NISH ELEMENT D 2.30
Dwi Ramadhani*, Iin Kurnia*, Setiawan Soetopo**, Devita Tetriana*, Irwan Ramli**, Budiningsih***, Andrijono****, Tjahja Kurjana***,
Maringan D. Lumban Tobing***
ABSTRAK
ANALISIS SERTA STITCHING CITRA IMUNOHISTOKIMIA MIB-1 DENGAN
IMMUNORATIO DAN PERANGKAT LUNAK NISH ELEMENT D 2.30. Keberhasilan radioterapi
untuk pengobatan kanker sangat bergantung pada tingkat sensitivitas sel kanker terhadap radiasi yang dapat diketahui dengan teknik pewarnaan immunohistokimia. Salah satu teknik pewarnaan immunohistokimia adalah MIB-1 (Ki67). Analisis preparat hasil pewarnaan MIB-1 dilakukan secara manual pada perbesaran 40X dengan menghitung banyaknya sel berwarna coklat dari 1000 sel baik yang berwarna biru maupun coklat menggunakan mikroskop. Proses tersebut dapat dilakukan secara otomatis menggunakan plugin perangkat lunak ImageJ 1.46 yaitu ImmunoRatio. ImageJ 1.46 adalah perangkat
lunak pengolahan citra yang dikembangkan dalam bahasa Java sehingga dapat digunakan pada semua sistem operasi komputer. Tujuan penelitian yang dilakukan adalah membandingkan hasil analisis citra MIB-1 yang diperoleh secara manual dengan otomatis dan melakukan stitching citra MIB-1 untuk
pembuatan virtual slide preparat MIB-1. Total sebanyak 50 citra MIB-1 di analisis menggunakan
ImmunoRatio. Analisis statistik menggunakan Uji T menunjukkan tidak terdapat perbedaan secara nyata antara hasil penghitungan nilai indeks MIB-1 secara manual dibandingkan dengan otomatis (P = 0,255, α = 0,05). Pembuatan virtual slide berhasil dilakukan menggunakan perangkat lunak NISH Element 2.3 dan virtual slide yang diperoleh dapat dilihat menggunakan JVSview sebagai mikroskop virtual. Dengan
demikian konsep telepatologi antara patologis dapat dilaksanakan dengan menggunakan mikroskop dan slide virtual.
Kata kunci: Imunohistokimia, ImmunoRatio,Perangkat Lunak, Stitching,Virtual Slide
ABSTRACT
ANALYSIS AND STITCHING IMAGE IMUNOHISTOKIMIA MIB-1 WITH IMMUNORATIO AND NISH ELEMENT D 2.30 SOFTWARE. Successful of radiotherapy for cancer treatment depends on the sensitivity level of cancer cells to the radiation that can be detected by immunohistochemistry staining techniques. One of the immunohistochemstry staining technique was MIB-1 (Ki67). Analysis of MIB-1 slide usually done manually under microscope at 40X magnification, by counting the number of brown cells in 1000 cells both in blue and brown. This process can be done automatically using Image J software plug in which is ImmunoRatio 1.46. Image J is image processing software that developed in Java so it can be used on all computer operating systems. Aim of this research is to compare the results of image analysis of MIB-1 were obtained by manually and automatically perform image stitching MIB-1 for the creation of virtual slide preparations MIB-1. Totally 50 images
* Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi - BATAN Jakarta, e-mail:dhani02@batan.go.id ** Departemen Radioterapi FKUI/RSCM-Jakarta
was analyses using ImmunoRatio. Statistical analysis using T test showed there was no significant difference between automatic calculation significantly of MIB-1 index compared to manually (P = 0.255, α = 0.05). Virtual slides successfully build using NISH Element 2.3 and can be viewed with JVSview as a virtual microscope. Thus the concept of telepathology can be implemented between pathologies using microscope and virtual slides.
Keywords: Immunohistochemistry, ImmunoRatio, Software, Stitching, Virtual Slide
PENDAHULUAN
Kanker merupakan salah satu penyakit penyebab kematian tertinggi di dunia. Sebanyak tiga belas persen dari jumlah total kematian di dunia atau sekitar 7,4 juta jiwa disebabkan oleh kanker pada tahun 2004. Pemilihan jenis terapi merupakan hal yang penting untuk pengobatan kanker. Salah satu jenis terapi untuk pengobatan kanker adalah radioterapi dengan menggunakan sinar radioaktif. Keberhasilan radioterapi sangat bergantung pada tingkat sensitivitas sel kanker terhadap radiasi [1,2]. Teknik pewarnaan immunohistokimia pada jaringan kanker dapat digunakan untuk mengetahui tingkat sensitivitas sel kanker terhadap radiasi. Imunohisto-kimia adalah metode untuk mendeteksi protein di dalam sel suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi dan antigen pada jaringan hidup [1].
Salah satu teknik pewarnaan immunohistokimia adalah MIB-1 (Ki-67). MIB-1 (Ki-67) merupakan marker proliferasi berupa antigen yang dapat diamati selama siklus sel kecuali G0 dan awal fase G1 dalam siklus sel. Analisis preparat hasil pewarnaan
MIB-1 umumnya dilakukan secara manual pada perbesaran 40X menggunakan mikroskop cahaya. Analisis dilakukan dengan menghitung banyaknya sel berwarna coklat dari 1000 sel baik yang berwarna biru maupun coklat menggunakan mikroskop cahaya [1]. Proses perhitungan secara manual membutuhkan waktu yang cukup lama yaitu sekitar 15-20 menit tiap preparat dengan akurasi subjektif. Oleh karena hal tersebut, akan sangat membantu apabila penghitungan dilakukan secara otomatis.
Beberapa perangkat lunak khusus untuk analisis citra digital MIB-1 telah tersedia secara komersial, akan tetapi dibutuhkan biaya yang cukup besar untuk mendapatkan perangkat lunak tersebut, serta umumnya hanya dapat digunakan pada komputer dengan spesifikasi tertentu [3]. Selain perangkat lunak yang bersifat komersial, beberapa peneliti telah mengembangkan perangkat lunak yang dapat digunakan secara bebas untuk menganalisis citra digital hasil pewarnaan immunohistokimia khususnya MIB-1 yaitu ImmunoRatio (Gambar 1). ImmunoRatio dapat di akses secara bebas atau digunakan secara online melalui perambah (browser) internet. ImmunoRatio mendukung semua jenis perambah dan sistem operasi komputer [3,4]. ImmunoRatio dapat digunakan secara offline sebagai plugin dari perangkat lunak pengolahan citra ImageJ 1.46. ImageJ 1.46 adalah perangkat lunak pengolahan citra yang dikembangkan dalam bahasa Java sehingga dapat digunakan pada semua sistem operasi komputer. ImageJ dikembangkan oleh research services
Gambar 1. Tampilan ImmunoRatio Secara OnLine
Gambar 2. Tampilan ImageJ
Pembuatan citra digital dapat dilakukan dengan menggunakan sistem pencitraan khusus untuk mikroskop yaitu NISH Element D 2.3. NISH Element D 2.3 adalah perangkat lunak pencitraan yang dapat digunakan untuk pengambilan citra dari mikroskop (akuisisi citra) serta penyimpanan data citra. NISH Element D 2.3 dapat digunakan untuk pembuatan virtual slide sehingga konsep telepatologi (analisis secara manual oleh beberapa patologis secara bersamaan menggunakan mikroskop virtual) dapat dilakukan. Virtual slide adalah citra digital yang dihasilkan dari proses pemindaian (scanning) preparat dengan resolusi tinggi [6]. Alat pemindai yang digunakan umumnya terdiri dari mikroskop cahaya untuk memperoleh gambar mikroskopis dari jaringan dan sistem robot yang secara berurutan menggerakan preparat sehingga seluruh preparat dapat di pindai. Citra digital yang dihasilkan selama proses pemindaian diperoleh secara elektronik dengan menggunakan kamera digital untuk merekam semua data citra dari preparat kemudian digabung-kan menjadi satu citra dengan resolusi yang sangat tinggi (Gambar 3). Proses penggabungan tersebut dinamakan “stitching images” dan dilakukan oleh komputer untuk memastikan penggabungan secara tepat (Gambar 4) [7].
Makalah ini akan membahas hasil analisis citra MIB-1 yang dilakukan secara otomatis untuk dibandingkan dengan manual dan melakukan stitching citra MIB-1 untuk pembuatan virtual slide preparat MIB-1.
Gambar 3. Pembuatan virtual slide dengan proses pemindaian [7].
Gambar 4. Citra hasil pemindaian sebelum (kiri) dan sesudah dilakukan proses
“stitching” (kanan) [7].
METODOLOGI Pewarnaan MIB-1
Jaringan kanker serviks pada blok parafin berasal dari departemen Patologi Rumah Sakit Hasan Sadikin (Bandung) dan Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo (Jakarta) dipotong dengan ketebalan 4µm menggunakan mikrotom, kemudian dideparafinasi dengan xylol, rehidrasi dengan konsentrasi ethanol menurun, selanjutnya direndam dalam PBS 15 menit (3 x 5 menit). Potongan jaringan kemudian diinkubasi dalam Dako Antigen Retrieval Buffer dalam microwave 94OC selama 20
menit dan diikuti dengan pendinginan pada suhu ruang selama 20 menit dan dicuci dengan PBS 15 menit (3 x 5 menit), kemudian diinkubasi dalam Block Peroxidase selama 10 menit, PBS 10 menit dan dilanjutkan dengan inkubasi dalam antibodi MIB-1 (overnight dengan suhu 4OC). Setelah diinkubasi dengan MIB-1, preparat kemudian
diinkubasi kembali dengan antibodi sekunder (Labeled Polymer HRP (Dako Cytomation)) selama 60 menit pada suhu ruang. Terakhir lakukan pewarnaan counter stain dengan Hematoksilin Meyer, kemudian didehidrasi dengan konsentrasi etanol meningkat, penjernihan dalam xylol selanjutnya slide ditutup dengan cover glass
Pengambilan Citra dan Analisis Citra MIB-1
Sebanyak 25 preparat MIB-1 diamati pada perbesaran 40X menggunakan mikroskop cahaya Nikon E200 dengan lensa objektif Nikon E Plan 100X/1,25 dan dilengkapi kamera digital Nikon DS-Fi1 yang terhubung secara langsung ke komputer dengan sistem operasi Microsoft Windows XP SP 2 32-bit. Processor yang digunakan adalah Intel Pentium 4, Random Access Memory (RAM) yang digunakan sebesar 1,016 Gb. Citra digital preparat MIB-1 di ambil dengan menggunakan perangkat lunak NISH Element D 2.3 dengan resolusi 2560×1920 pixels pada kedalaman warna 8 bit dan format Joint Photographic Experts Group (JPEG). Sebanyak dua lapang pandang yang berbeda diamati dan dilakukan pengambilan citra dari setiap lapang pandang pada masing-masing preparat. Total sebanyak 50 citra MIB-1 pada perbesaran 40X diperoleh dan di simpan dalam komputer. Citra MIB-1 kemudian di analisis menggunakan ImmunoRatio sebagai plugin dari ImageJ pada komputer dengan sistem operasi Microsoft Windows XP SP 2 32-bit. Processor yang digunakan adalah AMD Athlon(tm) 64 X2 Dual Core 5000+, Random Access Memory (RAM) yang digunakan sebesar 1,87 Gb.
Pembuatan Virtual Slide Preparat MIB-1
Pembuatan virtual slide dilakukan dengan mengambil citra pada perbesaran 40X terlebih dahulu kemudian digabungkan (stitching) menggunakan NISH Element D 2.3 dan disimpan dengan format JPEG2000. Proses “stitching” adalah proses penggabungan beberapa citra menjadi satu buah citra dan penata ulangan pixels pada bagian tepi citra yang saling tumpang tindih. NISH Element D 2.3 menyediakan fungsi “stitching assist” untuk proses penataulangan pixels pada bagian tepi citra agar tidak saling tumpang tindih (Gambar 5).
Gambar 5. Fungsi “stitching assist” pada NISH Element D 2.3.
Pengolahan Data Statistik
Hasil penghitungan nilai indeks MIB-1 secara otomatis dan manual diolah secara statistik menggunakan Uji T dengan hipotesis H0 adalah tidak terdapat
perbedaan secara nyata hasil yang diperoleh secara otomatis dibandingkan dengan secara manual. Taraf nyata yang digunakan (α) adalah 0,05.
HASIL
Penghitungan Nilai Indeks MIB-1 Secara Otomatis Dan Manual
Sebanyak 50 citra dari 25 preparat di analisis secara otomatis menggunakan ImmunoRatio secara offline dan secara manual. Hasil penghitungan nilai indeks MIB-1 ditunjukkan oleh Tabel 1. Perbedaan rerata nilai indeks MIB-1 yang diperoleh secara otomatis dibandingkan dengan manual adalah sebesar 5,79%. Diagram pencar (scatter plot) menunjukkan nilai korelasi antara hasil penghitungan nilai indeks MIB-1 secara otomatis dibandingkan dengan manual sebesar 0,78 (r=0,79) (Gambar 6).
Gambar 6. Diagram pencar hasil penghitungan secara otomatis dibandingkan dengan
manual.
Pengolahan Data Statistik
Analisis statistik menggunakan uji T terhadap hasil penghitungan nilai indeks MIB-1 secara otomatis dibandingkan dengan manual menunjukkan tidak terdapat perbedaan secara nyata antara hasil yang diperoleh secara otomatis dibandingkan dengan manual (P = 0,255).
PEMBAHASAN
Perbedaan penghitungan nilai indeks MIB-1 secara otomatis dengan manual pada beberapa pasien mencapai lebih dari 10%. Secara keseluruhan perbedaan hasil penghitungan secara otomatis dan manual adalah sebesar 7,046%. Perbedaan tersebut
Tabel 1. Hasil Penghitungan Nilai Indeks MIB-1 Secara Otomatis dan Secara Manual
Hasil penghitungan dengan ImmnuoRatio cenderung lebih tinggi (overestimated) dari penghitungan manual. Beberapa faktor dapat menyebabkan prediksi nilai indeks MIB-1 dengan ImmunoRatio lebih tinggi dari nilai sebenarnya. Hal tersebut dapat terjadi karena terdapat jaringan nonkanker pada seperti lymphoids dan pembuluh darah pada citra. ImmunoRatio tidak dapat membedakan daerah jaringan kanker dan non-kanker. Sebagai konsekuensi daerah jaringan non kanker akan ikut di hitung sebagai sel sehingga nilai indeks MIB-1 yang diperoleh lebih tinggi dari nilai sebenarnya.
Dengan demikian untuk meningkatkan keakurat-an hasil penghitungan secara otomatis nilai indeks MIB-1 sebaiknya di pilih daerah yang sedikit memiliki jaringan
non-kanker. Pada penelitian pengaturan nilai Brown threshold adjustment sebesar 5 dan Blue threshold adjustment sebesar 2 (Gambar 7). Hal tersebut dilakukan karena
No Nilai Indeks MIB-1 Secara Otomatis Nilai Indeks MIB-1 Secara Manual Beda 1 43,4 40,3 3,1 2 44 52,8 8,8 3 51,8 47 4,8 4 39,8 35,7 4,1 5 39,5 53,1 13,6 6 43,1 48,6 5,5 7 40,9 44,4 3,5 8 45,1 48,1 3 9 66,4 63,1 3,3 10 77,1 73,2 3,9 11 72,1 80 7,9 12 48,5 35,4 13,1 13 41,5 27,5 14 14 32,8 27,4 5,4 15 41,3 43,1 1,8 16 40 40,9 0,9 17 40,5 44,5 4 18 55,5 45,6 9,9 19 42,4 33 9,4 20 63,9 64,7 0,8 21 56,1 53,7 2,4 22 56,8 65,4 8,6 23 66,1 70,1 4 24 52,4 39,8 12,6 25 39,3 41 1,7 26 42,3 37,3 5 27 30,2 23,9 6,3 28 67,1 83,9 16,8 29 60,8 82,2 21,4 30 40,9 29,2 11,7 31 27,8 27,7 0,1 32 37,2 29,6 7,6 33 24,7 18,4 6,3 34 58,1 64,6 6,5 35 58,1 68,2 10,1 36 51,3 60,7 9,4 37 66,9 77,3 10,4 38 51,2 37,4 13,8 39 39,5 24,4 15,1 40 47,3 46,7 0,6 41 39,4 31,8 7,6 42 47,9 49,6 1,7 43 47,8 45,1 2,7 44 39,1 36,9 2,2 45 38,8 35,8 3 46 37,4 34,1 3,3 47 43,8 30,9 12,9 48 26,5 16,2 10,3 49 49,9 40,1 9,8 50 37,2 29,6 7,6 Rerata: 7,046
dengan nilai tersebut diperoleh nilai indeks MIB-1 yang paling akurat dan mendekati nilai indeks MIB-1 secara manual.
Gambar 7. Pengaturan nilai Brown and Blue threshold adjustment pada
ImmunoRatio 1.0
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ImmunoRatio dapat digunakan dengan baik untuk menghitung nilai indeks MIB-1 meskipun tidak lebih baik dari penghitungan secara manual. Meskipun demikian penghitungan nilai indeks MIB-1 secara otomatis menggunakan ImmunoRatio memiliki kelebihan dalam segi waktu yang diperlukan untuk menganalisis citra MIB-1. Waktu yang diperlukan untuk menganalisis citra MIB-1 secara manual adalah 15-20 menit untuk satu citra tergantung pada kualitas citra sedangkan waktu yang dibutuhkan oleh ImmunoRatio untuk menganalisis tiga citra sekaligus adalah selama 30 detik. Dengan demikian sejumlah besar data citra dapat dengan cepat dan mudah dianalisis dan diperoleh nilai indeks MIB-1 untuk dapat dikorelasikan dengan efek biologis [8]. Keuntungan lain dari analisis secara otomatis menggunakan ImmunoRatio adalah meminimalkan variabilitas antara pengamat bila dilakukan secara manual.
Pembuatan virtual slide berhasil dilakukan dengan menggunakan NISH Element D 2.3. Citra yang diperoleh disimpan dengan format JPEG2000 karena format tersebut memiliki kelebihan dibandingkan format lain terutama karena besarnya data citra hasil “stitching” dapat diperkecil bila menggunakan format JPEG2000 dibandingkan format lain seperti TIFF. Format JPEG2000 merupakan pengembangan dari JPEG yang berbasis transformasi wavelet. Format tersebut mendukung kompresi tipe lossless dan lossy, namun dukungan terhadap JPEG 2000 dalam berbagai aplikasi masih kurang, sehingga format JPEG200 tidak dapat dikenali oleh perangkat lunak pengolahan citra komersial seperti Adobe Photoshop maupun perangkat lunak pengolahan citra yang bersifat terbuka (open access) seperti ImageJ 1.46. Kompresi citra tipe lossless pada format JPEG200 memungkinkan data citra menjadi lebih ringkas tanpa kehilangan informasi sehingga besarnya file citra dengan
Meskipun pembuatan virtual slide dapat dilakukan dengan menggunakan NISH Element D 2.3, akan tetapi tidak semua bagian dari preparat dapat di buat menjadi virtual slide, hal tersebut dikarenakan keterbatasan pada RAM komputer yang digunakan. Virtual slide dapat digunakan untuk proses telepatologi dengan mengirimkan citra melalui surat elektronik (email) atau dengan mengunggah (upload) citra yang telah diperoleh agar dapat di unduh (download) untuk dilakukan analisis oleh pakar patologi dimana pun pakar tersebut berada dengan menggunakan mikroskop virtual. Seperti telah dijelaskan sebelumnya bahwa format JPEG2000 masih banyak tidak dapat dikenali oleh perangkat lunak pengolahan citra maupun sistem operasi komputer seperti Windows XP maupun Windows 7, maka untuk melihat citra dengan format JPEG2000 perlu dilakukan instalasi perangkat lunak JVSview. JVSview merupakan perangkat lunak yang bersifat open source dan dapat digunakan untuk membuka citra dengan format JPEG2000 secara lokal maupun melalui internet [9]. JVSview dapat berfungsi sebagai mikroskop virtual untuk melihat virtual slide yang telah dibuat dengan menggunakan NISH Element 2.3 karena JVSview memiliki aplikasi untuk melihat citra pada perbesaran 2,5,10,20,40 dan 80X.
Penggunaan JVSview sebagai mikroskop virtual dan virtual slide memungkinkan dilakukan konsep telepatologi yaitu melakukan analisis secara bersamaan antara patologis dapat dilakukan dengan menggunakan jaringan interconnection-networking (internet).
KESIMPULAN
Secara keseluruhan hasil penelitian memperlihatkan bahwa ImmunoRatio dapat digunakan dengan baik untuk menghitung nilai indeks MIB-1 secara otomatis, meskipun hasil yang diperoleh berbeda dengan hasil penghitungan secara manual. Pembuatan virtual slide berhasil dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak NISH Element 2.3 dengan format JPEG2000. Virtual slide yang diperoleh dapat dilihat menggunakan JVSview sebagai mikroskop virtual dan dapat digunakan sebagai alat untuk melaksanakan konsep telepatologi antara patologis.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada PTKMR, RSCM, RSHS dan Mafaza Tuitsuka (UNNES). Penelitian dilakukan oleh dana DIPA PTKMR dan program PKPP 2010. Penelitian yang dilakukan telah disetujui oleh Komite Etik pihak FKUI.
DAFTAR PUSTAKA
1. HANDAYANI, L., WIDYANTO, M.R., KODARIAH, R., DAN HANDAYANI, P.W., “Fuzzy Cells Extraction and Cell Morphology for the Aantigen Positivity Determination of Immunohistochemical Image”, International Journal of Video & Image Processing and Network Security IJVIPNS-IJENS 11(3) (2011).
2. KURNIA, I., BUDININGSIH, S., DAN LUSIYANTI, Y., “Penggunaan AgNOR Sebagai Biomarker Sensitivitas Radiasi Pada Kanker Serviks”, Prosiding Seminar Nasional Kesehatan Keselamatan Lingkungan III, Depok, 2006.
3. TREANOR, D., “Virtual Slides: an Introduction (Review)”, Diagnostic Histophatology 15(2) (2009).
4. TUOMINEN, V.J., RUOTOISTENMAKI, S., VIITANEN, A., JUMPPANEN, M., AND ISOLA, “J. Immunoratio: A Publicly Available Web Application For Quantitative Image Analysis Of Estrogen Receptor (Er), Progesterone Receptor (Pr), And Ki-67”, Breast Cancer Research 12(R56) (2010).
5. FERREIRA T A, RASBAND W., “The ImageJ user guide, Version 1.43 [EB/OL]”, Diakses pada 11 Juni 2012 dari http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf
6. ROJO, M,G., BUENO, G., DAN SLODKOWSKA, J., “Review Of Imaging Solutions For Integrated Quantitative Immunohistochemistry In The Pathology Daily Practice”, Folia Histochem Cytobiol. 47(3) (2009) 349-354.
7. TUOMINEN, V., “Virtual Microscopy: Design and Implementation of Novel Software Applications for Diagnostic Pathology”. Diakses pada 12 Juni 2012 dari http://acta.uta.fi/pdf/978-951-44-8774-3.pdf.
8. KOSTOPOULOS, S., CAVOURAS, D., DASKALAKIS, A., RAVAZOULA, P., dan NIKIFORIDIS, G., “Image Analysis System For Assessing The EstrogenReceptor’s Positive Status In Breast Tissue Carcinomas”. Proceeding International Special Topic Conference on Information Technology in Biomedicine, 2006.
9. TUOMINEN, V.J., dan ISOLA, J., “The Application of JPEG2000 in Virtual Microscopy”, Journal of Digital Imaging, 22(3) (2009) 250Y258.
DISKUSI
SAHRUL HIDAYAT
Apakah keunggulan dari sofiware yang dikembangkan dibandingkan dengan pengamatan secara manual?
DWI RAMADHANI
Kelebihan dari software adalah waktu yang dibutuhkan lebih cepat dibandingkan dengan pengamatan secara manual dan lebih baik karena ”paperless”.
![Gambar 3. Pembuatan virtual slide dengan proses pemindaian [7].](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123dok/2536519.2772865/4.918.254.639.128.360/gambar-pembuatan-virtual-slide-proses-pemindaian.webp)
