I.
I. JUDUL PERCOBAANJUDUL PERCOBAAN : Isolasi DNA Epithelial Mulut: Isolasi DNA Epithelial Mulut II.
II. TANGGAL PERCOBAANTANGGAL PERCOBAAN : : Kamis, Kamis, 2 2 November November 2017 2017 ; ; pukul pukul 09.30 09.30 WIBWIB III.
III. SELESAI PERCOBAANSELESAI PERCOBAAN : : Kamis, Kamis, 2 2 November November 2017 2017 ; ; pukul pukul 13.00 13.00 WIBWIB IV.
IV. TUJUANTUJUAN ::
Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur, dengan sampel DNA diambil dari Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur, dengan sampel DNA diambil dari sel ephitelial mulut
sel ephitelial mulut V.
V. DASAR DASAR TEORI TEORI ::
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59).
terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. DNA terdiri dari tiga macam DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. DNA terdiri dari tiga macam molekul, y
molekul, yaitu gula aitu gula deoksiribosa, gdeoksiribosa, gugus fosfat ugus fosfat dan bdan basa nitrogen. asa nitrogen. Gula pentosaGula pentosa memiliki 5 atom C, dan pada DNA atom C nomor 2 berikatan dengan atom H. Gugus memiliki 5 atom C, dan pada DNA atom C nomor 2 berikatan dengan atom H. Gugus fosfat pada DNA berikatan dengan atom C nomor 5 melalui ikatan fosfoester. Gugus fosfat pada DNA berikatan dengan atom C nomor 5 melalui ikatan fosfoester. Gugus fosfat tersebut y
fosfat tersebut yang menyebabang menyebabkan asam kan asam nukleat bermuatan nukleat bermuatan negatif. negatif. Basa nitrogenBasa nitrogen yang menyusun asam nukleat ada dua macam, yaitu basa purin yang terdiri dari yang menyusun asam nukleat ada dua macam, yaitu basa purin yang terdiri dari adenin dan guanin dan basa pirimidin yang terdiri dari timin dan sitosin. Ikatan adenin dan guanin dan basa pirimidin yang terdiri dari timin dan sitosin. Ikatan tersebut meng
tersebut menghasilkan molekul hasilkan molekul yang yang disebut disebut nukleosida. nukleosida. Nukleosida akan Nukleosida akan bergabungbergabung dengan fosfat dan membentuk molekul yang disebut nukleotida. Nukleotida adalah dengan fosfat dan membentuk molekul yang disebut nukleotida. Nukleotida adalah Satu komponen pembangun DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan Satu komponen pembangun DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa (Asris, 2010).
satu pasang basa (Asris, 2010).
Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai
Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang terpilin. Keduapolinukleotida yang terpilin. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin dengan rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin dengan timin sebanyak dua ikatan dan antara guanin dan sitosin sebanyak tiga ikatan. timin sebanyak dua ikatan dan antara guanin dan sitosin sebanyak tiga ikatan. Spesifisitas pasangan basa tersebut disebut sebagai komplementaritas Replikasi Spesifisitas pasangan basa tersebut disebut sebagai komplementaritas Replikasi merupakan proses pelipatgandaan DNA. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel merupakan proses pelipatgandaan DNA. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel akan membelah diri. Pada setiap sel, kecuali sel gamet, pembelahan diri harus disertai akan membelah diri. Pada setiap sel, kecuali sel gamet, pembelahan diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semua sel turunan memiliki informasi genetik yang dengan replikasi DNA supaya semua sel turunan memiliki informasi genetik yang sama. Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari sama. Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari
dua rantai dan rantai yang satu merupakan konjugat dari rantai pasangannya. Dengan dua rantai dan rantai yang satu merupakan konjugat dari rantai pasangannya. Dengan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan dapat dengan mudah dibentuk. Salah satu teori yang paling populer menyatakan dapat dengan mudah dibentuk. Salah satu teori yang paling populer menyatakan bahwa
bahwa pada pada masing-masing masing-masing DNA DNA baru baru yang yang diperoleh diperoleh pada pada akhir akhir proses proses replikasi,replikasi, satu rantai tunggal merupakan rantai DNA dari rantai DNA sebelumnya, sedangkan satu rantai tunggal merupakan rantai DNA dari rantai DNA sebelumnya, sedangkan rantai pasangannya merupakan rantai yang baru disintesis. Rantai tunggal yang rantai pasangannya merupakan rantai yang baru disintesis. Rantai tunggal yang diperoleh dari DNA sebelumnya tersebut bertindak sebagai cetakan untuk membuat diperoleh dari DNA sebelumnya tersebut bertindak sebagai cetakan untuk membuat rantai
rantai pasangannya pasangannya (Campbell, (Campbell, dkk., dkk., 2010).2010).
Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA polimerase
polimerase masuk masuk dan dan mengikat mengikat diri diri pada pada kedua kedua rantai rantai DNA DNA yang yang sudah sudah terbukaterbuka secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA polimerase
polimerase bergeser. bergeser. Hal Hal ini ini berlanjut berlanjut sampai sampai seluruh seluruh rantai rantai telah telah benar-benarbenar-benar terpisah.Sel eukariot memiliki DNA di dalam kromosom, yaitu di inti sel dan ada terpisah.Sel eukariot memiliki DNA di dalam kromosom, yaitu di inti sel dan ada beberapa sel eukariot
beberapa sel eukariot memiliki DNA di memiliki DNA di luar kromosom, yaitu DNA pada luar kromosom, yaitu DNA pada mitokondriamitokondria dan
dan kloroplas. kloroplas. DNA DNA nukleus nukleus berbentuk berbentuk linear linear dan dan berasosiasi sangat berasosiasi sangat erat derat denganengan protein
protein histon, histon, sedangkan sedangkan DNA DNA mitokondria mitokondria dan dan kloroplas kloroplas berbentuk berbentuk sirkular,sirkular, replikasinya berlangsung secara independen dan tidak bergantung pada replikasi replikasinya berlangsung secara independen dan tidak bergantung pada replikasi kromosom, serta tidak berasosiasi dengan protein histon. Organisasi gen mitokondria kromosom, serta tidak berasosiasi dengan protein histon. Organisasi gen mitokondria lebih mirip organisasi gen pada bakteri. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas lebih mirip organisasi gen pada bakteri. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua (Suryo, 2004)
kedua orang tua (Suryo, 2004)
DNA dari sel prokariot maupun sel eukariot dapat diperoleh dengan cara DNA dari sel prokariot maupun sel eukariot dapat diperoleh dengan cara mengisolasi DNA yang terdapat di dalam sel. Iso lasi DNA adalah teknik yang mengisolasi DNA yang terdapat di dalam sel. Iso lasi DNA adalah teknik yang dilakukan untuk memisahkan DNA dari zat yang lain di dalam sel. Fungsi dari dilakukan untuk memisahkan DNA dari zat yang lain di dalam sel. Fungsi dari pengisolasian
pengisolasian DNA DNA adalah adalah mendapatkan mendapatkan DNA DNA murni murni dari dari dalam dalam sel sel yang yang akanakan digunakan untuk penganalisisan genotip suatu organisme (Asris, 2010).
digunakan untuk penganalisisan genotip suatu organisme (Asris, 2010). Beberapa sifat penting DNA adalah :
Beberapa sifat penting DNA adalah : 1.
1. Mengabsorpsi sinar ultraviolet pada panjang gelombang 260 nmMengabsorpsi sinar ultraviolet pada panjang gelombang 260 nm 2.
2. Menunjukan roatsi optis yang kuatMenunjukan roatsi optis yang kuat 3.
3. Dalam larutan menunjukan viskositas yang tingi katena struktur heliksnya yangDalam larutan menunjukan viskositas yang tingi katena struktur heliksnya yang kokoh
4. Mengalami denaturasi akibat adanya pemanasan atau agitasi akibat pemecahan ikatan hidrogen, pendinginan memperbaki ikatan hidrogen antara pasangan- pasangan basa.
5. Ikatan hidrogen dapat dipecah dalam pH asam atau basa.
Struktur asam nukleat dapat diketahui lebih terinci lagi. Gugus hidroksi 3’ dari ribose terikat pada hidroksil 5’ dan ribose berikutnya melalui ikatan fosfodiester. Tentu saja basa heterosiklik dihubungkan dengan unit deoksiribosa oleh ikatan N-glikosida. Perlu dicatat bahwa pada DNA tidak ada lagi gugus hidroksil unit eoksiribosa yang tersisa. Pada setiap fosfat masih mempunyai satu proton bersifat asam yang biasanya mengion pada pH 7. Jika proton ada, zat tersebut adalah suatu asam, karena itulah bernama asam nukleat. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut:
Gambar 1. Struktur DNA
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).
Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyalinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut
dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).
Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang
dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA
merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara
mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen.
Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010).
Penambahan deterjen atau garam dapur dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).
Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :
1. Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan. 2. Pemecahan dinding sel.
3. Pemecahan membran sel.
4. Pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Dalam isolasi DNA, bahan yang digunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan, jaringan hewan, atau manusia, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. Struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar (Tohib, 2012).
1. Mendapatkan DNA murni yang akan digunakan dalam percobaan laboratorium tertentu.
2. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel
3. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern.
4. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. 5. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.
VI. ALAT DAN BAHAN :
Alat
–
alat :-
tabung ikrosentrifus 1 buah-
beaker glass 3 buah-
tabung reaksi 3 buah-
vortex 1 buah-
mikrosentrifus 1 buah-
pipet mohr 1 buah-
pipet tetes secukupnya -Bahan-Bahan :-
Aquades 4,5 mL-
Air mineral 4,5 mL-
Minuman isotonic 4,5 mL-
Buffer Tris-EDTA 3 mL-
NaCl 2,5 M 300 µL-
Etanol dingin 3 mLVII. ALUR PERCOBAAN 1. Pengumpulan Sel-sel
2. Pemecahan sel (lisis) dan pencernaan protein ±10 mL minuman isotonic, air
mineral, dan aquades
-
Digunakan untuk berkumurselama 1 menit
-
Hasil berkumur ditampungdalam beaker glass Larutan sel epitel
1,5 mL larutan sel epitel
-
Dimasukkan kedalam tabungmikrosentrifus
-
Disentrifuge dengan kecepatan 10.000rpm selama 1 menit
filtrat Residu
-
Ditambah larutan sel hingga 2 kali-
Ditambah 1 mL larutan bufferTris-EDTA
-
Divortex selama 1 menit sampaiendapan hancur Larutan epitel yang sudah di
3. Pengendapan DNA
Larutan epitel yang sudah divortex
-
Ditambahkan 100 µL NaCl-
Diaduk dengan cara membolak-balikkantabung
-
Dipindahkan semua isi tabung mikrosentrifuske tabung lain yang bersih dan kering
-
Ditambahkan 1 mL etanol dingin secarapelan-pelan
-
Dibiarkan selama 5 menitGumpalan putih seperti benang yang
VIII. HASIL PENGAMATAN
No Rancangan percobaan Hasil pengamatan Dugaan/reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
1 Pengumpulan Sel-Sel - Aquades :tidak
berwarna
- Air mineral: tidak berwarna - Isotonic: berwarna putih -Aquades setelah berkumur: tidak berwarna, muncul gelembung dan larutan bergel
-Air mineral setelah
berkumur: tidak berwarna, larutan bergel -Isotonic setelah berkumur: putih, larutan bergel - Larutan epitel aquades :tidak berwarna
DNA yang terisolasi akan menunjukkan gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang
Dalam percobaanini DNA yang dapat diisolasi berasal dari aquades, sedangkan air mineral dan minuman isotonic tidak menunjukkan adanya DNA.
- Larutan epitel air mineral: tidak berwarna - Larutan epitel
isotonic: berwarna putih
2 Pemecahan sel (lisis) dan pencernaan protein - Larutan epitel aquades :tidak berwarna - Larutan epitel air
mineral: tidak berwarna -Larutan epitel isotonic: berwarna putih Aquades -Disentrifus: muncul
endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna
-Diulang 2 kali:
endapan semakin banyak
-+ larutan buffer
Tris-EDTA: endapan larut sebagian
-Divortex selama 1
menit: endapan larut semua (larutan tak bewarna)
- Larutan epitel air mineral: tidak berwarna - Larutan epitel isotonic: berwarna putih
2 Pemecahan sel (lisis) dan pencernaan protein - Larutan epitel aquades :tidak berwarna - Larutan epitel air
mineral: tidak berwarna -Larutan epitel isotonic: berwarna putih Aquades -Disentrifus: muncul
endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna
-Diulang 2 kali:
endapan semakin banyak
-+ larutan buffer
Tris-EDTA: endapan larut sebagian
-Divortex selama 1
menit: endapan larut semua (larutan tak bewarna)
Air mineral:
-Disentrifus: muncul
endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna
-Diulang 2 kali:
endapan semakin banyak
-+ larutan buffer
Tris-EDTA: endapan larut sebagian
Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak bewarna)
Isotonik:
-Disentrifus: muncul
sedikit endapan putih didasar (residu)
Air mineral:
-Disentrifus: muncul
endapan putih didasar (residu), filtrate larutan tak berwarna
-Diulang 2 kali:
endapan semakin banyak
-+ larutan buffer
Tris-EDTA: endapan larut sebagian
Divortex selama 1 menit: endapan larut semua (larutan tak bewarna)
Isotonik:
-Disentrifus: muncul
sedikit endapan putih didasar (residu)
hampir tidak terlihat, filtrate larutan tak berwarna
-Diulang 2 kali:
sedikit endapan putih
-+ larutan buffer
Tris-EDTA: endapan larut sebagian
-Divortex selama 1
menit: endapan larut semua (larutan tak bewarna)
hampir tidak terlihat, filtrate larutan tak berwarna
-Diulang 2 kali:
sedikit endapan putih
-+ larutan buffer
Tris-EDTA: endapan larut sebagian
-Divortex selama 1
menit: endapan larut semua (larutan tak bewarna)
3 Pengendapan DNA -Larutan epitel
aquades yang sudah divortex: endapan larut
-Larutan epitel air
mineral yang sudah divortex: endapan larut
-Larutan epitel
isotonik yang sudah divortex: endapan larut
Aquades
-+ 100 µL NaCl:
larutan epitel tidak berwarna
-Diaduk: homogeny -+ etanol dingin 1 mL:
larutan epitel tidak berwarna -Didiamkan 5 menit: terdapat gumpalan putih seperti benangyang melayang-layang (DNA) Air mineral: -+ 100 µL NaCl:
larutan epitel tidak berwarna
-Diaduk: homogeny -+ etanol dingin 1 mL:
3 Pengendapan DNA -Larutan epitel
aquades yang sudah divortex: endapan larut
-Larutan epitel air
mineral yang sudah divortex: endapan larut
-Larutan epitel
isotonik yang sudah divortex: endapan larut
Aquades
-+ 100 µL NaCl:
larutan epitel tidak berwarna
-Diaduk: homogeny -+ etanol dingin 1 mL:
larutan epitel tidak berwarna -Didiamkan 5 menit: terdapat gumpalan putih seperti benangyang melayang-layang (DNA) Air mineral: -+ 100 µL NaCl:
larutan epitel tidak berwarna
-Diaduk: homogeny -+ etanol dingin 1 mL:
larutan epitel tidak berwarna
-Didiamkan 5 menit:
tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang (DNA)
Isotonik:
-+ 100 µL NaCl:
larutan epitel tidak berwarna
-Diaduk: homogeny -+ etanol dingin 1 mL:
larutan epitel tidak berwarna
-Didiamkan 5 menit:
tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang
larutan epitel tidak berwarna
-Didiamkan 5 menit:
tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang (DNA)
Isotonik:
-+ 100 µL NaCl:
larutan epitel tidak berwarna
-Diaduk: homogeny -+ etanol dingin 1 mL:
larutan epitel tidak berwarna
-Didiamkan 5 menit:
tidak muncul gumpalan putih seperti benang yang
melayang-layang (DNA)
melayang-layang (DNA)
IX. ANALISIS DATA DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerlukan waktu yang lama. DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecah-kan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mememecah-kanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/
IX. ANALISIS DATA DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerlukan waktu yang lama. DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecah-kan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mememecah-kanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan- bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur (Rachmat, 2012).
Praktikum isolasi DNA dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh aquades, air mineral, dan minuman isotonik terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Pelarut yang digunakan adalah aquades, air mineral, dan minuman isotonik. Prinsip dari percobaan ini adalah perusakan sel epitel secara kimiawi agar terjadi pemecahan sel, penambahan NaCl sehingga DNA dapat dikeluarkan dari dalam sel. NaCl yang digunakan pada percobaan ini sebesar 2,5 M.
Pertama, yang harus dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan untuk percobaan ini, terutama disiapkan akuades (tidak berwarna), air mineral (tidak berwarna), dan minuman isotonic (berwarna putih). Langkah pertama yaitu, masing-masing dari akuades, air mineral, minuman isotonic digunakan untuk berkumur selama 1 menit, kemudian hasil berkumurnya (larutan sel epitel) ditampung didalam beaker glass. Didapatkan hasil bahwa, aquades setelah
digunakan berkumur: larutan sel epitel tidak berwarna, muncul gelembung dan larutan berlendir; air mineral setelah digunakan berkumur: larutan sel epitel tidak berwarna, muncul gelembung dan larutan berlendir; minuman isotonik setelah digunakan berkumur: larutan sel epitel berwarna putih, muncul gelembung dan larutan berlendir. Untuk percobaan ini, yang akan digunakan sebagai sampel adalah bagian yang encer (bukan yang berlendir atau yang bergelembung).
Kedua, masing-masing larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic diambil 1,5 mL menggunakan pipet mohr dan dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifus, setelah itu disentrifus. Proses sentrifus digunakan untuk mengendapkan protein yang ada didalam larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic yang didalam protein tersebut terdapat DNA. Perlakuan diatas dilakukan sebanyak 3 kali untuk menambah endapan protein, endapan protein yang semakin banyak akan menunjukkan hasil positif terhadap kualitas DNA yang dihasilkan. Setelah disentrifus dihasilkan filtrat dan residu, dimana residu ini adalah protein yang mengandung DNA didalamnya, kemudian filtrate dan residu dipisahkan. Urutan banyaknya residu pada larutan sel epitel, akuades > isotonic > air mineral. Residu yang masih didalam tabung mikrosentrifus ditambahkan 1 mL larutan buffer EDTA yang tidak berwarna. Penambahan larutan buffer Tris-EDTA bertujuan untuk menjaga pH larutan, karena DNA dapat bertahan pada pH tertentu yaitu pada pH 5-12, pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5-12, larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi, sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA, fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA, larutan buffer Tris-EDTA yang digunakan adalah pH 8, selain itu ada pula senyawa EDTA (etilendiamintetraasetat) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan struktur selubung sel serta menghambat enzim yang dapat merusak DNA. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung mikrosentrifus yang berisi masing-masing residu (protein) larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic adalah endapan /residu yang dihasilkan berkurang (endapan sedikit larut) setelah ditambahkan larutan buffer Tris-EDTA. Kemudian ketiga tabung tersebut divortex selama 1 menit dengan kecepatan
1500 rpm. Vortex bertujuan untuk merusak dinding sel epitel, sehingga DNA dapat keluar dari sel epitel. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung mikrosentrifus yang berisi masing-masing residu (protein) larutan sel epitel akuades, air mineral, dan
minuman isotonic setelah divortex adalah endapan/residu larut semua (larutan tak berwarna).
Ketiga, Pada percobaan lainnya, pemecahan sel (lisis) dilakukan dengan penambahan detergen dan garam dapur untuk membantu proses pemecahan sel. sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Namun, pada percobaan kali ini digunakan NaCl 2,5 M, NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida seperti lemak, karbohidrat, protein, dll, NaCl juga berfugsi untuk memekatkan DNA, hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA, saat ion Na+ garam berikatan dengan gugus fosfat pada DNA, pada saat itulah DNA akan berkumpul, selain itu penambahan NaCl juga bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan dan untuk mengendapkan kotoran-kotorannya sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung mikrosentrifus (akuades, air mineral, dan minuman isotonik) yang berisi masing-masing larutan yang sudah divortex setelah ditambah 100 µL NaCl adalah larutan tak berwarna. Kemudian ketiga tabung tersebut diaduk dengan cara membolak-balikkan tabung mikrosentrifus. Selanjutnya larutan yang ada didalam tabung mikrosentrifus dipindahkan kedalam tabung reaksi yang bersih dan kering, kemudian ditambahkan 1 mL etanol dingin pada masing-masing tabung. Etanol berfungsi untuk untuk melakukan presipitasi sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya. Disini, yang digunakan adalah etanol dingin, karena apabila etanol yang digunakan dalam keadaan panas akan menyebabkan DNA mudah rusak, semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. Hasil yang didapatkan pada ketiga tabung (akuades, air mineral, dan minuman isotonik) setelah ditambah etanol dingin adalah larutan tak berwarna. Kemudian, didiamkan selama 5 menit. Langkah terakhir yaitu mengamati DNA yang terbentuk, didapatkan hasil bahwa hanya larutan sel epitel akuades yang menunjukkan adanya DNA yang dapat
dilihat dengan adanya gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang didalam larutan, sedangkan untuk larutan sel epitel air mineral dan minuman isotonic tidak menunjukkan adanya DNA, karena tidak menunjukkan adanya gumpalan putih seperti benang yang melayang-layang didalam larutan.
Pada dasarnya akuades, air mineral, dan minuman isotonic dapat mengikat DNA, namun yang paling banyak dapat mengikat DNA adalah minuman isotonic karena didalam minuman isotonic terkandung ion Na+, dimana ketika ion Na+ garam berikatan dengan gugus fosfat pada DNA, pada saat itulah DNA akan berkumpul, banyaknya DNA yang terkumpul ditandai dengan endapan yang banyak, banyaknya endapan dapat memperlihatkan DNA dengan jelas. Berdasarkan pengamatan organoleptik, endapan yang dihasilkan paling banyak terdapat ada larutan sel epitel aquades. Namun, berdasarkan teori seharusnya yang mempunyai endapan paling banyak adalah larutan sel epitel isotonic. Hal tersebut dikarenakan karena,
1. Kurang maksimalnya pada saat proses berkumur, sehingga menyebabkan tidak banyak protein yang ada didalam sel epitel tidak terikat oleh pelarut akudes, air mineral, dan minuman isotonic. DNA terdapat didalam protein, sehingga semakin sedikit protein yang terikat oleh pelarut akudes, air mineral, dan minuman isotonic maka akan sedikit atau tidak ada DNA yang teridentifikasi. 2. Keterbatasan mata praktikan dalam mengamati adanya DNA atau tidak pada
larutan sel epitel akuades, air mineral, dan minuman isotonic, karena DNA yang dihasilkan terlalu tipis (hanya satu helai).
3. Masih adanya ion ion Mg2+ dan enzim tertentu , dimana ion Mg2+ dan enzim tertentu dapat menyebabkan rusaknya struktur selubung sel dan merusak DNA.
4. Masih adanya senyawa polisakarida seperti lemak, karbohidrat, protein yang terkandung didalam larutan. Hal tersebut dikarenakan tidak ditambahkan larutan Proteinase K yang berfungsi untuk mencerna protein, sehingga DNA yang ada didalam protein belum lisis semuanya.
X. KESIMPULAN
Dalam percobaan ini DNA yang dapat diisolasi berasal dari aquades, sedangkan air mineral dan minuman isotonic tidak menunjukkan adanya DNA.
XI. DAFTAR PUSTAKA
Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 8 November 2017, pukul 04.00 WIB
Campbell, N. A., dan Jane B. R., 2010, Biologi Jilid I Edisi Kedelapan, Erlangga, Jakarta.
Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat . Erlangga. Jakarta.
Kirsman, 2010. Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl.com. Diakses pada tanggal 8 November 2017, pukul 04.00 WIB
Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada tanggal 8 November 2017, pukul 04.00 WIB
Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada tanggal 8 November 2017, pukul 04.00 WIB
Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler . Erlangga. Jakarta.
XII. JAWABAN PERTANYAAN
1. Gambarkan struktur DNA
2. Bagaimanakan cara menentukan jumlah DNA hasil isolasi tersebut menggu-nakan spektrofotometer!
Jawaban :
2. Cara menetukan DNA hasil isolasi menggunakan spektrofotometer:
-
Ditentukan panjang gelombangJumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 260 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260 / OD280 antara 1,8 -2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml.
DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang maksimal 260 nm, sementara kebanyakan protein menyerap kuat pada 180 nm. Namun, asam nukleat juga menyerap secara signifikan pada 280 nm (50%-55% dari absorbansi poada 260 nm), dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm (absrobansi bervariasi, tergantung pada protein). Dengan demikian, untuk mengukur secara akurat konsentrasi DNA, RNA dan protein dalam campuran yang kompleks bisa menjadi sulit. Namun, mengukur absorbansi pada 260 nm dan pada 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam nukleat: rasio A260/A280 di atas 1,8 untuk DNA atau 2,0 untuk RNA mengindikasikan sampel yang murni, nilai rasio yang rendah menunjukkan adanya protein atau kontaminan lainnya.
Untuk preparasi sampel Dipipet 5 µl sampel DNA hasil isolasi, ditambahkan aquadest secukupnya sehingga volume akhir 1 ml dicampur, kemudian pindahkan kedalam kuvet spektrofotometer, Blanko spektrofotometer dengan kuvet berisi 1 ml aquadest dibaca absorbansi sampel dengan spektorfotometer pada λ 260 nm dan dilakukan pembacaan yang ke-2 pada λ 280 nm.
