Laporan Glukosa Darah - Biokim 1

(1)

A.Judul Percobaan :

Penentuan Kadar Glukosa Darah

B.Mulai Percobaan : Senin, 11 November 2013 C.Selesai Percobaan : Senin, 11 November 2013

D.Tujuan :

Menentukan kadar glukosa dalam darah.

E.Dasar Teori :

Glukosa adalah suatu aldoheksosa dan sering disebut dekstrosa, karena mempunyai sifat dapat memuta cahaya terpolarisasi ke arah kanan. Di alam, glukosa terdapat dala buah-buahan dan madu lebah. Darah manusia normal mengandung glukosa dalam jumlah atau konsentrasi tetap, yaitu antara 70 – 100 mg tiap 100 ml darah. pankreas. Insulin membantu glukosa dalam darah masuk ke sel untuk menghasilkan tenaga. Gula darah yang tinggi dapat berarti bahwa pankreas tidak memproduksi cukup insulin, atau jumlah insulin cukup namun tidak bereaksi secara normal. Hal ini disebut dengan resistensi insulin. Tingkat gula darah diatur melalui umpan balik negatif untuk mempertahankan keseimbangan di dalam tubuh. Level glukosa di dalam darah dimonitor oleh pankreas.

Penentuan kadar glukosa darah dapat dilakukan dengan berbagai metode. Salah satu metode yang digunakan untuk penentuan kadar glukosa darah adalah reaksi reduksi ion kupri (Cu2+) di dalam larutan kupritartrat oleh glukosa darah menjadi ion kupro (Cu+) dalam suasana basa. Sebelumnya darah harus bebas protein (deproteinasi filtrat darah). Deproteinasi dilakukan karena dalam menentukan kadar glukosa darah maka albumin/protein dalam darah harus dihilangkan karena protein juga dapat bereaksi dengan Cu, ketika protein telah terdenaturasi maka tidak akan mengganggu absorbansi glukosa dengan analisis spektrofotometri UV-VIS sehingga didapatkan hasil yang valid untuk penentuan kadar glukosa.

(2)

Senyawa Cu2O yang terbentuk dari hasil penambahan larutan kupritartrat bereaksi dengan asam fosfomolibdat membentuk senyawa fosfomolibdenum oksida yangberwarna biru tua. Intensitas warna biru yang terbentuk sebanding dengan kadar glukosa didalam darah sampel sehingga dapat diukur serapannya secara spektrofotometri. Filtrat bebas protein dipanaskan dalam larutan tembaga alkalis akan menghasilkan Cu2O. Kemudian Cu2O direaksikan dengan asam fosfomolibdat yang akan menghasilkan warna biru yang dapat dibaca pada spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Intensitas warna biru molibdat ini merupakan ukuran banyaknya tembaga yang direduksi dengan demikian menyatakan jumlah glukosa yang diperoleh dibandingkandengan standar. Metode ini memiliki beberapa keuntungan, antara lain hanya dibutuhkan dua pelarut, filtrat yang terbentuk lebih netral, dan proses filtrasi ebih cepat.

Spektrofotometer UV VIS adalah semacam alat ukur yang bekerja berdasarkan prinsip spektrofotometri. Sederhananya adalah berdasarkan penyerapan panjang gelombang. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan Hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik melewatisuatu media, maka sebagian cahaya tersebut diserap, sebagian dipantulkan, dan sebagiandipancarkan. Perubahan warna yang terjadi diamati dan intensitas warnanya diamati dengan spektronik-20 pada panjang gelombang maksimum yaitu 660 nm.

A = k x c x l

Dimana :

A : absorbansi (serapan cahaya) k : koefisien ekstintik molar larutan l : tebal kuvet

c : konsentrasi sampel

Berdasarkan hukum lambert-Beer, serapan cahaya berbanding lurus dengan konsentrasi.

Konsentrasi glukosa darah merupakan faktor yang sangat penting untuk kelancaran kerja tubuh. Kadar normal glukosa dalam darah 70-90 mg/ 100 mL.

(3)

Keadaan dimana kadar glukosa berada di bawah 70-90 mg/ 100 mL disebut hipoglisemia, sedangkan di atas 90 mg/ 100 mL disebut hiperglisemia.

F. Alat Dan Bahan: Alat 1. Spektrofotometer UV-VIS 2. Sentrifuge 3. Tabung reaksi 4. Penangas air 5. Larutan Cu alkalis 6. Gelas ukur 7. Gelas piala Bahan 1. Larutan Ba(OH)2 0,3 N 2. Larutan ZnSO4.7H2O 5% 3. Larutan standar glukosa 1 mg/L 4. Pereaksi arsenomolibdat

(4)

G.Alur Percobaan

1. Deproteinasi Filtrat Darah 0,1 ml darah “oxalated”

- Dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang berisi 1,9 mL akuades

- Dicampur dengan baik (dengan pengaduk

- Ditambah 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 N

- Diaduk hingga rata

- Ditambahkan lagi 1,5 mL ZnSO4.7H2O 5%

- Dicampur dengan baik

- Didiaamkan selama 5 menit

- Disentrifuge selama 10 menit

- Didekantasi

Residu Filtrat (filtrat darah bebas protein)

Dilakukan uji biuret 3-5 tetes Hasil

(5)

2. Penentuan Kadar Glukosa dalam Darah

3. Pembuatan Kurva Standart

Hasil Pengamatan

1,0 ml Filtrat darah bebas protein

- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

- Ditambah 1,0 mL pereaksi Cu alkalis

- Dimasukkan ke dalam air mendidih selama 20 menit, kemudian dimasukkan dalam air dingin

- Ditambahkan 1,0 mL pereaksi arsenomolibdat

- Diaduk hingga merata

- Dibaca absorbansinya Hasil

- Dipipet masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi

- Dimasukkan ke dalam air mendidih selama 20 menit - Dimasukkan ke dalam air

dingin

- Ditabahkan 1,0 mL pereaksi arsenomolibdat

- Diaduk sampai merata - Dibaca absorbansinya 1 ml glukosa 0,5 mg/ml 1 ml glukosa 0,4 mg/ml 1 ml glukosa 0,3 mg/ml 1 ml glukosa 0,2 mg/ml 1 ml glukosa 0,1 mg/ml Hasil Pengamatan - Dipipet masing-masing

dimasukkan dalam tabung reaksi

dingin

- Diaduk sampai merata - Dibaca absorbansinya

(6)

4. Larutan Blanko

1 ml larutan blanko

Hasil Pengamatan - Dipipet masing-masing

dingin

(7)

H.Hasil Pengamatan

No. Alur Kerja Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Kesimpulan

1. Sebelum

- Aquades : tak berwarna - Ba(OH)2 0,3 N : larutan

jernih jernih tak berwarna

- Darah : merah

- ZnSO4.7H2O : larutan jernih tidak berwarna

Sesudah

- Darah + aquades : merah - Setelah ditambah

Ba(OH)2 : larutan darah menjadi hijau

kecokelatan.Terdapat gelembung dan terbentuk 2 lapisan Lapisan atas : jernih dan tak berwarna  Ba(OH)₂ sebagai suasana basa dan mengendapkan albumin  ZnSO4.7H2O membantu pengendapan protein dalam darah sehingga filtrat darah setelah didekantasi akan bebas dari protein

Filtrat darah yang dihasilkan berwarna biru setelah dilakukan uji biuret. Sehingga filtrate darah yang dihasilkan masih mengandung protein. 0,1 ml darah “oxalated”

- Dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang berisi 1,9 mL akuades

- Dicampur dengan baik (dengan pengaduk

- Ditambah 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 N

- Diaduk hingga rata

- Ditambahkan lagi 1,5 mL ZnSO4.7H2O 5%

- Dicampur dengan baik

- Didiamkan selama 5 menit

- Disentrifuge selama 10 menit

- Didekantasi

Residu Filtrat (filtrat darah bebas protein) Dilakukan uji biuret 3-5 tetes Hasil

(8)

Lapisan bawah: endapan hijau keruh

- Setelah disentrifuge :larutan menjadi 2 lapisan yaitu lapisan atas jernih dan tak berwarna sedangkan lapisan bawah :endapan putih - Uji biuret : larutan

berwarna biru.

2. Sebelum:

- Cu alkalis : larutan berwarna biru jernih - Arsenomolibdat :

larutan jernih tak berwarna.

Sesudah :

- Filtrat darah + Cu alkalis : larutan biru muda jernih.

 Glukosa darah akan mereduksi ion Cu+ dalam suasana basa dan hasil reduksi akan bereaksi dengan asrsebomolibdat menghasilkan warna biru  Diperoleh nilai absorbansi sebesar 0,020  Konsentrasi sampel adalah -0,180

1,0 ml Filtrat darah bebas protein

- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

- Dimasukkan ke dalam air mendidih selama 20 menit, kemudian dimasukkan dalam air dingin

- Ditambahkan 1,0 mL pereaksi arsenomolibdat

- Diaduk hingga merata

- Dibaca absorbansinya Hasil

(9)

- Setelah dipanaskan : terbentuk endapan putih (+), larutan biru jernih.

- Setelah didinginkan : terbentuk endapan putih (++), larutan biru jernih

- Absorbansi = 0,020  Kadar gula normal adalah 70-90 mg/100mL 3. Sebelum :

- Glukosa : larutan jernih tak berwarna.

- Cu alkalis : larutan biru jernih.

- Arsenomolibdat : larutan jernih tidak berwarna.

Sesudah:

- Glukosa + Cu alkalis : larutan berwarna biru jernih. - Setelah dipanaskan : Semakin besar konsentrasi maka semakin besar nilai absorbansi Semakin besar konsentrasi maka semakin besar nilai absorbansi y = 0,65521x + 0,13788 1 ml glukosa 0,2 ppm Hasil Pengamatan - Dipipet masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi

dingin

- Diaduk sampai merata - Dibaca absorbansinya 1 ml glukosa 0,2 ppm 1 ml glukosa 0,2 ppm 1 ml glukosa 0,2 ppm 1 ml glukosa 0,2 ppm

(10)

Tabung 1 : larutan berwarna biru jernih (++).

Tabung 2 : larutan berwarna hijau kebiruan, jernih (+) Tabung 3 : larutan berwarna hijau kebiruan (-)

Tabung 4 : larutan berwarna merah kecokelatan (-), jernih Tabung 5 : larutan merah kecokelatan agak keruh (+)

- Setelah ditambah arsenomolibdat :

Tabung 1 : larutan biru jernih (++),ada gel yang naik

Tabung 2 : larutan biru jernih +

Tabung 3 : larutan biru jernih +++

Tabung 4 : larutan biru jernih +

(11)

Tabung 5 : larutan biru ++++ - Nilai absorbansi Std.1 : 0,101 Std.2 : 0,358 Std.3 : 0,429 Std.4 : 0,355 Std.5 : 0,430 4. Sebelum - Larutan balnko (akuades) : tidak berwarna - Cu alkalis : larutan berwarna biru jernih - Arsenomolibdat :

larutan jernih tak berwarna.

Sesudah

- Blanko + Cu alkalis : biru jernih

- Setelah ditambahkan arsenomolibdat : larutan hijau 1 ml larutan blanko Hasil Pengamatan - Dipipet masing-masing

dingin

(12)

I. Analisis Data

1. Denaturasi protein dalam darah

Pada percobaan ini bertujuan untuk memperoleh sampel filtrat darah yang bebas protein. Yang pertama dilakaukan adalah 0,1 mL (2 tetes) darah yang oxalated dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian ditambahkan aquades sebanyak 1,9 mL. Penambahan aquades bertujuan untuk mengencerkan darah yang digunakan sehingga albumin dalam darah akan terlarut oleh aquades. Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas dan biasanya terdapat dalam serum darah.

Kemudian ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 N (larutan tidak berwarna), larutan tetap tidak berwarna. Larutan Ba(OH)2 tersebut berperan untuk mengendapkan albumin yang terlarut dalam air. Lalu ditambahkan 1,5 mL ZnSO4 5% (larutan tak berwarna), larutan menjadi keruh berwarna hijau kecoklatan. Kemudia larutan didiamkan selama 5 menit. Tujuan didiamkan ini agar terjadi endapan albumin secara sempurna. Penambahan ZnSO4 ini berfungsi sebagai katalisator untuk mempercepat reaksi pengendapan albumin oleh Ba(OH)2.

Selanjutnya larutan disentrifuge selama 10 menit agar terjadi endapan albumin secara sempurna, dan dihasilkan lapisan atas merupakan larutan bening dan tetap terdapat endapan berwarna hijau keruh. Dimana bagian yang bening/tak berwarna merupakan albumin darah yang merupakan filtrat darah bebas protein sedangkan bagian yang mengendap merupakan filtrat darah yang tak tersentrifuge secara sempurna.

Kemudian dilakukan dekantasi pada larutan tersebut sehingga diperoleh filtrat darah bebas protein tak berwarna dan diuji dengan penambahan 2 tetes biuret (biru jernih), ternyata larutan tersebut tetap tak berwarna/bening, hal ini menandakan filtrat tersebut bebas dari protein.

2. Penentuan Kadar Glukosa Darah

Pada percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar glukosa darah pada sampel filtrate bebas protein dari percobaan pertama diatas.

(13)

Pada penentuan kadar glukosa darah yang dilakukan adalah diambil 1 mL filtrat darah bebas protein hasil sentrifuge dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya ditambahkan 1 mL larutan Cu alkalis (biru jernih) dan larutan menjadi berwarna biru mudda jernih. Dimana penambahan Cu alkalis ini berfungsi sebagai pereduksi glukosa dalam sampel tersebut.

Kemudian larutan dimasukkan ke dalam air mendidih selama 20 menit, dimana pemanasan ini bertujuan untuk menambah laju reaksi oleh Cu alkalis menghasilkan endapan putih (+) dan larutan berwarna biru jernih. Lalu larutan didinginkan menghasilkan larutan warna biru jernih dan endapan putih (++) bertambah.

Selanjutnya ditambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat yang berwarna kuning jernih. Pada penambahan Cu alkalis terbentuk larutan berwarna hijau ketika ditambahkan pereaksi arsenomolibdat, karena larutan mengandung asam laktat dan ion Cu2+. Hal ini sesuai dengan prinsip uji Tauber yang akan memberikan hasil positif (larutan biru) pada larutan yang mengandung monosakarida (glukosa). Ion kupri (Cu+) akan direduksi oleh gula menjadi kupro (Cu2+) dan mengendap sebagai Cu2O (kuprooksida). Penambahan pereaksi arsenomolibdat tersebut bertujuan agar Cu2O dapat larut kembali dan warna larutan berubah menjadi biru tersebut karena adanya oksidasi arsenomolibdat.

Selanjutnya larutan diukur absorbansinya dengan metode spektofotometri. Spektrometer absorbsi adalah sebuah instrumen untuk mengukur absorbsi/penyerapan cahaya dengan energi (panjang gelombang) tertentu oleh suatu atom/molekul. Dalam praktikum ini pengukuran dilakukan pada panjang gelombang pada panjang gelombang 660 nm. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa absorbansi glukosa yang diperoleh sebesar 0,020. Dan konsentrasi sampel -0,180.

(14)

3. Penentuan Kurva Standar

Pada percobaan ini bertujuan untuk membuat kurva standar dan akan diperoleh kurva yang memiliki persamaan regresi untuk digunakan sebagai penentuan kadar glukosa darah darah pada percobaan kedua. Untuk membuat kurva standar tahap pertama yang harus dilakukan yaitu membuat larutan standar. Larutan standar dibuat dengan cara larutan glukosa 0,05 mg/mL. untuk larutan standart 0,01 mg/mL dibutuhkan 5 mL larutan glukosa 0,05 mg/mL yang diencerkan dengan aquades sampai volume 25 mL.

Selanjutnya untuk membuat larutan glukosa 0,008 mg/mL; 0,006 mg/mL; 0,004 mg/mL; 0,002 mg/mL digunakan rumus pengenceran:

M1x V1= M2x V2

Tahap selanjutnya, masing-masing larutan standart yang telah dibuat dipipet 1 mL dan diletakkan pada lima tabung reaksiyang berbeda. Kemudian ditambahkan 1 mL Cu alkalis pada masing-masing tabung dan dihasilkan larutan yang berwarna biru jernih. Penambahan Cu Alkalis mengakibatkan ion kupri (Cu+) akan direduksi oleh glukosa menjadi kupro (Cu2+) dan mengendap sebagai Cu2O (kuprooksida). Setelah ditambahkan Cu Alkalis, tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit. Pemanasan ini bertujuan untuk menambah laju reaksi oleh Cu alkalis, lalu didinginkan. Larutan berubah warna menjadi merah kecoklatan.

Kemudian ditambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat sehingga larutan berwarna hijau. Penambahkan pereaksi arsenomolibdat bertujuan agar Cu2O melarut lagi dan warna larutan akan berubah menjadi hijau yang disebabkan oleh adanya oksidasi. Lalu larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm, pengukuran panjang gelombang dilakukan pada panjanggelombang tersebut karena warna hijau memiliki rentang panjang gelombang pada 610-750 nm.

Adapun absorbansi yang didapat adalah sebagai berikut: - Glukosa 0,01 = 0,101 (hijau +++++)

(15)

y = -0.002x + 0.012 R² = 1 y = 0.0775x + 0.1141 R² = 0.6835 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 2 4 6 A b sor b an si Konsentrasi

Penentuan Kurva Standar

Konsentrasi Absorbansi Linear (Konsentrasi) Linear (Absorbansi) - Glukosa 0,008 = 0,358 (hijau ++++) - Glukosa 0,006 = 0,429 (hijau +++) - Glukosa 0,004 = 0,355 (hijau ++) - Glukosa 0,002 = 0,430 (hijau +)

Berdasarkan absorbansi yang didapat pada masing-masing larutan standart, dapat diperoleh kurva kalibrasi sebagai berikut:

No. Konsentrasi Absorbansi

1 0,010 0,101 2 0,008 0,358 3 0,006 0,429 4 0,004 0,355 5 0,002 0,490 4. Pembuatan blanko

Larutan blanko dibuat sebagai larutan standar dimana dari larutan blanko ini dapat diperoleh nilai absorbansi yang sebenarnya tanpa ada partikel–partikel lain didalam larutan tersebut. Dengan perlakuan sebagai berikut : dipipet 1 mL aquades dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

(16)

Selanjutnya ditambahkan 1 mL larutan Cu alkalis (biru jernih) dan larutan menjadi berwarna biru keruh. Kemudian larutan dimasukkan kedalam air mendidih selama 20 menit, dimana pemanasan ini bertujuan untuk menambah laju reaksi oleh Cu alkalis, lalu larutan didinginkan.

Selanjutnya ditambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat yang berwarna kuning jernih. Pada penambahan Cu alkalis terbentuk larutan berwarna hijau ketika ditambahkan pereaksi arsenomolibdat, karena larutan mengandung asam laktat dan ion Cu2+.

Hal ini sesuai dengan prinsip uji Tauber yang akan memberikan hasil positif (larutan biru) pada larutan yang mengandung monosakarida (glukosa). Ion kupri (Cu+) akan direduksi oleh gula menjadi kupro (Cu2+) dan mengendap sebagai Cu2O (kuprooksida).

Penambahan pereaksi arsenomolibdat tersebut bertujuan agar Cu2O dapat larut kembali dan warna larutan berubah menjadi biru tersebut karena adanya oksidasi arsenomolibdat. Selanjutnya larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm. Dan hasil absorbansi yang didapat dari larutan blanko yang besar, lebih dari 0,001.

J. Diskusi

Dalam percobaan ini didapatkan kurva absorbansi yang tidak linear. Hasil pengukuran kadar sampel filtrat darah bebas protein menunjukkan bahwa absorbansi glukosa yang diperoleh sebesar 0,020. Dan konsentrasi sampel -0,180. Hal ini disebabkan nilai absorbansi blanko pada percobaan kami terlalu besar, yaitu lebih dari 0,001, sehinga faktor pengurangnya terlalu besar mengakibatkan nilai absorbansi glukosa darah menjadi negatif. Seharusnya nilainya mendekati atau sama dnegan 0,001. Hal ini mungkin dikarenakan proses pengenceran sampel dan pengambilan larutan blanko yang tidak teliti.

K.Kesimpulan

(17)

1. Filtrat darah yang digunakan dalam sampel telah bebas dari protein yang ditandai oleh pengujian biuret menghasilkan warna larutan yang tidak berwarna.

2. Hasil pengukuran kadar sampel filtrat darah bebas protein menunjukkan bahwa absorbansi glukosa yang diperoleh sebesar 0,020. Dan konsentrasi sampel -0,180.

3. Dengan pembuatan kurva larutan standar menghasilkan persamaan regresi : y = -0,002x + 0,012

4. Larutan blanko dihasilkan nilai absorbansi sangat besar, yaitu lebih dari 0,001. Sehingga berpengaruh pada nilai absorbansi darah, karena absorbansi blanko berperan sebagai faktor pengurangan.

L.Daftar Pustaka

Fesenden, J Ralp, dan Joan S. Fessenden. 2006. Kimia Organik Jilid 2. Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka. Jakarta: Erlangga.

Imam. 2013. Laporan Praktikum Pemeriksaan Kadar Glukosa Darah. (online). http://imamri.wordpress.com/2013/06/13/laporan-praktikum-pemeriksaan-kadar-glukosa-darah/ diakses tanggal 27 oktober 2013.

Lehninger, Albert L. 1992. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga.

Tim. 2013. Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya : Universitas Negeri Surabaya.

(18)

M. Jawaban Pertanyaan

1. Tentukan kadar glukosa darah dalam mg glukosa/ 100 ml darah

2. Apa fungsi proses pendidihan pada percobaan diatas?

Proses pendidihan pada percobaan di atas berfungsi untuk melepas ikatan siklik dari glukosa sehingga gugus aldehid dari glukosa dapat mereduksi ion kupri (Cu2+) di dalam larutan kupritartrat menjadi ion kupro (Cu+) dalam suasana basa.

3. Jelaskan peranan hormon insulin dealam proses pengaturan kadar glukosa! Hormon insulin berfungsi untuk Merangsang pengubahan glukosa ke glikogen untuk disimpan dalam hati,membantu glukosa dalam darah masuk ke sel untuk menghasilkan tenaga.dan merangsang oksidasi glukosa untuk tujuan respirasi dalam sel. Sehingga Apabila kadar glukosa terlampau rendah, kurang dari jumlah normal, sel alfa pada kelenjar Langerhans akan mensekresikan lebih banyak hormon glukagon, kadar glukosa dalam darah akan naik, proses ini akan berlanjut sehingga kadar glukosa dalam darah berada pada jumlah normal.

H2O H C O H + 5OH- + 2CU2+ (sitrat) O -C O H + Cu2O (endapanmerahbata)

(19)

LAMPIRAN PERHITUNGAN

 Untuk 0,5 mg/ml  Untuk 0,4 mg/ml  Untuk 0, 3 mg/ml  Untuk 0,2 mg/ml  Untuk 0,1 mg/ml

(20)

LAMPIRAN FOTO

Alat yang digunakan

Bahan yang digunakan

Darah oxalated ditambah aquades Penambahan Ba(OH)2 dan ZnSO4 Disentrifuse selama 10 menit Setelah disentrifuse, darah bebas protein

(21)

Dimasukkan ke dalam 5 tabung

Penambahan biuret (tetap tidak berwarna)

Pengenceran sampel glukosa dan penambahan Cu Alkalis

Dipanaskan selama 20 menit

Setelah dipanaskan, sampel berubah warna menjadi

merah kecoklatan

Didinginkan, kemudian dibaca absorbansinya