Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 1
EVALUASI PERTUMBUHAN ISOLAT BAKTERI ASAL FESES SAPI
POTONG DAN PRODUKSI GAS METANA PADA BATUBARA LIGNIT
BACTERIA ISOLATE GROWTH EVALUATION FROM COW FECES
FOR PRODUCTION ENGINEERING OF METHANE GAS WITH
LIGNIT COAL MEDIA
M. Nicko Aryadi1, Tb. Benito A. Kurnani1,3, I Made Joni2,3, Ellin Harlia1,3*
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Jalan Raya Bandung – Sumedang KM. 21 Sumedang 45363
1Departemen Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran
2 Departemen Fisika FMIPA Universitas Padjadjaran
3Pusat Penelitian Pengembangan Institusi Nano Teknologi dan Graphen, Direktorat Riset dan Pengabdian
kepada Masyarakat, Universitas Padjajaran *e-mail:ellin.harlia@unpad.ac.id
ABSTRAK
Bakteri anaerob dapat digunakan sebagai katalis dalam meningkatkan hasil produksi gas metana pada gas metana batubara lignit. Bakteri anaerob yang berasal dari feses sapi potong perlu dilakukan evaluasi agar dibuktikan efeknya sebagai katalis pada gas metana batubara lignit, oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri dan produksi gas metana dengan media batubara lignit menggunakan isolat bakteri feses sapi potong. Penelitian ini menggunakan metode eksploratif dengan penjabaran secara deskriptif. Penelitian ini menggunakan 3 macam perlakuan dengan pengulangan sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh 9 unit sampel. Hasil penelitian menunjukan bahwa pengenceran isolat bakteri anaerob 10-2, 10-3 dan 10-4 dengan media batubara lignit berpengaruh terhadap pertumbuhan total bakteri anaerob baik bakteri metanogen dan nonmetanogen serta produksi gas metana yang dihasilkan dari aktivitas bakteri metanogen. Pengenceran 10-4 merupakan pengenceran yang paling tinggi karena pertumbuhan total bakteri anaerob terus meningkat dan pengenceran 10-2 merupakan pengenceran yang paling tinggi karena pada pengenceran 10-2 produksi gas metana terus meningkat.
Kata Kunci : Isolat bakteri, produksi gas metana, pertumbuhan bakteri, lignit. ABSTRACT
Anaerobic bacteria can be used as catalyst to increase methane production in Coal Bed Methane. Anerob bacterial derived from feces of beef cattle evaluation is necessary in order to prove its effect as catalyst in lignite cool bed methane. Therefore, this study was aimed to determine the growth of bacteria and production of coalbed methane from media lignite coal teeated with bacterial isolates of beef cattle feces. This research used explorative method with descriptive translation. This study used three kinds of treatments and were repeated 3 times, to make totally 9 experimental units. The results showed that the dilutions anaerobic bacterial isolates 10-2, 10-3 and 10-4 with the media lignite coal had effected the total growth of anaerobic bacteria either methanogenic or nonmethanogenic bacteria, and the production of methane gas resulting from the activity of methanogenic bacteria. Dilution bacteria isolate of 10-4 provided the best result because it increased growth anaerobic bacteria, and dilution bacterial isolate of 10-2 provided the best result because it increased methane production.
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 2
Keywords : Bacterial isolates, methane gas production, the growth of bacteria, lignite.
Pendahuluan
Peternakan sapi potong merupakan industri yang menghasilkan limbah padat dan cair dalam jumlah besar salah satunya feses. Feses sapi potong merupakan bahan organik yang dapat dikonversi menjadi gas metana. Produksi gas dipengaruhi oleh kandungan mikroorganisme dalam feses. Feses sapi potong mengandung bakteri yang memanfaatkan bahan organik dan memproduksi gas dalam kondisi anaerob. Bakteri pada feses sapi potong dapat mendegradasi bahan organik kompleks menjadi bahan organik sederhana. Proses tersebut membutuhkan energi dan kondisi yang mendukung. Oleh karena itu, untuk mendukung kondisi tersebut digunakan digester sebagai tempat pembuatan biogas.
Biogas merupakan pemanfaatan feses sapi potong yang menggunakan peran mikroorganisme untuk memproduksi gas dalam digester. Produk utama yang diharapkan dalam biogas adalah gas metana. Gas metana merupakan gas yang dapat mengurangi pengunaan energi konvensional dalam kehidupan sehari-hari. Hal ini dikarenakan ketersediaan energi yang terbatas sehingga gas metana ini dapat menjadikan energi alternatif. Biogas dapat terbentuk secara optimal jika syarat-syarat pembentukanya dapat terpenuhi. Rasio C/N atau perbandingan antara karbon dan nitrogen campuran pada biogas perlu diperhatikan untuk kelangsungan hidup dan pertumbuhan bakteri. Faktor pendukung yang harus dipenuhi adalah kandungan air, kandungan oksigen, proses fermentasi dan bahan pencampur salah satunya batubara. Batubara merupakan media untuk pembentukan Gas Metana Barubara (GMB), yaitu gas metana (biogenic methane) yang terbentuk pada tahap awal pembentukan batubara yang diproduksi oleh bakteri anaerob. Penambahan feses pada batubara di harapkan dapat mempercepat pembentukan gas metana. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian mengenai pengaruh penambahan feses terhadap batubara dengan berbagai pengenceran untuk menghasilkan produksi gas maksimum.
Produksi gas pada GBM setelah digunakan akan terbentuk kembali tetapi membutuhkan waktu yang lama. Penambahan feses yang kaya akan miroorganisme pada batubara bertujuan untuk mempercepat dan meningkatkan produksi biogas. Oleh karena itu, penelitian ini dapat dilanjutkan untuk pengaplikasian tingkat lanjut untuk memadukan antara tambang batubara yang sudah tidak produktif dengan peternakan sapi potong dengan cara menginjeksi isolat bakteri yang telah diperkaya.
Bahan dan Metode
1. Bahan
Bahan penelitian yang digunakan adalah feses segar sapi potong yang diperoleh dari peternakan rakyat daerah Jatinangor, batubara jenis lignit diambil dari desa Libur Dinding, Kabupaten Paser, Kalimantan Timur. Contoh batubara diambil dari Formasi Pamaluan, cairan isi rumen yang di peroleh dari RPH Tanjungsari. Feses sapi potong yang digunakan sebanyak 5 gram diencerkan dengan NaCl fisiologis 45 ml. Pengenceran sampel feses disimpan selama 5 menit. Sampel kemudian diencerkan pada1, 2, 10-3 dan 10-4 larutan pengencer. Batubara lignit yang dengan ukuran 1 x 1 x 1 cm sebanyak 2 buah dalam satu tabung hungate. Larutan mineral I dan II, larutan pengencer, media untuk bakteri metanogen, gas CO2, dan mix gas yang terdiri dari H2 20% dan CO2 80%.
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 3 Alat yang digunkan dalam penelitian ini adalah 18 unit tabung Hungate, tabung pengecer, erlenmeyer, tabung scott 250 dan 500 ml, syringe, kain kasa, parafilm, venoject, kuvet. Pengujian pertumbuhan total bakteri anaerob menggunakan spektrofotometer dengn OD 600 nm dan produksi gas menggunakan GC-14. Sampel yang diuji adalah 2 ml untuk pertumbuhan total bakteri dan 2 sampai 15 ml untuk pengujian produksi gas. Pengamatan dalam penelitian ini menggunakan waktu inkubasi bakteri berdasarkan Ogimoto dkk. (1981) selama 14 hari dengan waktu hari ke – 2, 5, 10, dan 14.
2. Metode
Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode eksploratif dengan penjabaran secara deskriptif. Penelitian ini tersusun atas tiga perlakuan dengan tiga ulangan, sehingga diperoleh sembilan unit sampel percobaan.
Hasil dan Pembahasan
1. Pertumbuhan Total Bakteri Anaerob dalam Rekayasa GMB
Pengujian isolat bakteri asal feses sapi potong dengan media batubara lignit terhadap pertumbuhan total bakteri anaerob dapat dilihat secara lengkap pada grafik dibawah ini.
Berdasarkan data di atas, pertumbuhan total bakteri anaerob pada pengenceran 10-2 terjadi penurunan sampai dengan hari ke-5 lalu meningkat sampai dengan hari ke-10. Pada hari ke-10 terjadi penurunan kembali sampai dengan hari ke 14. Pertumbuhan bakteri anaerob pada pengenceran 10-3 terjadi penurunan sampai dengan hari ke-10 lalu terjadi kenaikan kembali sampai dengan hari ke-14 walaupun sedikit. Pada pengenceran 10-4 terjadi peningkatan sampai dengan hari ke-14.
Kondisi penurunan pertumbuhan total bakteri anaerob tersebut sesuai dengan yang di kemukakan oleh Liang (2003) bahwa perubahan lingkungan dapat mengakibatkan perubahan sifat morfologi dan fisiologi mikroba sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba dalam media baru. Pada pengenceran 10-2 dan pengenceran 10-3 total bakteri anaerob cenderung turun sehingga total bakteri anaerob lebih sedikit dibandingkan dengan
137.42 121.92 135.83 130.22 140.93 139.72 122.11 123.81 122.46 126.36 125.6 132 110 115 120 125 130 135 140 145 150 2 5 10 14 Pengenceran 10^2 Pengenceran 10^3 Pengenceran 10^4 Hari ke-Per tu m b u h a n to ta l b a k te ri (% )
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 4 pengenceran 10-4.Peningkatan total bakteri dalam hasil analisis tersebut sesuai dengan yang dikemukakan oleh Setyati, dkk. (2015), kecepatan pertumbuhan bakteri sangat dipengaruhi oleh media tempat tumbuh dengan kandungan nutrien dan kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Pada hari ke-5 hingga hari ke-10 total bakteri anaerob pengenceran 10-2 mengalami peningkatan 13,91%. Hal tersebut terjadi karena fase pertumbuhan sudah masuk ke dalam fase logaritma atau eksponensial dimana sel membelah dengan laju yang konstan dengan massa menjadi dua kali lipat, sehingga aktivitas metabolik konstan dan keadaan pertumbuhan total bakteri anaerob seimbang.
Kurva pertumbuhan bakteri di atas sesuai dengan yang dikemukakan Manurung (2004) dimana pertumbuhan ditandai dengan peningkatan jumlah sel sedangkan kecepatan pertumbuhan bergantung pada lingkungan fisik dan kimianya. Pertumbuhan bakteri membentuk pola pembelahan biner. Pertumbuhan bakteri anaerob diamati dengan cara optical
density (OD) pada panjang gelombang 600 nm dengan alat spektrofotometer. Proses tumbuh
bakteri menunjukan pertambahan sel yang meningkat. Banyak aspek yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri dengan metabolisme bakteri, yaitu pH, media batubara lignit sebagai sumber karbon, efisiensi degradasi substrat, temperatur, sintesis protein dan senyawa kompleks lain, dan pelepasan produk metabolisme dari dalam sel bakteri anaerob.
2. Produksi Gas Metana dalam Rekayasa GMB
Pengujian isolat bakteri asal feses sapi potong dengan media batubara lignit terhadap produksi gas metana dapat dilihat secara lengkap pada grafik dengan menggunakan GC-A14.
Peningkatan produksi gas metana dihasilkan dari reduksi karbondioksida oleh hidrogen. Penurunan pertumbuhan total bakteri anaerob yang terjadi adalah bakteri nonmetanogen sehingga produksi gas metana meningkat dan penurunan produksi gas karbondioksida terjadi karena degradasi asam asetat dari tahap pengasaman langsung diubah menjadi karbondioksida tanpa adanya bantuan bakteri metanogen untuk memproduksi gas metan. Meningkatnya gas metana diikuti dengan penurunan gas nitrogen oksidapada hari ke-5
3.46 3.95 7.24 8.06 96.53 96.05 92.59 91.79 0.01 0 0.17 0.14 137.42 121.92 135.83 130.22 110 115 120 125 130 135 140 145 150 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2 5 10 14 Pe rtu m b uh a n to ta l b a k te ri a n a er o b (% ) Gas CH4 Gas CO2 Gas N2O Pertumbuha n total Bakteri Anaerob Pro d u k si G a s (% ) Hari
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 5 yaitudari 0,01% hingga 0% serta peningkatan kembali di hari ke-10 yaitu 0,17% dan menurun kembali di hari ke-14 menjadi 0,14%. Peningkatan pertumbuhan total bakteri anaerob yang terjadi adalah bakteri Bacillus denitrificans, Micrococus denitrificans, Pseudomonas stutzeni,
dan Achromobacter. Peningkatan produksi gas metana terjadi karena dekarboksilasi asetat dan
reduksi gas karbondioksida oleh hidrogen.
Gambar 3 Pengenceran Isolat Bakteri 10-3
Berdasarkan data di atas, produksi gas metana sejalan dengan pertumbuhan total bakteri anaerob. Penurunan terjadi bersamaan dengan penurunan pertumbuhan total bakteri anaerob dan peningkatan produksi gas karbondioksida. Penurunan tersebut terjadi karena bakteri metanogen masih dalam fase adaptasi terhadap lingkungan atau media baru. Peningkatan produksi gas metana ini terjadi karena dekarboksilasi asetat dan reduksi karbondioksida oleh hidrogen. Penurunan gas metana ini diikuti dengan penurunan pertumbuhan total bakteri anaerob dan peningkatan produksi gas karbondioksida.
5.56 4.23 5.72 3.83 94.44 95.75 94.23 96.06 0 0.02 0.05 0.12 140.93 139.72 122.11 123.81 110 115 120 125 130 135 140 145 150 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2 5 10 14 Pertu m b uh a n to ta l b a k te ri a n a er o b (% ) Gas CH4 Gas CO2 Gas N2O Pertumbuh an total Bakteri Anaerob P ro d u k si Ga s (% ) Hari ke-5.27 5.69 7.62 4.22 94.72 96.19 92.1 95.61 0.01 0.02 0.28 0.17 122.46 126.36 125.6 132 110 115 120 125 130 135 140 145 150 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2 5 10 14 Per tu m b u h a n to ta l b a k te ri a n a er o b (% ) Gas CH4 Gas CO2 Gas N2O Pertumbuh an total Bakteri Anaerob Pro d u k si G a s (% ) Hari
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 6 Berdasarkan data di atas, penurunan produksi gas metana terjadi karena kenaikan pertumbuhan bakteri total bakteri nonmetanogen yang kemungkinan memproduksi gas karbondioksida sehingga produksi gas metana menurun sedangkan pertumbuhan total bakteri anaerob yang terjadi adalah bakteri nonmetanogen.
Gas metana terbentuk dari hasil fermentasi secara anaerob, yaitu melalui proses perombakan polimer organic menjadi monomernya dengan bantuan mikroorganisme dalam kondisi anaerob. Tahapan pembentukan biogas dari fermentasi anaerob terjadi dalam empat tahapan, yaitu hidrolisis, pengasaman, asetogenensis dan metanogenesis (Firdaus, 2007). Proses hidrolisis terjadi pada hari ke-2 sampai hari ke-5 dimana proses penguraian senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana pada bahan biomassa. Kandungan biomassa yang terdiri dari karbohidrat, protein, dan lipid dipecah oleh mikroorganisme yang mengandung enzim amilase, protease, dan lipase (Ismawati, 2006). Proses pengasaman terjadi dengan adanya bakteri asetogenik (bakteripembentuk asam) dimana pada proses ini bakteri akan memecah struktur organic kompleks menjadi asam – asam lemak volatil (Volatile Fatty Acidatau VFA) (Firdaus, 2007). Fermentasi karbohidrat menghasilkan VFA sebagai produk utama untuk sumber energy sedangkan karbon untuk pertumbuhan dan mempertahankan kehidupan bakteri anaerob (Fujiati, 2008). Proses metanogenesis memanfaatkan peran bakteri metanogen untuk memproduksi gas metana dengan menggunakan asam yang terbentuk dari tahap pengasaman. Bakteri ini akan membentuk gas metana dan karbondioksida dari gas hidrogen (Nijaguna, 2002). Pada tahap metanogenesis substrat berupa asam organik yang didekomposisi oleh bakteri metanogenik dan menghasilkan gas metana melalui dua jalan, yaitu jalan fermentasi asam asetat menjadi metana dan karbondioksida serta jalan kedua reduksi karbondioksida menjadi gas metana dengan menggunakan gas hydrogen atau asam format yang diproduksi oleh bakteri lain. (Yanni, 2015).
3. Pengaruh Isolat Bakteri Feses Sapi Potong dalam Rekayasa Produksi GMB dengan Media Batubara Lignit
Gas metana merupakan gas yang diharapkan dari proses rekayasa GMB dengan memanfaatkan bakteri anaerob sebagai katalisator dalam mekanisme pembentukan gas metana batubara lignit. Berdasarkan analisis data, produksi gas metana dengan media batubara lignit untuk rekayasa produksi GMB dipengaruhi oleh waktu inkubasi bakteri anaerob. Waktu inkubasi bakteri yang digunakan berdasarkan Ogimoto dan Imai (1981) selama 14 hari dengan waktu hari ke-2, 5, 10, dan 14.
Pengenceran 10-2, 10-3, dan 10-4 isolat bakteri feses sapi potong dalam rekayasa produksi GMB dengan media batubara lignit memproduksi gas metana dari hasil dekarboksilasi asetat dan reduksi karbon dioksida oleh hidrogen, di mana pertumbuhan total bakteri anaerob mulai menurun tetapi produksi karbon dioksida masih tinggi. Peningkatan produksi gas karbon dioksida masih dapat menghasilkan gas metana dengan cara reduksi gas karbon dioksida.
Pada pengenceran 10-2, 10-3 dan 10-4 dihasilkan gas nitrogen oksida. Proses pembentukan gas metana oleh bakteri metanogen sangat dipengaruhi oleh sensitifitas lingkungan. Sifat bakteri metanogen adalah anaerob obligat yang pertumbuhannya akan terhambat oleh kandungan oksigen dan materi pereduksi seperti nitrit atau nitrat dapat menghambat bakteri metanogen (Yanni, 2015). Oleh karena itu, tiga pengenceran yang
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 7 digunakan menghaslikan peningkatan atau penurunan gas nitrogen oksida yang dapat menghambat produksi gas metana.
Isolat bakteri hasil pengenceran dapat tumbuh dalam batubara lignit dengan menggunakan komponen organik batubara sebagai substrat. Bakteri mendegradasi senyawa kompleks, senyawa hidrokarbon, dan campuran organik padat yang terkandung dalam batubara, sampai bakteri ini mampu memproduksi biogas (Strapoc dkk., 2008). Gas pada batubara terdiri atas campuran karbon monoksida, hidrogen, sedikit metana, karbon dioksida, dan sulfur. Mikroorganisme pada batubara lignit mampu mereaksikan gas karbon monoksida yang dikonversi menjadi asetat.
Peningkatan produksi gas metana yang diiringi dengan penurunan produksi gas karbondioksida serta pertumbuhan total bakteri anaerob yaitu kemungkinan bakteri yang pertumbuhannya mengalami penurunan yaitu bakteri non metanogenik sedangkan apabila pertumbuhan total bakteri anaerob mengalami kenaikan dan produksi gas metana mengalami kenaikan dan diiringi dengan penurunan produksi gas karbondioksida maka pertumbuhan total bakteri anaerob tersebut adalah bakteri metanogenik. Batubara lignit memiliki kemampuan untuk memproduksi gas metana dengan menggunakan inkubasi bakteri metanogen (Haris, dkk., 2008).
Batubara memiliki kemampuan menyimpan gas dalam jumlah yang banyak, karena permukaannya dapat mengadsorpsi gas. Batubara memiliki banyak pori-pori yang berukuran lebih kecil dari skala mikron, kondisi tersebut menyebabkan permukaan batubara mampu menyerap gas dalam jumlah yang besar. Jika tekanan gas semakin tinggi, maka kemampuan batubara untuk mengadsorpsi gas juga semakin besar. Gas yang terperangkap pada batubara sebagian besar terdiri atas gas metana. Kandungan karbon dalam batubara lignit lebih banyak sehingga dapat mempengaruhi kerja isolat bakteri dalam feses sapi potong dalam memproduksi gas metana.
Simpulan
1. Penggunaan feses sapi potong sebagai sumber bakteri dengan pengenceran 10-2, 10-3 dan 10-4 dalam media batubara lignit mempengaruhi pertumbuhan total bakteri anaerob, baik bakteri metanogen maupun nonmetanogen. Pengenceran 10-4 merupakan pengenceran yang paling tinggi karena pertumbuhan total bakteri anaerob yang terus meningkat.
2. Penggunaan feses sapi potong sebagai sumber bakteri dengan pengenceran 10-2, 10-3 dan 10-4 media batubara lignit mempengaruhi produksi gas metana. Pengenceran 10-2 merupakan pengenceran yang paling tinggi karena pada pengenceran 10-2 produksi gas metana terus meningkat.
Saran
Pemanfaatan isolat bakteri feses sapi potong dengan batubara lignit diperlukan penelitian lanjut untuk mengetahui jenis bakteri yang dapat digunakan dalam sumur batubara di dalam bumi serta kondisi lingkungan dalam bumi yang harus disesuaikan dengan lingkungan aktivitas bakteri guna produksi gas metana batubaraoptimum.
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran | 8
Ucapan Terimakasih
Penulis mengucapkan terimakasih kepada pembimbing utama Dr. Ir. Tb. Benito A. Kurnani , Dip. Est. dan pembimbing anggota Dr. Eng. I Made Joni, M.Sc., Hilda Amalia selaku laboran dan Titi Sopiawati, SP. pembimbing di LABTAN dan Prof. Dr. Ir. Ellin Harlia, M.S. selaku ketua tim Academic Leaderships Grant (ALG).
Daftar Pustaka
Firdaus, I.U. 2007. Keuntungan biogas. http//Biogen.litbang.deptan.go.id/
terbitan/prosiding200384-96susi.pdf. 02-08-2016. Pukul 18.30 WIB
Fujiati, A. K. 2008. Analisis Kandungan Volatile Fatty Acids (VFA) Kultur Probiotik Isolat Khamir R1 dan R2 dalam Fermentor Air-Lift Skala 18 liter. Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi. UIN Syarif Hidayatullah; Jakarta.
Haris, Steve H., Richard L.Smith., Charles E. Barker. 2008. Microbial and Chemical Factors Influencing Methane Production in Laboratory Incubations of Low-Rank Subsurface
Coals, U.S.A. Journal of Unconventional Coal Geology. Journal of Elsevier, 76(2008)
46-51.
Ismawati, I. A. 2006. Karakteristik Kimia Kotoran Sapi sebagai Bahan Baku Biogas dan Cairan Hasil Buangannya (Effluent). Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor; Bogor. Nijaguna, B. 2002. Biogas Technology; New Age International (P) Ltd; New Delhi. India.
Liang T-M. 2003. Application of Membrane Separation on Anaerobic Hydrogen Producing
Process. Phd Thesis Departement of Environmental Engineering.National Cheng
Kung University.
Manurung, Renita. 2004. Proses Anaerobik sebagai Alternatif untuk Mengolah Limbah Sawit. Skripsi. Universitas Sumatera Utara.
Nijaguna, B. 2002. Biogas Technology; New Age International (P) Ltd; New Delhi. India. Ogimoto K. dan Imai S. 1981. Atlas of Rumen Microbiology. Japan Scientific Societies Press.
Tokyo.
Setyati, Ati, Erni M., Triyanto, Subagiyo, dan Muhammad Z. 2015. Kinetika Pertumbuhan dan Aktivitas Protease Isolat 36k dari Sedimen Ekosistem Mangrove, Karimun Jawa, Jepara. Jurnal Ilmu Kelautan Vol. 20 No. 3.
Yanni, K dan Kosasih. 2015. Media Rumen untuk Meningkatkan Produksi Gas Metana
Batubara. Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Minyak dan Gas Bumi,
