PENGGUNAAN ASETONITRIL, MGSO
4DAN NACL UNTUK
ANALISA RESIDU PESTISIDA DDE (INSEKTISIDA
ORGANOKLORIN), DIAZINON DAN FENTION
(INSEKTISIDA ORGANOFOSFAT) DALAM PAKAN TERNAK
DENGAN CARA KHROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
[The use of Acetonitrile, MgSO
4and NaCl for DDE (Organochlorine
Insecticide), Diazinon and Fenthion (Organophosphate Insecticide) on
Pesticide Residue Analysis of Animal Feed by Thin Layer Chromatography]
YUNINGSIH
Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor 16114
ABSTRACT
Determination of DDE, diazinon and fenthion pesticide residue in animal feed was done by extraction of sample using acetonitrile, anhydrous magnesium sulfate and sodium chloride. After centrifugation, acetonitrile extract underwent was cleaned-up by magnesium sulfate and catridge C18, then its filtrate was
evaporated and detected by thin layer chromatography (TLC). Validation of this method was conducted by recovery and limit of detection (LOD), then effectivity of this method was evaluated by comparing with other pesticide methods. The result of recoveries after adding 2.5 ug DDE, 50 ug diazinon and 50 ug fenthion (in triplicates) were same value 80% for DDE, diazinon dan fenthion ranged 70 – 110% (range of Validation Acceptance Criteria for Analysis Pesticide Residues). It is concluded that this method is quite significant with LOD: 0.01ug for DDE and 0,1ug for both diazinon and fenthion. This method is quite quick and save compared to other pesticide residue mehod for its chemical waste is environmentally friendly.
Key Words: Diazinon, Fenthion, DDE, Residue Pesticide Analysis, Animal Feed, TLC
ABSTRAK
Analisis residu pestisida DDE (dichloro dichlorodiphenyl ethylene), fention dan diazinon dalam pakan ternak dengan ekstraksi sampel dengan pelarut asetonitril, anhydrous magnesium sulfat dan sodium klorida. Hasil ekstraksi disentrifus dan filtratnya dimurnikan melalui catridge C18 dan magnesium sulfat dan hasil
pemurnian dievaporasi dan dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Dilakukan uji validasi terhadap metoda: uji perolehan kembali dengan penambahan 2,5 ug DDE, 50,0 ug diazinon dan 50,0 ug fention kedalam sampel pakan ternak (masing-masing dilakukan 3 ulangan pemeriksaan) dan penetapan limit deteksi. Hasil uji validasi menunjukkan rata-rata uji perolehan kembali dari ketiga macam pestisida tersebut menunjukkan hasil yang sama: 80% (kisaran kriteria hasil validasi yang diterima untuk analisis residu pestisida), maka metode analisis residu pestisida DDE, diazinon dan fention dalam pakan cukup valid dengan limit deteksi: 0,01 ug untuk DDE dan 0,1 ug untuk diazinon dan fention. Metoda ini relatif cukup cepat dibandingkan dengan metoda analisis residu pestisida lain dan aman terhadap lingkungan dengan buangan limbah bahan kimia yang relatif cukup sedikit.
Kata Kunci: Diazinon, Fention, DDE, Analisis Residu Pestisida, Pakan Ternak, KLT
PENDAHULUAN
Hasil pengamatan WHO menunjukkan bahwa 3 juta manusia keracunan pestisida tiap tahun terutama di negara berkembang. Tiap tahun sekitar 20.000 terdapat korban keracunan
yang berakhir dengan kematian (OBSOLOTE PESTICIDES, 2010). Efek pestisida terhadap manusia maupun hewan dapat menyebabkan keracunan akut atau kronis tergantung dari jenis pestisidanya. Golongan organophosphate
yang dapat menghambat enzim
acetylcholenesterase, yang secara normal dapat memecahkan neurotransmitter acetycholine
(ACh), tetapi apabila terjadi akumulasi
acetylcholine dapat berpengaruh terhadap
sistim saraf pusat, seperti menyebabkan kelumpuhan (EXTOXNET, 1996). Sebagai contoh pestisida OP diazinon dan fention yang masih banyak digunakan di masyarakat, dan residunya masih terdeteksi dalam pakan ternak atau limbah pertanian (INDRANINGSIH dan Y. SANI, 2004). Disamping itu, pestisida OP bersifat racun akut, maka orang tertentu memanfaatkannya untuk membunuh hewan secara sengaja (kriminal). Seperti kematian akut pada beberapa jenis ternak di Bogor, Sukabumi dan Garut pada tahun 1988 dan 1993 (YUNINGSIH, 1988; DAMAYANTI dan YUNINGSIH, 1994). Begitu juga pestisida DDE yang merupakan hasil metabolit DDT merupakan senyawa lipophilic organoklorin dan salah satu masuk golongan oragnoklorin yang bersifat sebagai Persistent Organic
Pollutants (POPs), secara perlahan
diakumulasi dalam jaringan lemak dan menyebabkan teratogenik (EXTOXNET, 1996). Maka berdasarkan hasil konvensi pada The Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutans pada tahun 2001, bahwa macam pestisida yang bersifat POPs tersebut harus dihilangkan atau dibatasi produksinya.
Sejumlah metoda analisis residu pestisida telah banyak dilakukan dalam biji-bijian (bahan baku pakan), terutama menggunakan alat kromatografi gas dengan beberapa macam detektor, seperti flame photometric (FPD),
nitrogen phosphorus (NPD), pulsed flame
photometric (PFPD), electron capture(ECD) dan mass spectrometry (MS) sebagai liquid
chromatography (LC) dengan diode array
detector (DAD) atau fluoresence detector dan LC dihubungkan dengan MS (LC/MS). Keseluruhan instrumen ini merupakan alat deteksi pestisida dari hasil pemurnian ekstrak sampel (preparasi ekstrak). Sementara metoda preparasi ekstrak sampel sangat menentukan hasil akhir deteksi disampng penggunaan instrumennya. Kemudian preparasi ekstrak ini umumnya diperlukan macam bahan kimia organik yang cukup mahal harganya disamping sangat berbahaya bagi kesehatan manusia (lingkungan) dari buanganan limbahnya. Oleh sebab itu, telah dicoba pengembangan metoda
analisis residu pestisida diazinon, fention dan DDE yang cepat, mudah, murah dan aman, yaitu dengan cara modifikasi metode menurut LEHOTAYet al. (2005), yaitu ekstraksi sampel dengan asetonitril dengan MgSO4 dan NaCl, kemudian filtrat dimurnikan melalui cartridge
C18 dan MgSO4
MATERI DAN METODE
Sebagai bahan pemeriksaan yaitu berupa pakan ternak (konsentrat) dan dianalisis terhadap pestisida diazinon, fention dan DDE dan tahapan metodanya sebagai berikut: Pengembangan metode
Pengembangan metode dilakukan dengan cara modifikasi metoda menurut LEHOTAY et al. (2005) dan diagram metodenya sebagai berikut:
1. 5 g sampel pakan + 15 ml asetonitril + 6 g MgSO4 + 1,5 g NaCl
2. kocok (alat vortex) selama 5 menit, sentrifuse 2500 rpm, selama 10 menit 3. masukkan filtrat kedalam gelas piala yg
berisi 150 mg MgSO4 dan filtratnya masukkan ke cartridge C18 (Sep Pak C18) 4. eluate dikeringkan dengan alat rotary
evaporator dan spotting pada plat
kromatografi lapis tipis(KLT) F254
5. plat KLT dikembangkan dalam pelarut aseton : heksan = 1 : 4 dan hasil pengembangan dideteksi pada lampu UV dengan panjang gelombang 366 n
Evaluasi pengembangan metode Validasi pengembangan metode
a. uji perolehan kembali: penambahan larutan standar diazinon dan fention masing-masing sebanyak 50 µliter dari konsentrasi 1000 ppm (50 µgram) dan larutan standar DDE sebanyak 25 µliter dari konsentrasi 100 ppm (2,5 µgram) kedalam 5 gram pakan (masing-masing 3 ulangan) dan 1 ulangan untuk blanko. Kemudian lanjutkan ekstraksi seperti metode yang telah dikembangkan tersebut.
b. penetapan limit deteksi (Limit of detection, LOD): dilakukan spotting
larutan standar diazinon, fention dan DDE, masing-masing sebanyak 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 dan 1,0 ul dari konsentrasi 1000 ppm, kemudian 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; dan 10 ul dari konsentrasi 100 ppm dan 10 ppm.
Evaluasi efektivitas metode
Hasil pengembangan metode dievaluasi efektivitasnya dengan cara membandingkan dengan metoda analisis residu pestisida lain dalam hal pemakaian bahan kimia, kecepatan dan kemudahan dalam melakukan preparasi ekstrak dan pemurniannya serta keamanan bagi kesehatan manusia atau terhadap lingkungan dari buangan limbahnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengembangan metode
Pengembangan metoda analisis residu pestisida telah dilakukan dengan modifikasi metoda menurut LEHOTAY et al. (2005) dan hasilnya menunjukkan metoda yang cepat dan mudah pada tahap preparasi ekstrak cukup dilakukan pengocokan sampel dengan asetonitril sebagai pelarut pestisida (mengikat pestisida). Kemudian penambahan powder
MgSO4 dan NaCl yang keduanya berfungsi mengikat sisa air dan mengikat komponen- komponen lain dalam pelarut asetonitril, sehingga pestisida dalam asetonitril lebih bersih (murni). Untuk memperoleh hasil ekstrak yang lebih bersih dilakukan pengikatan komponen kembali dengan penambahan sedikit MgSO4 (150 mg) kedalam pelarut asetonitril tersebut dan dialirkan melalui cartridge C18 (tanpa kondisi) dengan kecepatan 3 tetes/detik.
Cartridge ini hanya berfungsi sebagai
penyaringan dan berlainan dengan metoda residu pestisida umumnya, bahwa pemakaian
cartridge harus dikondisikan (penambahan
pelarut organik) yang berfungsi untuk pengikatan pestisida (SCHENCK et al., 1996). Disamping itu C18 merupakan adsorben terbaik dalam pemurnian baik dalam bentuk kolom SPE (solid phase extraction) maupun bentuk
powder (tidak dipadatkan) (LEHOTAY et
al.,2001). Maka modifikasi pada pengembangan metode ini menggunakan
cartridge C18 (mudah diperoleh) sebagai
pengganti primary secondary amine (PSA) yang umumnya dipakai untuk sampel yang mengandung lemak tinggi (LEHOTAY et al., 2005).
Evaluasi pengembangan metode Uji perolehan kembali
Setiap pengembangan metode harus diuji keabsahannya (valid), dengan cara uji perolehan kembali sehingga dapat diketahui sejauh mana ketepatan pengembangan metode tersebut.
Hasil uji perolehan kembali dari hasil pengembangan metode dengan penambahan 50 µg pada masing-masing larutan standar diazinon dan standar fention dan 2,5 µgram standar DDE menunjukkan hasil rata-rata yang sama 80% dari masing-masing 3 ulangan (lihat Tabel 1). Kemudian nilai hasil uji perolehan kembali tersebut masuk dalam kisaran kriteria analisis residu pestisida yang diterima (70 – 110%) (SINGLE LABORATORY VALIDATION ACCEPTANCE CRITERIA, 2006), maka pengembangan metoda analisis residu ketiga macam pestisida DDE, diazinon dan fention tersebut cukup valid.
Limit deteksi
Batas konsentrasi yang masih terdeteksi atau limit deteksi dari pestisida diazinon, fention dan DDE dengan metoda KLT ini, masing-masing yaitu 0,1 µg, 0,1 µg dan 0,01 µg. Sementara batas maksimum residu (BMR) untuk diazinon dan fention adalah 0,1 ug dan untuk DDE: 0,1 ug dalam biji-bijian (bahan baku pakan) (DIR. BINA PERLINDUNGAN TANAMAN PANGAN, 1997), maka metode KLT ini cukup sensitif terhadap analisis ketiga macam pestisida tersebut Kemudian metoda yang cepat dan mudah ini juga sangat efektif untuk pemeriksaan diagnosa keracunan pestisida pada hewan. Sementara hewan menderita keracunan umumnya setelah mengkonsumsi pestisida dalam konsentrasi tinggi atau diatas level BMR, maka pemeriksaannya dengan metode ini dapat
Tabel 1. Hasil uji perolehan kembali setelah penambahan larutan standar diazinon, fention dan DDE ke dalam sampel pakan
Ulangan Penambahan standar diazinon (µg) Hasil uji perolehan kembali (µg) Hasil uji perolehan kembali (%) Rata-rata hasil uji perolehan kembali (%) 1 50 50 100 2 50 20 40 80 3 50 50 100
Penambahan standar fention (µg)
1 50 50 100
2 50 20 40 80
3 50 50 100
Penambahan standar DDE (µg)
1 2,5 2,0 80
2 2,5 2,0 80 80
3 2,5 2,0 80
Blanko - - - -
membantu mempercepat diagnosanya sehingga dapat mencegah sedini mungkin terjadinya keracunan berkelanjutan.
Evaluasi efektivitas metode
Untuk mengetahui sejauhmana efektivitas pengembangan metoda analisis residu pestisida maka perlu dibandingkan dengan metode analisis residu pestisida lain, seperti Table 2.
Berdasarkan perbandingan metoda tersebut diatas, membuktikan metode II atau metode
menurut LEHOTAY et al. (2005) ini cukup cepat, mudah, murah dan aman bagi kesehatan manusia karena pemakaian bahan kimia dan buangan limbahnya akan jauh lebih sedikit (ramah lingkungan). Sementara Metode I, preparasinya diperlukan macam bahan kimia dan dalam jumlah lebih banyak, begitu juga preparasinya diperlukan waktu lebih lama. Metode III diperlukan hanya 2 macam bahan kimia etil asetat dan cycloheksan yang bersifat pelarut kuat sehingga warna pigmen asal biji atau hijauan terbawa dalam hasil ekstrak yang
Tabel 2. Perbandingan antar metode analisis residu pestisida dalam pakan ternak
Tahap analisis Metode I Metode II Metode III Akstraksi pemurnian Aseton (50 ml)
catridge C18 (kondisi)
asetonitril, ethyl acetate, kolom florisil,
Na2SO4
asetonitril (10 ml), MgSO4, NaCl,
catridge C18 (tanpa kondisi)
etil asetat, cycloheksan, kertas saring khusus
Waktu preparasi (menit) 30 10 20
dapat mempengaruhi hasil deteksi apabila tidak dilakukan clean-up, maka dalam metodanya dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring khusus yang cukup mahal dan sulit diperoleh, kertas saring DP302, diameter 150 mm (ALBET,BARCELONA,SPAIN).
KESIMPULAN
Berdasarkan nilai rata-rata dari hasil uji perolehan kembali pengembangan metode analisis residu pestisida diazinon, fention dan DDE dalam pakan (80%), maka pengembangan metode analisis tersebut cukup valid. Pengembangan metode relatif cukup cepat dan pemakaian asetonitril yang merupakan bukan pelarut senyawa klor dan penggunaannya yang relatif cukup sedikit sehingga cukup aman terhadap lingkungan (ramah lingkungan).
DAFTAR PUSTAKA
CASSANOVA, J.A. 1996. Use of Solid-Phase Extraction Disk for Analysis of Moderately Polar and Nonpolar Pesticides in High- Moisture Foods. J. AOAC 79(4) 936 – 940. DAMAYANTI, R. dan YUNINGSIH. 1994. Gambaran
Patologi Keracunan Insektisida Organofosfat Diazinon pada Aya. Penyakit Hewan. 26(47) 53 – 56.
EXTOXNET. 1996. Pesticide Information Profiles Dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT). http://extoxnet.orst.edu/pips/ddt.htm (1Juni 2010).
EXTOXNET. 1996. Pesticide Information Profiles Diazinon. http://extoxnet.orst.edu/pips/ iazinon.htm (26 April 2010).
FENOLL, J.,P. HELLIN, C.M. MARTINEZ and P.FLORES. 2007. Pesticides Residue Analysis
of Vegetables by Gas Chromatography with Electron Capture Detection. J. AOAC 90(1) 263 – 270.
INDRANINGSIH dan Y.SANI. 2004. Residu pestisida pada produk sapi: Masalah dan Alternatif Penanggulangannya. Wartazoa 14(1) 1 – 13. LEHOTAY, S.J., A.R. LIGHTFIELD, J.A. HARMAN
-FETCHO and D.J.DONOGHUE. 2001. J. Agric. Food Chem. 49: 4589 – 4596.
LEHOTAY, S.J., A, DE KOK, M. HIEMSTRA and P. BODEGRAWEN. 2005. Validation of a Fast and Easy method for Detremination of Residues from 229 pesticides in Fruits and Vegetables using Gas and Liquid Chromatography and Mass Spectrometric Detection. J. AOAC 88(2) 595 – 614.
DIR. BINA PERLINDUNGAN TANAMAN. 1997. Peraturan Pemerintah RI tetang Perlindungan Tanaman Pangan dan Hortikultura. Direktorat Bina Perlindungan Tanaman, Jakarta.
OBSOLETE PESTICIDES. 2010. Obsolete, unwantedand/ or Banned Pesticides. http://www.org/ag/AGP/AGPP/Pesticid/Dispo sal/en/what/103380/printfriendly.html (29 April 2010).
SCHENCK, F.J., L. CALDERON and
D.E. SAUDARG. 1996. Florisil Solid Phase Extraction Cartridges for Cleanup of Organochlorine Pesticide Resiudes in Foods. J. AOAC 79(6) 1454 – 1458.
SINGLE LABORATORY VALIDATION ACCEPTANCE
CRITERIA. 2006. Method Validation. http://www.aoac.org/diet suppl/dietary-supplement-web-site/slv-criteria-pdf (26 April 2010).
YUNINGSIH. 1988. Kasus keracunan insektisida organofosfat diazinon pada hewan. Penyakit Hewan. 20(35) 38 – 39.
