Seminar Dewinta G34063443
Dewinta, Achmad Farajallah, dan Yusli Wardiatno. 2010. Pola Distribusi Geografis pada Udang Mantis di Pantai Jawa Berdasarkan Genom Mitokondria. Seminar disampaikan tanggal 11 September 2010, Departemen Biologi FMIPA IPB.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Udang mantis atau udang ronggeng merupakan anggota Filum Arthropoda, Subfilum Crustacea, Ordo Stomatopoda, yang terdiri atas empat famili, yaitu Odontodactylidae, Lysiosquillidae, Harpiosquillidae dan Squilidae. Sebagaimana udang pada umumnya, kelompok udang ini dicirikan dengan tubuh yang
bersegmen, di belakang kepala terdapat karapas pendek, kaki beruas-ruas, ukuran tubuh yang besar dan mata seringkali berbentuk T (Carpenter dan Niem 1998).
Habitat sebagian besar udang mantis adalah pantai, senang hidup di dasar air terutama pasir berlumpur. Cara hidup udang mantis dengan menggali dan bersembunyi di dasar air untuk berburu mangsa. Salah satu udang mantis yang bernilai ekonomi tinggi adalah Harpiosquilla harpax dari Famili Harpiosquillidae. Udang ini diekploitasi untuk diperdagangkan sebagai makanan eksotik. Jenis udang mantis lain yang sering diperdagangkan adalah Lysiosquillina maculata, Squilla empusa, dan S.mantis (Moosa 1997).
Karakteristik dari stomatopoda sebagai hewan pemangsa memiliki dua metode untuk menangkap mangsa. Kedua metode inilah yang kemudian akan membedakan kelompok fungsional stomatopoda yang sangat luas, yaitu smashers (galak) dan spearers (sangat baik). H. Harpax sendiri tergolong kedalam spearers (Ahyong 1997).
H. harpax banyak ditemukan di Pantai Utara Pulau Jawa, Selat Malaka sampai ke Laut Pasifik (Ahyong et al. 2008). Ciri-ciri H. harpax adalah tubuh terdiri atas tiga bagian yaitu kepala, thoraks dan abdomen, karapas dengan median carina, distal
segmen dari uropod memiliki garis tengah warna putih atau sedikit hitam, carina intermediat tidak terlalu tajam, rostal dilengkapi dengan projeksi anterior, panjang total mencapai 30 cm, mata sangat besar dan berbentuk T, telson berduri dan median carina pada telson memiliki dua bintik hitam (Carpenter dan Niem 1998).
Udang betina mampu menelurkan 50.000 hingga 1 juta telur, yang akan menetas setelah 24 jam menjadi larva nauplius (Choi dan Hong 2001). Tahap perkembangan larva pada udang mantis terdiri dari empat fase. Fase pertama yaitu nauplius, larva nauplius tidak dapat berenang sehingga terbawa arus kemana saja arus bergerak, terutama arus sejajar garis pantai, bermetamorfosis dalam enam stages berkisar selama dua hari. Fase ke dua yaitu protozoea, mempunyai tujuh pasang anggota tubuh, bermetamorfosis dalam tiga stages berkisar selama tujuh hari. Fase ketiga yaitu mysis bermetamorfosis dalam tiga stages berkisar selama tujuh hari. Fase terakhir yaitu postlarva, pada fase ini udang mulai memiliki karakteristik udang dewasa, dilanjuti menjadi juvenil dan udang dewasa (Choi, 2001).
Pergerakkan arus ini bergantung kepada arah/sudut gelombang yang datang. Pada kawasan pantai yang diterjang gelombang menyudut, terhadap garis pantai, arus yang dominan terjadi adalah arus sejajar pantai. Pergerakan arus sejajar dengan garis pantai inilah yang menyebabkan pola penyebaran terus mengikuti garis pantai. Persebaran larva yang hanyut terikut arus terus mengalami persebaran yang sangat luas bahkan antar samudera (Barber et al. 2002).
Dalam penelitian ini populasi H. harpax berusaha dipelajari menggunakan penanda genetik genom mitokondria, yaitu ruas genom yang dikenal dengan d-loop atau control region. Genom mitokondria hewan merupakan genom sitoplasmik yang diwariskan secara uniparental, dan tidak mengalami rekombinasi. Genom
mitokondria atau mtDNA terdiri atas 2 gen penyandi rRNA, 22 tRNA, dan 13 gen penyadi protein yang terlibat dalam rangkaian rantai respirasi selular, dan satu ruas yang berfungsi sebagai pengontrol transkripsi yang dikenal sebagai d-loop. Ruas d-loop dikenal mempunyai laju mutasi yang lebih cepat dibanding ruas-ruas gen lainnya, sehingga sangat cocok untuk digunakan sebagai penanda genetik untuk mempelajari fenomena intraspesifik (Cook 2005).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik udang mantis Harpiosquilla harpax di Pantai Jawa, berdasarkan genom mitokondria.
BAHAN DAN METODE
Metode
Koleksi Udang dan Identifikasi sampel. Udang mantis H. harpax sebanyak
delapan ekor koleksi bapak Dr. Yusli Wardiatno dari Departemen Manajemen
Sumberdaya Perairan IPB yang dipreservasi dalam etanol. Kepastian spesies udang mantis sebagai Harpiosquilla harpax diidentifikasi berdasarkan kunci identifikasi (Carpenter dan Niem 1998).
Ekstraksi dan Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan dari otot tungkai. Otot tungkai
yang disimpan dalam etanol dicuci dengan air destilata dua kali kemudian dihomogenasi dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8). Sel-sel otot dilisis menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1%. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood.
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA. Bagian d-loop dari mtDNA
diamplifikasi menggunakan primer yang didesain menggunakan Primer 3 (
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) dengan referensi beberapa mtDNA anggota stomatopoda yang ada di Gen Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Primer forward
AF180berada pada urutan 15102 nt dan primer reverse AF181 berada pada urutan 15127 terhadap mtDNA H.harpax, dengan target DNA hasil amplifikasi berukuran 929 bp.
Reaksi PCR dilakukan dalam volume 50 μL. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 30 siklus yang
terdiri atas denaturasi suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer suhu 54oC
selama 1 menit, pemanjangan 72oC selama 2.30 menit dan diakhiri pemanjangan
akhir suhu 72oC selama 7 menit. Produk PCR diuji menggunakan PAGE 6%,
kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstrom 1986).
Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequencing. Produk PCR berupa
pita tunggal di atas gel poliakrilamid dan berukuran sesuai desain primer dimurnikan, untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. PCR untuk
sequencing menggunakan primer yang sama seperti amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual. Runutan-runutan nukleotida yang telah diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi, yaitu H. harpax yang ditangkap dari Pantai Vietnam dengan No akses AY699271 (Miller dan Austin 2006) menggunakan program Clustal W 1.8 yang tertanam dalam program MEGA versi 4.00.
Analisis Filogeni. Analisis keragaman nukleotida dan filogenetik dilakukan
menggunakan MEGA (Kumar et al. 2008) berdasarkan model subtitusi Kimura-2 -parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi
Hasil identifikasi berdasarkan buku identifikasi Carpenter dan Niem (1998) menunjukkan bahwa sampel udang yang digunakan adalah spesies H. harpax.
Amplifikasi dan Visualisasi DNA
Dari kedelapan sampel yang digunakan, semuanya berhasil diamplifikasi.
Amplifikasi menggunakan pasangan primer AF180 dan AF181 menghasilkan pita tunggal berukuran sekitar 1100bp (Gambar 1).
Gambar 1. Produk PCR berupa pita tunggal yang diuji dengan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6%. Keterangan: M = DNA marker 100 bp, No urut sesuai dengan Gambar 2.
Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA SequencingPanjang basa nukleotida DNA setelah ruas penempelan primer dibuang dan diedit, yakni sekitar 800-an. Setelah disejajarkan, runutan nukleotida yang bisa dilanjutkan dianalisis berada pada posisi 13496 nt sampai 14273 nt berdasarkan referensi mtDNA H. harpax (Miller dan Austin 2006) sepanjang 787 nt. Dari 787 nukleotida, sebanyak 645 nt sama untuk semua sampel. Dari 142 nt yang berbeda, sebanyak 9 nt merupakan insersi/delesi yang hanya ditemukan pada satu sampel dan 84 nt substitusi yang hanya
ditemukan pada satu sampel sehingga sebanyak 93 nt tidak diikutkan dalam analisis berikutnya karena tidak bersifat parsimoni. Sisanya sebanyak 49 nt yang terdiri dari dua jenis mutasi, yaitu subsitusi dan insersi/delesi kemudian digunakan dalam menghitung keragaman genetik (Gambar 2).
Gambar 2. Runutan nukleotida yang saling berbeda antar sampel yang digunakan dalam analisis keragaman genetik dan membangun pohon filogeni. Nomor urut
nuleotida ditulis secara vertikal (5 baris paling atas) mengacu pada genom mitokondria H. harpax No. akses AY699271.
Secara filogeografi H. harpax di Perairan Cirebon terpisah dengan H. harpax di Perairan Vietnam. Hal ini dibuktikkan oleh nilai jarak genetik terjauh adalah antara H. harpax Vietnam dan H. harpax 3 yaitu sebesar 10,5%, sedangkan jarak genetik paling dekat adalah antara H. harpax 1dan 6 (kelompok 1) yaitu sebesar 1,8%. Keragaman genetik H.harpax di Perairan Cirebon berdasarkan ruas d-loop memiliki nilai lebih besar yaitu 5.1% (±0,005) (Tabel 1) bila dibandingkan dengan
keragaman genetik Halocyprida sp berdasarkan ruas C01 yaitu sebesar 2,27%. Nilai keragaman genetik d-loop yang lebih besar membuktikkan bahwa ruas d-loop memiliki laju mutasi lebih tinggi dibandingkan ruas-ruas pada mtDNA lainnya dan mutasi yang tinggi berbanding lurus dengan tingginya keragaman (Cook 2005).
Rata-rata komposisi nukleotida A=41,2% ; T=38,7% ; G=7,9% ; C=12,3%.
Persentase A+T (79,9%) lebih besar daripada C+G (20,2%). Banyaknya basa A+T pada genom mitokondria d-loop dibandingkan C+T berkaitan dengan d-loop sebagai promotor titik awal transkripsi bagi utas berat maupun utas ringan (Hoelzoel et al. 1994). Hal lain yang menyebabkan basa AT lebih tinggi disebakan oleh adanya sekuens yang berulang dan panjangnya urutan T (Cook 2005).
Analisis Filogeni
Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootstrap1000x mengelompokkan udang H. Harpax dalam satu percabangan dan H. Harpax Vietnam berada di luar percabangan. Struktur populasi yang digambarkan oleh mtDNA ini setidaknya membagi populasi H. harpax di perairan Cirebon menjadi dua yaitu kelompok 1 dan kelompok 2. H. harpax 1,4,6 dan 10 termasuk ke dalam
kelompok 1 dan saling berkerabat dekat.
H. harpax 2, 3, 5, dan 8 termasuk ke dalam kelompok 2 dan saling berkerabat dekat. Titik nenek moyang (anchestral node) menunjukkan bahwa kekerabatan H. harpax 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 dan 10 adalah berasal dari satu nenek moyang/indukkan. Sedangkan populasi H harpax dari perairan Cirebon berbeda nenek
moyang/indukan dengan H. harpax di perairan Vietnam (Gambar 3). Hal ini
disebabkan oleh pola penyebaran udang mantis sangat berkaitan erat dengan arus laut. Arus pada Laut Jawa bergerak ke arah Kalimantan sedangkan arus dari Laut China Selatan bergerak ke Vietnam sehingga pergerakan arus dari Cirebon dan Vietnam tidak searah. Penyebaran udang mantis melalui tingkat larva yang terbawa
arus dan bergerak mengikuti garis pantai. Teluk Vietnam yang berada di sisi utara dari Laut China Selatan tidak terhubung/ saling terpisah dengan Laut Jawa
(Cirebon), sehingga memiliki garis pantai yang tidak berhubungan (McCleave et al. 1984).
Hal lain yang menyebabkan H. harpax di Perairan Cirebon berbeda nenek moyang/indukkan dengan H. harpax dari Perairan Vietnam adalah arus dari Indo-Pasifik saling berhubungan karena arus yang datang dari Pasifik menuju lautan Indonesia yang juga melewati Vietnam bergerak bolak-balik, hanya saja dikarenakan adanya bencana alam yang pernah terjadi menyebabkan pola penyebaran H. harpax hanya berkisar ±40km, sehingga menyebabkan
keragamannya homogen dan pola penyebaran yang terbatas/tidak luas (Barber et al. 2002).
Dari data yang ada, kelompok 1 dan 2 mungkin sebagai spesies yang berbeda dalam genus Harpiosquilla . Hal ini diperkuat dengan adanya beberapa perbedaan yaitu seperti intermediat carina pada bagian thoraks tanpa/ dilengkapi dengan duri, dari segi warna ada yang lebih gelap dan terang, dan segmen distal pada uropod ada yang tidak/ bewarna sedikit hitam (data tidak diperlihatkan). Hal ini juga disebabkan oleh spesies H. harpax yang tertangkap di Perairan Cirebon seringkali tertangkap bersamaan dengan H. raphidae.
Gambar 3. Hasil rekontruksi pohon filogeografi pengelompokan sampel H. harpax berdasarkan ruas d-loop mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x.
Tabel 1.Jarak genetik antar sampel (di bawah diagonal) dan standar error (di atas diagonal) berdasarkan model subtitusi K2P dengan bootstrap 1000x.
No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 H. harpax 1 0.01 0 0.01 1 0.00 6 0.01 0 0.00 5 0.00 9 0.00 8 0.01 1 2 H. harpax 2 0.06 1 0.00 7 0.00 9 0.00 5 0.00 9 0.00 5 0.01 0 0.01 1 3 H. harpax 3 0.08 0 0.04 1 0.01 0 0.00 7 0.01 0 0.00 7 0.01 1 0.01 2 4 H. harpax 4 0.02 8 0.05 9 0.07 4 0.00 9 0.00 6 0.00 9 0.00 7 0.01 1 5 H. harpax 5 0.06 4 0.02 3 0.04 7 0.05 9 0.00 9 0.00 5 0.01 0 0.01 1 6 H. harpax 6 0.01 8 0.05 6 0.07 1 0.02 5 0.05 9 0.00 9 0.00 7 0.01 1 7 H. harpax 8 0.05 9 0.01 8 0.04 0 0.05 6 0.02 0 0.05 6 0.01 0 0.01 1 8 H. harpax 10 0.04 5 0.07 0 0.08 7 0.03 8 0.07 0 0.04 2 0.06 7 0.01 1 9 H. harpax Vietnam 0.08 5 0.08 9 0.10 5 0.07 9 0.08 8 0.07 9 0.09 1 0.08 3
SIM
PU
LA
N
da
n
SA
RA
N
Keragam an gen etik H. harp ax di Pera iran Cire bon berd asar kan ruas d-lo op mtD NA adal ah 5,1 % (±0, 005) . Pop ulasi H. harp ax di Pera iran Cire bon setid akny a bisa diba gi men jadi 2 kelo mpo
k. Pop ulasi H. harp ax di Laut Jawa jauh kem ung kina nnya bera sal dari Pera iran Viet nam . Hub ung an filog eni berd asar kan ruas d-lo op mtD NA men emp atka n H. harp ax Cire bon berb eda nen ek
moy ang/ indu kan den gan H. harp ax dari Viet nam . Sara n bagi pen elitia n ini adal ah dipe rluk an pen elitia n lebih lanju t men gun akan ruas mito kond ria yang berb eda atau selai n
d-lo op dan perl u anali sis pem ban ding sam pel H. harp ax dari Pant ai Utar a Kali man tan dan daer ah sekit ar Sela t Mala ka untu k me mbu ktikk an hub ung an keke raba tan anta ra H.
harp ax dari Cire bon dan H. harp ax dari Viet nam .
DAF
TA
R
PU
ST
AK
A
Ahy ong ST, Cha n TY, dan Liao YC. 200 8. A Cata logu e of Mantis Shri mps (Sto mat opo da) of Taiw an. Nati onal Taiw an Oce an Univ ersit y: Keel ung. Ahy ong ST. 199 7. Philo gen etic Anal ysis of the Sto mat opo da (Mal acos trac a). Jour nal
of Crus tace ans Biolo gy 17(4 ): 695-715. Al Rozi, F. 200 8. Pene rapa n Budi daya Uda ng Ram a dan Berk elanj utan Mela lui Aplik asi Bakt eri Anta goni s untu k Biok ontr ol Vibri
osis Uda ng Win du (Pen aeus mon odo n) [skri psi]. Yogy akar ta: Faku ltas Pert ania n, Univ ersit as Gadj ah Mad a. Barb er P, Moo sa MK, dan Palu mbi SR. 200 2. Rapi d Reco very of
Gen etics Dive rsity of Sto mat opo d Pop ulati ons on Krak atau : Tem pora l and Spat ial Scal es of Mari ne Larv al Disp ersal . Jour nal of The Roy al Soci ety 269: 159 1-15 97. Carp
ente r KE dan Nie m VH. 199 8. The Livin g Mari ne Reso urce s of The Wes tern Cent ral Pacif ic Volu me 2: Cep halo pods , Crus tace an, Holo thuri ans and Shar k. Food and Agri cult ure Orga nizat
ion of The Unit ed Nati on: Rom e. Choi HJ dan Hon g SY. 200 1. Larv al deve lop men t of the kishi velv et shri mp, met ape naeo psis dalei (rath bun) (dec apo da: pen aeid ae), rear
ed in the labo rator y. Fish Bull 99: 275-291. Coo k C. 200 5. The Com plet e Mito chon drial Gen ome of Sto mat opo d Crus tace an Squil la man tis. Jour nal of BMC Gen omic s 6: 1-9.
Hoel zoel AR, Lope z JV, Dov er GA, Brie n JO. 199 4. Rapi d evol utio n of a hete ropl asmi c repe titiv e sequ ence s in the mito chon drial DNA cont rol regi on of carn ivor es. J Mol Evol 39:1 91-1 99.
McCl eave JD, Arno ld GP, Dod son JJ, Neil WH. 198 4. Mec hani sm of Migr atio n in Fish esh. Plne um Pres s: New York dan Lond on. Mille r AD dan Aust in CM. 200 6. The Com plet e
Mito chon drial Gen ome Of The Man tis Shri mp H.Ha rpax , and A Phyl oge netic Inve stiga tion of The Dec apo da Usin g Mito chon drial Seq uenc es. Mol Phyl oge net Evol 38: 565– 574.
Moo sa, M. 199 7. Sto mat opo da seba gai Sala h Satu Pote nsi Sum berd aya Hay ati Laut . Perw ata Ose ana 5: 1-6. Kum ar S, Dudl ey J, Nei M, Tam ura K. 200 8. MEG A: A Biolo
gist-Cent ric Soft ware for Evol utio nary Anal ysis of DNA and Prot ein Seq uenc es. Brief ings in Bioi nfor mati cs 9: 299-306. Tege lstro m H. 198 6. Mito chon drial DNA in natu ral
pop ulati ons: an impr ove routi ne for the scre enin g of gen etic vari atio n base d on sens itive silve r stain ing. Elec ytro phor esis 7:22 6-22 9. Dew inta, Ach mad Fara jalla
h, dan Yusli War diat no. 201 0. Pola Distr ibusi Geo grafi s pad a Uda ng Man tis di Pant ai Jawa Berd asar kan Gen om Mito kond ria. Sem inar disa mpa ikan tang gal 11 Sept emb er 201 0, Dep arte
men Biolo gi FMIP A IPB.
PEN
DA
HU
LU
AN
Lata
r
Bel
aka
ng
Uda ng man tis atau uda ng rong gen g mer upak an ang gota Filu m Arth ropo da, Subf ilumCrus tace a, Ordo Sto mat opo da, yang terdi ri atas emp at fami li, yait u Odo ntod actyl idae, Lysi osqu illida e, Harp iosq uillid ae dan Squil idae. Seb agai man a uda ng pad a umu mny a, kelo mpo
k uda ng ini diciri kan den gan tub uh yang bers egm en, di bela kang kepa la terd apat kara pas pen dek, kaki beru as-r uas, ukur an tubu h yang besa r dan mat a serin gkali berb entu k T (Car pent
er dan Nie m 199 8). Habi tat seba gian besa r uda ng man tis adal ah pant ai, sena ng hidu p di dasa r air terut ama pasi r berl ump ur. Cara hidu p uda ng man tis den gan men
ggali dan bers emb unyi di dasa r air untu k berb uru man gsa. Sala h satu uda ng man tis yang bern ilai ekon omi ting gi adal ah Harp iosq uilla harp ax dari Fami li Harp iosq uillid ae. Uda ng ini diek
ploit asi untu k dipe rdag angk an seba gai mak ana n ekso tik. Jenis uda ng man tis lain yang serin g dipe rdag angk an adal ah Lysi osqu illina mac ulat a, Squil la emp usa, dan S.m antis (Moo sa
199 7). Kara kteri stik dari sto mat opo da seba gai hew an pem angs a me milik i dua met ode untu k men angk ap man gsa. Ked ua met ode inila h yang kem udia n akan me mbe daka
n kelo mpo k fung sion al sto mat opo da yang sang at luas, yait u sma sher s (gal ak) dan spea rers (san gat baik ). H. Harp ax send iri terg olon g keda lam spea rers (Ahy ong 199 7).
H. harp ax bany ak dite muk an di Pant ai Utar a Pula u Jawa , Sela t Mala ka sam pai ke Laut Pasif ik (Ahy ong et al . 200 8). Ciri-ciri H. harp ax adal ah tubu h terdi ri atas tiga bagi
an yait u kepa la, thor aks dan abd ome n, kara pas den gan med ian cari na, dista l seg men dari urop od me milik i garis teng ah warn a puti h atau sedi kit hita m, cari na inter med iat
tida k terla lu taja m, rost al dilen gkap i den gan proj eksi ante rior, panj ang total men capa i 30 cm, mat a sang at besa r dan berb entu k T, telso n berd uri dan med ian cari na pad a telso
n me milik i dua binti k hita m (Car pent er dan Nie m 199 8). Uda ng beti na ma mpu men elur kan 50.0 00 hing ga 1 juta telur , yang akan men etas setel ah 24 jam men jadi larv
a na upliu s (Cho i dan Hon g 200 1). Taha p perk emb ang an larv a pad a uda ng man tis terdi ri dari emp at fase. Fase pert ama yait u nau plius , larv a nau plius tida k dap at bere
nan g sehi ngg a terb awa arus kem ana saja arus berg erak , terut ama arus sejaj ar garis pant ai, ber met amo rfosi s dala m ena m stag es berk isar sela ma dua hari. Fase ke dua yait u prot
ozoe a, me mpu nyai tuju h pasa ng ang gota tubu h, ber met amo rfosi s dala m tiga stag es berk isar sela ma tuju h hari. Fase keti ga yait u mysi s ber met amo rfosi s dala m tiga stag
es berk isar sela ma tuju h hari. Fase tera khir yait u postl arva , pad a fase ini uda ng mul ai me milik i kara kteri stik uda ng dew asa, dilan juti men jadi juve nil dan ud ang dew asa
(Cho i, 200 1). Perg erak kan arus ini ber gant ung kepa da arah /sud ut gelo mba ng yang data ng. Pada kaw asan pant ai yang diter jang gelo mba ng men yud ut, terh ada p garis pant ai,
arus yang dom inan terja di adal ah arus sejaj ar pant ai. Perg erak an arus sejaj ar den gan garis pant ai inila h yang men yeba bkan pola peny ebar an teru s men giku ti garis pant ai. Pers ebar an larv
a yang hany ut terik ut arus teru s men gala mi pers ebar an yang sang at luas bahk an anta r sam uder a (Bar ber et al. 200 2). Dala m pen elitia n ini pop ulasi H. harp ax beru
saha dipel ajari men ggu naka n pen and a gen etik gen om mito kond ria, yait u ruas gen om yang dike nal den gan d-lo op atau cont rol regi on. Gen om mito kond ria hew an mer upak an gen om
sitop lasm ik yang diwa riska n seca ra unip aren tal, dan tida k men gala mi reko mbi nasi. Gen om mito kond ria atau mtD NA terdi ri atas 2 gen peny andi rRN A, 22 tRN A, dan 13 gen peny adi
prot ein yang terli bat dala m rang kaia n rant ai respi rasi selul ar, dan satu ruas yang berf ungs i seba gai pen gont rol tran skrip si yang dike nal seba gai d-lo op. Ruas d-lo op dike nal me mpu nyai
laju mut asi yang lebih cepa t diba ndin g ruas -rua s gen lainn ya, sehi ngg a sang at coco k untu k digu naka n seba gai pen and a gen etik untu k me mpe lajari feno men a intra spes ifik
(Coo k 200 5).
Tuju
an
Pene litian ini bert ujua n untu k men gan alisi s kera gam an gen etik uda ng man tis Harp iosq uilla harp ax di Pant ai Jawa , berd asar kan gen ommito kond ria.
BAH
AN
DA
N
ME
TO
DE
Met
ode
Kol eksi Uda ng dan Iden tifik asi sam pel. Uda ng man tis H. harp ax seba nyak dela pan ekor kole ksi bap akDr. Yusli War diat no dari Dep arte men Man ajem en Sum berd aya Pera iran IPB yang dipr eser vasi dala m etan ol. Kep astia n spes ies uda ng man tis seba gai Harp iosq uilla harp ax diide ntifi kasi berd
asar kan kunc i iden tifik asi (Car pent er dan Nie m 199 8). Ekst raks i dan Isol asi DNA . Isol asi DNA dilak ukan dari otot tung kai. Otot tung kai yang disi mpa n dala m etan ol dicu
ci den gan air desti lata dua kali kem udia n diho mog enas i dala m bufe r STE (NaC l 1M, Tris-HCL 10m M, EDT A 0.1 mM, pH 8). Sel-s el otot dilisi s men ggu naka n prot eina se K 0,12 5
mg/ ml dan sodi um dod esil sulfa t 1%. Met ode ekst raksi DNA sela njut nya men giku ti petu njuk Gen omic DNA mini kit for fres h bloo d. Am plifi kasi dan Visu alis asi Fra gme n
DNA . Bagi an d-lo op dari mtD NA dia mpli fikas i men ggu naka n prim er yang dide sain men ggu naka n Prim er 3 ( http: //fro do.w i.mit .edu /pri mer 3/) den gan refer ensi beb erap a mtD NA
ang gota sto mat opo da yang ada di Gen Ban k ( www .ncbi .nlm .nih. gov ). Pri mer forw ard AF1 80b erad a pad a urut an 151 02 nt dan prim er reve rse AF1 81 bera da pad a urut
an 151 27 terh ada p mtD NA H.ha rpax , den gan targ et DNA hasil amp lifika si beru kura n 929 bp. Rea ksi PCR dilak ukan dala m volu me 50 μL. Rea ksi PCR dilak ukan den gan
kond isi pred enat urasi pad a suhu 94oC sela ma 5 men it, kem udia n dilan jutk an 30 siklu s yang terdi ri atas den atur asi suhu 94oC sela ma 1 men it, pen emp elan prim er suhu 54oC sela ma
1 men it, pem anja nga n 72 oC sela ma 2.30 men it dan diak hiri pem anja nga n akhi r suhu 72oC sela ma 7 men it. Prod uk PCR diuji men ggu naka n PAG E 6%, kem udia n dilan jutk an
den gan pew arna an sens itif pera k (Teg elstr om 198 6). Per unu tan Pro duk PCR dan Ana lisis DNA Seq uen cing . Prod uk PCR beru pa pita tung gal di atas gel polia krila mid dan
beru kura n sesu ai desa in prim er dim urni kan, untu k dijad ikan ceta kan dala m PCR for sequ enci ng. PCR untu k sequ enci ng men ggu naka n prim er yang sam a sepe rti amp lifika si sebe
lum nya den gan met ode big dye term inat or cycl e sequ enci ng. Run utan nukl eoti da yang dipe role h kem udia n diedi t seca ra man ual. Run utan -run utan nukl eoti da yang tela h diedi t
kem udia n salin g disej ajar kan den gan runu tan nukl eoti da refer ensi, yait u H. harp ax yang dita ngka p dari Pant ai Viet nam den gan No akse s AY6 992 71 (Mill er dan Aust in 200 6) men
ggu naka n prog ram Clus tal W 1.8 yang terta nam dala m prog ram ME GA versi 4.00 . Ana lisis Filo geni . Anal isis kera gam an nukl eoti da dan filog enet ik dilak ukan men ggu naka
n MEG A (Ku mar et al . 200 8) berd asar kan mod el subti tusi Kim ura-2 -par ame ter. Anal isis keke raba tan anta r sam pel men ggu naka n met ode neig hbo ur joini ng (NJ) den gan boot
stra p 100 0x.
HAS
IL
DA
N
PE
MB
AH
AS
AN
Iden
tifi
kas
i
Hasil iden tifik asi berd asar kan buk u iden tifik asi Carp ente r dan Nie m (199 8)men unju kkan bah wa sam pel uda ng yang digu naka n adal ah spes ies H. harp ax.
Amp
lifi
kas
i
dan
Vis
uali
sas
i
DN
A
Dari kede lapa n sampel yang digu naka n, sem uany a berh asil dia mpli fikas i. Amp lifika si men ggu naka n pasa nga n prim er AF1 80 dan AF1 81 men ghas ilkan pita tung gal beru kura n sekit ar 110 0bp (Ga mba
r 1). Gam bar 1. Prod uk PCR beru pa pita tung gal yang diuji den gan men ggu naka n poly acril ami de gel elect roph oresi s (PAG E)
6%. Kete rang an: M = DNA mar ker 100 bp, No urut sesu ai den gan Gam bar 2. Peru nuta n Prod uk PCR dan Anal isis DNA Sequ enci ng Panj ang basa nukl eoti da DNA setel ah ruas
pen emp elan prim er dibu ang dan diedi t, yakn i sekit ar 800-an. Sete lah disej ajar kan, runu tan nukl eoti da yang bisa dilan jutk an dian alisi s bera da pad a posi si 134 96 nt sam pai 142
73 nt berd asar kan refer ensi mtD NA H. harp ax (Mill er dan Aust in 200 6) sepa njan g 787 nt. Dari 787 nukl eoti da, seba nyak 645 nt sam a untu k sem ua sam pel. Dari 142 nt yang berb
eda, seba nyak 9 nt mer upak an inser si/de lesi yang hany a dite muk an pad a satu sam pel dan 84 nt subs titus i yang hany a dite muk an pad a satu sam pel sehi ngg a seba nyak 93 nt tida
k diiku tkan dala m anali sis beri kutn ya kare na tida k bersi fat parsi mon i. Sisa nya seba nyak 49 nt yang terdi ri dari dua jenis mut asi, yait u subs itusi dan inser si/de lesi kem udia n digu naka
n dala m men ghit ung kera gam an gen etik (Ga mba r 2). Gam bar 2. Run utan nukl eoti da yang salin g berb eda anta r sam
pel yang digu naka n dala m anali sis kera gam an gen etik dan me mba ngu n poh on filog eni. Nom or urut nule otid a ditul is seca ra verti kal (5 baris palin g atas ) me ngac u pad a
gen om mito kond ria H. harp ax No. akse s AY6 992 71. Seca ra filog eogr afi H. harp ax di Pera iran Cire bon terpi sah den gan H. harp ax di Pera iran Viet nam . Hal ini dibu ktikk an oleh
nilai jara k gen etik terja uh adal ah anta ra H. harp ax Viet nam dan H. harp ax 3 yait u sebe sar 10,5 %, seda ngka n jara k gen etik palin g deka t adal ah anta ra H. harp ax 1da n 6 (kelo mpo
k 1) yait u sebe sar 1,8 %. Kera gam an gen etik H.ha rpax di Pera iran Cire bon berd asar kan ruas d-lo op me milik i nilai lebih besa r yait u 5.1 % (±0, 005) (Tab el 1) bila diba ndin gkan den
gan kera gam an gen etik Halo cypri da sp berd asar kan ruas C01 yait u sebe sar 2,27 %. Nilai kera gam an gen etik d-lo op yang lebih besa r me mbu ktikk an bah wa ruas d-loo p me milik i laju
mut asi lebih ting gi diba ndin gkan ruas -rua s pad a mtD NA lainn ya dan mut asi yang ting gi berb andi ng lurus den gan ting giny a kera gam an (Coo k 200 5). Rata -rata kom posi
si nukl eoti da A=4 1,2 % ; T=3 8,7 % ; G=7 ,9% ; C=1 2,3 %. Pers enta se A+T (79, 9%) lebih besa r dari pad a C+G (20, 2%). Ban yakn ya basa A+T pad a gen om mito kond ria d-lo op diba
ndin gkan C+T berk aita n den gan d-lo op seba gai pro mot or titik awal tran skrip si bagi utas bera t mau pun utas ring an (Hoe lzoel et al. 199 4). Hal lain yang men yeba bkan basa AT lebih ting gi
dise baka n oleh ada nya seku ens yang beru lang dan panj ang nya urut an T (Coo k 200 5).
Ana
lisi
s
Filo
gen
i
Topo logi poh on filog eni men ggu naka n met ode NJ dengan boot stra p10 00x men gelo mpo kkan uda ng H. Harp ax dala m satu perc aba nga n dan H. Harp ax Viet nam bera da di luar perc aba nga n. Stru ktur pop ulasi yang diga mba rkan oleh mtD NA ini
setid akny a me mba gi pop ulasi H. harp ax di pera iran Cire bon men jadi dua yait u kelo mpo k 1 dan kelo mpo k 2. H. harp ax 1,4, 6 dan 10 term asuk ke dala m kelo mpo k 1 dan salin g berk
erab at deka t. H. harp ax 2, 3, 5, dan 8 term asuk ke dala m kelo mpo k 2 dan salin g berk erab at deka t. Titik nen ek moy ang ( anch estr al nod e) men unju kkan bah wa keke
raba tan H. harp ax 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 dan 10 adal ah bera sal dari satu nen ek moy ang/ indu kkan . Sed angk an pop ulasi H harp ax dari pera iran Cire bon berb eda nen ek moy ang/ indu kan den gan
H. harp ax di pera iran Viet nam (Ga mba r 3). Hal ini dise babk an oleh pola peny ebar an uda ng man tis sang at berk aita n erat den gan arus laut. Arus pad a Laut Jawa berg erak ke arah Kali man tan
seda ngka n arus dari Laut Chin a Sela tan berg erak ke Viet nam sehi ngg a perg erak an arus dari Cire bon dan Viet nam tida k sear ah. Peny ebar an uda ng man tis mela lui ting kat larv a yang
terb awa arus dan berg erak men giku ti garis pant ai. Telu k Viet nam yang bera da di sisi utar a dari Laut Chin a Sela tan tida k terh ubu ng/ salin g terpi sah den gan Laut Jawa (Cire bon) , sehi
ngg a me milik i garis pant ai yang tida k berh ubu nga n (Mc Clea ve et al. 198 4). Hal lain yang men yeba bkan H. harp ax di Pera iran Cire bon berb eda nen ek moy ang/ indu kkan
den gan H. harp ax dari Pera iran Viet nam adal ah arus dari Ind o-Pa sifik salin g berh ubu nga n kare na arus yang data ng dari Pasif ik men uju laut an Indo nesi a yang juga mel ewat i Viet nam
berg erak bola k-bal ik, hany a saja dika rena kan ada nya benc ana alam yang pern ah terja di men yeba bkan pola peny ebar an H. harp ax hany a berk isar ±40 km, sehi ngg a men yeba bkan kera gam anny
a hom oge n dan pola peny ebar an yang terb atas/ tida k luas (Bar ber et al. 200 2). Dari data yang ada, kelo mpo k 1 dan 2 mun gkin seba gai spes ies yang berb eda dala m gen us
Harp iosq uilla . Hal ini dipe rkua t den gan ada nya beb erap a perb edaa n yait u sepe rti inter med iat cari na pad a bagi an thor aks tanp a/ dilen gkap i den gan duri, dari segi warn a ada
yang lebih gela p dan tera ng, dan seg men dista l pad a urop od ada yang tida k/ bew arna sedi kit hita m (dat a tida k dipe rliha tkan ). Hal ini juga dise babk an oleh spes ies H. harp ax
yang terta ngka p di Pera iran Cire bon serin gkali terta ngka p bers ama an den gan H. raph idae. Gam bar 3. Hasil reko ntru ksi poh
on filog eogr afi pen gelo mpo kan sam pel H. harp ax berd asar kan ruas d-lo op mtD NA men ggu naka n met ode NJ den gan boot stra p 100 0x. Tabe l 1.Jar ak
gen etik anta r sam pel (di baw ah diag onal ) dan stan dar error (di atas diag onal ) berd asar kan mod el subti tusi K2P den gan boot stra p 100 0x. No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 H. harpax 1 0.01 0 0.01 1 0.00 6 0.01 0 0.00 5 0.00 9 0.00 8 0.01 1 2 H. harpax 2 0.06 1 0.00 7 0.00 9 0.00 5 0.00 9 0.00 5 0.01 0 0.01 1 3 H. harpax 3 0.08 0 0.04 1 0.01 0 0.00 7 0.01 0 0.00 7 0.01 1 0.01 2 4 H. harpax 4 0.02 8 0.05 9 0.07 4 0.00 9 0.00 6 0.00 9 0.00 7 0.01 1
0.06 4
0.02 3
0.04 7
0.05 9
0.00 9
0.00 5
0.01 0
0.01 1
0.01 8
0.05 6
0.07 1
0.02 5
0.05 9
0.00 9
0.00 7
0.01 1
0.05 9
0.01 8
0.04 0
0.05 6
0.02 0
0.05 6
0.01 0
0.01 1
0.04 5
0.07 0
0.08 7
0.03 8
0.07 0
0.04 2
0.06 7
