III. METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober sampai dengan Desember 2008. Pengambilan sampel dilakukan di kawasan industri pabrik pupuk PT.
PUSRI Palembang hingga radius 1000 m (1 km). Analisis kualitas udara ambien di lakukan di Laboratorium Balai Pengendalian Dampak Lingkungan Daerah (Bapedalda) Propinsi Sumatera Selatan. Pembuatan sediaan anatomis dilakukan di Laboratorium Teknis Silvikultur Biotrop Bogor.
3.2. Penentuan lokasi pengambilan sampel
Penelitian ini terbagi dalam beberapa tahapan kerja yaitu di lapangan untuk pengambilan contoh dan penentuan nilai kandungan klorofil daun kemudian di laboratorium untuk analisis contoh berupa nilai kualitas udara ambien dan sediaan anatomis daun. Penetapan lokasi penelitian ditentukan oleh besar kecilnya tingkat gas – gas buangan di udara ambien dari pabrik PUSRI. Penelitian ini dibagi menjadi tiga zona pengamatan dan satu zona kontrol. Berikut adalah sketsa dari lokasi pengambilan sampel :
1. Hutan Wisata Punti Kayu Palembang sebagai kontrol. Jarak antara hutan wisata dengan PUSRI adalah sekitar 15 km pada kondisi yang berlawanan arah, sehingga dapat diasumsikan bahwa tanaman yang terdapat pada lokasi tersebut tidak terkena dampak dari pabrik pupuk PUSRI.
2. Zona A : Daerah Green Barier (Sabuk Hijau) PT. PUSRI yang terkena dampak lebih besar jika dibandingkan dengan daerah sekitarnya pada radius 100 m dari pabrik. Zona yang terdekat dari PT. PUSRI. Seringkali masyarakat yang bermukim di kawasan ini merasakan imbas polutan yang dikeluarkan oleh pabrik PUSRI berupa kebisingan dan bau yang menyengat dari operasional pabrik. Pada Zona A ini dilakukan pengambilan sampling di tiga stasiun yaitu :
(1) Stasiun 1 : Jalan Lorong H. Umar (2) Stasiun 2 : Sekolah YSPP Pusri
(3) Stasiun 3 : Jalan Mahoni Komplek Pusri
3. Zona B : Daerah sekitar kawasan PT. PUSRI yaitu pada radius 500 m dari pabrik pupuk. Di stasiun B ini dilakukan pengambilan sampling di tiga stasiun yaitu :
(1) Stasiun 1 : Jalan Sabokingking (2) Stasiun 2 : Taman Puri Indah
(3) Stasiun 3 : Jalan Sei Selayur (Akses Jalan Intirub)
4. Zona C : Daerah sekitar kawasan PT. PUSRI yaitu pada radius 1000 m dari pabrik pupuk. Di stasiun C ini dilakukan pengambilan sampling di tiga stasiun yaitu :
(1) Stasiun 1 : Jalan RE. Martadinata (Flexi) (2) Stasiun 2 : Komplek PHDM XII
(3) Stasiun 3 : Jalan Sei Selayur (Mata Merah)
Dari keempat zona utama penelitian ini dibuat sketsa sebagai berikut yaitu :
Gambar 5. Sketsa stasiun pengambilan contoh
3.3. Sampel daun
Tanaman yang diteliti adalah daun angsana (Pterocarpus indicus Willd.).
Kriteria daun angsana yang dijadikan contoh adalah sebagai berikut :
1. Daun yang tidak ternaungi dan dari percabangan yang menghadap ke arah pabrik. Daun merupakan daun kedua dari pangkal tangkai daun terletak pada ketinggian sekitar 5 m dari permukaan tanah dari cabang yang menghadap ke arah pabrik.
2. Pengambilan contoh klorofil daun dilakukan dengan berpedoman pada Bagan Warna Daun (BWD) dalam hal ini semua contoh menggunakan warna hijau daun no. 5 (Lampiran 2).
Pengambilan daun dilakukan sebanyak tiga kali di masing – masing zona.
Pengambilan dilakukan pada saat cuaca cerah dari jam 10:00 – 14:00. Pengukuran kandungan klorofil daun dengan menggunakan klorofil meter Konica Minolta seri SPAD 502 yang dapat dilakukan pengukuran secara langsung di lapangan (Lampiran 2). Klorofil meter atau SPAD (Soil Plant Analysis Development) meter adalah alat yang sederhana, mudah dibawa, alat yang dapat dengan mudah mengukur kadar kehijauan atau kandungan klorofil. Pengukuran ini menggunakan prinsip pengukuran panjang gelombang 650 dan 940 nm untuk mengestimasi kandungan klorofil (Pinkard et al. 2006). Nilai SPAD mengindikasikan kandungan relatif dari daun (Balasubramanian et al. 2000). Pengukuran yang cepat dan mudah dengan hanya dengan menyisipkan sebuah daun dan menutupnya dengan kepala pengukur (bagian sensor). Daun tidak harus dipotong, sehingga daun yang sama dapat diukur sementara proses pertumbuhan masih berlangsung. Tingkat akurasi tinggi mengikuti uji kondisi pertumbuhan tanaman (±1.0 SPAD unit untuk daun padi) (Singh et al. 2002; Kumar et al. 1999; Stalin &
Thyagarajan 2000).
Sampel daun dari pohon angsana (Lampiran 3) masing – masing diukur dengan tiga kali pengukuran untuk mendapatkan satu nilai klorofil total per daun.
Daun yang akan diukur kadar klorofilnya dijepitkan pada bagian sensor dari alat tersebut. Sensor SPAD ditempatkan di bagian pangkal, tengah dan ujung daun secara acak hanya pada bagian jaringan mesofil daun dengan menghindari bagian tulang daun. Pengukuran dibuat dengan menggunakan kerapatan cahaya flux
foton ~800 μmol-2s-1. Kemudian angka yang muncul pada monitor dicatat sebagai nilai klorofil total daun (Murdock et al. 2004; Fontes et al. 2006).
3.4. Sediaan Mikroskopis
Bahan kimia untuk sediaan mikroskopis adalah larutan pewarna safranin 1
% dalam air, larutan FAA, larutan seri n – Butanol, larutan seri alkohol, gliserin, paraplast, xilol, perekat entellan dan sampel daun Angsana. Alat – alat yang digunakan adalah mikroskop kamera Nikon M35s w/AFM, tabung film, oven parafin, spatula, lampu spiritus, mikrotom putar, kaca objek, kaca penutup, dan hot plate, staining jar.
Sediaan anatomis yang dilakukan adalah membuat irisan transversal daun yang dibuat dengan menggunakan metode parafin (Sass 1951) dan diwarnai dengan pewarnaan hemmalum. Tahapan pembuatan sayatan melintang daun adalah sebagai berikut : potongan daun berukuran 1 cm x 1,5 cm difiksasi dalam larutan FAA selama ± 24 jam.
Selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan merendam daun dalam seri larutan n – Butanol. Tahapan selanjutnya adalah infiltrasi (penyusupan lilin ke dalam jaringan) dengan cara sebagai berikut : botol sampel yang berisi potongan daun pada seri larutan n – Butanol terakhir ditambah dengan parafin (paraplast) cair, kemudian disimpan pada suhu kamar selama 4 jam dengan tutup botol tertutup. Selanjutnya tutup botol sampel dibuka dan dipindahkan ke dalam oven parafin dengan suhu 58 oC selama 24 jam. Larutan pada botol sampel dibuang kemudian diganti dengan parafin cair baru dan disimpan kembali ke dalam oven parafin selama 3 hari (Lampiran 2).
Proses selanjutnya yaitu embedding (penanaman sampel daun dalam parafin) dengan cara sebagai berikut : parafin cair dituang ke dalam cawan pencetak yang sudah diolesi dengan gliserin murni. Potongan daun dengan cepat dikeluarkan dari botol sampel dan ditanam di dalam parafin. Kemudian cawan pencetak yang berisi potongan daun tersebut direndam dalam bak plastik berisi air sampai blok parafin terlepas dari cawan. Blok – blok parafin yang sudah selesai dicetak dibiarkan selama 1 hari. Agar jaringan yang ditanam lebih mudah dipotong, blok parafin selanjutnya direndam di larutan Giffort. Blok parafin
selanjutnya dipotong dengan mikrotom putar dengan ketebalan 8 μm. Hasil potongan berupa pita parafin yang berisi sampel daun diletakkan pada gelas objek yang telah diolesi dengan larutan perekat Ewitt. Kemudian spesimen diletakkan di atas pemanas (hot plate) pada suhu 40 oC selama 4 – 5 jam agar pita terentang dengan baik. Tahapan selanjutnya yaitu spesimen diwarnai dengan pewarna rangkap tiga (Lampiran 2). Setelah selesai pewarnaan preparat ditutup dengan gelas penutup dan diberi perekat entellan (Sass 1951).
Karakter anatomi daun yang diamati adalah sayatan melintang daun dan kerusakan secara mikroskopis dari masing – masing contoh uji. Persentase kerusakan jaringan diukur dengan menggunakan kaca hemositometer yang diletakkan pada bagian atas preparat anatomis ketika diamati di mikroskop. Data kerusakan pada preparat dibandingkan dengan total luasan seluruh preparat kemudian dikalikan seratus persen (Dickison 2000).
3.5. Analisis Udara Ambien
Untuk pengukuran kualitas udara ambien disesuaikan dengan ketetapan yang telah ditetapkan Pemerintah dalam Keputusan Menteri Lingkungan Hidup mengenai Pengukuran Kualitas Udara Ambien untuk industri pupuk. Penetapan contoh udara ambien juga mengacu kepada Sertifikat Hasil Uji PT. PUSRI mengenai Udara Ambient Industri Pupuk Urea yang dikeluarkan oleh Laboratorium Lingkungan Bapedalda Propinsi Sumatera Selatan (Bapedalda 2008).
Pengukuran kadar amonia di udara ambien dengan Metode Biru Indofenol menggunakan Spektrofotometer. Prinsip analisis adalah amonia dari udara ambient yang telah dijerap oleh larutan penjerap asam sulfat, akan membentuk ammonium sulfat. Kemudian direaksikan dengan fenol dan natrium hipoklorit dalam suasana basa, akan membentuk senyawa komplek indofenol yang berwarna biru. Intensitas warna biru yang terbentuk diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm. Bahan kimia untuk analisis amoniak adalah air suling, asam sulfat pekat (H2SO4), natrium nitroprusid, natrium hidroksida (NaOH) 6.75 M, larutan hipoklorit, fenol, metanol, Na3PO4.12H2O, larutan hipoprusid 20 %, amonium klorida (NH4Cl), amonium
sulfat (NH4)2SO4, dan trokloro metan (CHCl). Alat – alat yang digunakan adalah Midget impinger (Lampiran 1), prefilter, Fritted bubbler, Gas scrubber, Botol penangkap uap air (mist trap) berisi serat gelas (glass wool) atau silica gel, Pompa pengisap udara, Flow meter, Spektrofotometer UV-VIS, Gelas piala, Labu ukur , Pipet volumetric, Pipet mikro, Gelas ukur 100 ml, Tabung uji, Timbangan analitik dengan ketelitian 0,1 mg, Buret 50 ml, Labu erlenmeyer 250 ml, Kaca arloji, Desikator oven, Termometer, Barometer, Penangas air, dan Kran pengatur (stop clock) (Bapedalda 2006).
Pengukuran kadar NO2 di udara dengan Metode Griess Saltzman menggunakan Spektrofotometer. Pengambilan contoh uji nitrogen dioksida di udara ambien dilakukan dengan cara dihisap menggunakan pompa ke dalam larutan penyerap Griess-Saltzman maksimum 60 menit, terbentuk suatu senyawa azo dye berwarna merah muda yang stabil setelah 15 menit. Bahan kimia untuk pengukuran NOx adalah hablur asam sulfanilat (H2NC6H4SO3H), larutan asam asetat glacial (CH3COOH pekat), air suling bebas nitrit, larutan induk N-(1- naftil)-etilendiamin dihidroklorida (NEDA, C12H16Cl2N2), larutkan 0,1 g NEDA, Aseton (C3H6O), Larutan penyerap Saltzman, Larutan Induk Nitrit (NO2-): 1640 μg/mL dan Larutan standar Nitrit (NO2-). Alat – alat yang digunakan adalah Air Sampler Impinger (Lampiran 1), labu ukur, gelas piala 500, 1000 mL, labu erlenmeyer 300 mL, pipet volumetrik, pro-pipet, buret asam, spektrofotometer UV-VIS dan cuvet, batang pengaduk /stirrer, neraca analitik, oven dan desikator, alat desilasi dan kaca arloji (Bapedalda 2006).
Konsentrasi diukur secara spektrometri pada panjang gelombang 550 nm.
Absorber fritted bubbler dapat menangkap nitrogen dioksida dengan efisiensi di atas 95% pada aliran kecepatan sebesar 0,4 L/min dan maksimum ukuran diameter pori 60 mikron. Metode ini digunakan untuk pengambilan contoh uji dalam waktu yang singkat dan contoh uji harus langsung diukur serapannya segera setelah sampling. Untuk pengambilan contoh uji dengan kecepatan aliran udara 0,4 L/menit selama 1 jam, maka konsentrasi yang dapat diukur berkisar antara 0,005 - 5 ppm (Bapedalda 2006).
Pengukuran kadar SO2 di udara dengan Metode Pararosanilin menggunakan Spektrofotometer. Sulfur dioksida dari udara ambien yang telah
diserap oleh larutan penyerap sodium tetrakloromerkurat (TCM) pada saat pengambilan contoh uji di lapangan, akan bereaksi membentuk senyawa stabil non volatil dikloro sulfit merkurat. Di laboratorium contoh uji ini direaksikan dengan larutan pararosanilin sehingga terbentuk warna merah. Intensitas warna yang terbentuk diukur serapannya pada panjang gelombang 560 nm dengan spektrofotometer UV-VIS. Bahan kimia untuk pengukuran SOx adalah Larutan penyerap TCM larutan TCM terdiri dari larutan merkuri klorida (HgCl2) dan potasium klorida (KCl), akuades dan EDTA. Larutan induk pararosanilin terdiri dari pararosanilin hidroklorida, dan akuades. Larutan formaldehida 0,2% , Larutan Asam Sulfamat dan larutan standar (larutan induk) terdiri dari sodium bisulfit (NaHSO3) dengan akuades. Alat – alat yang digunakan adalah Air Sampler Impinger (Lampiran 1), labu ukur, gelas piala, labu erlenmeyer 300 mL, pipet volumetrik, pro-pipet, batang pengaduk, buret asam, spektrofotometer UV-VIS dan cuvet (Bapedalda 2006).
Pengukuran kadar CO dengan menggunakan alat CO Detector yang dapat secara langsung dilihat nilai CO dalam waktu 15 menit. Angka yang muncul pada layar detector adalah nilai dari CO di kawasan tersebut. Alat yang digunakan adalah CO Detector (Lampiran 1). CO Detector di letakkan di tempat terbuka ditunggu sekitar lima belas hingga tiga puluh menit. Kemudian catat angka yang muncul di layar (Bapedalda 2006).
3.6. Variabel Pengamatan
Variabel yang diamati pada penelitian ini adalah kandungan klorofil daun dari sampel daun angsana (Pterocarpus indicus Willd.), sediaan mikroskopis daun berupa sayatan melintang daun dan kualitas udara ambien di masing – masing stasiun pengamatan pada setiap zona pengambilan sampel di sekitar kawasan pabrik pupuk PUSRI.
3.7. Analisis Data
Analisis statistik yang digunakan adalah analisis sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji beda rata – rata yaitu Uji Beda Nyata Terkecil untuk
menguji adanya perbedaan antar populasi yang mempengaruhi kandungan klorofil dan persentase kerusakan jaringan mesofil daun angsana (Hanafiah 2004).
3.8. Diagram Alir Penelitian
Untuk menjelaskan secara ringkas metode penelitian yang dilakukan, maka dibuat diagram alir penelitian seperti yang diperlihatkan pada Gambar 6.
Gambar 6. Diagram Alir Penelitian
![Pengujian hipersensitivitas sediaan patch transdermal ekstrak etanol daun angsana (pterocarpus indicus willd) pada kulit marmut. [CD-ROM]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)