ISBN 978-602-95471-0-8
ISBN 978-602-95471-0-8
20 Prosiding Biteknologi
EKSPRESI CYP1A1 DAN GST SERTA MUTASI GEN p53 DAN H-ras SETELAH INDUKSI 7,12-DIMETHYL BENZ(Ά)ANTRASEN (DMBA) DAN PEMBERIAN ANTI KARSINOGENESIS Gynura procumbens
PADA TIKUS GALUR SPRAGUE DAWLEY Abdul Gofur1) , Iwan Sahrial Hamid2), Edy Meiyanto3)
1)
Jurusan Biologi Universitas Negeri Malang 2)
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga 3)
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada ABSTRAK
Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengetahui aktifitas ekstrak etanol tanaman daun Mahkota Dewa (Gynura procumbens) sebagai antikarsinogenesis setelah inisiasi kanker payudara pada tikus dengan 7,12-Dimethylbenz(a)antrasen. Hasil penelitian diharapkan dapat dipergunakan sebagai pembuktian ilmiah penggunaan tanaman daun mahkota dewa sebagai antikanker khususnya kanker payudara.
Uji antikarsinogenesis dilakukan dengan menggunakan tikus betina galur Sprague dawley yang dibuat kanker payudara dengan menginduksi karsinogen DMBA.
Pengamatan antikarsinogenesis yang dimaksud meliputi uji aktifitas dan ekspresi enzim CYP1A1 dan Glutathion-s-trasnferase.Tanaman obat tersebut mempunyai kandungan bahan yang berkhasiat sebagai antikanker, memainkan peranan pada hambatan ensim sitokrom hepar CYP1A1 dan peningkatan GST. Aktifitas dan ekspresi CYP1A1 sebagai indikator meningkatnya metabolit DMBA yaitu benzilic carbonium. Glutation-s-transferase (GST) merupakan enzim yang berperan mengaktifasi pembentukan senyawa glutathion (GSH) yang mempunyai afinitas dengan metabolit DMBA berupa konjugasi yang membatasi efek karsinogen benzilic carbonium.
Kata kunci: antikarsinogenesis, Gynura procumbens A. PENGANTAR
Pemberian kemoterapi antikanker memiliki efek farmakologi yang kurang selektif, efek samping yang merugikan dan dilaporkan adanya resistensi beberapa jenis kanker (King, 2000). Ekstrak etanol daun Sambung nyawa yang mengandung flavonoid terbukti mampu menghambat pertumbuhan tumor paru pada mencit yang diinduksi dengan Benzo(a)pirene (Sugiyanto dkk., 2003). Demikian pula hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Tasminatun (2005) bahwa pemberian ekstrak etanolik daun G. procumbens yang diberikan seminggu 3 kali dengan dosis 250 mg/kgBB dan 750 mg/kgBB setelah inisiasi pada kanker payudara tikus terinduksi Dimethylbenz(a)antrasen (DMBA) mempunyai kecenderungan menurunkan insidensi tumor sebesar 10-20 %. B. TUJUAN
Tujuan dilaksanakannya penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Untuk mengetahui apakah terjadi penghambatan ekspresi enzim CYP1A1. 2. Untuk mengetahui apakah terjadi peningkatkan ekspresi glutathion-s- transferase
(GST).
C. CARA KERJA
• Pembuatan ekstrak etanolik
Sebanyak 500 gram serbuk Gynura procumbens diekstrak dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak 1,5 L. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan
ISBN 978-602-95471-0-8
Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009 21 kemudian diendapkan, lalu disaring untuk selanjutnya diuapkan dengan pengurangan tekanan menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.
• Pembuatan larutan karsinogen DMBA dalam minyak jagung
Pembuatan larutan DMBA diperhitungkan sehingga volume yang diberikan ke tikus antara 0,5-1,0 ml untuk dosis DMBA 20 mg/kgBB. Rumus umum yang digunakan adalah: DMBA kadar 20 x 1000 s badan tiku berat DMBA pemberian Volume =
• Penyiapan sediaan uji (ekstrak etanolik G. Procumbens dan C. zedoaria )
Ekstrak etanolik Gynura procumbens yang akan diberikan pada hewan coba disuspensikan dalam aquades dengan suspending agent CMC Na 0,5 % di dalam mortir. Rumus umum yang digunakan adalah :
ekstrak kadar dosis x 1000 s badan tiku berat pemberian Volume =
• Perlakuan pada hewan percobaan
Disain penelitian ini pada dasarnya menggunakan model pre inisiasi DMBA, yang dimaksudkan adalah pemberian ekstrak etanol senyawa anti kanker Gynura procumbens diberikan sebelum pemberian senyawa karsinogen DMBA. Hewan coba yang digunakan tikus putih galur Sprague dawley betina umur 40 hari dengan berat badan rata-rata 60-70 gram.
Sejumlah 40 ekor tikus betina galur Sprague Dawley dikelompokkan menjadi lima kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan memerlukan 8 ekor tikus. Pengelompokan hewan percobaan pada setiap kelompok perlakuan adalah sebagai berikut :
1. Kelompok I : Kelompok kontrol negatip Corn oil, yaitu tanpa inisiasi DMBA 30 mg/kg bb dalam corn oil, hanya pemberian corn oil yang frekuensinya sama dengan pemberian DMBA yaitu hari ke 9, 11 dan 13.
2. Kelompok II : Kelompok kontrol negatip CMC Na 0,5 %, yaitu tanpa pemberian ekstrak G. procumbens, hanya pemberian CMC Na 0,5 % yang frekuensinya sama dengan pemberian ekstrak G. procumbens yaitu mulai hari 1-13.
3. Kelompok III : Kelompok Kontrol Positip DMBA, yang dibuat model kanker payudara dengan pemberian DMBA dalam corn oil dengan dosis 30 mg/kg bb secara peroral sebanyak tiga kali pemberian yaitu pada hari ke 9, 11 dan 13. 4. Kelompok IV : Kelompok perlakuan ekstrak Gynura procumbens 300 mg/kg bb
dalam CMC Na 0,5% diberikan intragastrik selama 13 hari mulai hari ke 1-13, pemberian inisiasi DMBA dalam corn oil dosis 30 mg/kg bb secara peroral pada hari ke 9, 11 dan 13.
5. Kelompok V : Kelompok perlakuan ekstrak Gynura procumben 750 mg/kg bb dalam CMC Na 0,5% diberikan intragastrik selama 13 hari mulai hari ke 1-13, pemberian inisiasi DMBA dalam corn oil dosis 30 mg/kg bb secara peroral pada hari ke 9, 11 dan 13.
ISBN 978-602-95471-0-8
22 Prosiding Biteknologi
Percobaan pada hari pertama dimulai pada saat umur tikus mencapai 40 hari dan diakhiri pada umur 54 hari. Pemberian ekstrak Gynura procumbens dosis 300 dan 750 mg/kg bb dalam CMC Na 0,5% diberikan selama 13 hari. Inisiasi DMBA dosis 30 mg/kg bb diberikan sebanyak tiga kali yaitu pada hari ke 9, 11 dan 13. Pada hari ke 14 semua hewan coba (tiap kelompok terdiri dari 8 ekor tikus / n = 8) dikorbankan, diisolasi heparnya untuk dilakukan pengamatan ekspresi dan aktivitas CYP1A1 dan GSTµ. Penimbangan berat badan dilakukan pada hari pertama saat umur tikus 40 hari, umur 47 hari dan penimbangan pada akhir penelitian saat umur tikus mencapai 54 hari. Selanjutnya dilakukan pengamatan ekspresi GSTµ dan CYP1A1 dengan uji immunohistokimia.
• Pembuatan sediaan histologi
Analisis sediaan histopatologi dilakukan terhadap organ mammae dan hepar yang dinekropsi dari tikus yang dikorbankan setelah mendapat perlakuan inisiasi dengan DMBA dan pemberian ekstrak etanol tanaman Gynura procumbens. Sediaan yang terpilih kemudian diwarnai menurut teknik pewarnaan Verhoff von Gieson (VvG) (Bancroft and Cook, 1998).
• Analisis data
Digunakan model statistika parametrik dengan melakukan uji normalitas data dengan uji Kolmogorov-smirnov. Bila data terdistribusi normal, dilanjutkan dengan uji ANOVA (Univariate Analysis of Variance) satu arah dengan post-hoc test uji Duncan dengan taraf kepercayaan 95% untuk membandingkan ekspresi CYP1A1 dan GSTµ antar kelompok perlakuan. Uji statistik dilakukan dengan bantuan perangkat lunak SPSS® 13.0 for Windows®.
D. HASIL DAN PEMBAHASAN
• Ekspresi CYP1A1 pada pemberian Gynura procumbens
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa sel yang mengekspresikan CYP1A1 pada kelompok perlakuan dengan DMBA 20 mg/kg bb hampir merata pada setiap sel hepar dengan jumlah rata-rata tertinggi 56,79 ± 10,71, hasil tersebut tampak berbeda (p<0,05) dengan pengamatan ekspresi CYP1A1 pada kelompok perlakuan ekstrak G. Procumbens baik yang menggunakan dosis 300 maupun 750 mg/kg bb + DMBA 20 mg/kg bb serta juga berbeda nyata dengan kelompok perlakuan pelarut corn oil dan CMC Na. Kelompok perlakuan G. procumbens 300 mg/kg bb, 750 mg/kg bb dan pelarut CMC Na tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Sedangkan pada kelompok pelarut corn oil menunjukkan hasil jumlah ekspresi CYP1A1 yang paling sedikit yaitu 25,92 ± 7,34 dibandingkan dengan kelompok yang lain. Hasil pengamatan yang membandingkan antara kelompok perlakuan ekstrak dosis 300 mg/kg bb dengan dosis 750 mg/kg bb menunjukkan relatif tidak ada perbedaan dimana ekspresi CYP1A1 cenderung mengelompok pada sebagian kecil kelompok sel, tetapi jumlah rata-rata ekspresi CYP1A1 pada pemberian G.procumbens 750 mg/kg bb + DMBA lebih besar. Hal tersebut menunjukkan adanya kemampuan hambatan ekspresi CYP1A1 yang lebih rendah. Tabel 1 berikut menunjukkan rerata ekspresi CYP1A1 pada setiap kelompok perlakuan.
Tabel 5.1. Rerata Ekspresi CYP1A1 Setiap Kelompok Perlakuan
KELOMPOK Mean ± SD
ISBN 978-602-95471-0-8
Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009 23 Gyn 300 mg/kg bb + DMBA 20 mg/kg bb 32.04 bc ± 5,83 Gyn 750 mg/kg bb + DMBA 20 mg/kg bb 38,57 b ± 9,13 Corn Oil 25,92 c ± 7,34 CMC Na 30,66 bc ± 5,75
Keterangan : superskrip yang berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05).
Pemaparan DMBA 20 mg/kg bb mampu menyebabkan perubahan yang nyata pada ekspresi CYP1A1 sel hepar tikus, hal tersebut tampaknya sesuai dengan pendapat Pitot dan Dragan (2001) bahwa 7,12-dimethylbenz(a)antrasen merupakan senyawa karsinogen yang memerlukan aktivasi metabolisme untuk menjadi reaktif, terutama oleh enzim sitokrom P450 isoform CYP1A1, membentuk proximate carcinogen dan ultimate carcinogen.
Peningkatan dosis ekstrak akan berpengaruh pada kadar flavonoid dan terpenoid yang terdapat di dalam ekstrak, dengan demikian pemberian ekstrak dapat menghambat inisiasi karsinogenesis pada hepar, melalui hambatan ekspresi CYP1A1. Hal tersebut terjadi pada pemberian ekstrak G. procumbens 300 mg/kg bb yang mampu menekan ekspresi CYP1A1 dengan nilai rata-rata ekspresi lebih kecil dibandingkan dengan perlakuan pemberian DBMA dan pemberian ekstrak G.procumbens 750 mg/kg bb + DMBA. Hasil ekspresi CYP1A1 yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antara kelompok perlakuan ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Zhai et al. (1998) bahwa beberapa senyawa flavonoid memiliki potensi dan selektifitas yang tinggi untuk menghambat isoenzim CYP1A.
• Ekspresi GSTµ pada Pemberian Gynura procumbens
Pembandingan pengamatan ekspresi GSTµ pada kelompok ekstrak Gynura procumbens 300 mg/kg bb + DMBA tampak lebih mendominasi warna kecoklatan pada sitoplasma sel dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang lain. Hal ini juga terbukti pada hasil analisis statistik uji Duncan menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dibanding kelompok perlakuan yang lain dengan rata-rata tertinggi 66,20 ± 5,60. Hal ini berbeda dengan gambaran ekspresi GSTµ pada kelompok kontrol positip DMBA, dimana GSTµ diekspresikan tidak merata pada setiap sel dan tampak sebagian kecil sel yang mengekspresikan GSTµ, rata-rata ekspresi GSTµ paling sedikit dibanding kelompok perlakuan yang lainnya yaitu 25,45 ± 7,21. Sedangkan ekspresi GSTµ pada kelompok perlakuan Gynura procumbens 750 mg/kg bb, pelarut corn oil dan CMC Na tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05) dengan jumlah rata-rata berturut-turut 45,80 ± 4,10 ; 44,94 ± 8,49 dan 39,44 ± 15,65.
Senyawa DMBA merupakan senyawa bifunctional inducer, dimana senyawa ini dapat menginduksi enzim metabolisme fase I dan fase II melalui aktivasi aryl hydrocarbon receptor dan Nrf2 (Nguyen dkk, 2003), hal inilah memungkinkannya terdapat ekspresi GSTµ pada kontrol positip pemberian DMBA. Tabel 2 berikut menunjukkan rerata ekspresi GSTµ pada setiap kelompok perlakuan.
Tabel 5. 2. Rerata Ekspresi GSTµ Setiap Kelompok Perlakuan
KELOMPOK Mean ± SD
DMBA 20 mg/kg bb 25,45 c ± 7,21 Gyn 300 mg/kg bb + DMBA 20
mg/kg bb 66,20
ISBN 978-602-95471-0-8 24 Prosiding Biteknologi Gyn 750 mg/kg bb + DMBA 20 mg/kg bb 45,80 b ± 4,10 Corn oil 44,94 b ± 8,49 CMC Na 39,44 b ± 15,65
Meskipun ekspresi GSTµ sedikit bila dibandingkan dengan kelompok yang diberi ekstrak Gynura procumbens. Pada kelompok pemberian ekstrak Gynura procumbens 300 dan 750 mg/kg bb + DMBA memberikan gambaran ekspresi GSTµ yang lebih nyata, hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan senyawa flavonoid (isoflavon dan flavon) yang terkandung dalam ekstrak Gynura procumbens dapat menginduksi GSTµ.
Secara spesifik pada sel hepar yang diekspresikan adalah GSTµ, karena kelas isoenzim ini lebih banyak didistribusikan di hepar. Klasifikasi GST didasarkan pada sekuen homologi asam amino primer, distribusi ke jaringan, dan substrat spesifiknya (Atkins dkk, 1993). Struktur primer GST berperan menimbulkan perbedaan antara tiap kelas enzim tersebut. Perbedaan ini disebabkan karena adanya substitusi asam amino tunggal atau rantai polipeptida yang berbeda pada setiap struktur enzim tersebut (Mannervik dkk, 2001). Induksi GST diawali dengan aktivasi jalur Nrf2-ARE GST (Zhang dkk, 2004).
• Pengamatan Mikroskopis Kelenjar Mamae
Pengamatan mikroskopis kelenjar mamae tampak sel-sel kelenjar mamae dari payudara tikus pada kelompok perlakuan ekstrak etanolik daun G. procumbens dosis 300 dan 750 mg/kg bb menunjukkan gambaran normal seperti kelompok kontrol negatip corn oil dan CMC Na, yaitu ditemukan hanya satu lapis sel epitel acini (normal acinus) dan diantara acinus ada lapisan tipis dari jaringan ikat. Demikian pula terjadi pada kelompok kontrol positip DMBA 20 mg/kg bb, tidak menunjukkan adanya penebalan lapisan sel epitel mamae. Pada pengamatan ini tidak terlihat adanya proliferasi sel-sel epitel acini walaupun hanya proliferasi ringan sekalipun.
Hasil pengamatan mikroskopis sel kelenjar mamae yang relatif sama pada setiap kelompok perlakuan, kemungkinan disebabkan oleh belum terjadi perkembangan struktur kelenjar mamae secara mikroskopis maupun makroskopis kearah keganasan tumor. Perkembangan tumor pertama kali biasanya terjadi pada minggu ke 3 dan 4 setelah pemberian DMBA terakhir sampai pada minggu ke 12 menunjukkan pertumbuhan tumor 100 % pada semua tikus. Sebagaimana hasil penelitian yang dilakukan Tasminatun (2004) bahwah terjadi pertumbuhan nodul tumor mamae tikus 100% pada minggu ke 12 – 16, rata-rata insidensi 3,43 ± 1,813.
E. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh maka dapat ditarik suatu kesimpulan sebagai berikut :
1. Kelompok perlakuan dengan Gynura procumbens dosis 300 dan 750 mg/kg bb pada tikus betina galur Sprague dawley menunjukkan hambatan ekspresi CYP1A1. Ekspresi CYP1A1 pada membran sel hepar lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol positip DMBA 20 mg/kg bb.
2. Kelompok perlakuan dengan Gynura procumbens dosis 300 dan 750 mg/kg bb pada tikus betina galur Sprague dawley menunjukkan peningkatan ekspresi GSTµ. Ekspresi GSTµ pada membran sel hepar tampak lebih besar dibandingkan dengan kelompok kontrol positip DMBA 20 mg/kg bb.
ISBN 978-602-95471-0-8
Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009 25 3. Gambaran Histopatologi pada setiap kelompok perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p > 0,05), struktur epitel kelenjar mamae belum menunjukkan adanya perubahan ke arah keganasan.
F. DAFTAR PUSTAKA
King, R.J.B., 2000. Cancer Biology, 2nd Ed., Pearson Eduation Limited, London.
Mannervik, B., Bolton-Grob, R, Cameron, A. D., Etahadieh, M., Gustafsson, A., Hansson, L. O., Hubatsch I., Jemth, P. Johansson, Ann-Sofie, Jones, T. A., Larson, Anna-Karin, Nilsson, L. O., Olin, B., Petterson, P. L., Ridderstrom, M., Stenberg, G., Widersten, M., Wisen, S, 2001. Chemico-Biological Interactions, 133, 3-6
Moon, Young Jin, Wang Xiaodong Wang, Morris, M. E. 2005. Dietary Flavonoids : Effects on Xenobiotic and Carcinogen Metabolism, Elsevier, 20, 187-216. Sugiyanto, Sudarto, B., Meiyanto, E., Agung Endro Nugroho, Umar A. Jenie., 2003,
Aktivitas Antikarsinogenik Senyawa Yang Berasal Dari Tumbuhan, Majalah Farmasi Indonesia, 14(4), 216-225.
Tasminatun, S. 2004. Efek Antikarsinogenesis Ekstrak Etanolik Daun Gynura Procumbens (Lour.) Merr. Setelah Inisiasi Pada Kanker Payudara Tikus Terinduksi 7,12-Dimetil Benz(A)Antrasen (DMBA). Thesis Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
Zhai, S., Dai, R., Friedman, F., Vestal, R. 1998. Comparative Inhibition Of Human Cytochromes P450 1A1 and 1A2 By Flavonoids, Drug Metab. Disposition, 26 (10): 989-992.
Zheng, G. O., Kenney, P. M., & Lam, L. K., 1992. Sesquiterpenes From Cloves (Eugenia caryophyllata) as Potential Anticarcinogenic Agents, Carcinogenic, 55 (7), 999 – 1003.
