3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari 2010 sampai dengan Agustus 2011. Penelitian dilakukan di Insektarium laboratorum Parasitologi dan Entomologi Kesehatan Fakultas Kedokteran Hewan IPB, laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat IPB, laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) Bogor, Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri (Balittri) Sukabumi, laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Bogor, laboratorium Forensik Mabes Polri Jakarta, laboratorium Flavor Balai Besar Penelitian Tanaman Padi Sukamandi, laboratorium Balai Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Bogor, dan laboratorium kimia F-MIPA Kimia UGM Yogyakarta.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan biologis yang dipergunakan adalah biji kamandrah (C. tiglium L.) diperoleh dari Agro Widia Wisata Ilmiah (AWWI) Balittri Sukabumi. Bahan biologis lain yaitu telur A. aegypti berasal dari Insektarium Laboratorum Parasitologi dan Entomologi Kesehatan FKH IPB dan kelinci jantan albino berasal dari FKH IPB.
Bahan kimia yang digunakan adalah Na2S2O3, indikator pati, indikator PP,
KOH, Alkohol, petrolium eter, n-Heksan, asam asetat glasial, KI, kloroform, NH4OH, H2SO4, etilen diklorida, gliserin, aerosil, corn starch, laktosa, poli vinil
pirolidon, aquadest, eudragit, metanol, dan etanol.
Alat yang dipergunakan adalah pengempa hidrolik, Gas Chromatography (GC) merk Hitachi 263-50, Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) merk Agilent, Infra Red Spectrofotometry (FTIR) merk Shimadzu, vacum drying, tabung reaksi, erlemeyer, gelas ukur, beaker gelas, pengaduk magnetik, kertas saring, neraca analitik, blender, kain saring, stirer, mikroskop, micropiper, cawan petri, saringan, botol aqua, nampan plastik, kertas saring, dan alat gelas lainnya.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan, adapun diagram alir proses penelitian ini dilakukan seperti pada Gambar 6.
Gambar 6. Diagram alir pelaksanaan penelitian Penentuan karakteristik biji kamandrah
(Kadar air dan proksimat)
Penentuan efikasi larvasida dan sifat fisiko-kimia minyak biji kamandrah pada berbagai tingkat kematangan buah kamandrah
(Rendemen minyak, uji larvasida dan uji fisiko-kimia minyak) Biji kamandrah
(Croton tiglium L.)
Ekstraksi minyak biji kamadrah dengan pengempaan terpilih
Analisis kelayakan finansial terhadap rancangan teknologi proses produksi
larvasida
Stop
Perancangan teknologi proses produksi larvasida dari biji kamandrah
Optimasi proses ekstraksi minyak biji kamandrah dengan pengempaan (Rendemen minyak dan uji larvasida)
Identifikasi asam lemak, senyawa aktif, gugus fungsional minyak biji kamandrah dengan Gas Chromatography (GC),
Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS), dan Spektrofotometer infra merah (FTIR)
3.3.1. Isolasi dan Karakterisasi Larvasida dalam Minyak Biji Kamandrah 3.3.1.1. Analisis Proksimat Biji Kamandrah
Penentuan kandungan proksimat biji kamandrah masing-masing dianalisis dengan metode AOAC 934.01; 988.05; 920.05 dan 962.09 (AOAC 2000), berturut-turut untuk kadar air, protein, lemak, serat kasar, abu dan karbohidrat (by different) (Lampiran 1).
3.3.1.2. Penentuan efikasi larvasida dan sifat fisiko-kimia minyak kamandrah pada berbagai tingkat kematangan buah kamandrah Buah kamandrah yang digunakan pada penelitian ini dipanen dari AWWI Balittri Sukabumi berdasarkan tingkat kematangan buah. Pemetikan buah didasarkan atas umur buah, dihitung dari hari setelah pembungaan (HSP) buah dan ragam warna kulit luar buah kamandrah yaitu W1 = umur buah 24 HSP (warna kulit buah hijau kecoklatan); W2 = umur buah 33 HSP (warna kulit buah coklat kehijauan); dan W3 = umur buah 42 HSP (warna kulit buah coklat penuh).
Buah kamandrah disortir untuk memisahkan buah yang baik dan yang rusak. Buah dikeringkan dibawah sinar matahari selama 3 hari sampai kulit luar kering, selanjutnya dikupas. Biji kamandrah disortasi kembali untuk memisahkan antara biji yang baik dan biji yang rusak. Biji dikeringkan pada suhu 50oC selama 3 jam, selanjutnya digiling menggunakan hammer mill sebanyak 2 kali agar ukurannya lebih kecil (lolos 40 mesh). Setiap kali proses ekstraksi minyak kamandrah dengan pengempaan digunakan 200g biji kamandrah yang telah dihaluskan. Biji ditimbang dan dimasukan dalam alat pengempa yang memiliki alat pemanas pada landasan tekan. Ekstraksi dilakukan dengan menekan tuas hidrolik secara berulang-ulang sampai dicapai tekanan piston yang diinginkan yaitu 10,54 MPa dan dibiarkan pada suhu pemanasan 65OC selama 15 menit. Bersamaan dengan penekanan, minyak akan keluar disela-sela plat pemanas. Selanjutnya minyak ditampung menggunakan gelas piala. Pengempaan diulang 3 kali dengan cara yang sama. Minyak disaring menggunakan kertas saring, hasil minyak pada setiap pengempaan dicampur dan ditimbang untuk mengetahui rendemen minyaknya. Minyak kamandrah yang dihasilkan dianalisis dengan uji larvasida dan sifat fisiko-kimianya (Lampiran 2 dan 3).
3.3.1.3. Identifikasi Asam Lemak Minyak Kamandrah Dengan Gas
Chromatography (GC)
Komponen asam lemak yang terkandung dalam minyak kamandrah diidentifikasi menggunakan GC. Proses analisis dilakukan sebagai berikut : Sampel (minyak) ditimbang 0,2 g dalam tabung reaksi tertutup, kemudian ditambahkan 2 ml natrium hidroksida dalam metanol, dipanaskan pada suhu 80oC selama 20 menit, kemudian diangkat dan dibiarkan dingin. Selanjutnya ditambahkan 2 ml larutan boron trifluorida 20% dan dipanaskan kembali selama 20 menit, kemudian diangkat, dibiarkan dingin dan ditambahkan 2 ml natrium klorida jenuh serta 2 ml larutan heksan. Setelah itu campuran dikocok sampai merata, lalu lapisan heksannya diambil dan dimasukkan ke tabung uji (evendop).
Kondisi alat kromatografi gas yang digunakan untuk analisis asam lemak adalah:
Jenis alat (GC) : Hitachi 263-50
Detektor : Detektor ionisasi nyala (FID) Jenis kolom : DEGS
Laju alir nitrogen : 1 kgf/cm2 Laju alir hidrogen : 0,5 kgf/cm2 Suhu awal : 150oC Suhu akhir : 180oC Suhu injektor : 200oC Suhu detektor : 250oC Volume injek : 2 µl
Hasil preparasi kemudian diinjeksikan ke alat kromatografi gas ketika suhu menunjukkan 150oC. Tombol start pada rekorder dan alat ditekan, dan hasilnya akan keluar berupa kromatogram. Selanjutnya dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif. Berdasarkan kromatogram yang diperoleh, kemudian pencocokan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi asam lemak standar. Kadar asam lemak dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Lc Cs x V Kadar asam lemak (%) = x
Ls b Keterangan: Lc = luas area contoh
Ls = luas area standar Cs = konsentrasi standar V = volume akhir b = bobot contoh
3.3.1.4. Identifikasi Senyawa Aktif Minyak kamandrah dengan Gas
Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)
GC-MS digunakan untuk identifikasi senyawa aktif dari komponen mudah menguap serta mendapatkan bobot molekul dan pola fragmentasi dari senyawa yang terdapat pada minyak kamandrah. Sampel yang dianalisis disuntikan pada GC-MS sejumlah 1 µl dengan kondisi operasi yang telah disesuaikan, seperti disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5. Kondisi dan spesifikasi operasi alat GC-MS
Kondisi GC Metode I Metode II Metode III
Kolom Kolom kapiler (Agilent 19091J-433 tipe HP-5 dengan diameter 0,25 mm, panjang 30 m dan lebar 0,25 µ m)
Kolom kapiler (Agilent 1520.51616 tipe DB-1 dengan diameter 250 µ m, panjang 60 m dan lebar 0,25 µ m)
Kolom kapiler (Agilent 1520.51616 tipe DB-1 dengan diameter 250 µ m, panjang 60 m dan lebar 0,25 µ m)
Detektor MS MS MS
Gas pembawa Helium Helium Helium
Teknik injeksi Split (1:40) Splitness Splitness Waktu injeksi 0 menit 0,5 menit 0,5 menit Suhu injektor 150oC 50oC 50oC Suhu detektor 250oC 250oC 250oC
Suhu awal 70 oC 70 oC 70 oC
Inlet Mode split Suhu 300oC
Kecepatan : 38,2 ml/min Total aliran : 42,2 ml/min Tekanan : 8,28 psi
Mode Splitness Suhu 250 oC
Kecepatan : 3 ml/menit Total aliran : 7 ml/min Tekanan : 16,090 psi
Mode Splitness Suhu 250 oC
Kecepatan : 3 ml/menit Total aliran : 7 ml/min Tekanan : 16,090 psi Oven Suhu awal : 70oC
Suhu akhir : 60oC Suhu maksimum : 330oC Waktu operasi : 39,67 min
Suhu awal : 70oC Suhu akhir : 60oC Suhu maksimum : 330oC Waktu operasi : 58 min
Suhu awal : 70oC Suhu akhir : 60oC Suhu maksimum : 330oC Waktu operasi : 54,5 min Laju kenaikan suhu 15oC/menit hingga mencapai 290oC ditahan selama 25 menit Mencapai suhu 50oC selama 0 menit Mencapai suhu 50oC selama 0 menit Suhu pertengahan
5oC/menit hingga suhu mencapai 250oC ditahan selama 15 menit
4oC/menit hingga suhu mencapai 180oC selama 0 menit
Laju kenaikan suhu akhir
10oC/menit hingga suhu mencapai 250oC ditahan selama 15 menit Kondisi MS
Solvent delay 3 menit 11 menit 11 menit
EMV Mode False Relative Relative
EM Voltage 2282 1824 1824 Scanparameter - Massa rendah - Ambang - Massa tinggi 35 150 800 40 150 500 40 150 500 MS Zones : MS Source MS Quad 150-200oC 250-300 oC 150-200oC 230-250 oC 150-200oC 230-250 oC
Interpretasi spekta massa dilakukan dengan bantuan komputer untuk membandingkan pola spektra massa suatu senyawa dengan pola spektra massa pada mass spectra library koleksi National InstituteStandar and Tecnology (NIST) yaitu NIST yang memiliki koleksi pola spektra massa lebih dari 62.000 pola. Selain itu dibandingkan juga dengan database Wiley, dan Pest.1. Interpretasi juga dilakukan secara manual yaitu dengan membandingkan pola spektra massa komponen pada sampel dengan yang terdapat pada jurnal atau buku (publikasi). 3.3.1.5. Identifikasi Gugus Fungsional Minyak kamandrah dengan
Spektofotometer Fourier Transform Infra Red (FTIR)
Spektrofotometer FTIR berfungsi untuk mengukur serapan radiasi inframerah pada berbagai panjang gelombang. Ditimbang 1 mg sampel dan digerus dengan 100 mg kalium bromida (KBr) kering sampai homogen. Kemudian di tekan hingga berbentuk pelet yang transparan, dimasukkan ke dalam sel dan di ukur serapannya dengan spektrometer FTIR pada bilangan gelombang 4000-500 cm-1.
3.3.2. Optimasi Proses Ekstraksi Minyak Biji Kamandrah dengan Pengempaan
Optimasi proses ekstraksi minyak biji kamandrah dengan pengempaan menggunakan Response Surface Methodology meliputi 3 perubah terpilih, yaitu suhu pemanasan, lama pemanasan dan tekanan pengempaan. Pertama kali buah kamandrah disortir untuk memisahkan buah yang baik dan yang rusak. Buah dikeringkan dibawah sinar matahari selama 3 hari sampai kulit luar kering, selanjutnya dikupas. Biji kamandrah disortasi kembali untuk memisahkan antara biji yang baik dan biji yang rusak. Biji dikeringkan pada suhu 50oC selama 3 jam, selanjutnya digiling menggunakan hammer mill sebanyak 2 kali agar ukurannya lebih kecil (lolos 40 mesh). Setiap kali proses ekstraksi digunakan 200g biji kamandrah yang telah dihaluskan. Biji ditimbang dan dimasukan dalam alat pengempa yang memiliki alat pemanas pada landasan tekan. Suhu diset sesuai dengan perlakuan dengan memutar saklar termokopel. Ekstraksi dilakukan dengan menekan tuas hidrolik secara berulang-ulang sampai dicapai tekanan piston yang
diinginkan dan dibiarkan sampai suhu yang diinginkan. Kemudian tuas hidrolik ditekan ulang, bersamaan dengan penekanan, minyak akan keluar disela-sela plat pemanas. Selanjutnya minyak ditampung menggunakan gelas piala. Pengempaan diulang dengan cara yang sama, sampai batas waktu lama pemanasan berakhir. Minyak disaring menggunakan kertas saring, hasil minyak pada setiap pengempaan dicampur dan ditimbang untuk mengetahui respon rendemen minyaknya. Minyak kamandrah yang dihasilkan dianalisis dengan uji larvasida untuk mendapatkan nilai LC50 dan LC90 (Lampiran 3). Rancangan percobaan
untuk mendapatkan data respon yang muncul dari perlakuan digunakan metode Box-Behken dengan 5 center point per block. Selanjutnya untuk menentukan daerah optimum pada respon digunakan metode permukaan respon (RSM). Untuk membantu penyelesaian optimasi ini digunakan perangkat lunak Design Expert V 7.1.5 (DX.7) (Estiasih et al. 2009).
Design Expert V7.1.5 adalah suatu program komputer yang dapat digunakan untuk mengoptimasi formula suatu produk atau proses. Program ini menyediakan empat jenis rancangan percobaan dengan efisiensi tinggi, yakni factorial design, respons surface method (RSM), mixture design technique, dan combined design. Design Expert terdiri dari 3 orde, yakni orde 1 (persamaan linear), orde 2 (persamaan kuadrat) dan orde 3 (persamaan pangkat) (Anomin 2011a). Peubah, sandi dan taraf sandi yang dicoba pada penelitian ini disajikan pada Tabel 6, sedangkan matrik rancangan percobaan disajikan pada Tabel 7. Proses optimasi pengempaan minyak biji kamandrah disajikan pada Gambar 7. Tabel 6. Peubah bebas dan taraf yang digunakan pada proses ekstraksi minyak
biji kamandrah dengan pengempaan
Taraf Peubah Sandi Satuan
-1 0 +1
Suhu pemanasan X1 oC 55 70 85
Lama pemanasan X2 menit 15 30 45
Gambar 7. Diagram alir proses ekstraksi minyak biji kamandrah dengan pengempaan
Tabel 7. Matrik Box-Behken yang mengandung 17 percobaan dengan 3 perubah percobaan dalam kode unit.
Peubah Sandi No X1 (oC) X2 (MPa) X3 (menit) Respon (Y) 1 0 -1 1 ? 2 1 -1 0 ? 3 0 0 0 ? 4 1 0 1 ? 5 -1 1 0 ? 6 0 -1 -1 ? 7 1 0 -1 ? 8 -1 0 -1 ? 9 0 0 0 ? 10 1 1 0 ? 11 0 0 0 ? 12 0 1 -1 ? 13 0 0 0 ? 14 -1 -1 0 ? 15 0 0 0 ? 16 0 1 1 ? 17 -1 0 1 ?
Serbuk Biji Kamandrah
Ekstraksi dengan pengempaan : • Suhu pemanasan: 55 – 85oC • Tekanan : 7,90 – 10,54 MPa • Lama pemanasan : 15 - 45 menit
Ampas
Penyaringan Ampas
3.3.3. Perancangan Teknologi Proses Produksi Larvasida Nabati dari Biji Kamandrah
Metode perancangan proses meliputi sintesis proses dan simulasi proses. Metode yang dipergunakan dalam perancangan teknologi proses adalah metode sintesis proses. Sintesis proses dimulai dengan mengembangkan teknologi proses ekstraksi minyak biji kamandrah menggunakan metode pengempaan. Pertimbangan menggunakan metode ekstraksi minyak biji kamandrah dengan pengempaan ini adalah hasil penelitian Iswantini et al. (2007) menyatakan bahwa hasil uji fitokimia dari bagian tanaman kamandrah yaitu daun, batang, dan biji dalam bentuk serbuk dan diekstrak dengan air dan etanol, serta minyak yang di dapat dengan cara pengempaan dari biji mengandung senyawa alkaloid terbanyak diikuti dengan flavonoid, terperoid, saponin, steroid dan tanin. Setelah dilakukan uji larvasida dengan nyamuk A. aegypti instar 3 didapatkan bagian dari biji yaitu minyak yang di peroleh dengan cara ekstraksi dengan pengempaan yang paling berpotensi sebagai larvasida/insektisida.
Untuk memperoleh proses produk akhir ekstrak, dengan melakukan sintesis proses yang dimulai dengan melakukan proses ekstraksi minyak biji kamadrah sebagai senyawa aktif larvasida, penentuan bentuk produk akhir larvasida menggunakan metode perbandingan eksponensial (MPE) (Ansel, 1989; Anonim, 1986). Kemudian dilakukan analisis kelayakan finansial terhadap produk yang dihasilkan. Output perancangan proses yang diperoleh dari penelitian ini adalah rancangan teknologi proses produksi larvasida nabati dari minyak biji kamandrah. Beberapa tahapan sintesis proses tersebut dilakukan sebagai berikut : a. Proses ekstraksi senyawa aktif dari biji kamandrah
Selama ini penggunaan biji kamandrah sebagai larvasida secara tradisional telah dilakukan dengan memasukan beberapa biji kamandrah kedalam gentong/bak air. Dari hasil penelitian Thamrin (2002) menyatakan bahwa ekstrak biji kamandrah cukup ampuh membunuh jentik nyamuk A. aegypti hingga 84% dengan LD50 sebesar 0,06%. Senyawa 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate
(TPA) hasil isolasi dari C. tiglium dapat membunuh 100% larva culex pipiens instar 2 pada konsentrasi 0,6 ppm (Marshall et al. 2005). Hasil penelitian
Iswantini et al. (2009) menyatakan minyak biji kamandrah mempunyai potensi tinggi sebagai larvasida terhadap larva nyamuk A. aegypti instar 3 dengan nilai LC50 dan LC90 berturut-turut 25,98 ppm dan 164,80 ppm. Penggunaan konsentrasi
minyak kamandrah 0,3-0,5% dapat menghambat penetasan telur (ovisida) dan menurunkan jumlah peletakan telur pada ovitrap (anti-oviposisi) nyamuk A. aegypti dan Ae. Albopictus (Iswantini et al. 2008, Astuti 2008).
Pada penelitian ini melakukan pengembangan proses ekstraksi secara mekanik menggunakan metode pengempaan. Proses ekstraksi dengan pengempaan dilakukan untuk mendapatkan senyawa aktif dari biji kamandrah, pengempaan dilakukan pada suhu pemanasan 85oC, tekanan 10,54 Mpa, dan lama pemanasan 15 menit. Proses ekstraksi bahan aktif dari biji kamandrah dengan metode pengempaan disajikan pada Gambar 8.
Sebelum dilakukan ekstraksi senyawa aktif dari biji kamandrah terlebih dahulu dilakukan penyiapan bahan. Penyiapan bahan dilakukan sesuai dengan standar mutu simplisia yang meliputi pengumpulan bahan, sortasi bahan, pengeringan, pengupasan kulit luar buah, dan pengecilan ukuran (Badan POM 2005).
b. Penentuan produk akhir ekstraksi biji kamandrah
Oleh karena produk akhir yang dihasilkan adalah larvasida nabati, maka aplikasi yang umum dilakukan adalah dengan cara disebar sehingga calon produk yang dipilih dapat berupa wettable power (WP), water dispersible granula (WG), capsule suspension (CS), dust (D), dan granula (GR). Metode yang digunakan dalam pemilihan produk akhir menggunakan metode perbandingan eksponensial (MPE) (Marimin 2004). Menurut Eriyatno (1998) bahwa langkah-langkah yang diperlukan dalam pemilihan keputusan dengan menggunakan MPE adalah 1). Penyusunan calon bentuk produk akhir; 2). Penyusunan kriteria yang dikaji; 3) Penentuan tingkat kepentingan; 4) Penentuan skor tiap produk akhir pada setiap kriteria; dan 5) Perhitungan total skor calon produk akhir.
Gambar 8. Diagram alir proses ekstraksi senyawa aktif dengan metode pengempaan
Keuntungan menggunakan metode ini adalah nilai skor yang menggambarkan urutan prioritas menjadi besar karena merupakan fungsi eksponensial, sehingga urutan prioritas alternatif keputusan lebih nyata. Dari hasi perhitungan total skor tertinggi merupakan produk akhir yang terpilih dengan menggunakan persamaan sebagai berikut :
m
TNi = Σ (Rkij)TKKj
j = i
dimana :
TNi = Nilai total alternatif ke i
RKij = Derajat kepentingan relatif kriteria ke j pada pilihan keputusan ke i TKKj = Derajat kepentingan kriteria keputusan ke j; TKK > 0
m = Jumlah kriteria keputusan
Pemilihan buah kamandrah
Buah kamandrah Buah tak normal
Pengeringan buah (kadar air 12%)
Pengupasan kulit buah
Pengecilan ukuran 40 mesh
Ekstraksi metode pengempaan Suhu pemanasan : 850C
Tekanan : 10,54 MPa Lama pemanasan : 15 menit
Uap air
Kulit buah
Ampas
Pengujian dan identifikasi senyawa aktif Ekstrak minyak kamandrah
n = Jumlah pilihan keputusan c. Aplikasi produk
Aplikasi produk didasarkan atas hasil ekstrak minyak biji kamandrah yang diperoleh dan telah dilakukan pengujian terhadap khasiat minyak sebagai larvasida nabati. Produk yang di buat atas dasar perlakuan terbaik hasil uji larvasida menggunakan larva A. aegypti instar 3, uji iritasi pada mata dan uji iritasi pada kulit. Ekstrak minyak biji kamandrah yang diperoleh selanjutnya diformulasi dengan bahan lain. Formulasi ditetapkan dari hasil kegiatan KKP3T tahun 2008. Ketepatan komposisi bahan formulasi disesuaikan dengan ketentuan yang berlaku menurut Handbook of pharmaceutical excipients (Anonim 1986).
D. Analisis kelayakan finansial
Analisisi kelayakan finansial bertujuan untuk mengkaji sampai seberapa jauh prospek produk yang dihasilkan berupa industri larvasida nabati dari biji kamandrah, maka perlu dilakukan analisis finansial dalam periode waktu tertentu yang meliputi Net Present Value (NPV), Internal Rate of Return (IRR), Net B/C ratio (Net B/C), Payback Period (PBP), dan analisis sensitivitas yang memberikan nilai tambah dari produk yang dikaji.
