molekuler RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Penelitian ini dilaksanakan di Pusat Kajian Hortikultura dan Tropika (PKHT) IPB Bogor dan Laboratorium Genetika Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi 6 spesies: Coelogyne pandurata, C. massangeana, C. mayeriana, C. asperata, C.
celebensis dan C. rumphii.
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah: CTAB, H2O, HCl, NaCL, EDTA, PVPP, NaCl, merkaptoetanol, CIAA (kloroform isoamylalkohol), Na Asetat, primer, master mix untuk PCR, agarose, buffer TAE, dan buffer TE gel loading.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi timbangan analitik, mesin centrifuge, vortex, inkubator, gene quant, asppirator, , mesin PCR, elektroforesis tank, cetakan agarose, biorad dan kamera digital.
Tahapan penelitian meliputi ekstraksi DNA, uji kuantitas dan kualitas DNA, reaksi amplifikasi, dan elektroforesis.
DNA genom diekstraksi dari daun muda menurut metode CTAB (Doyle dan Doyle, 1987), dengan beberapa modifikasi. Uji kualitas DNA, membuat elektroforesis agarosa dan dimasukkan ke dalam cetakan yang mengandung TAE penyangga. Mempersiapkan DNA lambda sebagai pembanding. Pencampuran setiap sampel DNA dengan pewarna pemuatan sebagai pemberat.
Seleksi primer Operon Technology (Operon Almaeda, 2000) digunakan untuk mendapatkan produk amplifikasi dengan tingkat polimorfisme yang tinggi. Primer yang digunakan adalah 11 primer dari 15 primer yang diuji adalah OPA 02, OPA 07, OPA 09, OPA 13, OPA 16, OPB 12, OPB17, OPB 18, OPD 02, OPD 08 dan OPD11. Adapun jenis primer dan urutan nukleotida yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1 berikut:
Tabel 1. Jenis primer dan urutan nukleotida penyusunnya
No Primer Sequence 5’ to 3’
1 OPA-02 TGCCGAGCTG
2 OPA-07 GAAACGGGTG
3 OPA-09 GGGTAACGCC
4 OPA-13 CAGCACCCAC
5 OPA-16 AGCCAGCGAA
6 OPB-12 CCTTGACGCA
7 OPB-17 AGGGAACGAG
8 OPB-18 CCACAGCAGT
9 OPD-02 GGACCCAACC
10 OPD-08 GTGTGCCCCA
11 OPD-11 AGCGCCATTG
Amplifikasi PCR dilakukan sebanyak 45 siklus yang terdiri dari beberapa tahap yaitu preheating 95oC selama 5 menit, denaturasi suhu 95oC selama 30 detik, annealing 36oC selama 30 detik, elongasi 72oC selama 1 menit dan elongasi akhir 72oC selama 5 menit. Proses elektroforesis dilakukan untuk mengetahui kenampakan pita DNA. Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati di bawah UV transluminator kemudian difoto dengan kamera.
Analisis Data
Keragaman genetik diamati dengan menentukan skor berdasarkan ada atau tidaknya pita DNA. Pita DNA diterjemahkan dalam data biner, jika ada nilai 1 dan jika tidak ada nilai 0. Analisis pengelompokan dilakukan secara cluster analysis menggunakan program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariative Analysis System) versi 2.02 (Rolhf, 1998) dengan metode Unweight Pair Group Method Arithmetic (UPGMA) fungsi SIMQUAL (Similarity Qualitative). Matrik kemiripan menggunakan koefisien Dice (Rolhf, 1998), sehingga akan diperoleh dendrogram hubungan kekerabatan anggrek Coelogyne spp.
3. Teknik Hibridisasi untuk menambah ragam genetik anggrek hitam (Coelogyne pandurata)
Hasil kajian pertama dengan penanda morfologi dan kajian kedua dengan penanda molekuler diperoleh tetua terpilih C. rumphii yang mempunyai kedekatan genetik dengan C. pandurata, yang akan digunakan sebagai bahan hibridisasi. Persilangan dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya LIPI Bogor, dilanjutkan penumbuhan biji secara invitro di laboratorium Kultur Jaringan Kebon Raya Bogor dan di Laboratorium Fisiologi dan Bioteknologi Fakultas Pertanian UNS.
rumphii. Alat yang digunakan adalah pinset, tusuk gigi, kertas label, benang, dan loupe.
Persilangan dilakukan pada pagi hari pukul 07.00 – 10.00 pada tanaman yang telah mekar penuh dengan menyilangkan induk C. pandurata dan C. rumphii sebagai tetua jantan atau betina. Polinia ditransfer dari anther ke stigma dengan menggunakan tusuk gigi steril. Persilangan dilakukan pada 4 individu yang berbunga sebagai ulangan, dengan metode sebagai berikut: (i) crossing: C. pandurata sebagai induk betina yaitu polinia ditransfer ke dalam stigma antara dua bunga yang berbeda berasal dari dua individu tanaman, (ii) reciprocal: C. pandurata sebagai induk jantan, (iii) selfing yaitu polinia ditransfer ke dalam stigma pada satu bunga dalam satu tanaman.
Setelah penyerbukan dilakukan pengamatan persentase keberhasilan persilangan, buah rontok dan kemasakan buah serta terbentuknya protokorm diamati secara teratur.
4. Identifikasi hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan Coelogyne rumphii berdasarkan analisis sitologi dan flow cytometry.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika dan Laboratorium Sitologi Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tetua anggrek C. pandurata, tetua anggrek C. rumphii, F1 hasil persilangan ♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii, F1 hasil persilangan ♀ C. rumphii x ♂ C. pandurata.
Metode penelitian meliputi dua percobaan: Analisis Sitologi dan Flow Cytometry
a. Analisis Sitologi
Analisis sitologi ini dilakukan untuk mengetahui jumlah kromosom, bentuk kromosom dan ukuran kromosom tetua dan hasil silangannya. Cara kerja: ujung akar sepanjang 1 cm dimasukkan ke dalam botol berisi 8-Hydroxyquinoline 0.002 M dan disimpan selama 24 jam pada suhu 200C, selanjutnya ujung akar difiksasi dengan asam asetat 45% selama 10 menit, akar dipindahkan ke dalam larutan HCL 1 N : asam asetat 45% (3:1) pada
suhu 600C selama 2-2.5 menit (dipanaskan), pewarnaan akar menggunakan orcein 2%. Ujung akar dipotong sepanjang 1-2 mm, kemudian diletakkan diatas gelas objek dan ditutup dengan gelas penutup dengan media orcein 2%, selanjutnya ujung akar dipijit atau dipukul-pukul halus dengan pinset dan dipanaskan, preparat diamati dengan mikroskop Olympus CX31. Sel terpilih diamati dengan perbesaran 40 x 10, kromosom dihitung dengan perbesaran 1000 x. Dari tiap preparat yang berisi ujung akar, dipilih beberapa sel yang menunjukkan fase metaphase dan tidak terjadi tumpang tindih antar sel dan antar kromosom, pada fase tersebut kromosom tampak menyebar, sehingga memudahkan dalam pengamatan.
Variabel pengamatan jumlah kromosom dilaksanakan dengan menggunakan metode squash menurut Darnaedi (1991) dan Manton (1950). Pengamatan meliputi jumlah kromosom, ukuran kromosom dan bentuk kromosom. Penentuan bentuk kromosom mengacu pada cara Ciupercescu et al. (1990) cit. Parjanto et al. (2003), dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Bentuk kromosom berdasarkan rasio lengan kromosom Bentuk kromosom Rasio lengan
⁄
Metasentrik (m) Submetasentrik (sm) Akrosentrik (a) Telosentrik (t)
1,0 < r ≤ 1,7 1,7 < r ≤ 3,0 3,0 < r ≤ 7,0
≥ 7,0
b. Analisis Flow Cytometry
Analisis Flow Cytometry dilakukan untuk mengetahui tingkat ploidi tetua dan hasil silangannya. Cara kerja: Potongan daun (0.5 cm2) dicacah menggunakan silet di dalam cawan petri yang berisi 250 µl buffer ekstraksi. Setelah 30 – 90 detik buffer ekstraksi disaring menggunakan Partec 30 µl Cell Trics filter. Pewarnaan menggunakan buffer PI (Propidium Iodide) dan RNAse (1 ml), selanjutnya diinkubasi selama 30 menit sebelum dianalisis dalam flow cytometry.
5. Identifikasi hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan Coelogyne rumphii menggunakan marka molekuler RAPD dan ISSR.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tetua tanaman anggrek C. pandurata, tetua anggrek C. rumphii, F1 hasil persilangan ♀ C. pandurata x ♂ C. rumphii, F1 hasil persilangan ♀ C. rumphi x ♂C. pandurata.
Metode penelitian meliputi ekstraksi DNA, genom DNA diekstraksi mengikuti metodologi yang dijelaskan oleh Doyle dan Doyle (1987), dengan beberapa modifikasi. Isolasi sampel daun segar + 0.4 g, daun segar digerus dengan pestle dalam tube 1.5 ml sampai halus, ditambah + 0.03 g PVP dan + 0.1 g pasir kuarsa (untuk membantu penggerusan), Memasukkan sampel yang sudah halus kedalam tube (1.5 ml) yang telah diisi dengan 800 ul buffer ekstraksi, kemudian diInkubasi dalam suhu 65oC selama 1 jam di waterbath. Ditambahkan 700 ul C:I (chloroform:isoamil alkohol, 24:1) dan di campur rata kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu kamar. Mengambil supernatan yang terbentuk 500 ul kemudian ditambahkan 500 ul Et-OH absolut kemudian diinkubasi dalam freezer -20oC selama 12 jam. Sentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit, kemudian buang supernatan, kemudian dikeringanginkan 15 menit, pellet dilarutkan dengan 300 ul ddH2O kemudian ditambah 15 ul RNAse (200 ug/ ml). Diinkubasi dalam suhu 37oC selama 30 menit dan tambahkan 300 ul PCI (phenol chloroform isoamilalkohol, 24:1:1) lalu di campur. Sentrifuse dengan kecepatan 12.000
pelet dikeringkan dengan dikering anginkan. Pelet yang terbentuk diencerkan dengan 25 ul TE.
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis dengan membandingkan dengan DNA lamda. Hal ini dilakukan untuk mengetahui tingkat kualitas DNA: a. Agarose dibuat dan diletakkan dalam cetakan elektroforesis dan dibiarkan sampai padat, b. Gel agarose dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE, sampai terendam, c. DNA lambda disiapkan sebagai pembanding. d. Masing-masing DNA sampel dicampur dengan loading dye sebagai pemberat, e. DNA lambda dan DNA sampel yang telah dicampur dengan loading dye dimasukkan pada sumuran gel elektroforesis, kemudian dilakukan elektroforesis selama 57 menit pada voltase 50 volt, f. Gel hasil eletroforesis direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) selama 30 menit, g. Hasil elektroforesis diamati di bawah UV transluminator kemudian difoto dengan kamera, h. Hasil foto dilihat dan dibandingkan antara DNA sampel dengan DNA lambda, dengan ditandai ada atau tidaknya pita DNA.
Seleksi primer dari Operon Technology (Operon Almaeda, 2000) digunakan untuk mendapatkan produk amplifikasi dengan tingkat polimorfisme yang tinggi.
Enam RAPD primer: OPA-02, OPA-07, OPB-12, OPB-17, OPB-18, OPD-11 (Operon Technology Ltd) dan empat primer ISSR yang dipilih adalah primer yang digunakan pada anggrek Cattleya labiata (Lucas et al., 2012) yaitu UBC 814, UBC 826, UBC 807 dan UBC 810 dan pada anggrek Cymbidium sinense ( Jiang et al., 2011) yaitu UBC 826 dan UBC 807.
Analisis data
Analisis keragaman genetik berdasarkan data fragmen DNA yaitu ada atau tidaknya pita DNA. Profil pita DNA diterjemahkan dalam data biner dengan ketentuan nilai 0 untuk tidak ada pita dan nilai 1 untuk ada pita DNA pada satu posisi yang sama dari jenis anggrek yang dibandingkan. Untuk mengetahui besarnya keragaman maupun kemiripan genetik antar individu tetua dan hasil persilangan dengan menggunakan analisis klaster atau gerombol. Analisis klaster dilakukan dengan program NTSYSpc versi
2.02i dengan metode UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Arithmatic Average) fungsi SimQual (Rohlf, 1998).
26
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian
1. Identifikasi Keragaman Genetik Coelogyne spp berdasarkan Penanda Morfologi
a. Pendahuluan
Family Orchidaceae, salah satu family tanaman bunga terbanyak, dengan keragaman spesies yang tinggi (Wallace, 2003; Niknejad et al., 2009). Karakterisasi tanaman merupakan kegiatan untuk menemukan deskripsi masing-masing spesies digunakan sebagai bahan untuk menentukan hubungan kekerabatan antar spesies. Hubungan kekerabatan berbagai jenis tanaman merupakan sumber informasi awal untuk hibridisasi untuk menghasilkan variasi. Xu et al. (2010) menyatakan bahwa semakin jauh hubungan genetik tanaman, semakin sulit untuk persilangan. Maka dibutuhkan untuk proses penentuan kekerabatan berbagai macam jenis anggrek.
Penentuan kekerabatan dapat dilakukan fenotipe dengan pengamatan morfologis. Salah satu keberhasilan persilangan adalah hubungan erat antara kekerabatan genetik tetua. Oleh karena itu, perlu untuk mengidentifikasi keragaman genetik dan menentukan kedekatan genetik antara C. pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne digunakan sebagai tetua dengan menggunakan penanda morfologi.
b. Bahan dan Metode
Bahan tanaman koleksi dari Pusat Konservasi tumbuhan Kebun Raya LIPI Bogor beberapa spesies Coelogyne spp (Tabel 3)
Tabel 3. Bahan tanaman berdasarkan asal dan ketinggian tempat
No Nama anggrek Asal Ketinggian
tempat (m. dpl)
1 Coelogyne pandurata Kalimantan Timur 100
2 Coelogyne massangeana Sumatra Barat 1150-2100
3 Coelogyne mayeriana Jambi 100
4 Coelogyne asperata Kalimantan Barat 320/ 1000
5 Coelogyne celebensis Sulawesi Selatan 826/ 220
6 Coelogyne rumphii Sulawesi Selatan 100-2000
Metode penelitian: Penelitian dilakukan dengan cara pengamatan morfologi secara langsung dan mendokumentasikan bagian-bagian dari 6 spesies anggrek Coelogyne. Karakterisasi dilakukan terhadap batang, daun, bunga serta akar meliputi 45 karakter dengan menggunakan skoring menurut Gravendeel dan Vogel (2000), terdapat pada lampiran 6.
Analisis data dilakukan menggunakan skoring data morfologi dari deskripsi menjadi data biner. Karakter morfologi dianalisis dengan menandai ada (1) atau tidak ada (0) untuk setiap karakter yang dihasilkan.
Untuk mengetahui besarnya keragaman maupun kemiripan antar individu menggunakan analisis klaster/ gerombol. Analysis klaster dilakukan dengan program NTSYSpc versi 2.02i dengan metode UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Arithmatic Average) fungsi SimQual (Rohlf, 1998).
c. Hasil dan Pembahasan
Identifikasi morfologi dari enam spesies Coelogyne yaitu C. pandurata, C. massangeana, C. mayeriana, C. asperata, C. celebensis dan
C. rumphii meliputi 45 karakter (Gravendeel dan Vogel, 2000) seperti rimpang, umbi semu, tipe perbungaan, batang penumpu, tangkai majemuk, daun pelindung, bakal buah, mahkota, kelopak, bibir, kepingan ketiga pada bibir bunga, epichile, leher tugu, benang sari, tangkai memanjang alat kelamin jantan dan betina.
