TESIS
POLIMORFISME GEN GROWTH HORMONE SAPI
BALI DI DATARAN TINGGI DAN DATARAN
RENDAH NUSA PENIDA
NI LUH MADE IKA YULITA SARI HADIPRATA
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
TESIS
POLIMORFISME GEN GROWTH HORMONE SAPI
BALI DI DATARAN TINGGI DAN DATARAN
RENDAH NUSA PENIDA
NI LUH MADE IKA YULITA SARI HADIPRATA NIM 1492361004
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
POLIMORFISME GEN GROWTH HORMONE SAPI
BALI DI DATARAN TINGGI DAN DATARAN
RENDAH NUSA PENIDA
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Kedokteran Hewan Program Pasca Sarjana Universitas Udayana
NI LUH MADE IKA YULITA SARI HADIPRATA NIM 1492361004
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
iv
Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 13 JANUARI 2016
Pembimbing I, Pembimbing II,
Prof.Dr.drh.Ni Ketut Suwiti,M.Kes Dr. Drh. I Wayan Suardana, M.Si NIP. 19630716 198903 2 001 NIP. 19700122 199512 1 001
Mengetahui
Ketua Program Magister Direktur
Kedokteran Hewan Program Pascasarjana Program Pascasarjana Universitas Udayana, Universitas Udayana,
v
Tesis Ini Telah Diuji dan Dinilai oleh Panitia Penguji pada Program Pascasarjana Universitas Udayana pada Tanggal 13 Januari 2016
Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana No : 0287/UN14.4/HK/2016 Tanggal : 11 Januari 2016
Panitia Penguji Tesis adalah : Ketua : Prof. Dr. drh. Ni Ketut Suwiti, M.Kes Anggota :
1. Dr. Drh. I Wayan Suardana, M.Si 2. Dr. Drh. I Nengah Wandia, M.Si
vi
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT
Saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Ni Luh Made Ika Yulita Sari Hadiprata Nim : 1492361004
Program Studi : Kedokteran Hewan
Judul Tesis : Polimorfisme Gen Growth Hormone pada Sapi Bali di Dataran Tinggi dan Dataran Rendah Nusa Penida
Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai dengan peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku.
Denpasar, 13 Januari 2016 Yang membuat pernyataan,
vii
DAFTAR RIWAYAT HIDUP
Penulis Ni Luh Made Ika Yulita Sari Hadiprata dilahirkan pada tanggal 20 Juli 1991 di Denpasar, Provinsi Bali. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara, putri dari pasangan suami istri Drh. I Ketut Hadiprata dan Ni Wayan Sulastrini, S.Pd. Penulis menempuh pendidikan Sekolah Dasar di SDN 1 Kerobokan Kelod dan menamatkan pendidikan tahun 2003, Pendidikan Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 4 Denpasar, diselesaikan pada tahun 2006, Pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMAN 3 Denpasar, diselesaikan pada tahun 2009. Selanjutnya penulis menempuh pendidikan di Kedokteran Hewan Universitas Udayana, menyelesaikan pendidikan Sarjana Kedokteran Hewan (SKH) Tahun 2013 dan menyelesaikan Pendidikan Profesi Dokter Hewan Tahun 2014. Penulis diterima menjadi mahasiswa Program Magister Program Studi S2 Kedokteran Hewan di Universitas Udayana Pada Tahun 2014. Selanjutnya penulis melakukan penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran
Universitas Udayana berjudul “Polimorfisme Gen Growth Hormone Sapi Bali di
Dataran Tinggi dan Dataran Rendah Nusa Penida”. Penelitian ini dibuat sebagai
viii
UCAPAN TERIMA KASIH
ix
telah memberikan masukan, saran dan sanggahan sehingga tesis ini dapat terwujud seperti ini. Ucapan terima kasih yang tulus juga penulis sampaikan kepada para dosen yang telah membimbing penulis dalam mengikuti pendidikan Program Magister pada Program Studi Kedokteran Hewan Program Pascasarjana Univesitas Udayana. Pada kesempatan ini secara khusus penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Komang Sri, Nanik Astuti dan Senshi Septia yang telah meluangkan waktu memberikan bimbingan dalam pelaksanaan penelitian di laboratorium. Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada Bapak I Ketut Hadiprata dan Ibu tersayang Ni Wayan Sulastrini yang telah memberikan dukungan dan perhatian dalam penulisan tesis ini. Kepada Sita, Eka, Gea, Mei, Sista, dan Wela terutama terimakasih banyak kepada Kadek Sumara yang menjadi rekan dalam suka dan duka selama penelitian dan penulisan tesis dan teman-teman lain yang tidak bisa disebutkan satu persatu yang telah banyak membantu hingga terwujudnya tesis ini.
x
ABSTRAK
POLIMORFISME GEN GROWTH HORMONE SAPI BALI DI DATARAN TINGGI DAN DATARAN RENDAH NUSA PENIDA
Telah dilakukan penelitian untuk mengetahui karakteristik dan polimorfisme gen growth hormone sapi bali di Kecamatan Nusa Penida Kabupaten Klungkung Provinsi Bali. Sampel yang digunakan adalah darah sapi bali yang dipelihara di dataran tinggi dan dataran rendah Nusa Penida yang berjumlah 50 sampel. Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) yang dipotong dengan enzim HaeIII. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 50 sampel menunjukkan satu alel dengan frekuensi 1.00 dan nilai PIC marker 0.000. Hasil restriksi produk PCR menggunakan enzim HaeIII menunjukkan seluruh sampel terpotong menjadi dua pita dengan ukuran 179 pb dan 225 pb. Dapat disimpulkan gen growth hormone pada sapi bali yang dipelihara di Nusa Penida bersifat monomorfik. Dengan demikian perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan metode lain tentang keragaman genetik dari gen growth hormone pada sapi bali di Nusa Penida sehingga dapat digunakan kriteria untuk seleksi sapi bali unggul di Nusa Penida.
xi
ABSTRACT
THE POLYMORPHISM OF GROWTH HORMONE GENE OF BALI CATTLE AT HIGHLANDS AND LOWLANDS OF NUSA PENIDA
ISLAND
The research has been conducted to know the characteristics and polymorphisms of growth hormone gene of bali cattle at Nusa Penida island. Totally 50 samples of blood Bali cattle reared in Nusa Penida island were used in this study, and the PCR-RFLP method with enzym HaeIII was used in order to know the polymorphism of their growth hormone gene. The results showed that among 50 samples that were studied, the growth hormone gene of bali cattle in Nusa Penida island showed one allele with frequency of 1.00 and PIC marker value of 0.000. The digestion of PCR product using HaeIII enzyme showed all of samples divided into two bands i.e 179 bp and 225 bp. The result conclude, the growth hormone gene of bali cattle that breeding in Nusa Penida island is monomorphic. Eventhough, the others research with another methods in order to know the genetic diversity of growth hormone gene of bali cattle in Nusa Penida island is still needed so that can be used as a criterion for selecting of bali cattle superior in Nusa Dua island.
xii
RINGKASAN
Nusa Penida merupakan kawasan pengembangan dan pusat pembibitan sapi bali, oleh karena itu diperlukan strategi untuk mendapatkan bibit yang unggul tidak hanya dengan seleksi secara fenotipe namun juga secara genotipe melalui marka gen yang disebut Marker-Assisted Selection (MAS). Salah satu gen yang berpotensi menyandi sifat produksi seperti bobot badan, tinggi pundak, panjang badan dan lingkar dada adalah gen Growth Hormone (GH). Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh informasi tentang karakteristik genetik gen GH yang direstriksi dengan enzim HaeIII serta polimorfismenya dari bibit sapi bali di Nusa Penida yang dipelihara di daerah dataran tinggi dan dataran rendah sehingga dapat digunakan sebagai penanda genetik bibit sapi bali di Nusa Penida. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode PCR-RFLP (Polymerase Chain
Reaction-Restriction Length Polymorphism), dengan jumlah sampel sebanyak 50
xiii
SUMMARY
Nusa Penida is an area for developing and breeding centers of bali cattle in Bali, therefore it is needed a strategy to improve the cattle which superior performance in this area. In order to reach those purposes, the selection of cattle can be conducted not only by phenotype selection, but also genotype phenotype through marker gene that familiarly as Marker-Assisted Selection (MAS). One of the genes that can be used as a MAS is growth hormone (GH) gene which known encoding potential production such as body weight, shoulder height, body length and chest circumference . This research obtain to know the information about the genetic characteristics of GH gene of Bali cattle in Nusa Penida island that were restricted by HaeIII enzyme and its polymorphism. The method used in the study was the PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Length Polymorphism) method. Totally 50 blood samples collected from low lands and high lands of Nusa Penida island were used in the study. The results showed among 50 samples that were studied, the growth hormone gene of bali cattle in Nusa Penida island showed one allele with frequency of 1.00 and PIC marker value of 0.000. The digestion of PCR product using HaeIII enzyme showed all of samples divided into two bands i.e 179 bp and 225 bp. The result conclude, the growth hormone gene of bali cattle that breeding in Nusa Penida island is monomorphic. Eventhough, the others research with another methods in order to know the genetic diversity of growth hormone gene of bali cattle in Nusa Penida island is still needed so that can be used as a criterion for selecting of bali cattle superior in Nusa Dua island.
xiv
BAB III KERANGKA BERPIKIR,KONSEP, DAN HIPOTESIS ... 13
3.1 Kerangka Berpikir ... 13
4.8.1 Pengambilan Sampel Darah ... 21
4.8.2 Ekstraksi DNA... 21
4.8.3 Amplifikasi Gen Growth Hormon ... 22
4.8.4 Restriksi Gen GH dengan Enzim HaeIII ... 23
4.9 Analisis Data ... 24
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ... 25
5.1 Amplifikasi Gen GH ... 25
5.2 Keragaman Genetik GHSapi Bali ... 27
xv
5.2.2 Nilai Polymorphic Informative Content (PIC) ... 30
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ... 32
6.1 Simpulan ... 32
6.2 Saran ... 32
DAFTAR PUSTAKA ... 33
xvi
DAFTAR TABEL
Tabel Hal
Tabel 5.1. Jumlah genotipe dan frekuensi alel sapi bali Nusa
Penida-Bali………. 27
Tabel 5.2. Nilai Polymorphic Informative Content (PIC) sapi bali di Nusa
xvii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Hal
Gambar 2.1. Posisi primer depan, primer belakang dan produk PCR gen
GH………... 10
Gambar 3.1. Kerangka Konsep Penelitian……… 15 Gambar 4.1. Alur Pelaksanaan Penelitian……… 17 Gambar 5.1. Visualisasi amplifikasi gen Growth Hormon sapi bali pada
gel agarose 1,5% ( M ; marker 100 bp, 1-8 : sampel
penelitian)……… 25
Gambar 5.2. Visualisasi PCR-RFLP GH HaeIII pada gel poliakrilamid 8% (M ; marker 100bp, 1-4 ; amplifikasi gen GH, R1-R4 ;
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Hal
Lampiran 1. Perhitungan Rumus………...………... 39 Lampiran 2. Visualisasi 50 Produk PCR dan Restriksi GH HaeIII...…… 41
1 BAB I
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Sapi bali merupakan salah satu sapi lokal Indonesia yang memberi kontribusi dalam penyediaan daging untuk memenuhi kebutuhan protein hewani masyarakat. Sapi bali mempunyai keunggulan diantaranya memiliki tingkat fertilitas yang tinggi, mampu beradaptasi dengan baik terhadap lingkungan yang baru, memiliki daging berkualitas baik dengan kadar lemak yang rendah, serta memiliki produksi karkas yang tinggi (Handiwirawan dan Subandriyo, 2004). Dengan keunggulan tersebut sapi bali menjadi salah satu kandidat sapi lokal yang mutu bibitnya perlu ditingkatkan.
Sapi bali tersebar di seluruh wilayah Indonesia bahkan juga terdapat di Negara Asia Tenggara lainnya, Australia, Texas, dan tersebar di 112 kebun binatang dan penangkaran dalam jumlah terbatas di seluruh dunia (Davendra et al., 1973; Kirby, 1979; Scherf, 1995; Talibet al., 1998). Walaupun demikian, sapi bali di Indonesia hampir semuanya bermula dari sapi bali yang ada di Bali dan hasil pembuktian menunjukkan sapi bali di Bali adalah yang paling murni (Namikawa dan Widodo, 1978; Namikawa et al., 1980) jika digunakan darah banteng sebagai kontrolnya.
2
2013, Nusa Penida merupakan kawasan pengembangan dan pusat pembibitan sapi bali oleh karena itu diperlukan strategi untuk mendapatkan bibit yang unggul tidak hanya dengan seleksi secara fenotipe namun juga secara genotipe melalui marka gen yang disebut Marker-Assisted Selection (MAS) (Chung et al., 1998).
Salah satu gen yang berpotensi menyandi sifat produksi seperti bobot badan, tinggi pundak, panjang badan dan lingkar dada adalah gen Growth
Hormone (GH) (Unanian et al., 2002). Gen GH yang menyandi hormon
pertumbuhan diketahui sangat berperan dalam pertumbuhan, laktasi dan perkembangan kelenjar susu, gluconeogenesis, aktivasi lipolisis dan memicu inkorporasi asam amino dalam protein otot (Burton et al., 1994). Gen GH telah dipetakan terletak pada kromosom 19 dengan lokasi q26-qtr (Hediger et al., 1990).
Nusa Penida merupakan kawasan pemurnian dan pembibitan sapi bali dimana Nusa Penida terdiri dari wilayah dataran tinggi dan dataran rendah (Tejasinarta, 2013). Menurut Noor (2002), suatu individu/genotipe dapat menampilkan lebih dari satu bentuk morfologi, status fisiologi dan/atau tingkah laku sebagai respon terhadap perubahan lingkungan yang dikenal dengan sebutan kelenturan fenotipik.
3
di wilayah lainnya di Bali. Demikian juga dengan kadar hormon sapi bali di Nusa Penida (Suwiti et al., 2014 ; Saka et al., 2011). Dimana diketahui sekresi hormon pertumbuhan dipengaruhi oleh gen GH. Kondisi geografis dataran tinggi Nusa Penida curah hujannya lebih tinggi dibandingkan dataran rendah dimana berpengaruh terhadap nutrisi pada pakan ternak dimana pakan hijauan pada daerah tersebut mengandung nutrisi lebih baik (Kadarsih, 2004). Dengan nutrisi yang baik akan semakin meningkatkan growth hormone releasing hormone
(GHRH) yaitu IGF-1 dan ghrelin dimana merupakan penginduksi pelepasan
hormon pertumbuhan (Kojima et al., 2001). Sebaliknya, dataran rendah Nusa Penida memiliki suhu yang terlalu tinggi yang dapat menyebabkan ternak menjadi stres sehingga terjadi penurunan sekresi hormon pertumbuhan (Shimon et al.,
4
1.2 Rumusan Masalah
1.2.1 Bagaimanakah karakteristik gen Growth Hormone bibit sapi bali di Nusa Penida ?
1.2.2 Apakah ada perbedaan polimorfisme gen Growth Hormone yang direstriksi dengan enzim HaeIII pada bibit sapi bali yang dipelihara di daerah dataran tinggi dengan daerah dataran rendah di Nusa Penida ?
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Untuk mengidentifikasi karakteristik gen Growth Hormone bibit sapi bali di Nusa Penida.
1.3.2 Untuk mengetahui polimorfisme gen Growth Hormone pada bibit sapi bali yang dipelihara pada daerah dataran tinggi dengan daerah dataran rendah di Nusa Penida.
1.4 Manfaat Penelitian
5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Gambaran Umum Sapi Bali
Sapi bali (Bos Sondaicus) adalah sapi asli Indonesia hasil domestikasi banteng liar. Para ahli meyakini bahwa penjinakan tersebut telah dilakukan sejak akhir abad ke-19 di Bali sehingga sapi jenis ini dinamakan sapi bali. Bangsa sapi bali memiliki klasifikasi taksonomi menurut (Williamson dan Payne, 1993) sebagai berikut ; Phylum : Chordata, Sub-phylum : Vertebrata, Class : Mamalia, Ordo : Artiodactyla, Sub-ordo : Ruminantia, Family : Bovidae, Genus : Bos, Species : Bos sondaicus.
6
pantat. Dibandingkan dengan sapi bali jantan, sapi bali betina relatif lebih kecil dan berat badannya sekitar 250 hingga 350 kg (Darmaja, 1980).
2.2 Keragaman Genetik
Genotipe hewan merupakan sebuah pendekatan yang berguna untuk menggambarkan prinsip-prinsip genetika dan penerapan langsung dalam hal pewarisan sifat. Hukum Hardy-Weinberg menyatakan bahwa frekuensi genotipe suatu populasi yang cukup besar akan selalu dalam keadaan seimbang bila tidak ditemukan seleksi, migrasi, mutasi, dan genetic drift. Sifat-sifat ditemukan dalam keragaman genetik dalam spesies dan bangsa atau galur dalam masing-masing spesies. Genetika dipandang dari segi populasi, terutama frekuensi gen dengan efek yang diinginkan (Yuniarsih et al., 2011).
Frekuensi gen merupakan istilah yang digunakan untuk menunjukkan proporsi dari semua lokus untuk pasangan gen atau rangkaian alel ganda dalam suatu populasi. Frekuensi gen dari perbedaan-perbedaan itu sangat beragam dari bangsa-bangsa dan antar galur. Frekuensi gen yang timbul dipengaruhi oleh seleksi, mutasi gen, pencampuran dua populasi yang frekuensi gen berbeda, silang dalam (inbreeding), silang luar (outbreeding) dan genetic drift (Yuniarsih et al.,
2011).
7
kromosom disebut lokus. Bila individu mempunyai alel yang sama pada pasangan kromosom individu tersebut disebut homozigot dan bila alelnya berbeda pada sekuensing DNA maka individu tersebut disebut heterozigot. Alel ditemukan berada pada lokus dan mempengaruhi genotipe dari lokus tersebut. Menurut Hartl dan Clark (1997) sebuah lokus yang polimorfik ditandai dengan salah satu frekuensi alel yang kurang dari 0,95.
Eksperesi gen dapat mempengaruhi sifat yang muncul. Fenotipik yang muncul dapat dipengaruhi oleh variasi gen pada arah dan besar respon terhadap perubahan lingkungan (Noor, 2008). Fenotipik yang bersifat ekonomis merupakan sifat kuantitatif yang dikontrol oleh banyak gen dan masing-masing gen memberikan sedikit kontribusi pada sifat tersebut (Noor, 2008). Gen semacam ini disebut dengan gen mayor yang terletak pada lokus sifat kuantitatif atau
quantitative traits loci (QTL). Gen mayor dapat digunakan sebagai kandidat
dalam program Marker Assisted Selection (MAS) apabila gen tersebut mempunyai fungsi dan pengaruh biologis yang nyata terhadap sifat kuantitatif (Diyono, 2009).
2.3 Gen Bovine Growth Hormone
8
dikarakterisasikan oleh peningkatan ukuran dari sel individu (hypertrophy) sama seperti peningkatan jumlah sel pada jaringan (hyperplasia) (Aberle et al., 2001).
Pertumbuhan dipengaruhi oleh bovine growth hormon (BGH) secara alami dihasilkan oleh somatotrof, subclass dari sel hipofisa acidophilic yang terletak dalam kelenjar hipofisa bagian depan (Reis et al. 2001). BGH merupakan hormon pertumbuhan pada sapi memiliki ukuran sebesar 22 kilo Dalton (kDa) yang disusun oleh 190-191 asam amino sebagai produk dari gen BGH (Gordon et
al., 1983). Sekresi hormon pertumbuhan pada sapi dipengaruhi oleh banyak faktor
salah satunya adalah faktor ketinggian tempat pemeliharaan (Herd dan Sprott, 1986). Hal ini berkaitan dengan curah hujan, karakteristik lahan, suhu dan kelembaban yang berpengaruh terhadap nutrisi pada pakan ternak dimana pakan hijauan pada daerah yang curah hujannya tinggi mengandung nutrisi lebih baik daripada daerah dengan curah hujan yang rendah (Kadarsih, 2004). Dengan nutrisi yang baik akan semakin meningkatkan growth hormone releasing hormone
(GHRH) yaitu IGF-1 dan ghrelin dimana merupakan penginduksi pelepasan
9
Gen Bovine Growth Hormone (BGH) adalah gen yang menyandi hormon pertumbuhan (growth hormone) pada kelompok bovine. Gen BGH merupakan salah satu gen utama dalam mempengaruhi pertumbuhan dengan mempengaruhi sekresi hormon pertumbuhan. Fungsi dari gen BGH pada sapi menjadi hal yang penting dikarenakan gen BGH mengatur sifat-sifat yang bernilai ekonomi yang tinggi (Carnicella et al. 2003). Gen BGH memiliki peranan yang sangat penting dalam pengaturan regulasi pertumbuhan dan matabolisme dari tubuh ternak.
Gen Bovine growth hormon (BGH) merupakan gen yang sangat
mendasar dan berperan dalam pertumbuhan dan pertambahan bobot badan pada ternak (Sutarno, 1998). Gen BGH merupakan gen dalam pengaturan produksi susu, karkas dan respon imun (Granner, 2003). Selain itu, gen BGH juga diperlukan dalam pertumbuhan jaringan, metabolisme lemak dan reproduksi (Burton et al., 1994).
10
Gambar 5.1. Posisi primer depan, primer belakang dan produk PCR gen GH (Sari
et al., 2012)
2.4 Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism
(PCR-RFLP)
Polymerase chain reaction (PCR) adalah satu dari teknik yang paling banyak diaplikasikan dalam biologi molekuler. PCR dikembangkan pertama kali pada tahun 1985 oleh Kary Mullis (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Teknik ini merupakan teknik perbanyakan DNA secara in-vitro. Teknik ini memungkinkan adanya amplifikasi antara dua region DNA yang diketahui hanya di dalam tabung reaksi tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in-vivo).
11
Lima bahan baku yang diperlukan untuk melakukan PCR adalah DNA template yaitu DNA tempat PCR dilakukan, primer, enzim taq polimerase, nukleotida (dNTP), dan bufer polimerase. Sampel target merupakan DNA yang ingin diamplifikasi. Primer merupakan untai DNA pendek yang menempel pada fragmen DNA target, serta sebagai tempat awal terjadinya replikasi. Enzim taq polimerase berfungsi untuk replikasi DNA. Larutan dNTP (mengandung dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP) perlu ditambahkan agar DNA polimerase dapat membentuk kompleks rantai baru yang komplementer. Reaksi PCR membutuhkan suatu bufer yang mengandung MgCl2 karena aktivitas enzim polimerase
dipengaruhi oleh konsentrasi ion Mg2+. Ion Mg2+ akan menstimulasi aktivitas enzim secara maksimal pada konsentrasi 2 mM. Jika konsentrasinya lebih tinggi, maka dapat bersifat sebagai inhibitor (Sambrook et al., 1989).
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) merupakan suatu
teknik pengembangan dari PCR yang menganalisis variasi pada sekuen DNA homolog. Hal ini mengacu pada lokasi situs enzim restriksi yang berbeda antar sampel molekul DNA homolog. Pada analisis RFLP, sampel DNA terpisah menjadi potongan-potongan dan selanjutnya dicerna oleh enzim restriksi kemudian fragmen restriksi yang dihasilkan dipisahkan menurut panjangnya dengan gel elektroforesis. Tahapan RFLP meliputi 4 tahap yaitu isolasi DNA, pemotongan DNA dengan enzim restriksi endonuklease, elektroforesis hasil pemotongan DNA dan southern blot (Fanani, 2011).
12
penghilangan (delesi), maupun subtitusi nukleotida yang terjadi pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi menyebabkan tidak lagi dikenalinya situs pemotongan enzim restriksi dan terjadinya perbedaan pola pemotongan DNA (Lewin, 1994). Metode RFLP telah diterapkan untuk mendeteksi Quantitative
Traits Loci (QTL) pada ternak. Pendeteksian RFLP telah dikembangkan dan
digunakan untuk studi linkage pada ternak seperti sapi, ayam dan babi. Pendeteksian RFLP dilakukan pada sekuen DNA yang telah diketahui fungsinya, misalnya gen (penyandi protein), dan juga pada sekuen DNA yang belum jelas fungsinya (Montgomery dan Kinghorn, 1997).
Menurut Suryanto (2003), PCR-RFLP digunakan untuk melihat polimorfisme dalam genom organisme dengan menggunakan suatu enzim pemotong tertentu (enzim restriksi), karena sifatnya spesifik, maka enzim ini akan memotong situs tertentu yang dikenali oleh enzim ini. Situs enzim pemotong dari genom suatu kelompok organisme yang kemudian berubah karena mutasi atau berpindah karena genetic rearrangement dapat menyebabkan situs tersebut tidak lagi dikenali oleh enzim atau enzim restriksi akan memotong daerah lain yang berbeda. Proses ini menyebabkan terbentuknya fragmen-fragmen DNA yang ukurannya berbeda dari satu organisme ke organisme lainnya. Beberapa enzim yang digunakan untuk memotong pada reaksi PCR-RFLP diantaranya enzim
