falciparum
Effect of ethanolic extract of clove (Eugenia caryophylata Thunb) as anti-malaria
activity on Plasmodium falciparum
Faizal Hermanto*, Maria Immaculata Iwo**, Puji BS Asih***
*Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA Universitas Jenderal Achmad Yani-Cimahi **Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung
***Lembaga Biologi Molekular Eijkman
ABSTRAK
Malaria masih merupakan salah satu masalah kesehatan utama di Indonesia. Pengobatan malaria saat ini menggunakan kombinasi artemisinin dengan antimalaria lain (Artemisinin Based Combination Therapy). Masalah utama penggunaan artemisinin adalah radikal bebas yang dihasilkan, yang tidak hanya toksik pada
P. falciparum tetapi juga toksik terhadap inang. Untuk mengatasi dampak radikal bebas diperlukan suatu antioksidan, seperti yang dapat diperoleh dari bunga cengkeh (Eugenia caryophylata Thunb). Penelitian ini bertujuan menguji efek ekstrak etanol bunga cengkeh (EEBC) sebagai antioksidan dalam terapi dengan artemisinin. Komponen aktif dalam bunga cengkeh diekstraksi dengan cara refluk menggunakan etanol 96% (v/v). Dalam penelitian ini P. falciparum galur 3D7 dikultur dalam Medium RPMI 1640 yang mengandung sel darah merah, dapar HEPES, serum AB dan NaHCO3 sesuai teknik Trager dan Jensen. Hasil menunjukan pada pemeriksaan status oksidan, kadar MDA pada kultur P. falciparum yang diinkubasi dengan kombinasi EEBC dan artemisinin menurun (1,778±0,07 nM/ml) secara bermakna (p<0,05) dibandingkan terhadap kontrol tanpa EEBC (2,026±0,47 nM/ml). Hasil sebaliknya, kadar GSH pada kultur yang sama meningkat (1,1318±0,07 µg/ ml) secara bermakna (p<0,05) dibandingkan terhadap kontrol tanpa EEBC (0,2496±0,01 µg/ml). Berdasarkan hasil penelitian ini, ekstrak etanol bunga cengkeh dapat meredam radikal bebas yang terbentuk akibat kerja artemisinin tetapi tidak mempengaruhi aktivitas antimalaria falciparum artemisinin.
Kata kunci : Eugenia caryophylata Thunb, Plasmodium falciparum, artemisinin, GSH, MDA
ABSTRACT
use of artemisininbecause it is generating free radicals, which are not only toxic to P. falciparum but also toxic to the host. To minimize the effects of free radicals is by takes an antioxidant, that can be derived from clove (Eugenia caryophylata Thunb). This study aims to examine the effects of the ethanol extract of clove (EEBC) as
antioxidants in artemisinin treatment. Active component in clove was extracted by reflux using ethanol 96%
(v/v). In this study, P. falciparum strain 3D7 was cultured in RPMI 1640 medium containing red blood cells, HEPES buffer, serum AB and NaHCO3 withTrager and Jensen techniques. The results of the examination on oxidant status showed that levels of MDA in the culture of P. falciparum were incubated with combination ofartemisinin and
EEBC were significantly decreased (1.778 ± 0.07 nM / ml) ( p < 0.05 ) compared to controls without EEBC (2.026 ± 0.47 nM / mL). In the other side, GSH levels were significantly increased in the same culture (1.1318 ± 0.07 mg/ ml) (p < 0.05) compared to controls without EEBC (0.2496 ± 0.01 mg/mL). It was concluded that ethanol extract
of clove can reduce free radicals whis are formed as a result of the artemisinin work but did not affect the activity of artemisinin as antimalarial.
Keywords: Eugenia caryophylata Thunb, Plasmodium falciparum, artemisinin, GSH, MDA
PENDAHULUAN
Malaria masih merupakan masalah kesehatan utama di dunia baik di negara-negara berkembang maupun negara maju. Di Indonesia pada tahun 2010 terdapat 544.470 kasus malaria, sedangkan pada tahun 2009 terdapat 1.100.000 kasus malaria klinis, dan pada tahun 2010 meningkat menjadi 1.800.000 kasus malaria klinis (WHO, 2010).
Upaya pemberantasan panyakit malaria mengalami hambatan karena berkembangnya resistensi Plasmodium falciparum terhadap obat-obat antimalaria yang ada saat ini seperti klorokuin, amodiakuin, sulfadoxin-pirimetamin, dan kinin. Pada tahun 1972 peneliti Cina berhasil mengisolasi artemisinin atau qinghaosu
yang berasal dari tanaman Artemisian annua L. yang merupakan tanaman tradisional cina yang digunakan sebagai penurun demam dan secara klinis terbukti sangat berkhasiat terhadap P.
falciparum termasuk P. falciparum yang resisten
terhadap obat antimalaria konvensional (Li et al., 1994).
Artemisinin merupakan seskuiterpen trioksan lakton yang mengandung jembatan peroksida yang sangat penting untuk aktivitas antimalarial. Salah satu target kerja artemisinin adalah vakuola pencernaan parasit, dimana hemoglobin yang merupakan sumber nutrisi parasit akan dicerna dan mengasilkan heme. Heme dan besi (Fe2+)
(MDA). Malondialdehid merupakan produk hasil peroksidasi lipid yang merupakan indikator terjadinya stres oksidatif dan dapat diukur kadarnya secara eksperimental.
Oleh karena radikal bebas yang dihasilkan oleh artemisinin tidak hanya merusak parasit tetapi juga merusak sel inang, maka dibutuhkan suplemen antioksidan. Salah satu sumber antioksidan alam adalah bunga cengkeh yang pada beberapa penelitian menunjukan aktivitas antioksidannya lebih baik dari rempah-rempah lainnya seperti rosemary, sage, oregano, pala, jahe dan hampir sama kuat dengan antioksidan sintetis butil hidroksianisol dan butil hidroksi toluene (Lee and Shibamoto, 2001; Gulcin et al., 2004; Nasar et al., 2007; Phoupuritham et al., 2007).
Pengaruh dari ekstrak etanol bunga cengkeh terhadap artemisinin ditentukan dengan penentuan status oksidan dan antioksidan dalam kultur ditentukan melalui penetapan kadar MDA dan GSH.
METODE PENELITIAN Bahan
Kultur P. falciparum galur 3D7 diperoleh dari Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jakarta. Sebagai pelarut untuk ekstraksi bunga cengkeh digunakan etanol sedangkan bahan kimia yang digunakan untuk identifikasi kandungan senyawa aktif ekstrak cengkeh ialah natrium hidroksida, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, serbuk magnesium dan seng, asam klorida, pereaksi Molisch, pereaksi Lieberermann-Burcard, kalium hidroksida.
Bahan yang digunakan untuk kultur P.
falciparum ialah air suling, aquabidest, natrium
klorida, sorbitol, natrium bikarbonat, dapar HEPES, medium RPMI 1640 (Gibco), gentamisin sulfat (Sigma culture grade), serum manusia, eritrosit manusia, larutan dapar fosfat (pH 7,4), artemisinin (Sigma), minyak imersi, pewarna Giemsa, metanol, lilin.
Bahan yang digunakan untuk pengujian kadar malondialdehid (MDA) dan glutation (GSH) ialah asam 2-tiobarbiturat (TBA) 0,67%, Larutan TCA (trichloro acetic acid) 20% dan 5%, MDA standar (1,1,3,3 tetraethoxypropane), reagen DTNB (ditiobis nitro benzoic acid) 39,6 mg dalam 10 mL dapar fosfat 0,1 M pH 7, larutan standar glutation (GSH) 2 mg/ml dalam dapar fosfat pH 8.
Alat
Alat reflux, tabung Eppendorf, pipet pastur, pipet mikro, injeksi spuit, kaca objek, filter milipor 0,22 µl, tabung sentrifuga 15 ml, cawan petri Ø 6 cm, culture flask, botol medium, Erlenmeyer, lempeng sumur mikro 6x4, candle jar, mikroskop binokuler, lampu spirtus, lampu ultraviolet, incubator, autoklav, oven, vortex, sentrifuga, spektofotometer sinar tampak (Shimadzu), water bath.
Cara Kerja
Pembuatan ekstrak
Bunga cengkeh dikeringkan kemudiaan digiling dan diekstraksi dengan alat refluks menggunakan pelarut etanol 96%. Ekstrak etanol yang diperoleh dipekatkan sampai diperoleh ekstrak kental.
Pengujian pengaruh ekstrak etanol terhadap artemisinin
menggunakan sorbitol sehingga diperoleh parasit dengan stadium cincin. Uji dilakukan dua kali replikasi memakai lempeng sumur mikro 24 lubang. Setelah diinkubasi selama 48 jam, supernatan kultur ditentukan status oksidannya dengan penetapan kadar malondialdehid (MDA) dan glutation (GSH) dalam kultur P. falciparum
tunggal dan kultur P. falciparum yang diinkubasi dengan kombinasi EEBC dan artemisinin secara spektrofotometri.
Penentuan kadar malondialdehid (MDA)
Sebanyak 1 ml supernatan kultur dicampur dengan 1 ml TCA 20% dan 2 ml TBA 0,67%. Campuran tersebut dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit, setelah dingin supernatan disentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm lalu ditentukan serapannya pada panjang gelombang 532 nm.
Penentuan kadar glutation (GSH)
Sebanyak 0,25 ml supernatan ditambah dengan 8,9 ml dapar fosfat pH 8,0 kemudian dicampur dengan 1 ml TCA 5%. Larutan dikocok sampai homogen lalu disentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm selama 5 menit. Campuran larutan tersebut diambil sebanyak 4 ml dan ditambah dengan 0,05 ml DTNB dan inkubasi selama 1 jam. Setalah inkubasi, campuran larutan ditentukan serapannya pada panjang gelombang 412 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Bunga cengkeh kering yang digunakan berasal dari Kebun Tanaman Obat Manoko, Lembang. Hasil determinasi identitas botani yang dilakukan di Herbarium Bandungense, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi
Bandung. Rendemen ekstrak kental bunga cengkeh yang diperoleh adalah sebesar 30%. Ekstrak etanol bunga cengkeh dikarakterisasi dan dilakukan penapisan fitokimia dengan hasil seperti pada Tabel 1.
Tabel 1. Karakteristik dan Penapisan Fitokimia Ekstrak
Parameter Ekstrak Etanol Bunga Cengkeh
Kadar air (% v/b) 18
Kadar abu total (% b/b) 2,6 Kadar abu larut air (% b/b) 1,8
Kadar abu larut asam (% b/b) 0,7
Kadar sari larut etanol (% b/b) 12,0
Kadar sari larut air (% b/b) 10,4
Kandungan Kimia :
+ = menunjukkan adanya golongan senyawa uji - = menunjukkan tidak adanya golongan senyawa uji
senyawa berwarna yang akan mengabsorpsi pada panjang gelombang 532 nm. Glutation (GSH) merupakan antioksidan non enzimatik yang berguna dalam detoksifikasi radikal bebas. Di dalam sel dan jaringan yang normal, lebih dari 90% glutation dalam bentuk tereduksi sedangkan kurang dari 10% glutation dalam bentuk teroksidasi (GSSH). Tingginya kadar GSH dijaga oleh enzim glutation reduktase (GR) yang berfungsi untuk mempertahankan keseimbangan redok intraselular. Rendahnya kadar GSH mengindikasikan terjadinya stress oksidatif.
Hasil uji penetapan kadar MDA seperti terlihat pada Tabel 2, kultur yang diinkubasi dengan artemisinin mengalami peningkatan kadar MDA dan penurunan kadar GSH bila dibandingkan dengan kontrol. Ini sesuai dengan salah satu mekanisme kerja artemisinin yaitu pembentukan radikal bebas akibat pembukaan jembatan endoperoksid sehingga terjadi stress oksidatif yang akan mengakibatkan peningkatan status oksidan dengan parameter peningkatan kadar MDA dan terjadi penurunan kadar GSH. Sedangkan pada kultur yang diberi EEBC konsentrasi 0,374 dan 3,74x10 -2 mg/ml mengalami penurunan kadar MDA
yang bermakna secara berturut-turut adalah 1,778±0,07; 1,837±0,06.
Hasil uji penetapan kadar GSH seperti terlihat pada Tabel 2, konsentrasi EEBC 0,374 dan 3,74x10-2 mg/ml terlihat selain menurukan
kadar MDA juga mengalami peningkatan kadar GSH yang bermakna (p<0,05). Hal ini dapat disimpulkan bahwa EEBC berkhasiat meredam radikal bebas pada kultur yang diinkubasi dengan artemisinin dengan parameter penurunan kadar MDA dan peningkatan kadar GSH.
Peredaman radikal bebas yang terjadi pada kultur yang diinkubasi dengan kombinasi ekstrak etanol bunga cengkeh dan artemisinin diduga disebabkan oleh eugenol. Eugenol merupakan senyawa yang bertanggungjawab sebagai antioksidan dalam minyak cengkeh. Menurut Rajalaksmi and Narasimhan (1995), antioksidan dari cengkeh bekerja sebagai penangkap radikal bebas dengan mendonasikan hidrogen atau elektron ke radikal bebas dan mengkonversinya menjadi produk yang lebih stabil (non radikal).
Ekstrak etanol bunga cengkeh pada konsentrasi 0,374 mg/ml dan 3,74x10-2 dapat
menurunkan stres oksidatif pada kultur P.
falciparum yang diinkubasi dengan artemisinin
dengan parameter penurunan kadar MDA dan peningkatan kadar GSH. Ekstrak etanol bunga cengkeh pada konsentrasi tersebut tidak mempengaruhi aktivitas antimalaria artemisinin.
Tabel 2 Kadar MDA dan GSH dalam kultur P. falciparum yang diinkubasi dengan kombinasi ekstrak etanol
bunga cengkeh dan artemisinin
Zat uji Dosis (mg/ml) Kadar rata-rata MDA (nmol/ml)
Kadar rata-rata GSH (µg/ml)
kontrol Kontrol (-) 2,026 ± 0,47 0,2496 ± 0,01
Artemisinin 3,97 nM 2,332 ± 0,19 0,1581 ± 0,012a
EEBC + Artemisinin 3,74x10-1
1,778 ± 0,07 ab 1,1318 ± 0,07ab
3,47x10-3 1,936 ± 0,07 ab 0,8364 ± 0,08ab
3,47x10-4 2,911 ± 0,02 0,7581 ± 0,14ab
3,47x10-5 2,916 ± 0,05 0,6248 ± 0,08ab
3,47x10-6 2,919 ± 0,04 0,5380 ± 0,02ab
3,47x10-7 2,917 ± 0,26 0,5264 ± 0,03ab
EEBC = Ekstrak etanol bunga cengkeh a = (p<0,05)dibandingkan terhadap kontrol b = (p<0,05)dibandingkan terhadap artemisinin
KESIMPULAN
Dari penelitian yang dilakukan disimpulkan ekstrak etanol bunga cengkeh mampu meredam radikal bebas yang dihasilkan atas aktivitas artemisinin sebagai obat anti-malaria.
DAFTAR PUSTAKA
Gulcin I., Sat IG., Beydemir S., Elmastas M., dan Kufrevioglu OI. 2004. Comparison of antioxidant activity of clove (Eugenia
caryophylata Thunb) buds and lavender
(Lavandula stoechas L.). Food Chemistry,
87:393-400
Lee KG., dan Shibamoto T. 2001. Antioxidant property of aroma extract isolated from clove buds (Syzygium aromaticum (L.) Merr et Perry.). Food Chemistry, 74(4): 443-448 Li GQ., Guo XB., Fu LC., Jian HX., and Wang XH. 1994.
Clinical Trials of Artemisinin and Its Derivates in The Treatment of Malaria in China. Trans R
Soc Trop Med Hyg., 88: Suppl 1, S5-6
Machlin LJ. and Bendich A. 1987. Free Radical Tissue Damage: Protective Role of Antioxidant nutrients. The FASEB Journal,
1(6): 441-445
Nasar MI., Gaara AH., El-Gharab AH., Farray ARH., Shen H., Hug E., and Mabry TJ. 2007. Chemical constituents of clove (Syzygium
aromaticum, Fam. Myrtaceae) and their
antioxidant activity. Revista Latino
americana de Quimica, 35(3):47-57
Phoupuritham P., Thongngam M., Yoksan R., Suppakul P. 2007. Antioxidant and radical scavenging activities of selected plant extracts and possible application in active packaging. Proceeding of The 15th IAPRI
World Conference on Packaging.
Punchard NA. and Kelly FJ. 1996. Free Radicals:
a Practical Approach. Oxford University
Press, New York. p 1-5
Rajalaksmi D. and Narasimhan S. 1996. Food antioxidants: sources and methods of evaluation. in Madhavi DL, Deshpande SS, Salunkhe DK (ed). Food antioxidants technological, toxicological and health
perspectives. New York, Marcel Dekker Inc.
