Studi Ekspresi Transforming Growth Factor Beta (TGF-Β) dan Gambaran Histopatologi Ginjal Tikus (Rattus norvegicus) Model Fibrosis Ginjal Hasil Induksi Streptokinase Pasca Terapi
Pemberian Air Rebusan Kacang Kedelai
Study of The Expression of Transforming Growth Factor Beta (TGF-Β) And Kidney Histopathologycal In Rats (Rattus norvegicus) Renal Fibrosis Induced by
Streptokinase After Soybean Stew Water Therapy
Fela Kurniawati Susanto, Agung Pramana Warih Marhendra, Aulanni’am
Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya clarafelasusanto@gmail.com
ABSTRAK
Penyakit ginjal merupakan penyakit yang dapat menyerang manusia dan hewan. Hewan memiliki prevalensi penyakit ginjal diestimasi sebesar 1,6-20% untuk pet animal. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui penurunan ekspresi TGF- dan perbaikan gambaran histopatologi ginjal pada tikus (Rattus norvegicus) model fibrosis ginjal yang diinduksi streptokinase pasca pemberian terapi rebusan kacang kedelai. Pada penelitian ini terdapat empat kelompok perlakuan yaitu kontrol sehat (A), kontrol sakit (B), terapi air rebusan kacang kedelai dosis 6 g/2 ml/ekor (C), dan terapi air rebusan kacang kedelai dosis 9 g/2 ml/ekor (D). Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah ekspresi TGF- yang diamati dengan metode imunohistokimia dan gambaran histopatologi ginjal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi air rebusan kacang kedelai secara signifikan (P<0,05) mempengaruhi ekspresi TGF-β antar perlakuan. Penurunan rata-rata TGF-β terbaik diketahui terjadi pada kelompok terapi air rebusan kacang kedelai 9 g/2 ml/ekor yaitu sebesar 71%. Terapi air rebusan kacang kedelai secara kualitiatif menunjukkan adanya perbaikan pada gambaran histopatologi ginjal yang ditandai dengan penurunan akumulasi myofibroblas serta penurunan kerusakan epitel tubulus, perbaikan terbaik terjadi pada kelompok terapi air rebusan kacang kedelai 9 g/2 ml/ekor.
Kata kunci : Fibrosis ginjal, Streptokinase, Transforming Growth Factor (TGF-β), Air rebusan kacang kedelai, histopatologi ginjal, myofibroblas
ABSTRACT
Renal disease is a disease that can attack human and animal. Animal have prevalence for renal disease estimated at 1,6-20% for pet animal. The purpose of this study is to determine the decrease in the expression of TGF-β and the improvement of kidney histopathology in rats (Rattus norvegicus) renal fibrosis induced by streptokinase after soybean stew water therapy. In this study, there were four treatment groups, negative control (A), positive control (B), soybean stew water therapy dose 6 g/2 ml/rats (C), and soybean stew water therapy dose 9 g/2 ml/rats (D). Parameters observed in this study were the expression of TGF-β observed by immunohistochemical methods and an overview of renal histopathology. The result of this study showed that soybean stew water therapy significantly (P<0,05) showed differences expression between treatments. The best decreased expression of TGF-β known at soybean stew water therapy dose 9 g/2 ml/rats. Soybean stew water therapy qualitatively showed an improvement of kidney hisopathology that characterized by decreased amount of myofibroblast and decreased in damage of epithelial tubular, the best improvement occured at soybean stew water therapy dose 9 g/2 ml/rats.
Keywords : Renal fibrosis, streptokinase, Transforming Growth Factor Beta (TGF-β), soybean stew water, kidney histopathology, myofibroblast
PENDAHULUAN
Penyakit ginjal merupakan masalah kesehatan di seluruh dunia karena jutaan orang telah menjalani terapi untuk menggantikan fungsi ginjal yang mengalami gangguan. Hewan memiliki prevalensi penyakit ginjal diestimasi sebesar 1,6-20% untuk pet animal
(Francey dan Schweighauser, 2008; Kirk dan Hickman, 2000).
Penyakit ginjal sering disertai dengan proses inflamasi jaringan ginjal yang disebabkan oleh proses imunologis maupun non-imunologis. Awal penyakit ginjal kronik adalah terjadi inflamasi glomerulus yang diikuti dengan kerusakan pada sel epitel tubulus dan terbentuknya sel-sel inflamasi. Pembentukan jaringan sklerotik dan fibrosis adalah proses selanjutnya setelah terbentuk sel-sel inflamasi, sehingga akhirnya terjadi gagal ginjal terminal.
Salah satu pemicu timbulnya penyakit ginjal adalah penggunaan streptokinase. Streptokinase secara luas digunakan sebagai obat trombolitik (Buniya et al., 2014). Fibrosis ini dapat ditunjukkan dengan adanya peningkatan ekspresi
Transforming Growth Factor β (TGF-β)
ginjal tikus (Rattus norvegicus) model fibrosis ginjal yang diinduksi dengan streptokinase.
Peningkatan ekspresi TGF-β dapat diakibatkan oleh streptokinase dengan cara pengaktivasian plasminogen menjadi plasmin (Trihono, 2011).TGF-β diketahui merupakan salah satu regulator utama dari renal fibrosis (Terashima et al., 2014).
Kerusakan glomerulus yang semakin parah akan diikuti dengan pengaktivasian sel tubulointerstisial untuk memproduksi TGF-β. Peningkatan ekspresi TGF-β inilah yang akan memicu penumpukan matriks ekstraselular dan dapat menyebabkan fibrosis ginjal secara progresif (Goumenos
et al., 2002).
Kerusakan glomerulus yang semakin parah dapat ditekan dengan pemberian isoflavon yang bersifat menstabilkan radikal bebas (ROS). Kandungan isoflavon yang paling banyak terdapat di dalam
kacang kedelai adalah genistein dan daidzin (Sierens et al., 2002). Pada beberapa penelitian klinis, genistein diketahui dapat menekan aktivitas
Transforming Growth Factor β (Xu dan
Raymond, 2006).
MATERI DAN METODE Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang pemeliharaan hewan coba, peralatan bedah (gunting, scalpel, dan pinset), cawan petri, vaccutainer, pisau, talenan, falcon, gelas objek, plastik klip, aluminium foil, sendok pencampur, pipet tetes, gelas ukur 100ml, mikro pipet (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL), yellow tip, spuit insulin 1 ml, spuit 3 ml dan 5 ml, rak tabung reaksi, penangas air, tabung
appendof, lemari pendingin, pH meter
digital, penjepit, mitokrom, neraca analitik, oven, termometer raksa, alat sentrifugasi (Denley tipe BR 401), inkubator (Memmert), vortex (Guo-Huq), mikroskop dan autoclave.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah hewan coba yaitu tikus putih (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar berumur 10 minggu dengan berat 150-250 gram, Streptokinase, kacang kedelai, Aquades, Air, NaCl-fisiologis, Formaldehid, Xylol, etanol 70%, etanol 80%, etanol 90%, etanol 100%, H2O2, antibodi anti-rat TGF-β, Dako LSAB + SA-HRP, larutan PBS, PFA 4%, Mayer Albumin, Hematoxylen, Eosin, Entellan, Gliserin, Parafin dan larutan PBS Azida. Prosedur Kerja
Perlakuan Hewan Model
Hewan model fibrosis ginjal yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan strain wistar yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta dengan umur 10 minggu dan berat badan antara 150-200 gram serta telah mendapatkan sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No. 218-KEP-UB.
iii
Induksi Streptokinase
Pada hari pertama, tikus dari kelompok B, kelompok C, dan kelompok D diinjeksi dengan sediaan streptokinase dosis 6000 IU/ekor tikus secara intravena melalui vena coccygea. Pada hari keenam dan kesebelas, tikus kelompok B, kelompok C, dan kelompok D diinjeksi kembali dengan streptokinase dosis 6000 IU/ekor tikus secara intravena melalui vena coccygea.
Preparasi Air Rebusan Kacang Kedelai
Kacang kedelai dibersihkan dari kotoran, kemudian ditimbang sebanyak 75 gram, lalu dicuci dengan air bersih. Dibagi menjadi 2 bagian, bagian pertama sebanyak 30 gram untuk kelompok C dan bagian kedua 45 gram untuk kelompok D. Kacang kedelai yang telah dibersihkan dan dibagi direndam selama 6-8 jam pada suhu kamar dengan air bersih sebanyak 100 ml, lalu kedelai dicacah kasar, dimasukkan ke dalam gelas ukur dan diberi air bersih sebanyak 75 ml. Kacang kedelai direbus pada suhu 60-80oC sampai volume air hanya tersisa 10 ml, kemudian disaring.
Pemberian Terapi Air Rebusan Kacang Kedelai
Air rebusan kacang kedelai diberikan
HASIL DAN PEMBAHASAN
setiap hari pada tikus, mulai hari ke-16 sampai dengan hari ke-30 menggunakan metode sonde lambung setiap harinya Terapi air rebusan kacang kedelai diberikan dengan dosis 6 g/2 ml/ekor untuk kelompok C dan 9 g/2 ml/ekor untuk kelompok D.
Pengamatan Histopatologi dan
Pewarnaan Imunohistokimia (IHK)
Pengamatan dilakukan pada organ ginjal hewan model menggunakan pewarnaan Imunohistokimia untuk mengetahui ekspresi TGF-β dan pewarnaan Hematoksilin-Eosin untuk mengetahui gambaran histopatologi ginjal. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop Olympus BX51 dengan perbesaran 400x dan 1000x.
Analisa Data
Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini yaitu menggunakan analisa kualitatif deskriptif untuk gambaran histopatologi ginjal dan kuantitatif statistik untuk ekspresi TGF-β dengan uji ANOVA untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan yang dilanjutkan dengan uji BNJ α = 5 % untuk melihat dan menganalisa perbedaan antar kelompok perlakuan (Kusriningrum, 2008).
Keterangan :
A = ginjal tikus kontrol negatif (sehat); B = ginjal tikus kontrol negatif (sakit); C = ginjal tikus perlakuan 1 (air rebusan kacang kedelai 3 g/ml); D = ginjal tikus perlakuan 2 (air rebusan kacang kedelai 4,5 g/ml). ( ) Ekspresi TGF-β. Insert : Ekspresi TGF-β.
Gambar 1. Ekspresi Transforming Growth Factor-β (TGF-β) pada Hewan Model Fibrosis Ginjal yang Diinduksi Streptokinase (Perbesaran 1000x)
iv Bintik berwarna kecoklatan pada semua preparat imunohistokimia menunjukkan ekspresi TGF-β. Adanya bintik berwarna coklat ini merupakan gambaran dari ekspresi TGF-β yang diakibatkan adanya ikatan antara antigen jaringan dengan antibodi yang diberikan dalam proses pembuatan preparat imunohistokimia untuk mengamati ekspresi TGF-β (Gambar 1).
Hasil uji statistik (One-Way ANOVA) menggunakan SPSS 16.0 for Windows menunjukkan adanya perbedaan yang nyata antara kelompok perlakuan A, B, dan C (p<0,05), tetapi tidak menunjukkan perbedaan yang nyata pada kelompok D. Hal ini menunjukkan adanya pengaruh pada masing-masing perlakuan yang diberikan pada setiap kelompok perlakuan. Pemberian terapi air rebusan kacang kedelai menyebabkan penurunan jumlah rata-rata ekspresi TGF-β dibandingkan dengan kontrol positif tiap kelompok perlakuan berbeda-beda. Terapi pemberian air rebusan kacang kedelai yang mengandung isoflavon menekan peningkatan produksi TGF-β dengan cara mendonorkan ion hidrogen dalam ikatannya sehingga ROS yang terbentuk ketika terjadi reaksi tubuh hewan model akibat diinduksi dengan streptokinase akan mengalami penurunan karena distabilkan oleh ion hidrogen yang berasal dari isoflavon. Permeabilitas membran yang
Transforming Growth Factor-β (TGF-
β) diketahui merupakan salah satu regulator utama dari renal fibrosis (Terashima et al., 2014). TGF-β merupakan penginduksi EMT yang merupakan salah satu penyebab utama dari fibrosis ginjal (Kalluri, 2003). TGF-β diketahui akan mengalami peningkatan ketika terjadi fibrosis ginjal.
awalnya meningkat pasca diinduksi dengan streptokinase secara perlahan akan mengalami penurunan sehingga Ca2+ intraseluler juga mengalami penurunan. Penurunan kadar Ca2+ intraseluler menyebabkan aktivitas enzim protease menurun yang diikuti dengan penurunan sitokin-sitokin pro-inflamatori yang salah satunya adalah TGF-β.
Persentase penurunan ekspresi TGF-β didapatkan dengan cara konversi dari rata-rata ekspresi TGF-β dan diubah dalam bentuk persentase. Kelompok C menunjukkan penurunan ekspresi TGF-β sebesar 59% dibandingkan dengan kelompok kontrol positif dan kelompok D menunjukkan penurunan ekspresi TGF-β sebesar 71% dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (Tabel 1).
v Gambaran histopatologi ginjal hewan model fibrosis ginjal yang diinduksi streptokinase pasca terapi pemberian air rebusan kacang kedelai menunjukkan adanya perbedaan gambaran pada setiap kelompok perlakuan. Akumulasi myofibroblas pada pengamatan kualitatif terdapat pada kelompok perlakuan B dan kelompok perlakuan C, akumulasi myofibroblas terbanyak terdapat pada kelompok perlakuan B. Kelompok perlakuan B juga menunjukkan kerusakan epitel tubulus paling banyak, yang menunjukkan bahwa tingkat kerusakan ginjal pada hewan model kelompok B paling parah. Kelompok perlakuan D yang mendapatkan terapi air rebusan kacang kedelai dengan dosis 9 g/2 ml/ekor menunjukkan hasil bahwa kerusakan epitel tubulus lebih sedikit daripada kelompok perlakuan C yang mendapatkan terapi air rebusan kacang kedelai dengan dosis 6 g/2 ml/ekor, hal ini menunjukkan bahwa terapi air rebusan 9 g/2 ml/ekor memberikan hasil yang baik pada perbaikan histopatologi ginjal hewan model tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi oleh streptokinase (Gambar 2).
Air rebusan kacang kedelai diketahui mengandung isoflavon yaitu genistein dengan berat molekul 270 kDa setelah dilakukan uji LCMS. Isoflavon akan bertindak sebagai donor hidrogen pada ROS bersifat tidak stabil yang dihasilkan dari proses oksidasi lipid pada membran sel, pembentukan ROS merupakan salah satu efek samping dari induksi streptokinase. Isoflavon pada air rebusan kacang kedelai akan membentuk sebuah kompleks ROS-isoflavon yang bersifat lebih stabil. Pengikatan ROS oleh isoflavon akan menghambat dari perkembangan fibrosis ginjal menuju tahap selanjutnya.
Pemberian air rebusan kacang kedelai dengan dosis 9 g/2 ml/ekor pada kelompok perlakuan D dengan pengamatan secara kualitatif mampu menghambat fibrosis ginjal menuju tahap yang lebih lanjut. Terjadi perbaikan dari epitel tubulus yang rusak pasca induksi streptokinase dan penurunan secara kualitatif dari deposisi myofibroblas yang merupakan bentuk aktif dari fibroblas secara signifikan pada kelompok perlakuan terapi air rebusan kacang kedelai dengan dosis 9 g/2 ml/ekor
Keterangan : A = ginjal tikus kontrol negatif (sehat) B = ginjal tikus kontrol negatif (sakit) C = ginjal tikus perlakuan 1 (air rebusan kacang kedelai 6 g/2 ml) D = ginjal tikus perlakuan 2 (air rebusan kacang kedelai 9 g/2 ml).
vi apabila dibandingkan dengan kelompok perlakuan tanpa terapi.
Kerusakan sel epitel tubulus terjadi karena adanya pengaruh dari enzim degradasi membran yang menyebabkan kerusakan dari nefron tubular. Kerusakan dari nefron tubular menyebabkan lepasnya epitel dan dibawa oleh proses EMT menuju ke rongga interstisial ginjal dan diubah menjadi jaringan fibroblas.
Rongga interstisial ginjal normal terdiri atas sparse cell, terutama fibroblas dan sel dendrit yang terdapat di dalam jaringan matriks ekstraselular (ECM) yang terdiri atas kolagen tipe I, III, VII, fibronektin, dan tenascin (Alexakis et al., 2006). Pada fibrosis ginjal interstisial, dikarakteristikkan dengan akumulasi dari fibroblas aktif dan protein matriks baru yang dibatasi oleh membran basement (kolagen tipe IV dan laminin). Akumulasi fibroblas aktif pada jaringan yang mengalami kerusakan berhubungan dengan resiko perkembangan menjadi fibrosis.
Yang et al., (2010) menunjukkan bahwa perubahan dari ginjal normal yang mengalami luka yang diperbaiki menjadi fibrosis ginjal terjadi ketika sel epitel tubular berada pada fase G2/M siklus sel, sebuah fase yang bersamaan dengan perubahan dari interfase menuju mitosis. Jumlah sel epitel tubulus proksimal yang berada di dalam fase G2/M menunjukkan hubungan dengan perkembangan fibrosis, dan sel ini akan memproduksi TGF-β dalam jumlah tinggi serta connective tissue
growth factor yang menunjukkan bahwa
siklus sel ini mengubah epitel normal sel menuju ke pertumbuhan fibrosis.
KESIMPULAN
1. Terjadi penurunan level ekspresi TGF-β pada tikus (Rattus norvegicus) model fibrosis ginjal yang diinduksi streptokinase setelah pemberian terapi air rebusan kacang kedelai. Penurunan level ekspresi TGF-β pada kelompok perlakuan terapi air rebusan kacang kedelai dosis 6 mg/2 ml/ekor sebesar 59% dan penurunan level ekspresi
TGF-β pada kelompok perlakuan terapi air rebusan kacang kedelai dosis 9 mg/2 ml/ekor sebesar 71%.
2. Terjadi perbaikan gambaran histopatologi ginjal pada tikus (Rattus
norvegicus) model fibrosis ginjal yang
diinduksi streptokinase setelah pemberian terapi air rebusan kacang kedelai. Perbaikan gambaran histopatologi ginjal ditandai dengan penurunan akumulasi myofibroblas serta berkurangnya kerusakan epitel tubulus.
SARAN
Perlu dikaji lebih lanjut mengenai mekanisme genistein yang berasal dari kacang kedelai dalam peranannya sebagai antioksidan.
DAFTAR PUSTAKA
Alexakis C., P. Maxwell., and G. Bou-Charlos. 2006. Organ-specific Collagen Expression: Implications for Renal Disease.
Nephron Exp Nephrol
(102):71-75.
Buniya, H.K., Murugan V., and Thangadurai, C. 2014. Cloning And Expression of Hybrid Streptokinase Towards Clot-Specific Activity. Journal of
Microbiological Methods 98
(14):84–88.
Francey and A. Schweighauser. 2008. Clinical Epidemiology Of Kidney Diseases In The Cat. Veterinary
Focus 18(2):02-08.
Goumenos, D.S., S. Tsakas, A.M. El-Nahas, S. Alexandri, S. Oldroyd, and P. Kalliakmani. 2002. Transforming Growth Factor-β1 in the Kidney and Urine of Patients with Glomerular Disease and Proteinuria. Journal of
Nephrol Dial Transplant
17:3145-2152.
Kalluri, R. and E.G. Neilson. 2003. Epithelial-Mesenchymal
vii Fibrosis. The Journal of Clinical
Investigation 112:1776-1784.
Kirk, C.A. and M.A. Hickman. 2000. Dietary Protein Requirement of Cats With Spontaneous Renal Disease. J Vet Intern Med 13:351. Kusriningrum. 2008. Dasar Perancangan
Percobaan dan Rancangan Acak Lengkap. Fakultas Kedokteran
Hewan. Universitas Airlangga. Surabaya.
Sierens, J., J.A. Hartley, M.J. Campbell, A.J. Leathern, and J.V. Woodside. 2002. In Vitro Isoflavone Supplementation Reduces Hydrogen Peroxide-Induced DNA Damage in Sperm. Teratog Carcinog Mutagen (22):227-234.
Terashima, H., M. Kato, M. Ebisawa, H. Kobayashi, K. Suzuki, Y. Nezu, and T. Sada. 2014. R-268712, an Orally Active Transforming Growth Factor-β Type 1 Receptor Inhibitor, Prevents Glomerular Sclerosis in a Thy1 Nephritis Model. Eur J Pharmacol 3(45):1-7.
Trihono, P.P. 2011. Peran Transforming Growth Factor- β1 Pada Penyakit Ginjal. Sari Pediatri 13(1):49-54. Xu, Li and R.C. Bergan. 2006. Genistein
Inhibits Matrix Metalloproteinase Type 2 Activation and Prostate Cancer Cell Invasion by Blocking the Transforming Growth Factor β-Mediated Activation of Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated Protein Kinase 2-27-kDa Heat Shock Protein Pathway. Division of Hematology/Oncology,
Northwestern University Medical School, Illinois. 70(3):869-877.
Yang, L., T.Y. Besschetnova, C.R. Brooks, J.V. Shah, and J.V. Bonventre. 2010. Ephitelial Cell Cycle Arrest in G2/M Mediated Kidney Fibrosis After Injury. Nat
