PERCOBAAN I
PENGUJIAN TOKSISITAS EKSTRAK DAUN DAN KULIT BATANG JAMBU BIJI (Psidium guajava) SERTA BIJI KOPI (Coffea canephora)
METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST ( BSLT)
A. Tujuan
1. Mengetahui toksisitas ekstrak daun dan kulit batang jambu biji (Psidium guajava)serta biji kopi (Coffea canephora) dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test).
2. Mengetahui nilai LC50 ekstrak daun dan kulit batang jambu biji (Psidium
guajava)serta biji kopi (Coffea canephora).
B. Dasar Teori
1. Uraian Tanaman
a. Jambu Biji (Psidium guajava)
Nama ilmiah jambu biji adalah Psidium guajava. Psidium berasal dari bahasa Yunani yaitu “Psidium” yang berarti delima. Sementara “guajava” bersal dari nama yang diberikan oleh orang Spanyol. Adapun taksonomi tanaman jambu biji di klasifikasikan
Spesies : Psidium guajava Linn.
Jambu biji merupakan tanaman perdu bercabang banyak. Tingginya dapat mencapai 3-10 m. Batang jambu biji memiliki ciri khusus, diantaranya berkayu keras, liat, tidak mudah patah, kuat dan padat. Kulit kayu tanaman jambu biji halus dan mudah terkelupas. Pada fase tertentu, tanaman mengalami pergantian atau peremajaan kulit. Batang dan cabang-cabangnya mempunyai kulit berwarna cokelat atau cokelat keabu-abuan.
diare. Ranting muda juga dapat digunakan untuk pengobatan keputihan.
(Parimin, 2008) b. Kopi Robusta (Coffea canephora)
Kopi robusta atau yang disebut dengan Coffea canephora pada awalnya hanya dikenal sebagai semak atau tanaman liar yang mampu tumbuh hingga beberapa meter tingginya. Batang dan cabang-cabang kopi robusta dapat tumbuh hingga mencapai ketinggian 2-5 m dari permukaan tanah atau mungkin juga lebih. Kopi robusta tumbuh baik pada temperatur ratarata tahunan 24° -30° C. Kopi robusta memiliki kandungan kafein. Kafein merupakan senyawa kimia alkaloid dikenal sebagai trimetilsantin dengan rumus molekul C8H10N4O2. Selain kafein, kopi juga mengandung
antioksidan kuat.
Berikut merupakan klasifikasi tanaman kopi robusta: Kingdom : Plantae
Toksisitas berasal dari kata toxican yang berarti racun, merupakan ilmu yang mempelajari hal ikhwal racun dan cara kerjanya atau disebut juga pengetahuan tentang racun. Untuk memaparkan adanya efek toksik atau dimana menilai batas keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan suatu senyawa, maka dilakukan uji toksisitas. Pengukuran toksisitas dapat ditentukan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat keamanan dan tingkat berbahaya zat tersebut (Frank, 2008).
a. Uji toksisitas akut
Dilakukan dengan memberikan bahan tersebut berulang-ulang biasanya setiap hari atau sekali seminggu selama jangka waktu kurang lebih 10% dari masa hidup hewan.
c. Uji toksisitas jangka panjang (kronik)
Percobaaan jenis ini mencakup pemberian obat secara berulang-ulang selama 3-6 bulan atau seumur hidup hewan.
(Frank, 2008) 3. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode skrining awal untuk menentukan ketoksikan suatu ekstrak ataupun senyawa. Metode ini juga sering digunakan untuk bioassay dalam usaha mengisolasi senyawa toksik tersebut dari ekstrak (Meilani, 2006).
Secara umum, senyawa yang bersifat sitotoksik juga menunjukkan sifat toksiknya terhadap Artemia salina. Uji toksisitas akut pada hewan ini dapat digunakan sebagai uji pendahuluan yang mengarah ke uji sitotoksik karena ada kaitannya dengan uji toksisitas akut dengan uji sitoktoksik jika harga LC50 dan uji toksisitas akut yang kurang dari 1000 g/ml (Lenny, 2006).
Artemia salina termasuk fillum Anthropoda, kelas Crustacea, ordo Anastraca, family Aretemidae, genus Artemia dan spesies Artemia salina Leach. Secara alami Artemia hidup dari makanan alami berupa bahan organik (sisa bahan alam yang hancur), ganggang renik, ganggang hijau, ganggang biru, dan cendawan (ragi laut) (Cahyadi, 2009).
C. Alat dan Bahan
f. Gelas kimia 100 ml g. Labu ukur 10 ml h. Pipet tetes
i. Seperangkat alat penetas larva j. Spatula
d. Ekstrak biji kopi (Coffea canephora) e. Ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava)
f. Ekstrak kulit batang Jambu biji (Psidium guajava) g. Larva udang Artemia salina Leach
h. Ragi Sacharomyces cereviciae D. Prosedur Kerja
1. Penyiapan Sampel
a. Ditimbang ekstrak metanol daun dan kulit batang jambu biji serta ekstrak metanol biji kopi masing-masing sebanyak 100 gram.
b. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml lalu dilarutkan dengan air laut, apabila tidak larut ditambah Tween 80 (Tween 80 51% dari total volume air laut.
c. Ditambahkan air laut pada labu ukur lalu di tambahkan hingga tanda batas.
2. Penyiapan Hewan Uji
a. Direndam telur udang (Artemia salina Leach) dalam wadah penetasan yang berisi air laut.
b. Diletakkan dibawah cahaya lampu 40/60 watt pada suhu kamar dan dilengkapi aerator.
c. Dilihat telur akan menetas selama 24 jam menjadi larva setelah larva berumur 48 jam, larva udang siap diujikan.
3. Pengujian Toksisitas
b. Dimasukkan 10 ekor larva udang Artemia salina Leach kedalam botol vial.
c. Dimasukkan masing-masing ekstrak metanol kulit batang jambu biji, ekstrak metanol daun jambu biji, dan ekstrak biji kopi dengan konsentrasi 100 ppm, 300 ppm, 500 ppm, 700 ppm, dan 900 ppm. d. Ditambahkan air laut sampai tanda batas 5 mL.
e. Ditutup botol vial dengan menggunakan aluminium foil lalu dilubangi.
f. Disimpan botol vial di keranjang dan diletakkan di tempat yang cukup mendapatkan sinar lampu.
g. Diamati selama 24 jam jumlah larva yang mati pada masing-masing konsentrasi termasuk kontrol yang hanya dimasukkan 10 ekor larva udang tanpa ekstrak
h. Dihitung jumlah larva yang mati pada masing-masing konsentrasi. i. Dicatat jumlah larva udang yang mati dan dihitung LC50 dengan
E. Hasil Pengamatan 1. Tabel Pengamatan
a. Ekstrak Kulit Batang Jambu Biji (Psidium guajava) 1) Tabel Kematian
Jumlah Terakumulasi Rasio Mortalitas(%)
Mat
100 300 500 700 900
1 1 2 3 3 3 0 Harga Probits 2,05 4,08 4,20 4,30 4,42
b. Ekstrak Daun Jambu Biji (Psidium guajava)
Jumlah Terakumulasi Rasio Mortalitas(%)
Mat
kontrol - 14 36 14 233 247 0,0567 5,67 100 2,0 6 44 20 197 217 0,0922 9,22
100 300 500 700 900
c. Ekstrak Biji Kopi (Coffea canephora)
Jumlah Terakumulasi Rasio Mortalitas(%)
Mat
100 300 500 700 900
1 1 1 4 1 4 2
Harga Probits 3,59 0 4,23 0 4,48
2. Perhitungan
a. Ekstrak Kulit Batang Jambu Biji (Psidium guajava) 1) Pembuatan Stok
larutan stok =1000 ppm 100 mL 1000 mg
100 mL = x 10 mL x=100 mg 2) Variasi Konsentrasi
a) 100 ppm
M1× V1= M2× V2
1000× V1=100×5
V1=0,5 mL
b) 300 ppm
M1× V1= M2× V2 1000× V1=300×5
V1=1,5 mL
c) 500 ppm
M1× V1= M2× V2
1000× V1=500×5
V1=2,5 mL
d) 700 ppm
M1× V1= M2× V2 1000× V1=700×5 V1=3,5 mL e) 900 ppm
M1× V1= M2× V2
1000× V1=900×5
3) Reed and Muench
c) Hasil Kali Jarak Proporsi dengan Logaritma Pertambahan g=h×i
% Kematian=
∑
hewan uji mati-∑
hewan uji mati kontrolTotal hewan uji ×100%
(1) 100 ppm
% Kematian =5 - 4
(2) 300 ppm
% Kematian =13 - 4
50 × 100 % = 18 % (3) 500 ppm
% Kematian =16 - 4
50 × 100 % =24 % (4) 700 ppm
% Kematian =17 - 4
50 × 100 % = 26 % (5) 900 ppm
% Kematian =18 - 4
50 × 100 % =28 % b) Persamaan Regresi Linear
a=-2,51 b=2,43 r=0,93 y=bx+a
=2,43x-2,51
Jika y adalah 5 (50%), maka x = ... ? 5=2,43x-2,51
2,43x=7,51 x=3,09 c) Nilai LC50
LC50= antilog x
b. Ekstrak Daun Jambu Biji (Psidium guajava) 1) Pembuatan Stok
larutan stok =1000 ppm 100 mL 1000 mg
100 mL = x 10 mL x=100 mg 2) Variasi Konsentrasi
a) 100 ppm
M1× V1= M2× V2
1000× V1=100×5
V1=0,5 mL
b) 300 ppm
M1× V1= M2× V2 1000× V1=300×5
V1=1,5 mL
c) 500 ppm
M1× V1= M2× V2
1000× V1=500×5
V1=2,5 mL
d) 700 ppm
M1× V1= M2× V2 1000× V1=700×5
V1=3,5 mL e) 900 ppm
M1× V1= M2× V2
1000× V1=900×5
3) Reed and Muench a) Jarak Proporsi
h = 50%-a b-a
=50 %-40,46 % 65,05 %-40,46 % =0,387
b) Logaritma Pertambahan Konsentrasi i=logk
s = log900
700 =0,109
c) Hasil Kali Jarak Proporsi dengan Logaritma Pertambahan g=h×i
=0,387×0,109 =0,042 d) Nilai y
y=g + log s
= 0,042+ log700 =2,887
e) LC50
LC50=antilog y
=antilog 2,887 = 770,90 ppm 4) Probits
a) % Kematian
% Kematian=
∑
hewan uji mati-∑
hewan uji mati kontrolTotal hewan uji ×100%
(1) 100 ppm
% Kematian =6 - 1 4
(2) 300 ppm c. Ekstrak Biji Kopi (Coffea canephora)
1) Pembuatan Stok larutan stok =1000 ppm
d) 700 ppm
M1× V1= M2× V2
1000× V1=700×5
V1=3,5 mL
e) 900 ppm
M1× V1= M2× V2 1000× V1=900×5 V1=4,5 mL 3) Reed and Muench
a) Jarak Proporsi h = 50%-a
b-a
=50 %-33,3 % 65,9 %-33,3 % =0,512
b) Logaritma Pertambahan Konsentrasi i=logk
s = log900
700 =0,109
c) Hasil Kali Jarak Proporsi dengan Logaritma Pertambahan g=h×i
=0,512×0,109 =0,056 d) Nilai y
y=g + log s
e) LC50
LC50 =antilog y
=antilog 2,901 =796,16 ppm 4) Probits
a) % Kematian
% Kematian=
∑
hewan uji mati-∑
hewan uji mati kontrolTotal hewan uji ×100%
(1) 100 ppm
% Kematian =9 - 5
50 × 100 %= 8 % (2) 300 ppm
% Kematian =4 - 5
50 × 100 %= -2 % (3) 500 ppm
% Kematian =16 - 5
50 × 100 %= 22 % (4) 700 ppm
% Kematian =4 - 5
50 × 100 %= -2 % (5) 900 ppm
% Kematian =20 - 5
50 × 100 %= 30 % b) Persamaan Regresi Linear
a=2,8597 b=-0,1540 r=-0,0256 y=bx+a
=-0,1540x+2,8597
x=-13,898 c) Nilai LC50
LC50 = antilog x =antilog -13,898
F. Pembahasan
Toksisitas merupakan efek beracun dari suatu senyawa atau bahan obat pada organ target. Umumnya suatu senyawa kimia mempunyai potensi terhadap timbulnya gangguan atau kematian jika diberikan pada organisme hidup. Pengukuran toksisitas dapat ditentukan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat keamanan dan tingkat keberbahayaan suatu zat yang diuji atau dikenal dengan istilah uji toksisitas.
Salah satu metode untuk menguji bahan-bahan yang bersifat sitotoksik adalah dengan uji toksisitas terhadap larva udang dari Artemia salina L (Brine Shrimp Lethality Test). Alasan digunakannya larva udang adalah karena larva merupakan general bioassay sehingga semua zat dapat menembus masuk dinding sel larva tersebut. Larva udang sangat sensitif terhadap cemaran zat kimia yang terpapar di lingkungannya. Metode ini sering digunakan untuk pra skrining terhadap senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak perlu kondisi aseptis) dan dapat dipercaya.
Selain itu, metode BSLT juga digunakan untuk meneliti toksisitas ekstrak fungi, tumbuhan, logam berat, pestisida, dan substansi toksin dari cyanobacteria. Prinsip dari metode ini yaitu menarik hubungan antara konsentrasi larutan ekstrak terhadap respon kematian (tingkat mortalitas) larva udang Artemia salina L. Hasil yang diperoleh dihitung sebagai nilai LC50 (Lethal Concentration) ekstrak uji, yaitu jumlah dosis atau konsentrasi
ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian larva udang sejumlah 50 % setelah masa inkubasi selama 24 jam. Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk
pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan uji secara berkelompok, yaitu pada saat hewan uji dipaparkan suatu bahan kimia melalui udara maka hewan uji tersebut akan menghirupnya atau percobaan toksisitas dengan media air.
dan komponen yang terdapat dalam ekstrak. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika nilai LC50 < 1000 µg/mL. Nilai LC50 0 – 250
ppm bersifat sangat toksik, 250 – 500 ppm bersifat toksik, 500 – 750 ppm bersifat sedang, 750 – 1000 atau ≥ 1000 ppm dikatakan tidak bersifat toksik. Ekstrak yang digunakan dalam pengujian ini adalah ekstrak metanol daun dan kulit batang jambu biji (Psidium guajava) serta ekstrak etanol biji kopi (Coffea canephora).
Pengujian BSLT dilakukan dengan terlebih dahulu menyiapkan larva udang. Kemudian dibuat variasi konsentrasi ekstrak uji yaitu 100 ppm, 300 ppm, 500 ppm, 700 ppm, dan 900 ppm. Hal ini bertujuan untuk membandingkan toksisitas atau efek toksik yang ditimbulkan masing-masing konsentrasi tersebut terhadap larva udang. Selain itu, dibuat juga kontrol negatif terhadap semua konsentrasi ekstrak uji. Tujuan pembuatan kontrol negatif adalah untuk mengetahui pengaruh zat lain yang bukan ekstra uji terhadap larva udang. Setiap variasi konsentrasi dan kontrol dibuat replikasi sebanyak 5 kali agar didapat data statistik yang baik. Selanjutnya pada pengujian BSLT, larva udang yang telah berumur 48 jam dimasukkan ke dalam vial dengan jumlah sama banyak dan ditambahkan masing-masing larutan variasi konsentrasi ekstrak uji ke dalam tiap vial serta ditambahkan 1 tetes ragi sebagai sumber makanan dari larva udang. Kemudian disimpan di tempat yang memiliki penerangan cukup selama 24 jam jam dan diamati jumlah larva yang mati. Ragi mengandung vitamin B, nitrogen organik, dan senyawa karbon yang digunakan sebagai makanan untuk larva udang agar mampu bertahan hidup selama waktu inkubasi (1 x 24 jam), sehingga faktor kematiannya murni disebabkan oleh efek toksik dari ekstrak uji.
konsentrasi larutan ekstrak 100 ppm sejumlah 6 ekor, 300 ppm 14 ekor, 500 ppm 12 ekor, 700 ppm 8 ekor, dan pada 900 ppm 15 ekor. Selanjutnya jumlah larva udang (Artemia salina) yang mati pada ekstrak biji kopi, yaitu pada kontrol 5 ekor, pada konsentrasi larutan ekstrak 100 ppm sejumlah 9 ekor, 300 ppm 4 ekor, 500 ppm 16 ekor, 700 ppm 4 ekor, dan 900 ppm 20 ekor. Berdasarkan data dari kedua sampel ekstrak daun jambu biji dan biji kopi menunjukkan data kematian larva udang yang fluktuatif. Seharusnya, semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka kematian larva udang juga semakin banyak, namun pada sampel ekstrak daun jambu biji kematian larva udang yang paling banyak justru terdapat pada kontrol. Sama hal nya dengan ekstrak daun jambu biji, pada sampel ekstrak kulit batang jambu biji dan biji kopi juga terdapat kematian larva udang dalam kontrol meskipun dengan jumlah yang sedikit. Seharusnya kontrol negatif tidak menimbulkan kematian pada larva udang karena kontrol negatif hanya berisi air laut, larva udang, dan ragi sebagai pakan tanpa pemberian ekstrak uji.
Kemudian dilakukan penentuan LC50 dari masing-masing ekstrak uji.
Penentuan LC50 dapat dilakukan dengan 2 metode yaitu Reed and Muench dan
Analisa Probit. Perhitungan dengan Reed and Muench sebelumnya harus diketahui jumlah larva yang mati dan hidup, kemudian dihitung ukuran jarak, kenaikan dosis, nilai (g), nilai (y), kemudian dapat ditentukan nilai LC50 dari
masing-masing ekstrak. Berdasarkan metode ini, nilai LC50 pada ekstrak kulit
batang jambu biji adalah 739,60 ppm, pada ekstrak daun jambu biji 758,58 ppm, dan pada ekstrak biji kopi 796,16 ppm. Hal ini berarti ketoksikan ekstrak kulit batang jambu biji bersifat sedang dan ekstrak daun jambu biji serta biji kopi bersifat toksik.
Sedangkan perhitungan dengan metode analisa probit, diperlukan tabel probit dan rumus regresi linear untuk menentukan nilai a, b, dan r. kemudian dapat ditentukan nilai LC50. Adapun hasil perhitungan dengan metode ini
menunjukkan nilai LC50 pada ekstrak kulit batang jambu biji adalah 1230,26
ppm dan pada ekstrak biji kopi -1,265 x 10-14 ppm.
Perbedaan nilai LC50 yang didapat berdasarkan kedua metode tersebut
G. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Ekstrak kulit batang jambu biji bersifat sedang, dengan nilai LC50 yaitu
739,60 ppm.
