LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MATERI dan ENERGI
ASAM AMINO dan PROTEIN
Oleh
NAMA : ANGELIA ASTRIA
NIM : 31160048ASISTEN : BRILLIANT SINDIANI S.A
PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS BIOEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA
YOGYAKARTA
BAB I
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Protein merupakan salah satu unsur makro yang terdapat pada bahan pangan selain lemak dan karbohidrat. Protein merupakan sumber asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O dan N dalam ikatan kimia. Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-bahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein juga berperan dalam mengatur proses daam tubuh. Dengan cara zat-zat pengatur proses dalam tubuh. Protein dapat mengatur keseimbangan cairan dalam jaringan dan pembuluh darah, yaitu dengan cara menimbulkan tekanan osmotik koloid. Tekanan osmotik tersebut dapat menarik cairan jaringan ke daam pembuuh darah. Selain itu sifat amfoter protein yang dapat bereaksi dengan asam dan basa, dapat mengatur keseimbangan asam basa dalam tubuh.
Untuk memenuhi kebutuhan protein dalam tubuh, seseorang harus mengkonsumsi makanan yang mengandung protein. Contoh makanan yang mengandung protein yang sering dikonsumsi oleh manusia adalah telur dan tempe. Telur dan tempe biasanya dikonsumsi sebagai lauk. Walaupun telur dan tempe sangat terkenal sebagai makanan yang mengandung protein, masing banyak yang tidak mengetahui jenis dan kadar kandungan asam amino yang terdapat pada telur dan tempe serta kadar kandungan protein yang terdapat didalamnya. Sedangkan jenis asam amino dan konsentrasinya serta kadar protein pada telur dan tempe sangat pentinng untuk diketahui sebagai indikator pemenuhan gizi. Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui jenis asam amino dan kadarnya pada telur dan tempe serta kadar protein dalam telur dan tempe.
B. TUJUAN
1. Menentukan kandungan asam amino dari ekstrak asam amino dengan kromatografi lapis tipis.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Protein merupakan polimer yang tersusun dari asam amino sebagai monomernya. Monomer-monomer ini tersambung dengan ikatan peptida, yang mengikat gugus karboksil milik satu monomer dengan gugus amina milik monomer di sebelahnya. Reaksi
penyambungan ini (disebut translasi) secara alami terjadi di sitoplasma dengan bantuan
ribosom dan tRNA. Pada polimerisasi asam amino, gugus -OH yang merupakan bagian gugus karboksil satu asam amino dan gugus -H yang merupakan bagian gugus amina asam amino
lainnya akan terlepas dan membentuk air. Oleh sebab itu, reaksi ini termasuk dalam reaksi
dehidrasi. Molekul asam amino yang telah melepaskan molekul air dikatakan disebut dalam bentuk residu asam amino (Tim Dosen Kimia, 2009).
Reaksi dua asam amino membentuk ikatan peptida.
Berikut adalah pengelompokan asam amino berdasarkan sifat-sifatnya :
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi kertas, krometografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).
terdiri dari fase diam (fase stasioner) dan fase gerak (fase mobile). Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fse diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).
Kromatografi kertas merupakan salah satu jenis kromatografi partisi yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh dari pada yang sukar larut. Setelah mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut dan dibiarkan mengering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu sama lainnya, dan dengan penyemprotan dengan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatua asam amino tertentu (b) dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari garis awal sampai garis akhir (a) diberi lambang Rf (Poedjiadi, 2006).
Kandungan protein ditentukan dengan metode Lowry Folin – ciocalteu, Pereaksi Folin-Ciocalteu merupakan larutan kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat. Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat, natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromin. Pada kenyataannya reagen ini mengandung rangkaian polimerik yang memiliki bentukan umum dengan pusat unit tetrahedral fosfat (PO4)3- yang dikelilingi oleh beberapa unit
oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum (Folin dan Ciocalteu, 1944).
Menurut Direktorat gizi depkes (1992), kandungan protein pada tempe kedelai adalah 18,30 gr. Menurut Sidiq (2013) Kandungan protein pada putih telur adalah 14,3 gr. Menurut umifarah (2013) kandungan asam amino tirosin pada tempe adalah yaitu 0,10. Menurut Direktorat gizi depkes (1992), kandungan asam amino esensial tempe (mg/g nitrogen) dapat dilihat pada tabel berikut :
Asam amino Tempe Metionin – sistein 171
Treonin 267
Valin 349
Lisin 404
Leusin 538
Fenilalanin – tirosin 475
Isoleusin 340
BAB III
METODOLOGI
A. ALAT
1. Plate TLC 8. Tabung reaksi
2. Oven 9. Rak tabung reaksi
3. Pipet ukur 10. Alat vortex
4. Propipet 11. Erlenmeyer
5. Mikropipet 12. spektrofotometer
6. Tip 13. Kertas saring
7. Pipa kapiler 14. Mortal
8. Larutan pengembang( solven A dan solven B) 9. Reagen ninhidrin
10. Tirosin 11. Aquadest 12. Etanol 50% 13. Albumin fraksi V
C. CARA KERJA
1. Preparasi ekstrak asam amino dan protein
2. Identifikasi jenis asam amino pada ekstrak sampel
Ditimbang 1,5 g tempe dan 2 g putih telur ( di dalamnya terkandung albumin )
Secara bertahap ditambahkan 10 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7. Untuk sampel padat dihaluskan dengan mortal, kemudian disaring untuk diambil ekstraknya. Sedangkan untuk sampel berupa larutan dicampurkan sampai homogen jika terdapat endapan/kotoran dilakukan penyaringan terlebih dahulu.
Plate TLC diaktivasi terlebih dahulu pada suhu 105 °C selama 30 menit.
Dilakukan spotting larutan asam amino tirosin dan sampel berisi ekstrak asam amino bebas.
Disemprot dengan reagen ninhidrin dan dipanaskan pada 110 °C selama 10 menit.
Dilakukan elusi dengan larutan pengembang terdiri atas : Solven A : n-butanol : asam asetat : air (12:3:5 v/v) Solven B : fenol : air ( 4: 1 v/v )
3. Penentuan asam amino secara kuantitatif
Diamati kromatogram yang terbentuk. Dihitung Rf dan ditentukan jenis asam amino yang terdapat pada ekstrak sampel
Dibuat kurva standar dengan cara :
Ditambahkan tirosin 0 mL, 0,1 mL, 0,3 mL, 0,5 mL, 0,7 mL dan 1,0 mL untuk masing-masing tabung, aquades 4 mL , 3,9 mL , 3,7 mL , 3,5 mL , 3,3 mL dan 3 mL untuk masing-masing tabung , ninhidrin 1 mL untuk masing-masing tabung.
Diambil 4 mL sampel berisi ekstrak asam amino, ditambah 1 mL ninhidrin. Dicampur sampai homogen, dipanaskan 100 °C 15 menit, didinginkan.
Ditambah etanol 50% 1 mL pada masing-masing tabung.
Diukur intensitas warna pada panjang gelombang 44 nm dan 550
4. Penentuan protein secara kuantitatif
Dibuat kurva standar protein dengan cara :
Ditambahkan albumin fraksi V 0 mL, 0,1 mL, 0, 3 mL, 0,5 mL, 0,7 mL dan 1 mL pada masing-masing tabung, Aquades 1 mL, 0,9 mL, 0,7 mL, 0,5 mL, 0,3 mL dan 0 mL pada masing-masing tabung reaksi secara berurutan serta reagen D 1 mL.
Dengan menggunakan kurva standar, ditentukan besarnya protein yang terkandung dalam sampel.
Diukur absorbansi pada 450 nm.
BAB IV
HASIL dan PEMBAHASAN
Ninhidrin adalah suatu reagen berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Uji ninhidrin digunakan untuk menunjukan asam amino dalam larutan uji dan berlaku untuk semua asam amino. Asam amino bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan molekul NH3 dan CO2. Ninhidrin yang telah bereaksi akan membentuk hidrindantin. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna biru/keunguan yang disebabkan oleh molekul ninhidrin + hidrindantin yang yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi.
1. Identifikasi jenis asam amino pada ekstrak sampel
sampel, plate TLC terlebih dahulu diaktivasi pada suhu 105 °C selama 30 menit yang bertujuan untuk menghilangkan kandungan air yang terdapat pada plate sehingga daya serap plate menjadi maksimal. Asam amino yang digunakan sebagai marker adalah arginin, triptofan, glisin dan tirosin.
Solven A berisi n-butanol, asam asetat dan air dengan perbandingan larutan adalah 12:3:5 sedangkan solven B berisi fenol dan air dengan perbandingan larutan adalah 4:1. Perbandingan campuran pada solven A dan solven B bertujuan agar perbedaan kecepatan perpindahan masing-masing komponen dapat diamati. Plate TLC yang sudah dispotting dimasukan di dalam solven untuk proses penyerahan. Setelah mencapai batas, plate TLC dibiarkan kering. Setelah kering disemprot dengan reagen ninhidrin untuk mendeteksi asam amino dan dipanaskan pada suhu 110°C selama 10 menit untuk mendeteksi warna-warna yang dihasilkan pada plate TLC.
Pada plate TLC A kromatogram yang terbentuk pada putih telur sejajar dengan glisin dan tirosin, arginin lebih rendah dari triptofan dan triptofan dan arginin tidak sejajar dengan putih telur sehingga secara kualitatif dapat dikatakan bahwa asam amino yang terkandung dalam putih telur adalah glisin dan tirosin berdasarkan kesejajaran garis. Kromatogram yang terbentuk pada tempe sejajar dengan tirosin, triptofan dan glisin sedangkan arginin berada diatasnya. Sehingga secara kualitatif dapat dikatakan bahwa asam amino yang terdapat pada tempe adalah glisin, triptofan dan tirosin berdasarkan kesejajaran garis.
Pada plate TLC B kromatogram yang terbentuk pada putih telur tidak sejajar dengan asam amino yang digunakan sebagai marker. Sedangkan kromatogram pada tempe tidak terbentuk karena asam amino yang terdapat pada tempe tidak bereaksi dengan fenol. Sehingga secara kualitatif asam amino yang terdapat pada putih telur dan tempe belum dapat diketahui melalui solven B.
Selain secara kualitatif asam amino yang terdapat putih telur dan tempe dapat diidentifikasi secara kuantitatif menggunakan rumus:
Sampel
Jarak tempuh (cm) Nilai Rf
Solven A Solven B Solven A Solven B
Tempe 3,16 - 0,4
Rf
=
jarak totaljarak total−jarak titikPada solven A jarak tempuh putih telur adalah 4,3 cm sedangkan jarak total adalah 6 cm, sehingga Rf yang diperoleh adalah
Rf
=
jarak totaljarak total−jarak titik=
6−64,3= 0,283 ≈ 0,28
Nilai Rf asam amino pada solven A yang mendekati adalah 0,28 dengan asam amino yaitu prolin. Sedangkan pada solven B jarak tempuh putih telur adalah 2,1 cm dan jarak total adalah 6 cm, sehingga Rf yang diperoleh adalah
Rf
=
jarak totaljarak total−jarak titik=
6−62,1= 0,65 ≈ 0,64
Nilai Rf asam amino pada solven B yang mendekati adalah 0,64 dengan asam amino yaitu tirosin.
Pada solven A jarak tempuh tempe adalah 3,6 cm sedangkan jarak total adalah 6 cm, sehingga Rf yang diperoleh adalah
Rf
=
jarak totaljarak total−jarak titik=
6−63,6= 0,40 ≈ 0,40
Nilai Rf asam amino tempe pada solven A yang mendekati adalah 0,40 dengan asam amino yaitu methionin. Sedangkan pada solven B asam amino tidak dapat diidentifikasikan karena asam amino pada tempe tidak bereaksi sehingga tidak menghasilkan kromatogram.
2. Penentuan asam amino secara kuantitatif
Penentuan asam amino secara kuantitatif dapat dilakukan dengan pembuatan larutan standar. Larutan yang digunakan yaitu larutan standar tirosin yang setelah diencerkan dengan akuades diperoleh konsentrasi 0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 dan 1 mL. Selanjutnya ke dalam larutan standar ditambahkan reagen ninhidrin untuk mengidentifikasi kadar asam amino pada larutan standar. Ninhidrin (triketohidrine hidrat) merupakan pengoksidasi kuat yang dapat bereaksi dengan asam amino menghasilkan warna ungu ketika sudah bereaksi dengan NH3 pada asam amino. Setelah dipanaskan pada suhu 100°C dan didinginkan kepekatan warna ungu yang terbentuk semakin meningkat dari larutan standar 1 sampai 6. Kepekatan warna biru tersebut mendedikasikan kadar tirosin dalam larutan.
Setelah dilakukan spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm didapatkan data absorbansi dalam tabel berikut ini :
Tabung Tirosin (mL) OD (A)
1 0 0
2 0,1 0,336
3 0,3 0,687
4 0,5 1,590
5 0,7 2,569
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
f(x) = 3.41x - 0.07 R² = 0.98
KURVA STANDAR ASAM AMINO TIROSIN
OD
Linear (OD)
Nilai konsentrasi
Dari tabel dan kurva di atas dapat dilihat bahwa nilai OD berbanding lurus dengan konsentrasi tirosin ditunjukan dengan garis linear OD, sehingga semakin tinggi konsetrasi tirosin nilai OD yang terukur pada saat spektrofotometri semakin tinggi. Dari kurva standar asam amino tirosin dapat ditentukan nilai konsentrasi sampel dengan persamaan:
R2 = 0,982
Keterangan:
Y = nilai OD sampel
X = nilai konsentrasi yang dicari
Sampel OD (A)
Putih telur
-Tempe 0,202
Setelah diukur absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm nilai OD putih telur tidak diketahui karena kekurangtelitian ketika praktikum, sedangkan nilai OD tempe adalah 0,202. Nilai konsentrasi dari tempe dapat diketahui dengan persamaan kurva standar asam amino tirosin yaitu :
Y = 3,14101x – 0,0714 0,202 = 3,14101x – 0,0714
X = 0,202+0,0714 3,14101 = 0,087≈ 0,09
Nilai konsentrasi asam amino tirosin pada tempe adalah 0,09. Hasil tersebut sama dengan litelatur pada jurnal “Komposisi kimia dan asam amino pada tempe kacang nagara, Susi umifarah” yaitu 0,10 ≈ 0,09.
3. Penentuan protein secara kuantitatif
Jenis protein yang digunakan dalam praktikum sebagai larutan standar adalah albumin fraksi V. Dalam praktikum ditambahkan reagen D yang merupakan reagen biuret. Penambahan reagen Biuret pada tabung 1-6 (berisi larutan standar), tabung 7 dan 8 yang berisi sampel tidak mengubah warna larutan. Larutan kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. Penambahan reagen Biuret ke dalam larutan bertujuan untuk meningkatkan sensitivitas reagen Folin-Ciocalteu, dimana dengan penambahan reagen biuret akan terbentuk kompleks Cu2+ dengan residu asam amino
yang terdapat dalam larutan uji menghasilkan kompleks Cu-protein.
Komplek Cu – protein yang dihasilkan dari reagen biuret dengan protein.
Perbedaan kepekatan warna biru pada setiap tabung disebabkan oleh perbedaan konsentrasi albumin fraksi V yang direduksi reagen folin – Ciocalteu. Setelah dilakukan pengukuran menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm didapatkan data absorbansi dalam tabel berikut ini:
Tabung Albumin fraksi V (mL) OD ( A )
1 0 0
2 0,1 0,092
3 0,3 0,133
4 0,5 0,190
5 0,7 0,347
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
KURVA STANDAR PROTEIN ALBUMIN FRAKSI V
OD
Linear (OD)
Dari tabel dan kurva di atas dapat dilihat bahwa nilai OD berbanding lurus dengan konsentrasi albumin fraksi V ditunjukan dengan garis linear OD, sehingga semakin tinggi konsentrasi albumin fraksi V, nilai OD yang terukur pada saat spektrofotometri semakin tinggi. Dari kurva standar protein albumin fraksi V dapat ditentukan nilai konsentrasi sampel dengan persamaan:
Y = 3,14101x – 0,0714 R2 = 0,982
Keterangan:
Y = nilai OD sampel
X = nilai konsentrasi yang dicari
Sampel OD (A)
Putih telur 1,692
Tempe 1,292
Setelah diukur absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm nilai OD putih telur adalah 1,692, sedangkan nilai OD tempe adalah 1,292. Nilai konsentrasi dari putih telur dapat diketahui dengan persamaan kurva standar albumin fraksi V yaitu :
Y = 0,5761x – 0,0185 1,692 = 0,5761x – 0,0185
= 2,969 ≈ 2,97
Nilai konsentrasi albumin fraksi V pada putih telur adalah 2,97.
Nilai OD tempe adalah 1,292. Nilai konsentrasi dari tempe dapat diketahui dengan persamaan kurva standar albumin fraksi V yaitu :
Y = 0,5761x – 0,0185 1,292 = 0,5761x – 0,0185
X = 1,2920,5761+0,0185
= 2,274 ≈ 2,27
Nilai konsentrasi albumin fraksi V pada tempeadalah 2,27.
BAB V
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Tim Dosen Kimia. 2009. Penuntun Praktikum Biokimia Umum. Universitas Hassanudin: Makassar.
Poedjiadi, A. 2006. Dasar – Dasar Biokimia.E disi Revisi. Jakarta: UI - Press. Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press .
Bresnick, S. 2004. Intisari Kimia Organik. Hipokrates: Jakarta.
Akbar, Y. 2011. Pemisahan dan Identifikasi Asam Amino (online), (http:// akbarbanjar.wordpress.com/2011/03/17/laporan-biokimia/), diakses pada tanggal 20 November 2016.
Folin, Octo, Ciocalteu, Vintila. 1944. On Tyrosine and Tryptophane Determinations in Proteins, Jour.Bio.Chem., 73 : 627-650, 1927, in. Todd-Sanford, 10, 412.
Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965. Colorimetry of Total Phenolic with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147.
Direktorat Gizi Departemen Kesehatan RI. 1992. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Bhartara Karya Aksara: Jakarta.
Sidiq, Ahmad. 2013. Jurnal Uji Kadar protein dan organoleptik pada telur ayam leghorn setelah disuntik dengan ekstrak black garlic. Makassar: Universitas Hassanudin, diakses pada tanggal 20 November 2016.
composition of Nagara Bean Tempe (( Vigna unguiculata ssp. cylindrica). Diakses pada tanggal 20 November 2016.
