BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Senduduk Merah (Melastoma sanguineum Sims)
Tumbuhan senduduk merah (Melastoma sanguineum Sims) adalah tanaman yang berkhasiat, memiliki banyak manfaat.Penyebaran tanaman ini berada di daerah-daerah tropis.Dalam bidang farmakologi, potensi dari tumbuhan ini belum banyak dikembangkan manusia (Heim, 2015).
2.1.1 Sistematika Tumbuhan Senduduk Merah
Daun Senduduk Merah (Melastoma sanguineum Sims) Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledoneae
Ordo : Myrtales
Famili : Melastomataceae Genus : Melastoma
Spesies :Melastoma sanguineum Sims Nama Lokal : Senduduk Merah
(Herbarium Bogoriense, 2016)
2.1.2 Morfologi dan Manfaat Tumbuhan Senduduk Merah
Senduduk Merah banyak tumbuh di kawasan Asia tropis sampai subtropis (Holm, 1997).Setiap bagian dari tumbuhan ini memiliki beberapa manfaat, salah satunya adalah bagian daun yang dapat dimanfaatkan untuk mengobati penyakit seperti diare dan sariawan (Hidayat, 2013).
2.2Senyawa Organik Bahan Alam
Pada hakekatnya, kimia bahan alam merupakan pengetahuan yang telah dikenal sejak peradaban manusia tumbuh. Contohnya adalah pembuatan bahan makanan, pewarnaan benda, obat-obatan atau stimulan dan sebagainya (Sastrohamidjojo, 1996).
Pada pertengahan abad ke 18, pengetahuan ini berkembang sehingga dapat dipisahkan beberapa senyawa organik dari makhluk hidup serta hasil produksinya. Dalam keahliannya di bidang ini seorang ahli kimia Jerman, Karl Eilhelm Scheele (1742-1786) telah berhasil memisahkan beberapa senyawa sederhana. Biogenesis dari produk alami, meskipun pada mulanya berkaitan dengan kimia organik dan biokimia, menjadi berlainan karena memiliki tujuan yang berlainan. Kimia organik terutama mempelajari tentang struktur, sifat-sifat kimia dan fisika, serta cara sintesisnya, baik secara alami ataupun invitro dari zat-zat kimia tetapi cenderung untuk mengabaikan sifat-sifat khusus dari bahan alam, misalnya tentang cara pembentukan dan peran biologisnya. Biokimia, berusaha menjawab pertanyaan-pertanyaan yang paling banyak diajukan terutama tentang metabolism primer, dan mengabaikan proses-proses sekunder misalnya tentang pembentukan alkaloid, terpena dan lain-lain (Manitto, 1981).
Dengan meningkatnya jenis dan tipe senyawa yang ditemukan di berbagai bahan alam, berkembang juga sistem klasifikasi senyawa yang berasal dari bahan alam.
Ada 4 jenis klasifikasi yang digunakan (Nakanishi et al, 1974). 1. Klasifikasi Berdasarkan Struktur Kimia
Klasifikasi ini adalah klasifikasi formal berdasarkan kerangka struktur molekul, yaitu :
a. Senyawa lemak rantai terbuka atau alifatik, seperti asam-asam lemak, gula-gula dan hampir semua asam amino.
b. Senyawa sikloalifatik atau alisiklik, seperti terpenoid, steroid, dan beberapa alkaloid.
c. Senyawa benzenoid atau aromatik, seperti fenol dan kuinon.
2. Klasifikasi Berdasarkan Aktivitas Fisiologi
Pengembangan bahan alam yang didahului dengan pengamatan dan pengalaman empirik khasiat bahan alam tersebut untuk menyembuhkan penyakit tertentu. Oleh karena itu, salah satu cara penyelidikan bahan obat dari tumbuhan atau bahan alam lainnya adalah melalui ekstraksi dan penetapan khasiat farmakologi ekstrak yang diikuti dengan isolasi komponen murni.
3. Klasifikasi Berdasarkan Taksonomi
Klasifikasi ini didasarkan pada pengkajian morfologi komparatif atau taksonomi tumbuhan.Di dalam hewan dan sebagian mikroorganisme metabolit akhir biasanya diekskresikan ke luar tubuh, sedangkan di dalam tumbuhan, metabolit tersebut disimpan di dalam tubuh tumbuhan.Walaupun beberapa metabolit selama ini diketahui spesifik pada tumbuhan tertentu, tetapi sekarang telah diketahui tersebar di dalam berbagai tumbuhan, misalnya alkaloid dan isoprenoid telah dapat diisolasi dari berbagai genus, spesies, suku, atau ordo.Bahkan di dalam satu spesies terdapat sejumlah komponen yang memiliki struktur dasar yang berkaitan.
Pengetahuan tentang kandungan komponen tumbuhan berkembang dengan sangat pesat karena berkembangnya metode ekstraksi, isolasi dan karakterisasinya.Hal ini mendorong berkembangnya suatu bidang baru yang disebut kemotaksonomi (chemotaxonomy) atau sistematik kimia (chemosystematic) yang mengarah ke pembagian kandungan tumbuhan berdasarkan taksa tumbuhan. Dengan kata lain, isi kandungan tumbuhan dianggap sebagai tanda bagi evolusi dan klasifikasi tumbuhan.
4. Klasifikasi berdasarkan Biogenesis
Biogenesis dan biosintesis memiliki arti yang sama dan sering kali digunakan tanpa perbedaan. Namun, istilah biogenesis biasanya digunakan untuk reaksi pembentukan yang masih dalam taraf hipotesis, sedangkan jika reaksi tersebut telah dibuktikan secara eksperimen, digunakan istilah biosintesis.
Berbagai teori tentang pembentukan senyawa metabolit primer dan metabolit sekunder telah dikemukakan di dalam berbagai publikasi. Diawali dengan teori aturan isoprena pada tahun 1930, yang menyatakan bahwa semua terpenoid dibentuk dari unit isoprena 5-C, dilanjutkan dengan teori poliketometilena untuk senyawa fenolik, yang merupakan saran pertama bagi biosintesis asetogenin (poliketida).
Komponen pembangun utama untuk atom-atom karbon dan nitrogen di dalam semua senyawa bahan alam berasal dari 5 kelompok prekursor seperti terlihat pada Gambar 2.1 dibawah ini :
Asetil ko-A
Malonil ko-A unit 2C(Me-C O
) poliketida (asetogenin) a.
b. asam sikimat unit 6C-3C (6C-1C atau 6C-2C) senyawa fenolik c. asam mevalonat unit prenil isoprenoid
CH2=C-CH2-CH2
Me
d. unit asam amino seperti fenilanalina, tirosina, ornitina, lisina, dan triptofan alkaloid
e. 5-5'-deoksiadenilmetionina unit 1C
Gambar 2.1 Kelompok Prekursor pembangun Utama semua Senyawa BahanAlam (Wiryowidagdo, 2008).
2.3 Metabolit Sekunder
2.4Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida diturunkan dari unit C6-C3 (fenil propana) yang bersumber
dari asam sikimat (via fenilalanin) dari unit C6 yang diturunkan dari jalur
poliketida. Fragmen poliketida ini disusun dari tiga molekul malonil-KoA yang bergabung dengan unit C6-C3 sebagai KoA tioester untuk membentuk unit awal
triketida.Oleh karena itu, flavonoid yang berasal dari biosintesis gabungan yang terdiri atas unit-unit yang diturunkan dari asam sikimat dan jalur poliketida.Unit awal triketida mengalami siklisasi oleh enzim kalkon sintase untuk membentuk gugus kalkon pada flavonoid.Kemudian terjadi siklus untuk menghasilkan cincin piranon yang mengandung inti flavanon, yang dapat memiliki ikatan C2-C3
teroksidasi (tidak jenuh) untuk menghasilkan gugus flavon, atau dihidroksilasi pada posisi C3 cincin piranon untuk menghasilkan gugus flavanol pada flavonoid.
Sistem penomoran untuk turunan senyawa flavonoid menurut Robinson, dapat dilihat pada Gambar 2.2 berikut :
O
Gambar 2.2 Sistem penomoran pada Flavonoid (Robinson, 1995)
Senyawa flavonoid sangat bermanfaat dalam makanan karena berupa senyawa fenolik, senyawa ini yang bersifat antioksidan kuat. Banyak kondisi penyakit yang diketahui bertambah parah oleh adanya radikal bebas seperti superoksida dan hidroksil, dan flavonoid memiliki kemampuan untuk menghilangkan dan secara efektif menyapu spesies pengoksidasi yang merusak itu. Oleh karena itu, makanan yang kaya akan flavonoid dianggap penting untuk mengobati penyakit (Heinrich et al, 2009).
2.4.1Biosintesis Flavonoida
Senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linear yang terdiri dari tiga atom karbon.Kerangka ini dapat ditullis sebagai C6-C3-C6.
adalah senyawa 1,2 diarilpropana, sedang senyawa-senyawa neoflavonoida adalah senyawa 1,1 diarilpropana.
Senyawa flavonoida diturunkan dari unit C6-C3 (fenil propana) yang bersumber
dari asam sikimat (via fenilalanin) dan unit C6 yang diturunkan dari jalur
poliketida.Fragmen poliketida ini disusun dari tiga molekul malonil-KoA yang bergabung dengan unit C6-C3 (sebagai KoA tioester) untuk membentuk unit awal
triketida.Oleh karena itu, flavonoid yang berasal dari biosintesis gabungan terdiri atas unit-unit yang diturunkan dari asam sikimat dan jalur poliketida (Heinrich et al, 2009).
Semua varian flavonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama yang melalui alur sikimat dan alur asetat-malonat. Flavonoida yang pertama kali terbentuk pada biosintesis adalah khalkon dan semua bentuk diturunkan darinya melalui berbagai alur. Modifikasi flavonoida lebih lanjut mungkin terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan: penambahan (atau pengurangan) hidroksilasi, metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida, metilenasi gugus orto-dihidroksil, dimerisasi (pembentukan biflavonoida), dan glikosilasi gugus hidroksil (pembentukan flavonoida O-glikosida) atau inti flavonoida (pembentukan flavonoida C-glikosida).
Jalur Biosintesa hubungan antara jenis monomer flavonoida dari alur asetat-malonat dan alur sikimat dapat dilat pada Gambar 2.3 berikut :
2.4.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida (Harborne, 1987).
Dalam tumbuhan, flavonoid terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Keragaman struktur flavonoid ini disebabkan karena perbedaan tahap modifikasi dari struktur dasar flavonoid, antara lain :
1. Flavonoida O-glikosida
Pada flavonoida O-glikosida (Gambar 2.4) yang biasanya terdapat pada flavonoid, dimana satu gugus hidroksil flavonoida atau lebih terikat pada satu gula (lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikolisasi menyebabkan flavonoida menjadai kurang reatif dan lebih mudah larut dalam air, sifat ini memungkinkan penyimpanan flavonoid di dalam vakuola sel. Walaupun gugus hidroksil pada setiap posisi dalam inti flavonoid dapat di glikosilasi, kenyataannya hidroksil pada tempat tertentu mempunyai peluang yang lebih besar untuk terglikosilasi ketimbang tempat-tempat lain. Sudah diakui bahwa dalam tumbuhan O-glikosilasi dan metilasi terjadi sebagai salah satu tahap akhir pada biosintesis dan katalisasi oleh enzim yang sangat khas. Ada kalanya glikosida mengalami modifikasi lebih lanjut, yaitu asilasi. Glikosida terasilasi mempunyai satu gugus hidroksil gula yang berkaitan dengan asam asetat atau asam ferulat.
O O
OH
OH
O O ROH2C
HO HO
OH
2. Flavonoida C-glikosida
Gula terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon tahan asam jika disbanding dengan O-glikosida. Glikosida yang demikian disebut C-glikosida (Gambar 2.5). Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoida. Jenis glukosa yang pada umumnya dan galaktosa menjadi bagiannya juga ramnosa, xilosa, dan arabinosa. Jadi walaupun isoflavon, flavanon, dan flavonol kadang-kadang terdapat dalam bentuk C-glikosida, sebegitu jauh hanya flavon C-glikosida yang paling lazim ditemukan.
O O HO
OH
OH O
CH2OH HO
OH
HO
Gambar 2.5 Flavonoid-C-glikosida (Markham, 1988).
3. Flavonoida Sulfat
Senyawa ini mengandung satu ion sulfat atau lebih yang terikat pada hidroksi fenol atau gula. Senyawa ini sebenarnya bisulfat karena terdapat sebagai garam, yaitu flavon-O-SO3K. Banyak yang berupa glikosida bisulfat, bagian bisulfat
terikat pada hidroksil fenol yang mana saja masih bebas atau pada gula.
4. Biflavonoid
O
Gambar 2.6 Biflavonoid (Markham, 1988).
5. Aglikon flavonoid yang aktif-optik
Sejumlah aglikon flavonoid (Gambar 2.7) mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan demikian menunjukkan keaktifan optik (yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar). Yang termasuk dalam golongan flavonoida ini adalah flavanon, dihidroflavonol, katekin, rotenoid, dan beberapa biflavonoid. Putaran aglikon flavonoid alam berkaitan dengan stereokimia mutlak flavonoid.
O
Gambar 2.7 Aglikon flavonoid yang aktif-optik (Markham, 1988).
Robinson (1995), mengelompokkan flavonoid beradasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu :
1. Flavanon
Flavanon (Gambar 2.8) terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk, dua glikosida yang paling lazim adalahneringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
O O
2. Flavon
Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3-hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon (Gambar 2.9) dianggap sebagai induk dalam nomenklatur
kelompok senyawa flavonoida
Gambar 2.9 Flavon 3. Flavonol
Flavonol (Gambar 2.10)paling sering terdapat terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonoid yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiinflamasi.
O O
Gambar 2.10 Flavonol 4. Isoflavon
Merupakan isomer flavon, jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin (senyawa pelindung) yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan terhadap penyakit. Isoflavon (Gambar 2.11) sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi manapun.
O O
Gambar 2.11 Isoflavon
5. Flavanonol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar flavanonol (Gambar 2.12) ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.
O O
OH
Gambar 2.12 Flavanonol 6. Kalkon
Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat tua dengan sinar UV bila dikromatografi kertas.Aglikon khalkon dapat dibedakan dari glikosidanya karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air.Struktur kalkon dapat dilihat pada gambar 2.13.
O
Gambar 2.13 Kalkon
7. Auron
O
CH
O
Gambar 2.14 Auron 8. Katekin
Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu.Katekin (Gambar 2.15) dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai banyak kesamaan dengan semua senyawa tanpa warna.
O
OH
OH HO
OH OH
Gambar 2.15 Katekin
9. Antosianin
Antosianin adalah pigmen pada daun, bunga dan batang tanaman yang memiliki banyak warna biru, lembayung, violet, dan semua yang mendekati warna merah. Antosianin (Gambar 2.16) terdapat juga dalam bagian lain tumbuhan tinggi kecuali fungus. Antosianin selalu terdapat dalam bentuk glikosida. Faktor-faktor yang mempengaruhi warna dari antosianin yaitu pH, logam dalam bentuk kompleks dan juga tanin.
O
OH +
Gambar 2.16 Antosianin 10.Leukoantosianidin
O
OH HO
OH OH
HO OH
Gambar 2.17 Leukoantosianidin
2.4.3 Sifat Kelarutan Flavonoida
Senyawa flavonoid termasuk senyawa polar, karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil ataupun suatu gugus gula.Hal ini memungkinkan flavonoid dapat larut dalam pelarut polar seperti etanol (EtOH), metanol (MeOH), butanol, aseton, dimetilsulfoksida (DMSO), dimetilformamida (DMF), air dan lain-lain.Flavonoid yang berupa aglikon merupakan golongan polifenol yang memiliki sifat senyawa fenol yaitu bersifat agak asam, Keberadaan gugus gula yang terikat pada flavonoid (glikosida) cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah terlarut dalam air.Namun hal sebaliknya tidak berlaku pada aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
2.5 Skrining Fitokimia
Banyak reagen yang dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan dari flavonoid, meskipun beberapa juga akan bereaksi positif dengan senyawa polifenol. Reagen yang biasa digunakan adalah :
1. Shinoda Test, yaitu dengan menambahkan serbuk magnesium pada ekstrak sampel dan beberapa tetes HCl pekat, warna orange, pink, merah sampai ungu akan terjadi pada senyawa flavon, flavonol, turunan 2,3-dihidro dan xanton dan hanya flavanonol yang memberikan perubahan warna merah pekat sampai magenta, flavanon dan flavonol akan memberi warna merah muda yang lemah sampai magenta.
2. H2SO4(p), flavon dan flavonol akan memberikan perubahan larutan kuning
kebiru-biruan. Flavanon memberikan warna orange sampai merah (Cannell, 1998).
3. NaOH 10% , menghasilkan larutan biru violet
4. FeCl3 5%, menghasilkan warna kehijauan, warna biru, dan warna hitam-biru
(Robinson, 1995).
2.6Teknik Pemisahan
Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam satu golongan (Muldja, 1995).
2.6.1 Ekstraksi
Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling sederhana adalah ekstraksi dingin (dalam labu besar berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil gilingan diekstraksi pada suhu kamar secara berturut-turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi. Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai. Penggunaan pelarut dengan peningkatan kepolaran secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan alam berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya) dalam ektraksi. Ekstraksi dingin memungkinkan banyak senyawa terekstraksi, meskipun beberapa senyawa memiliki kelarutan terbatas dalam pelarut ekstraksi pada suhu kamar (Heinrich et al, 2009).
proses akhir pelarut akan berdifusi keluat dari sel bersama dengan metabolit (Sarker, 2007).
Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat, biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1996).
2.6.2 Partisi
Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak.Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya meningkat.
Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap:
1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan organik
2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich et al, 2009).
2.6.3 Hidrolisa
2.6.4 Kromatografi
Saat ini kromatografi adalah teknik pemisahan yang paling umum dan sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dimanfaatkan untuk analisis baik secara kualitatif dan kuantitatif atau bahkan analisis preparatif. Teknik kromatografi telah berkembang dan digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi komponen-komponen yang kompleks, baik organik maupun anorganik (Sudjadi, 2007).
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan yang pertama kali dipakai untuk memisahkan zat-zat warna tanaman.Pemisahan dengan teknik ini dijalankan dengan mengadakan manipulasi atas dasar perbedaan sifat-sifat fisik dari zat-zat yang menyusun suatu campuran (Adnan, 1997).
Semua teknik kromatografi pada dasarnya menggunakan dua fasa, yaitu fasa tetap dan fasa bergerak. Pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari kedua fasa tersebut. Kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat dari fasa tetap, jika berupa zat padat dikenal sebagai kromatografi serapan (absorption chromatography) dan jika berupa zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi (partition chromatography) (Sastrohamidjojo, 1985).
Proses Sorpsi
Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fasa gerak ke fasa diam, sedangkan proses sebaliknya pemindahan solut dari fasa diam ke fasa gerak disebut desorpsi. Keduanya terjadi secara terus-menerus selama pemisahan karena sistem kromatografi berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fasa yang sesuai dengan perbandingan distribusinya untuk menjaga keadaan yang setimbang. Beberapa mekanisme yang terlibat pada proses sorpsi yaitu adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi ukuran.
Adsorben
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaannya karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu 1050C, meskipun demikian reprodusibilitasnya sulit dicapai kecuali jika suhu dan kelembapan benar-benar dijaga secara hati-hati. Semakin polar solut maka akan semakin tertahan kuat ke dalam adsorben silika gel ini (Sudjadi, 2007).
2.6.4.1 Kromatografi Lapis Tipis
Dalam kromatografi lapis tipis, fase diamnya merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30µm. Semakin kecil ukuran partikel fase diam, maka semakin baik kinerja efisiensi dan resolusi kromatografi lapis tipis. Penjerap yang sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembangakan bergerak sepanjang fase diam akibat adanya pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) ataupun pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Sudjadi, 2007).
2.6.4.2Kromatografi Kolom
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca. Pelarut sebagai fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom. Pita senyawa pelarut bergerakmelalui kolom dengan laju berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom (Gritter, 1991).
2.6.5 Kristalisasi
Kristalisai adalah pengendapan kristal dari larutan yang terbuat dari bhan tertentu. Selama proses pembentukan kristal, molekul akan cenderung menjadi melekat kristal tumbuh terdiri dari jenis yang sama molekul karena cocok dalam kisi kristal untuk molekul struktur yang sama daripada molekul yang lain. Jika proses kristalisasi diperbolehkan untuk terjadi dalam mendekati kondisi kesetimbangan, preferensi molekul untuk deposit pada permukaan terdiri dari molekul seperti akan menyebabkan peningkatan dalam kemurnian bahan kristal. Sehingga proses rekristalisasi adalah salah satu metode yang paling penting tersedia bagi ahli kimia untuk pemurnian padatan (Pasto, 1992).
2.6.5.1 Rekristalisasi
Amorf yang diperoleh dari hasil isolasi dilarutkan kembali dengan EtOAc, diaduk hingga semua amorf larut sempurna.Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan – lahan hingga pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di dasar wadah.Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut (Jacobs, 1974).
2.7 Teknik Spektroskopi
Teknik analisis spektroskopi berasaskan antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan fenomena bermakna sebagai parameter analisis. Pada spektroskopi pembangkit sinyal adalah hasil antaraksi energi radiasi elektromagnet dengan elektron dalam atom/molekul analit.
Teknik analisis spektroskopi berasaskan antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan fenomena bermakna sebagai parameter analisis. Karena pada setiap teknik spektroskopi antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom/ molekul khas dan tidak semuanya sama, uraian teknik analisis didahului dengan mekanisme antaraksi tersebut, serta fenomena yang dipakai sebagai parameter analisisnya (Satiadarma , 1995).
2.7.1 Spektroskopi Ultraviolet (UV-Vis)
Spektrofotometer UV-Vis merupakan pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel.Spektrofotometer UV-Vis umumnya digunakan untuk menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap terkonjugasi, serta menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Dachriyanus, 2004).
Penyerapan sinar ultraviolet dan tampak oleh suatu molekul organik akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik pada molekul tersebut, dan karenanya sering dinamakan spektrometri elektronik. Panjang gelombang serapan merupakan ukuran perbedaan tingkatan-tingkatan energi transisi elektronik dari orbital tersebut.
Ciri spektrum khas spektrumialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum kalkon, auron, dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi. Ciri ini nisbi tak berubah bahkan juga bila pola oksigenasi berubah, sekalipun rentang maksimal serapan pada jenis flavonoid yang berlainan tumpang tindih sebagai keragaman pola oksigenasi.
Petunjuk mengenai rentang maksima utama yang diperkirakan untuk setiap jenis flavonoid yang disajikan pada tabel 2.1 (Markam,1988) dibawah :
Tabel 2.1 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan Flavonoida
No Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis Flavonoida
1 250-280 310-350 Flavon
2 250-280 330-360 Flavonol (3-OH tersubstitusi)
3 250-280 350-385 Flavonol (3-OH bebas)
4 245-274 310-330 bahu Isoflavon
5 275-295 300-330 bahu Flavanon dan dihidroflavonol
6 230-270
(kekuatan rendah)
340-390 Khalkon
7 230-270
(kekuatan rendah)
380-430 Auron
Perubahan penyulihan pada cincin A cenderung tercerminkan pada serapan pita II, sedangkan perubahan penyulihan pada cincin B dan C cenderung lebih jelas tercermin pada serapan pita I.
2.7.2Spektroskopi Inframerah(FT-IR)
Spektrofotometer inframerah umumnya digunakan untuk menentukan gugus fungsi senyawa organik dan mengetahui informasi struktur suatu senyawa organik dengan membandingkan daerah sidik jarinya.
Pengukuran spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya tengah (mid-infrared) yaitu pada panjang gelombang 2.5 – 50µm atau bilangan gelombang 4000 –
200 cm-1. Sehingga energi yang dihasilkan oleh radiasi ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Setiap jenis ikatan kimia dan gugus fungsi memiliki pita absorbsi inframerah yang khas dan spesifik.
Karakteristik frekuensi vibrasi IR dipengaruhi oleh perubahan yang sangat kecil pada molekul sehingga sulit untuk menentukan struktur yang hanya berdasarkan pada data IR saja. Spektrum IR berguna untuk mengidentifikasi suatu senyawa dengan membandingkannya dengan spektrum senyawa standar terutama pada daerah sidik jari. Secara praktikal, spektrum IR hanya dapat digunakan untuk menentukan gugus fungsi (Dachriyanus, 2004).
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul, antara lain:
1. Streching (vibrasi regang/ulur) : vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekan ikatan.
2. Bending (vibrasi lentur/tekuk) : vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang gelombang. Contohnya, ikatan O-H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm
-1
panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlainan ini disebut cara vibrasi fundamental (Supratman, 2010).
2.7.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Spektrometer resonansi magnetik inti (Nuclear Magnetic Resonance), yang disingkat sebagai NMR, merupakan instrumen yang sangat penting untuk memperoleh informasi senyawa kimia, juga dapat menyelesaikan dan memecahkan masalah atau informasi yang sebelumnya sulit untuk diperoleh.
NMR mempunyai peranan penting dalam ilmu kimia, disebabkan oleh dua faktor. Pertama, penerapan NMR yang terbaru dimana hasil peningkatan selama beberapa tahun terakhir. Kedua, spektrometer NMR merupakan instrumen yang tersedia di pasaran berkembang terus, dan memenuhi standar sensitivitas, fleksibilitas, efisiensi, kecanggihan komputasi, dan harga yang sesuai dipasaran (Jenie, 2014).
Pada tahap ini akan ditunjukkan jumlah atom hidrogen yang berhubungan dengan gugus tertentu (integrasi) dan bagaimana gugus tersebut terlindungi (shielded) atau tidak terlindungi. Ada perlindungan atau tidak terjadi akibat adanya gugus menarik elektron atau menarik elektron (Supratman, 2010).
Semua proton dalam molekul yang identik dalam lingkungan kimia akan memiliki pergerseran kimia yang sama. Dengan demikian, semua proton dari TMS atau semua proton dalam benzena, siklopentana, atau aseton memiliki nilai resonansi
