URUTAN NUKLEOTIDA DAERAH HVSI DNA
MITKONDRIA MANUSIA POLI-C
SKRIPSI
DEA PUSPITASARI
NIM : 10503041
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
URUTAN NUKLEOTIDA DAERAH HVSI DNA
MITKONDRIA MANUSIA POLI-C
(Nucleotide Sequence Of Poli-C Human Mitochondrial DNA
HVSI Region)
SKRIPSI
DEA PUSPITASARI
NIM : 10503041
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
Program Studi Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung
Menerangkan bahwa Skripsi yang disusun oleh:
Nama : Dea Puspitasari NIM : 10503041
telah disetujui sebagai persyaratan untuk mendapatkan gelar Sarjana Kimia
Bandung, September 2007
Pembimbing
Achmad Saifuddin Noer, M.Si., Ph.D NIP : 130 875 577
Abstrak
Mitokondria memiliki genomnya sendiri dan diwariskan melalui jalur ibu. Pada daerah D-loop DNA mitokondria (mtDNA) manusia, terdapat daerah Hypervariable Segment I (HVSI) yang memiliki tingkat polimorfisme tinggi. Fenomena heteroplasmi mtDNA manusia telah banyak dipublikasi dan diduga menyebabkan penentuan urutan daerah HVSI yang mengandung poli sitosin (poli-C) melalui metode direct sequencing tidak bisa lengkap karena tidak terbacanya urutan setelah rangkaian poli-C tersebut. Penelitian terdahulu telah berhasil menjawab masalah ini melalui proses kloning dan didapatkan hasil sekuensing lengkap daerah HVSI yang memiliki urutan poli-C. Heteroplasmi pada sampel terbukti berupa variasi panjang rangkaian poli-C dari beberapa klon yang telah disekuensing. Adapun penelitian ini bertujuan untuk membuktikan hipotesis bahwa heteroplasmi sebagai penyebab tidak terbacanya urutan nukleotida poli-C di atas melalui sekuensing campuran templat DNA klon yang mempunyai urutan poli-C berbeda dengan komposisi yang bervariasi. Penelitian ini dilakukan dengan penyiapan templat DNA dari koloni tunggal bakteri dengan bantuan metode lisis, perbanyakan dengan metode PCR, pencampuran klon DNA yang memiliki variasi panjang poli-C, sekuensing dengan metode Dideoksi Sanger dan analisis urutan nukleotida dengan program SeqmanTM versi 4.0.0. Hasil PCR yang dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa menunjukkan satu pita DNA berukuran 0,4 kb dan melalui sekuensing diperoleh elektroforegram serta data urutan nukleotida HVSI mtDNA masing klon dan hasil campuran klon. Urutan nukleotida HVSI mtDNA untuk masing-masing klon dan hasil campuran klon yang telah dianalisis terhadap Cambridge Reference Sequence (CRS) menunjukkan indikasi yang kuat bahwa heteroplasmi menjadi penyebab ketidakberhasilan direct sequencing sampel yang memiliki urutan poli-C.
Abstract
Mitochondria has its own genome that is maternaly inherited. There is a region of Hypervariable Segment I (HVSI) that has high polymorphism rate on the D-loop area of human mitochondrial DNA (mtDNA). There are a lot of publication concerning heteroplasmy phenomena of human mtDNA and its suggested as the cause of the incompletion of sequence determination HVSI region which has poli-cytosin (poli-C) stretch through direct sequencing shown by the unread sequences after those stretch. The previous experiment has solved this problem by using cloning method. Heteroplasmy on sample proved as length variation of poli-C from several sequenced clones. The objective of this research is to prove a hypothetic that heteroplasmy of mtDNA as the cause of the problem through sequencing of DNA template clones mixture that have different poli-C by variable composition. This research started by preparation DNA template of bacterial single colony by lysis method, then was amplified using Polymerase Chain Reaction (PCR) method, mixed DNA clones that have length variation of poli-C, followed by sequencing of the amplified mtDNA using Dideoxy Sanger method along with nucleotides analysis using SeqmanTM version 4.0.0. Analysis of PCR product showed 0.4 kb band on the agarose gel electrophoresis. Samples electrophoregraph along with HVSI nucleotide sequence for each clones and clones mixture was obtain through sequencing process. Analysis of HVSI nucleotide sequences for each clones and clones mixture to Cambridge Reference Sequence (CRS) shown significant indication that heteroplasmy caused unsuccessfully of direct sequencing the samples that have poli-C stretch.
“Simplex veri sigillum”
(Kesederhanaan Menandakan Kebijaksanaan)
Ya Allah, jadikanlah aku seorang manusia yang mampu meraih hari
depan
Tapi tak melupakan masa lalunya
Dan setelah segala sesuatu menjadi milikku
Semoga aku senantiasa dilengkapi hati yang ringan
Untuk bergembira serta selalu bersungguh-sungguh
Namun jangan sekali-kali berlebihan
Berikanlah kepadaku kesederhanaan dan kerendahan hati
Pikiran cerah dan terbuka bagi sumber kearifan
Dan kelembutan dari kekuatan yang sebenarnya
Sehingga aku dapat berkata
”Hidupku tidaklah sia-sia”
Ucapan Terima Kasih
Segala puji syukur penulis ucapkan kepada Allah Yang Maha Kuasa karena berkat rahmat, hidayah, dan ridho-Nya lah penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang secara langsung maupun tidak langsung telah membantu penulis dalam menyelesaikan tugas akhir ini, terutama kepada:
1. Bapak Achmad Saifuddin Noer Ph. D. selaku dosen pembimbing atas bimbingan, kesabaran, dorongan dan kepercayaannya kepada penulis dalam menyelesaikan tugas akhir ini.
2. Bu Ati, atas bantuan dan dukungan yang telah diberikan selama penelitian. Mohon maaf apabila sering merepotkan.
3. Orang tua penulis (papah dan mamah), atas doa, cinta dan dukungan terbesar yang telah diberikan sehingga penulis mendapatkan ketenangan dalam menyusun skripsi ini. Terima kasih juga atas pengertiannya karena penulis sering pulang malam untuk menyelesaikan penelitian.
4. Kakak penulis, Citra Muraya dan Aldo Helmy, yang telah memberikan kehangatan di tengah keluarga. Terima kasih atas dukungan kepada adikmu ini.
5. Faika Dwiyanti dan Helly, peneliti terdahulu mengenai topik fenomena heteroplasmi ini, yang telah begitu banyak membantu dalam memberikan petunjuk dan saran kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian.
6. Teman-teman satu laboratorium biokimia yang telah meramaikan lab dan bersama-sama mengejar deadline, Anggi, Dian, Syifa, Teh Indira, Teh Dwita, ayo semangat kawan!! Teman-teman satu bimbingan, Mira, Bambang, Iman, Teh Puti, Teh Ira, Karina, yang sudah terlebih dahulu meninggalkan ITB dan yang akan segera menyusul Kang Anton, Pak Rafi, Pak Ari, dan Bu Mastura atas bantuan dan dukungannya dalam penyelesaian tugas akhir ini. Terutama kepada Mira dan Bambang, thank you for the happiness we have share together, you guys are my best friends ever!!
7. Teman-teman kimia angkatan 2003 atas dukungan, semangat, dan suka duka yang telah dijalani bersama selama empat tahun terakhir ini. Terutama kepada Mpeth, Rini, Ferra, Novita, Nyeu-nyeu, Minda, Mita, Yoga, Andri, Naldo, Budi, Arman, Amran, dan lain-lain. Mohon maaf ya karena temanmu ini jarang ikut kegiatan
angkatan. Terima kasih juga kepada beberapa teman yang sering direpotkan karena telah sukarela mengantar penulis pulang ke rumah yang nun jauh disana.
8. Teman-teman AMISCA angkatan 2001, 2002, 2003, dan 2004 yang telah bekerja sama dan telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk belajar berorganisasi.
9. Rerencangan ti Lingkung Seni Sunda ITB, yang telah memberikan banyak pelajaran dan pengalaman sehingga penulis lebih mencintai budaya sunda. Terutama kepada LSS 2003, Rofie, Iis, Anggun, Ratih, Kuneng, Ainun, Intan, Poets, Heri, Abin, Revi, Luki, Aji, Iqbal, Wildan yang senantiasa mendukung penulis dan menjadi pendengar setia di saat penulis ingin mencurahkan isi hati (kapan 2003 main bareng teh?).
10. Dosen-dosen kimia ITB atas ilmu, dukungan, dan perhatian yang telah diberikan kepada penulis. Terutama kepada Bapak Aminuddin Sulaeman selaku dosen wali penulis selama tiga tahun ini.
11. Rekan-rekan S3 yang bersama-sama penulis bekerja di Laboratorium Penelitian Biokimia ITB, Bu Prima, Bu Lulus, Bu Hira, Bu Heni dan Pak Savante.
12. Segenap karyawan Tata Usaha Program Studi Kimia, Pak Suwandi, Ibu Soni dan Ibu Tini yang selalu direpotkan penulis, Bapak-bapak dan Ibu-ibu petugas di Laboratorium Biokimia ( Pak Edi, Pak Dadan, Pak Yayat, Bu Eshar), Kimia Dasar, Kimia Analitik, Kimia Fisik, Kimia Organik, Kimia Anorganik.
13. Alm. kakek dan nenek, semua ua, bibi, dan paman penulis atas segala doa, nasehat, dan kasih sayangnya terhadap penulis. Juga kepadasaudara sepupu penulis, Indi, Mita, dan Mayang yang telah menjadi saudara sekaligus sahabat terdekat penulis (Mit, jadi wisuda bareng kan?).
14. Piki Tresna Hidayat, terima kasih atas perhatian dan tawaran bantuannya. Maaf ya sering membingungkanmu, pasti ada makna dari semua yang telah terjadi.
15. Adik-adik baruku dari SMA Darul Hikam, Sani, Rani, dan Myrna, terima kasih atas semangatnya dan menjadikan tujuh hari kita bersama terasa lebih berwarna.
16. Teman-teman penulis selama di SD, SMP dan SMA yang sudah lama tidak bertemu. Terutama kepada Pane (maaf ya selalu membuatmu menunggu), Hayuning, Detri, Nidya, dan yang tidak bisa disebutkan satu persatu. Terima kasih banyak. I miss you all, keep in touch ya!!
17. Teman-teman LSS, KPA, dan MGG yang menjadi peserta Cultural Journey ke Malaysia, terima kasih atas unforgetable momentnya, that was a great show guys. Teman-teman dari Perhimpunan Pelajar Indonesia di Malaysia yang telah menyambut dan memfasilitasi selama disana, terima kasih atas jalan-jalannya.
18. For someone out there, biarkan takdir yang mempertemukan kita.
19. And last but not least, terima kasih kepada sumber dari segala penghidupan ini dan hanya kepadaMu lah kami akan kembali. Terima kasih atas segala energi dan pikiran yang diberikan dan karenanya penulis dapat berkarya. Semoga semua ini tidak menjadi suatu kesia-siaan.
Bandung, September 2007
Daftar Isi
ABSTRACT ... ii
ABSTRAK ... iii
UCAPAN TERIMA KASIH ... vi
DAFTAR ISI ... ix
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiii
DAFTAR SINGKATAN ... xiv
1 PENDAHULUAN ... 1 2 TINJAUAN PUSTAKA ... 3 2.1 Mitokondria ... 3 2.1.1 Struktur mitokondria ... 3 2.1.2 Fungsi mitokondria ... 5 2.2 DNA Mitokondria ... 6
2.2.1 Sifat-sifat dan keunikan DNA mitokondria ... 7
2.3 Gen Heteroplasmi ... 8
2.4 Teknologi PCR ... 12
2.5 Rujukan Analisis mtDNA ... 15
2.5.1 Cambridge reference sequence ... 15
2.5.2 Mitomap ... 16
3 METODOLOGI PENELITIAN ... 18
3.1 Peralatan dan Bahan ... 18
3.1.1 Peralatan ... 18
3.1.2 Bahan ... 19
3.2 Screening Klon Rekombinan ... 20
3.3 Penyiapan Templat DNA ... 20
3.4 Amplifikasi DNA ... 20
3.5 Analisis Hasil PCR ... 21
3.6 Pencampuran Klon DNA ... 21
3.7 Penentuan Urutan Nukleotida ... 21
4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 23
4.1 Screening Klon Rekombinan ... 23
4.2 Karakterisasi Sampel ... 25
4.3 Penyiapan Templat Sampel ... 25
4.4 Fragmen 0,4 kb Hasil Amplifikasi PCR ... 26
4.5 Hasil Sekuensing Daerah HVSI Sampel ... 29
4.6 Analisis Urutan Nukleotida Daerah HVSI Sampel ... 31
5 KESIMPULAN ... 37
DAFTAR PUSTAKA ... 38
LAMPIRAN ... 42
Daftar Gambar
Gambar 2.1 Struktur mitokondria ... 4
Gambar 2.2 Proses replikasi mitokondria ... 5
Gambar 2.3 DNA mitokondria (mtDNA) manusia ... 6
Gambar 2.4 Pola pewarisan DNA mitokondria ... 7
Gambar 2.5 Ilustrasi heteroplasmi ... 8
Gambar 2.6 Jenis-jenis heteroplasmi ... 9
Gambar 2.7 Penentuan urutan daerah HVSI mtDNA sampel XXAM melalui direct sequencing ... 10
Gambar 2.8 Penentuan urutan daerah HVSI mtDNA sampel XXAM melalui sekuensing setelah kloning ... 10
Gambar 2.9 Elektroforegram lengkap hasil sekuensing daerah HVSI mtDNA sampel GMR ... 11
Gambar 2.10 Komponen-komponen dasar PCR ... 13
Gambar 2.11 Skema PCR ... 14
Gambar 2.12 Urutan nukleotida cambridge reference sequence daerah HVSI ... 16
Gambar 2.13 Tampilan mitomap untuk mutasi pada daerah HVSI ... 17
Gambar 4.1 Vektor pGEM-T ... 23
Gambar 4.2 Screening klon rekombinan ... 24
Gambar 4.3 Foto elektroforesis gel agarosa hasil reaksi PCR ... 29
Gambar 4.4 Elektroforegram hasil sekuensingsampel klon G18 ... 30
Gambar 4.5 Contoh urutan nukleotida lengkap hasil sekuensing fragmen 0,4 kb mtDNA Manusia ... 31
Gambar 4.6 Contoh analisis perbandingan urutan fragmen 0,4 kb mtDNA manusia terhadap CRS ... 32
Gambar 4.7 Tampilan program seqman untuk analisis sampel GMR ... 33
Gambar 4.8 Contoh urutan nukleotida campuran klon DNA ... 34
Gambar 4.9 Tampilan program seqman untuk analisis sampel G1, G2, G3, G10, dan G18 ... 35
Daftar Lampiran
Lampiran A Elektroforegram Sampel ... 42 Lampiran B Urutan Nukleotida Sampel ... 47 Lampiran C Perbandingan Rangkaian Poli-C Sampel ... 48
Daftar Tabel
Tabel 2.1 Perbandingan urutan sampel GMR ... 12
Tabel 2.2 Perbandingan urutan sampel XXAM ... 12
Tabel 3.1 Urutan nukleotida primer M-1 dan M-2 ... 19
Tabel 4.1 Karakterisasi sampel ... 25
Tabel 4.2 Hubungan antara jumlah molekul target dengan jumlah siklus PCR ... 26
Tabel 4.3 Perbandingan urutan sampel GMR terhadap CRS dan terhadap satu sama lain ... 33
Daftar Singkatan
A : Adenine
ATP : Adenosine Triphosphate
C : Cytosine
CRS : Cambridge Reference Sequence
dATP : Deoxyadenosine triphosphate
dCTP : Deoxycytidine triphosphate
ddH2O : akua bidestilasi
dGTP : Deoxyguanosine triphosphate
DNA : Deoxyribose Nucleic Acid
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
dTTP : Deoxythymidine triphosphate
EDTA : Etilendiamintetraasetat EtBr : Etidium Bromida
G : Guanine
H : Heavy
HVSI : Hypervariable Segment I
kb : kilo basa
L : Light
mtDNA : mitochondrial DNA
pb : pasang basa
PCR : Polymerase Chain Reaction
RNA : Riboxynucleic Acid
rRNA : RNA ribosom rpm : rotasi per menit
T : Thymine
TAE : Tris Asetat EDTA tRNA : RNA transfer
