BAB 3
METODE PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian observasional analitik dengan studi pendekatan potong lintang.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara / RSUP Haji Adam Malik Medan bekerjasama dengan Departemen Ilmu Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Penelitian dilakukan pada bulan November 2015 sampai dengan Januari 2016. Penelitian dihentikan bila jumlah sampel minimal tercapai atau waktu pengambilan sampel telah mencapai tiga bulan.
3.3. Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi Penelitian
Populasi penelitian ini adalah pasien yang menderita DM tipe 2 terkontrol dan tidak terkontrol yang berobat jalan atau dirawat diruang rawat inap bagian Ilmu Penyakit Dalam RSUP H. Adam Malik Medan. 3.3.2 Sampel Penelitian
3.3.3 Besar sampel
Sampel dipilih secara consecutive sampling dengan perkiraan besar sampel dari subjek yang diteliti dipakai rumus uji hipotesa formula korelasi :38
Jumlah sampel minimal pada masing-masing kelompok adalah 48 orang
3.4 Kriteria Penelitian 3.4.1. Kriteria Inklusi :
3.4.2 Kriteria Eksklusi • Penyakit tiroid • Gagal ginjal kronik • Penyakit hati kronik
• Mendapat terapi kortikosteroid • Keganasan
• Anemia
• Infeksi dan inflamasi sistemik • Tidak bersedia ikut penelitian
3.5 Identifikasi Variabel 3.5.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah serum ferritin, HbA1c 3.5.2 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah DM tipe 2
3.6 Definisi Operasional
HbA1c: Hemoglobin yang terglikasi dan merupakan subfraksi yang terbentuk dari perlekatan gula pada molekul Hb.41
Ferritin: Kompleks besi-protein yang larut dalam air, dengan berat molekul 465.000.30
3.7 Analisa Data
1) Untuk menampilkan data karakteristik dasar subjek penelitian digunakan mean dan standar deviasi, kemudian disajikan dalam bentuk tabulasi dan dideskripsikan.
2) Untuk menilai perbedaan ferritin terhadap kontrol glikemik (HbA1c) pasien dengan diabetes mellitus tipe 2 yang terkontrol dan pasien dengan diabetes mellitus tipe 2 yang tidak terkontrol digunakan uji T-tidak berpasangan jika data berdistribusi normal, atau uji Mann Whitney jika data tidak berdistribusi normal.
3) Untuk melihat hubungan antara HbA1c dan ferritin menggunakan uji Pearson correlation jika data berdistribusi normal, atau uji Spearman jika data tidak berdistribusi normal.
3.8. Bahan dan Cara Kerja 3.8.1. Bahan Yang Diperlukan
Sampel yang diperlukan dalam penelitian ini adalah darah tanpa anti koagulan untuk pemeriksaan kadar gula darah dan ferritin. Sedangkan untuk pemeriksaan HbA1c adalah darah vena dengan antikoagulan EDTA.
3.8.2. Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Setelah memenuhi kriteria penelitian, dilakukan inform consent dan mengisi surat persetujuan mengikuti penelitian.
Bahan darah subyek diambil melalui vena punksi dari vena mediana cubiti. Tempat vena punksi terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70% dan dibiarkan kering. Darah diambil dengan menggunakan venoject, kemudian darah dimasukkan ke dalam tabung tanpa koagulan
sebanyak 3 ml untuk pemeriksaan ferritin dan kedalam tabung EDTA sebanyak 2 ml untuk pemeriksaan HbA1c
Bahan darah beku setelah dibiarkan membeku selama 20 menit pada suhu ruangan, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit, serum dipisahkan dan dimasukkan ke dalam tabung plastik (aliquot) 1 ml.
3.8.3. Pemeriksaan Laboratorium 3.8.3.1 Pemeriksaan HbA1c
Hemoglobin (Hb) terdiri dari empat rantai perotein dengan empat heme portion, pigmen merah yang berlokasi di eritrosit. Setiap molekul mampu berikatan dengan empat molekul oksigen. Hb terdiri dari berbagai subfraksi dan derivat. Diantara grup tersebut, HbA1c adalah satu dari hemoglobin yang terglikasi. HbA1c merupakan subfraksi yang terbentuk dari perlekatan gula pada molekul Hb.
Konsentrasi total Hb dan HbA1c ditentukan setelah hemolisis dari spesimen darah dengan antikoagulan. Total Hb diukur dengan metode kolorimetrik. HbA1c ditentukan dengan metode immunoturbidimetri. Rasio dari kedua konsentrasi ini merupakan hasil akhir dari HbA1c (HbA1c (%)).
Total Hb diukur oleh sistem COBAS INTEGRA menggunakan metode cyanide-free colorimetric yaitu berdarasrkan pembentukan kromofor hijau kecoklatan (alkaline hematine D-575) pada larutan alkaline detergent. Intensitas warna diukur pada panjang gelombang absorben 552
nm.
dengan jumlah glikopeptida dan diukur pada panjang gelombang 552 nm secara turbidimetri.
Hasil akhir dipresentasikan dengan persen HbA1c dan dihitung dengan rasio HbA1c/Hb sebagai berikut :
(HbA1c/Hb) x 100 = HA1c (%) 3.8.3.2. Pemeriksaan feritin43
Pemeriksaan ferritin menggunakan prinsip Electrochemiluminescence Immunoassay (ECLIA)
i. Inkubasi pertama: 10 ul sampel, antibodi spesifik feritin monoclonal biotinylasi, dan antibody spesifik feritin yang dilabel dengan komplek ruthenium membentuk kompleks sandwich ii. Inkubasi kedua: setelah ditambahkan mikropartikel yang dilapisi
streptavidin, komplek yang terbentuk berikatan dengan fase solid melalui interaksi biotin dengan streptavidin.
iii. Campuran reaksi diaspirasi dalam cell pengukur dimana mikropartikel secara magnetic ditangkap pada permukaan elektroda. Substansi yang tidak berikatan dibuang melalui Procell. Aplikasi voltase (tegangan) pada elektroda kemudian menginduksi emisi chemiluminescent yang diukur oleh photomultiplier.
3.9. Pemantapan Mutu
Pemantapan mutu dilakukan untuk menjamin dan mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik. Sebelum diakukan pemeriksaan terlebih dahulu dilakukan kalibrasi alat.
3.9.1 Kalibrasi HbA1c41
Kalibrasi pengukuran konsentrasi HbA1c digunakan C.f.a.s HbA1c Lot No.6028417. Kalibratornya dalam bentuk cair dan sudah dalam keadaan siap pakai (S1, S2, S3, S4, S5 dan S6) untuk menentukan konsentrasi standard pada kurva kalibrasi sehingga didapat kurva kalibrasi yang bersifat linier. Untuk titik nol digunakan aquadest sebagai zero calibrator. Selama penelitian kalibrasi dilakukan 1 kali pada waktu
membuka reagen baru.41
3.9.2. Kontrol kualitas HbA1c
Tabel 3.1. Kontrol HbA1c
Dilakukan dengan menggunakan The Elecsys Ferritin Assay dengan kalibrator Lot 18714305 dan Lot 18970489. Kalibratornya dalam bentuk cair dan sudah dalam keadaan siap pakai (CAL1 dan CAL2) untuk menentukan konsentrasi standard pada kurva kalibrasi sehingga didapat kurva kalibrasi yang bersifat linier. Kalibrasi pada penelitian ini dilakukan 2 kali, kalibrasi dilakukan setiap pemakaian reagen baru.
3.9.4 Kontrol Kualitas Ferritin43
Kontrol untuk feritin dilakukan dengan PreciControl Tumor Marker 1 dengan Lot 13045572 dan Lot 15798271 dan Tumor marker 2 dengan Lot 18022598 dan Lot 16724599. Kontrol dilakukan diawal sebelum melakukan pemeriksaan, setiap pemakaian reagent kit baru dan setelah selesai kalibrasi. Untuk kontrol feritin digunakan PreciControl Tumor Marker 1 dan Tumor marker 2. Nilai konsentrasi kontrol harus masuk
Tabel 3.2. Hasil kontrol feritin
3.10 Ethical clearance dan informed consent
3.11. Kerangka Kerja
Subjek Penelitian
Anamnese dan Pemeriksaan Fisik
Kriteria Inklusi :
1. Telah terdiagnosa DM tipe 2 ,usia > 2. Gagal ginjal kronik 3. Penyakit hati kronik
4. Mendapat terapi kortikosteroid 5. Anemia
6. Keganasan
7. Infeksi dan inflamasi sistemik 8. Tidak bersedia ikut penelitian
HbA1c
KGD
DM tipe 2 terkontrol
(HbA1c < 7)
DM tipe 2 tidak terkontrol
(HbA1c ≥ 7)
Feritin Feritin
Uji
BAB 4
HASIL PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui hubungan feritin dengan HbA1c pada penderita DM tipe 2, yang dilaksanakan mulai November 2015 sampai Januari 2016. Subjek penelitian adalah penderita DM tipe 2 yang memenuhi kriteria. Pada subjek penelitian dilakukan anamnese, pemeriksaan fisik, dan pemeriksaan laboratorium. Data tersebut dicatat dalam status khusus penelitian.
Subjek penelitian penderita DM tipe 2 berjumlah 98 orang terdiri dari 61 orang laki-laki dan 37 orang perempuan dengan kisaran umur 30 – 72 tahun, dimana 49 orang (31 laki – laki dan 18 perempuan) penderita DM tipe 2 yang terkontrol dengan kadar HbA1c lebih kecil dari 7% dan 49 orang (30 laki – laki dan 19 perempuan) penderita DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan kadar HbA1c lebih besar atau sama dengan 7%.
Tabel 4.1. Karakteristik subjek berdasarkan parameter penelitian Karakteristik Satuan DM Tipe 2
Terkontrol
Umur (Mean±SD) Tahun 55,65±8,560 56,57±6,865 0,559 KGD Puasa
(Mean±SD)
mg/dL 117,47±31,602 186,86±92,455 < 0,001
HbA1c (Mean±SD) % 6,349±0,4088 9,514±2,4397 < 0,001 Ferritin (Mean±SD) ng/dL 312,44±126,626 477,46±225,554 < 0,001 Uji perbedaan menggunakan uji T- tidak berpasangan, dengan perbedaan
bermakna bila p < 0,05.
Pada kelompok DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan rerata umur 55,65 tahun tidak ada perbedaan bermakna secara statistik (p=0.559) dibandingkan pada kelompok DM tipe 2 yang terkontrol dengan rerata umur 56,57 tahun
Pada kelompok DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan rerata HbA1c 9,514% lebih tinggi bermakna secara statistik (p< 0,001) dibandingkan pada kelompok DM tipe 2 yang terkontrol dengan nilai rerata HbA1c adalah 6,349%
Pada kelompok DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan rerata ferritin adalah 477,46 ng/dL lebih tinggi bermakna secara statistik (p< 0,001) dibandingkan pada kelompok DM tipe 2 yang terkontrol dengan rerata ferritin adalah 312,44 ng/dL.
Tabel 4.2. Korelasi antara Kadar KGD, Kadar HbA1c dengan Ferritin pada Pasien DM Tipe 2
Uji hubungan menggunakan Pearson Corelation, hubungan bermakna bila p < 0,05
Pada tabel 4.2 diatas dapat dilihat juga hubungan kadar KGD Puasa dengan kadar Ferritin menunjukkan hubungan positif (r = 0,420), dan dari hasil uji statistik didapatkan hubungan yang bermakna antara kadar KGD Puasa dan kadar Ferritin (p < 0.001) pada pasien DM tipe 2.
Pada kelompok DM Tipe 2 yang terkontrol, hubungan kadar HbA1c dengan kadar Ferritin menunjukkan hubungan positif (r = 0,412), dan dari hasil uji statistik didapatkan hubungan yang bermakna antara kadar HbA1c dan kadar Ferritin (p < 0,003).
Ferritin
R Ρ
KGD Puasa 0,420 < 0,001
HbA1c < 7% 0,412 < 0,003
Pada kelompok DM Tipe 2 yang tidak terkontrol, hubungan kadar HbA1c dengan kadar Ferritin menunjukkan hubungan positif (r = 0,317), dan dari hasil uji statistik didapatkan hubungan yang bermakna antara kadar HbA1c dan kadar Ferritin (p = 0.026).
Gambar 4.1. Grafik Hubungan Kadar HbA1c dengan Kadar Ferritin pada Kelompok DM Tipe 2 yang terkontrol.
(Uji hubungan menggunakan Pearson Corelation, hubungan bermakna bila p < 0,05 )
Gambar 4.2. Grafik Hubungan Kadar HbA1c dengan Kadar Ferritin pada Kelompok DM Tipe 2 yang Tidak Terkontrol.
(Uji hubungan menggunakan Pearson Corelation, hubungan bermakna bila p < 0,05 )
BAB 5 PEMBAHASAN
Subjek penelitian penderita DM tipe 2 berjumlah 98 orang terdiri dari 61 orang laki-laki dan 37 orang perempuan dengan kisaran umur 30 – 72 tahun, dimana 49 orang (31 laki – laki dan 18 perempuan) penderita DM tipe 2 yang terkontrol dengan kadar HbA1c lebih kecil dari 7% dan 49 orang (30 laki – laki dan 19 perempuan) penderita DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan kadar HbA1c lebih besar atau sama dengan 7%.
Pada kelompok DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan rerata umur 55,65 tahun tidak ada perbedaan bermakna secara statistik (p=0.559) dibandingkan pada kelompok DM tipe 2 yang terkontrol dengan rerata umur 56,57 tahun
Pada kelompok DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan rerata KGD puasa 186,86 mg/dL lebih tinggi bermakna secara statistik (p< 0,001) dibandingkan pada kelompok DM tipe 2 yang terkontrol dengan rerata KGD puasa adalah 117,47 mg/dL,
Pada kelompok DM tipe 2 yang tidak terkontrol dengan rerata HbA1c 9,514% lebih tinggi bermakna secara statistik (p< 0,001) dibandingkan pada kelompok DM tipe 2 yang terkontrol dengan nilai rerata HbA1c adalah 6,349%
0,001) dibandingkan pada kelompok DM tipe 2 yang terkontrol dengan rerata ferritin adalah 312,44 ng/dL.
Pada penelitian ini hubungan kadar KGD Puasa dengan kadar Ferritin menunjukkan hubungan positif sedang (r = 0,420), dan dari hasil uji statistik didapatkan hubungan yang bermakna antara kadar KGD Puasa dan kadar Ferritin (p < 0.001) pada pasien DM tipe 2.
Pada kelompok DM Tipe 2 yang terkontrol, hubungan kadar HbA1c dengan kadar Ferritin menunjukkan hubungan positif (r = 0,412), dan dari hasil uji statistik didapatkan hubungan yang bermakna antara kadar HbA1c dan kadar Ferritin (p < 0,003).
Pada kelompok DM Tipe 2 yang tidak terkontrol, hubungan kadar HbA1c dengan kadar Ferritin menunjukkan hubungan positif (r = 0,317), dan dari hasil uji statistik didapatkan hubungan yang bermakna antara kadar HbA1c dan kadar Ferritin (p = 0.026).
pada laki – laki (r = 0, 46, p < 0,01) sedangkan pada perempuan berkorelasi positif (r = 0.51, p < 0,01).47
Akan tetapi pada penelitian P Padmaja dkk menunjukkan juga kadar ferritin pada orang sehat secara signifikan berkorelasi positif terhadap HbA1c baik pada laki – laki (r = 0.54, p < 0,01) maupun perempuan (r = 0.50, p < 0,01) dan juga kadar ferritin pada orang sehat secara signifikan berkorelasi positif terhadap KGD puasa baik pada laki – laki (r = 0.43, p < 0,01) maupun perempuan (r = 0.37, p < 0,01).47
Hubungan positif antara kadar ferritin dan HbA1c menunjukkan bahwa kontrol metabolik atau dysglycemia mempengaruhi kadar ferritin mungkin disebabkan oleh inflamasi atau stress oksidatif atau kombinasi kedua mekanisme memainkan peran penting pada patogenesis DM tipe 2.47
Dan pada penelitian Maheswari A V pada tahun 2015 terhadap 50 pasien dengan DM tipe 2 dibandingkan dengan kontrol orang sehat, menunjukkan ferritin serum lebih tinggi bermakna ( p< 0,0001) pada pasien DM tipe 2 dibandingkan kontrol orang sehat. Dan didapati hubungan positif antara ferritin dan HbA1c ( r = 0,701, p <0,0001).48
serum ferritin pada pasien DM secara signifikan berkorelasi positif terhadap HbA1c.
(r = 0.209, p < 0,05).10
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
Terdapat hubungan positif sedang antara kadar ferritin dan kadar HbA1c pada pasien DM tipe 2, baik pada kelompok DM yang terkontrol dan juga pada kelompok DM tipe 2 yang tidak terkontrol. Ferritin diketahui sangat erat kaitannya dengan stres oksidatif. Stres oksidatif diketahui dapat menyebabkan resistensi insulin serta peningkatan sintesis ferritin.
6.2. Saran
