A. Tinjauan Pustaka
1. Morfologi Tanaman Anggrek
Anggrek genus Coelogyne spp, terdiri dari 200 spesies yang tersebar di seluruh Asia Tenggara dengan pusat keragaman utama di Kalimantan, Sumatera, dan Himalaya. Kebanyakan tumbuh di daerah tropis dataran rendah dan hutan. (Butzin, 1992 dalam Gravendeel et al., 2001).
Klasifikasi anggrek Coelogyne sebagai berikut: Kerajaan : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Orchidales Famili : Orchidaceae Genus : Coelogyne
Anggrek Coelogyne spp mempunyai tipe pertumbuhan epifit, bentuk daun ellipticus, perbungaan muncul diantara 2 ketiak daun dengan bentuk daun lanseolatus (Musa et al., 2013). Empat tipe tanaman anggrek berdasarkan tempat tumbuhnya menurut Sumardi dan Prabowo (2010); Syukur et al., 2012 yaitu: (a). Anggrek epifit tumbuh menunpang pada batang atau cabang lain. Contoh: anggrek bulan, Dendrobium sp., Cattleya sp. (b). Anggrek terestrial juga disebut anggrek tanah adalah anggrek yang tumbuh di tanah dan membutuhkan cahaya matahari langsung. Contoh: Vanda sp., Arachnis sp. (c). Anggrek Litofit adalah anggrek yang tumbuh pada batu-batuan atau tanah berbatu dan tahan terhadap cahaya matahari penuh. Anggrek ini mengambil makanan dari air hujan, udara, humus. Contoh: Cytopedium, Paphiopedilum. (d). Anggrek saprofit tumbuh pada media yang mengandung humus atau daun-daun kering serta membutuhkan sedikit cahaya matahari. Contoh: Calanthe, Gooddyera sp.
Tipe pertumbuhan tanaman anggrek epifit menurut Sutopo (2009) yaitu (a). Monopodial, yakni anggrek yang hanya memiliki satu batang dan satu titik tumbuh. Batang utama terus tumbuh dan tidak terbatas
panjangnya. Bentuk batangnya ramping dan tidak berumbi. Tangkai bunga akan keluar di antara dua ketiak daun. Anggrek jenis ini dapat diperbanyak dengan cara stek, batang dan biji. Contoh genus Aerides, Arachnis, Vanda, Phalaenopsis, Renanthera dan lain-lain. (b). Simpodial adalah anggrek yang memiliki batang utama yang tersusun oleh ruas-ruas tanaman. Batang utama berhenti tumbuh pada akhir musim, dan akan menghasilkan pertumbuhan baru pada musin berikutnya. Anggrek tipe simpodial mempunyai batang yang berumbi semu (pseudobulb) yang berfungsi sebagai cadangan makanan, yang tumbuh pada setiap akhir musim pertumbuhan, seringkali dilanjutkan dengan fase berbunga. Akar anggrek tumbuh dari risom, bentuknya silindris, menebal, berbentuk benang atau bercabang dan biasanya panjang seperti Aerides.
Bunga anggrek berkelamin dua (hermaprodit), yaitu pollen dan putik terdapat di dalam satu bunga, sedangkan karakter kelaminnya adalah monoandrae yaitu kelamin jantan dan betina terletak pada satu tempat (Syukur et al., 2012). Pada umumnya bunga anggrek tersusun dalam bentuk lateral inflorescence seperti Cymbidium, Oncidium, Odontoglossum, Lycaste dan Phaius. Tetapi adapula bunga yang muncul dari bagian dasar atau samping pseudobulb, tumbuh pada pseudobulb pendek tanpa daun-daun atau muncul langsung dari risom diantara pseudobulb (Sutopo, 2009). Bunga anggrek tersusun dalam karangan bunga. Jumlah kuntum bunga pada satu karangan dapat terdiri dari satu sampai banyak kuntum. Karangan bunga pada beberapa spesies letaknya terminal, sedangkan pada sebagian besar letaknya aksilar (Ayu et al., 2012). Menurut Comber (2001), bunga anggrek memiliki beberapa bagian utama yaitu sepal (daun kelopak), petal (daun mahkota), stamen (benang sari), pistil (putik) dan ovarium (bakal buah). Sepal anggrek berjumlah tiga buah. Sepal bagian atas disebut sepal dorsal, sedangkan dua lainnya disebut sepal lateral. Anggrek memiliki tiga buah petal. Petal pertama dan kedua letaknya berseling dengan sepal. Petal ketiga mengalami modifikasi menjadi
labellum (bibir). Pada labellum terdapat gumpalan-gumpalan yang
mengandung protein, minyak dan zat pewangi. Warna bunga tananan commit to user
anggrek sangat bervariasi dan berfungsi untuk menarik serangga hingga pada bunga untuk mengadakan polinasi (penyerbukan).
Colum (tugu) yang terdapat pada bagian tengah bunga merupakan tempat alat reproduksi jantan dan alat reproduksi betina. Pada ujung columnya terdapat anter atau kepala sari yang merupakan gumpalan serbuk sari atau polinia. Polinia tertutup dengan sebuah cap (anther cap). Stigma (kepala putik) terletak di bawah rostellum dan menghadap ke labellum. Ovarium bersatu dengan dasar bunga dan terletak di bawah colum, sepal, dan petal.
Biji anggrek tidak mengandung endosperm. Oleh karena itu, perkecambahannya dilakukan menggunakan media kultur jaringan.Biji pada tanaman anggrek diperoleh melalui proses penyerbukan (polinasi) yang diikuti dengan pembuahan. Persilangan pada tanaman anggrek tidak bisa terjadi secara alami kecuali pada jenis anggrek tertentu, oleh karena anggrek memiliki struktur bunga yang khas dengan kepala putik yang terletak di dalam maka sulit terjangkau serangga. Penyerbukan alami dengan bantuan angin juga jarang terjadi. Salah satu cara adalah penyerbukan dengan bantuan manusia (Andayani, 2007).
Bentuk dan ukuran buah anggrek yang disebut dengan capsule sangat bervariasi, dari yang berukuran kecil seperti pada Dendrobium
canaliculatum sampai berukuran besar pada Catlleya. Bentuk buah
umumnya lonjong dengan sedikit variasi, ada yang bulat gemuk, dengan kulit buah licin, ada yang memiliki semacam rambut dan sebagainya (Sutopo, 2009)
2. Studi Keragaman DNA dengan Penanda RAPD dan ISSR
Karakterisasi genotipik adalah karakterisasi dengan memperhatikan susunan gen atau DNA yang merupakan ciri khas dari masing-masing spesies (Jones et al., 1998). Karakterisasi bertujuan untuk mengetahui identitas satu spesies berdasarkan susuan gen atau DNA. Selain itu karakteristik genotipik juga didapatkan pengelompokan atau klaster. commit to user
Karakter genotipik dapat dilakukan secara sitologi dan molekuler (Fatchiyah et al., 2011). Seiring berkembangnya teknologi ada beberapa teknik dan penanda untuk menganalisis hubungan kekerabatan dengan penanda molekuler. Penanda molekuler tersebut antara lain RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism), RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeat), ISSR (InterSimple Sequence Repeat). RAPD adalah suatu metode yang dapat digunakan untuk mempelajari keragaman antar spesies, dalam satu spesies dan antar populasi. Profil konstruksi RAPD memiliki beberapa keunggulan, seperti kecepatan proses, biaya rendah dan penggunaan sejumlah kecil bahan tanaman antara lain pada tanaman Trichodesma indicum (Verma et al., 2009). RAPD merupakan dasar dari metoda pendeteksian aksesi-aksesi anggrek yang dijadikan tetua maupun hasil persilangannya, misalnya untuk identifikasi kultivar Dendrobium, penanda RAPD mampu membedakan tetua dalam persilangan antar atau intra-sectional dan diperoleh hibrida (Inthawong et al., 2006).
Beberapa penelitian menggunakan teknik RAPD antara lain, keragaman genetik pada tanaman hias antara lain anggrek Doritis (Katengam dan Padcharee, 2008), pada tanaman anggrek Aerides (Sivanaswari et al., 2011), identifikasi analisis genetik pada anggrek Vanda (Tanee et al., 2012), karakterisasi anggrek Phalaenopsis (Niknejad et al., 2009), interspesifik hibridisasi Begonia (Chen dan Mii, 2012), variasi genetik spesies Iris (Azimi et al., 2012). Selain itu studi keragaman genetik pada tanaman pangan dan lainnya lainnya misalnya perbedaan genetik interspesifik dan analisis kekerabatan genus Jatropha (Sudheer, 2009), evaluasi keragaman genetik Pisum sativum (Gowhar et al., 2010) dan identifikasi keragaman genetik salak Jawa (Nandariyah, 2007).
Metode RAPD dapat menunjukkan perbedaan dari masing-masing jenis anggrek yang diidentifikasi. Hal ini dapat dilihat dengan adanya pola-pola keragaman anggrek (Sulistianingsih et al., 2010; Parab dan Krishnan, 2008; Susantidiana et al., 2009). Tanaman anggrek merupakan tanaman
hias yang memiliki pola keragaman yang tinggi (Maiti et al., 2009; Xue et al., 2010; Khosravi et al., 2009). Tanaman ketumbar (Coriandrum sativum) memiliki pola pita polimorfisme dengan persentase 43.24%, (Nisha et al., 2011) lebih tinggi dari Dacydium pierrei 33,3% dan Cathaya argrophylla (32%) (Wang et al., 2009).
Marka ISSR dihasilkan oleh amplifikasi DNA dengan PCR yang menggunakan primer tunggal. Intersimple Sequence Repeats (ISSR) digunakan untuk membentuk hubungan kekerabatan Grevillea, tanaman asli Australia (Pharmawati et al., 2004), penentuan kekerabatan strawberry (Fragaria ananassa Duch) yang diambil dari Fruit Breeding Departmen’s,
Research Institute of Pomologi and Floriculture, Polandia (Kuras et al., 2004), keragaman genetik gandum di Cina Barat (Hou et al., 2005).
Intersimple Sequence Repeats (ISSR) memiliki reproduksibilitas tinggi dari pada RAPD pada beberapa tanaman (Guo et al., 2009), karena penggunaan primer yang lebih panjang (16-25) basa nukleotida) dibandingkan primer RAPD (10 basa nukleotida), yang menggunakan suhu annealing yang tinggi (45-600 C). Intersimple Sequence Repeats (ISSR) kebanyakan tersegregasi sebagai marka yang dominan mengikuti penurunan Hukum Mendel (Astarini, 2009). Penanda bersifat dominan, yaitu tidak dapat membedakan individu yang homozigot dan heterozigot, sedangkan penanda kodominan dapat membedakan individu yang homozigot dan heterozigot. Sampai saat ini informasi mengenai keragaman genetik hasil persilangan tanaman anggrek yang dapat digunakan untuk perbaikan karakter belum banyak tersedia.
3. Persilangan Anggrek
Hibridisasi atau persilangan adalah metode dalam menghasilkan kultivar tanaman baru yaitu dengan cara menyilangkan dua atau lebih tanaman yang memiliki konstitusi genetik berbeda dengan tujuan untuk menggabungkan karekter-karakter baik dalam satu tanaman, menambah keragaman genetik, memperluas variabilitas genetik tanaman melalui rekombinasi gen, dan untuk mendapatkan hibrid vigor. Pemilihan tetua
atau kombinasi hibrid merupakan hal yang sangat penting dalam pemuliaan tanaman dan hal tersebut sangat menentukan keberhasilan atau kegagalan program pemuliaan (Poehlman dan Quick 1983 dalam Damayanti 2006).
Persilangan anggrek ditujukan untuk mendapatkan varietas baru dengan warna dan bentuk yang menarik, mahkota bunga kompak dan bertekstur tebal sehingga dapat tahan lama sebagai bunga potong, jumlah kuntum banyak dan tidak ada kuntum bunga yang gugur dini akibat kelainan genetis serta produksi bunga tinggi (Hadi, 2005). Menurut Andayani (2007) persilangan pada anggrek dapat dilakukan melalui perlakuan penyerbukan sendiri atau penyerbukan silang. Penyerbukan sendiri artinya putik satu bunga diserbuki dengan benangsari (polen) berasal dari bunga yang sama. Penyerbukan silang artinya putik pada satu bunga diserbuki dengan menggunakan serbuksari yang berasal dari bunga pada tanaman lain tetapi masih satu jenis tanaman.
Pemilihan tetua merupakan tahap awal yang sangat penting dalam menentukan keberhasilan suatu program hibridisasi. Menurut Widiastoety et al. (2010) dalam pemilihan induk jantan dan betina yang akan disilangkan harus disertai penguasaan sifat-sifat kedua induk tersebut, termasuk sifat dominan seperti ukuran bunga, warna dan bentuk bunga yang akan muncul pada turunannya. Agar persilangan berhasil, sebaiknya dipilih induk betina yang mempunyai kuntum bunga yang kuat, tidak cepat layu atau gugur, mempunyai tangkai putik dan bakal buah yang lebih pendek agar tabung polen dapat mudah mencapai kantong embrio yang terdapat pada bagian bawah bakal.
Persilangan bisa dikatakan berhasil apabila 3-4 hari setelah persilangan tangkai kuntum bunga induk betina masih segar atau berwarna kehijauan. Beberapa hari kemudian kelopak dan mahkota bunganya layu, kering dan akhirnya rontok, kemudian muncul calon buah yang berbentuk bulat telur dan berwarna hijau (Iswanto, 2005). Setelah terjadi fertilisasi, zigot akan terbentuk yang selanjutnya tumbuh dan berkembang menjadi embrio di dalam biji. Setelah terbentuk, zigot dapat dikecambahkan atau
ditumbuhkan secara in vitro. Proses tersebut dapat berlangsung apabila ada kecocokan antara pollen dan ovum (Darmono, 2006).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam menyilangkan anggrek adalah persilangan sebaiknya dilakukan pada pagi hari. Persilangan akan berhasil bila dilakukan sehari atau dua hari setelah bunga mekar atau minggu pertama sampai minggu kelima sejak bunga mekar (Darmono, 2003 cit. Hartati, 2006). Mekarnya kuncup-kuncup bunga merupakan suatu tanda bahwa putik telah masak dan siap untuk menerima serbuk sari yang akan disilangkan (Darjanto dan Siti, 1990 dalam Hartati, 2008). Melalui persilangan menyebabkan munculnya genotip - genotip baru yang dapat menambah karakter tanaman. Menurut Chaudari (1971) dalam Rostini (2005), walaupun persilangan tidak menghasilkan gen-gen baru, namun rekombinasi genetik dari gen-gen yang dimiliki kedua tetua memungkinkan diperolehnya variasi atau kombinasi gen-gen baru. Penelitian Tanee et al. (2012) pada tanaman hybrid Vanda dibandingkan dengan tetuanya, dengan analisis RAPD dapat membedakan anggrek liar, hibrida, spesies pada tiga kelompok yang berbeda.
4. Sitologi Anggrek
Sitologi adalah cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang sel. Kromosom adalah bahan genetik yang terletak di dalam sel. Kromosom adalah suatu struktur makro molekul yang berisi DNA dimana informasi genetik dalam sel disimpan. Perbedaan kromosom menggambarkan perbedaan kandungan genetik pada suatu individu. Individu dalam satu spesies mempunyai jumlah kromosom sama tetapi spesies yang berbeda dalam satu genus mempunyai jumlah kromosom berbeda (Suliartini et al., 2004). Individu-individu dalam satu spesies biasanya mempunyai jumlah kromosom sama, tetapi spesies yang berbeda dalam satu genus sering mempunyai jumlah kromosom berbeda. Tipe dan jumlah kromosom setiap makhluk hidup berbeda-beda. Dengan mikroskop perbesaran 1000x seluruh kromosom dapat dibedakan satu dengan yang lain dari commit to user
penampilannya. Hal ini dikarenakan ukuran kromosom dan posisi sentromernya berbeda.
Ramesh dan Renganathan (2013a) menyatakan bahwa spesies
Coelogyne corymbosa memiliki kromosom 2n=26 dan Coelogyne
fimbriata 2n=22, dan disebut sebagai diploid sedangkan pada penelitian sebelumnya menyatakan bahwa spesies tersebut memiliki kromosom 2n=44. Pada anggota Orchidaceae, menunjukkan variasi kromosom somatik yang dipelajari dari 2n=10 sampai 40. Spesies yang memiliki kromosom somatik 30 yaitu Coelogyne breviscapa 2n=32 dan Coelogyne cristata 2n=26 dianggap sebagai triploid.
Anggrek yang memiliki jumlah kromosom n=19 lebih banyak dari pada yang memiliki jumlah kromosom n=20. Terdapat sekitar 280 spesies anggrek memiliki jumlah kromosom n=19, sedangkan yang memiliki jumlah kromosom n=20 sekitar 274 spesies. Anggrek Phalaenopsis pinlong cinderela dan Phalaenopsis Joane Killeup June memiliki jumlah kromosom 2n=40 (Hartati, 2010). Anggrek alam tetua Paraphalaeonopsis serpentilingua memiliki jumlah kromosom 2n=40, hasil persilangannya menunjukkan jumlah kromosom 2n=38. Anggrek tetua Rhyncostiles gigantea common memiliki jumlah kromosom 2n=40, hasil persilangannya 2n=40. Tetua Paraphalaeonopsis labukensis memiliki jumlah kromosom 2n=40, hasil persilangannya 2n=38 (Hartati, 2011). Penelitian Balanos et
al. (2008), membuktikan bahwa kromosom induk Phalaenopsis sp
mempunyai 2n=38 tetapi pada keturunannya Doritaenopsis memberikan hasil jumlah kromosom yang berbeda 2n=76.
B. Kerangka Berpikir
Indonesia memiliki kekayaan ragam plasma nutfah anggrek yang bernilai ekonomis dan belum semua teridentifikasi. Salah satu anggrek yang mempunyai nilai ekonomis tinggi adalah anggrek hitam (Coelogyne pandurata) yang berasal dari Provinsi Kalimantan Timur. Anggrek hitam mempunyai karakter bunga yang unik yakni berukuran besar, berwarna hijau dengan lidah hitam tersusun pada rangkaian tandan dengan panjang
15-20 cm dan jumlah bunganya mencapai 14 kuntum per tandan. Warna hitam pada lidah bunga merupakan sifat yang langka, yang dibutuhkan oleh para ahli pemuliaan tanaman untuk menghasilkan silangan baru..
Oleh karena di habitat aslinya jenis ini sudah sukar ditemukan, maka usaha pembudidayaan dan peningkatan ragam genetik harus dilakukan, salah satunya adalah dengan melakukan persilangan dengan jenis lain.
Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan persilangan pada tanaman anggrek adalah kedekatan hubungan kekerabatan. Tanaman anggrek yang berkerabat dekat akan meningkatkan peluang keberhasilan. Oleh karena itu untuk melakukan persilangan pada Coelogyne pandurata perlu dilakukan seleksi tetua yakni spesies lain dari genus Coelogyne spp
Untuk mengetahui keragaman dan hubungan kekerabatan pada tanaman anggrek dapat dilakukan dengan karakterisasi menggunakan penanda morfologi dan karakterisasi menggunakan penanda molekuler. Karakterisasi menggunakan penanda morfologi biasanya dipengaruhi lingkungan. Penanda molekuler dapat memberikan gambaran yang lebih akurat, karena analisis deoxyribo nucleid acid (DNA) sebagai materi genetik tidak dipengaruhi lingkungan. Penanda molekuler RAPD merupakan salah satu yang dimanfaatkan dalam kegiatan pemuliaan anggrek. Hasil karakterisasi menggunakan penanda morfologi dan molekuler RAPD digunakan untuk menyeleksi tetua yang mempunyai kedekatan genetik dengan anggrek hitam (Coelogyne pandurata).
Tetua terpilih tersebut akan digunakan sebagai bahan persilangan. Metode persilangan yang digunakan juga dapat menentukan keberhasilan persilangan. Untuk itu persilangan antara Coelogyne pandurata dengan tetua terpilih perlu diuji dengan menggunakan metode crossing, reciprocal dan selfing.
Keragaman pada hasil persilangan anggrek dapat diketahui dengan menggunakan analisis sitologi, flow cytometry, molekuler RAPD dan ISSR. Dengan analisis tersebut akan dapat diprediksi apakah F1 dari hasil persilangan anggrek menghasilkan karakter baru yang berbeda dari
induknya.
Upaya memecahkan permasalahan kelangkaan anggrek hitam Coelogyne pandurata di atas maka penelitian ini dilaksanakan melalui alur penelitian yang tersaji pada Gambar 1 berikut.
Gambar 1. Diagram alur penelitian Keragaman anggrek Coelogyne spp. Kajian 1 dan 2 Identifikasi anggrek Coelogyne spp.berdasarkan karakter morfologi dan
molekuler RAPD Pemilihan ragam genetik/ seleksi berdasarkan karakter morfologi dan molekuler RAPD Hibridisasi: crossing, reciprocal dan selfing
Kajian 3 Didapatkan tetua terpilih Coelogyne rumphii Didapatkan biji hasil persilangan Kajian 4 dan 5 Identifikasi hasil persilangan Coelogyne pandurata secara sitologi, flow cytometry,
molekuler RAPD dan ISSR Teridentifikasi keragaman F1 hasil persilangan Didapatkan Varian baru Anggrek commit to user
C. Hipotesis
1. Terdapat keragaman dan kedekatan genetik (kekerabatan) Coelogyne pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp.
2. Terdapat persilangan yang kompatibel antara Coelogyne pandurata dengan dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp.
3. Terdapat varian baru pada F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp. berdasarkan sitologi (kromosom dan tingkat ploidi)
4. Terdapat varian baru pada F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dengan spesies lain dalam genus Coelogyne spp. berdasarkan penanda molekuler RAPD dan ISSR (InterSimple Sequence Repeats).
D. Kebaharuan (Novelty)
Kebaharuan (novelty) yang telah didapatkan dari beberapa kajian yang dilakukan adalah:
1. Metode persilangan yang kompatibel antara Coelogyne pandurata dengan Coelogyne rumphii.
2. Teridentifikasi susunan kromosom anggrek Coelogyne pandurata diploid (2n=2x=36) dan Coelogyne rumphii tetraploid (2n=4x=72) 3 Diperoleh varian baru F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dan
Coelogyne rumphii berdasarkan analisis sitologi yang mempunyai susunan kromosom triploid 2n=3x=54
4 Diperoleh varian baru F1 hasil persilangan Coelogyne pandurata dan Coelogyne rumphii berdasarkan analisis molekuler.
17