33 BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan Laboratorium Sintesis Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Malang.
4.2 Alat Penelitian
4.2.1 Pembuatan Serbuk Simplisia (1) Pengayak mesh 30-45
(2) Blender (3) Oven binder
(4) Timbangan analytic balance Scout Pro 400 4.2.2 Identifikasi Bakteri Propionibacterium acnes
(1) Object glass (2) Bunsen (3) Kawat ose
(4) Mikroskop cahaya
4.2.3 Pengujian Difusi Cakram (1) Laminar Air Flow
(2) Inkubator (3) Autoklaf (4) Tabung Reaksi (5) Bunsen
(6) Mikro pipet (7) Erlenmeyer (8) Hotplate (9) Penjepit (10) Pipet volume (11) Kertas saring
(12) Kawat ose (13) Cawan petri (14) Cotton bud (15) Jangka sorong (16) Ependorf (17) Vorteks
4.2.4 Proses Ekstraksi
(1) Timbangan analytic balance Scout Pro 400 (2) Gelas ukur
(3) Desikator (4) Cawan porselen (5) Penyaring Buchner (6) Oven binder (7) Pipet tetes
(8) Batang pengaduk (9) Stopwatch (10) Sudip besi (11) Erlenmeyer (12) Beaker glass
(13) Rotary evaporator vacuum (14) Mesin pengaduk
4.2.5 Identifikasi Profil KLT (1) Chamber
(2) Lempeng KLT (3) Cawan porselen (4) Penampak noda (5) Hotplate
(6) Pinset
(7) Pipa kapiler 5 μl (8) Sinar UV
(9) Timbangan analytic balance (10) Vorteks
4.3 Bahan Penelitian 4.3.1 Bahan Uji
Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak etanol buah Limonia acidissima L. Bagian buah yang diambil yaitu bagian buah yang belum matang yang berwarna putih kekuningan. Buah ini didapatkan di kota Bima NTB yang diambil dengan cara memecahkan tempurungnya, kemudian isi dikikis dengan menggunakan sendok. Selanjutnya hasil kikisan dijemur dibawah sinar matahari hingga kering, sehingga diperoleh sampel berupa simplisia. Simplisia tersebut digiling sehingga diperoleh sampel berupa serbuk dengan ukuran 30−45 mesh. Bakteri uji yang digunakan adalah Propionibacterium acnes yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Parasitologi Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Proses Ekstraksi
(1) Pelarut etanol teknis (CV. Amani Media) (2) Daging buah kinca (Limonia acidissima L.) 4.3.3 Identifikasi Bakteri Propionibacterium acnes
1. Peremajaan bakteri Propionibacterium acnes 2. Crystal violet (PT. Bratachem)
3. Lugol (PT. Bratachem)
4. Alkohol 96% (PT. Bratachem) 5. Safranin (PT. Bratachem) 4.3.4 Pengujian Difusi Cakram
(1) Fraksi Etanol daging buah Limonia acidissima L.
(2) Aquadest steril (PT. Bratachem) (3) Nutrient Agar (NA) (CV. Gematama)
(4) DMSO 1% (PT. Merck Chemicals and Life Sciences) (5) Propionibacterium acnes
(6) Klindamisin 30 μg/ cakram (CV. Gematama) 4.3.5 Identifikasi Senyawa dengan KLT
(1) Etil asetat teknis (CV. Krida Tama Persada) (2) N-heksan teknis (CV. Krida Tama Persada)
(3) Pereaksi FeCl3 (PT. Merck Chemicals and Life Sciences) (4) Asam Sulfat 10% (PT. Merck Chemicals and Life Sciences)
(5) Anisaldehida asam sulfat (PT. Merck Chemicals and Life Sciences) (6) Dragendorf (CV. Makmur Sejati)
(7) KOH 10% (PT. Bratachem) 4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas
Senyawa zat kimia pada fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L.
dengan konsentrasi fraksi sebesar 10%, 15%, dan 20% digunakan sebagai variabel bebas pada penelitian ini.
4.4.2 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah diameter zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi etanol buah Limonia acidissima L.dalam menghambat pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes yang ditandai dengan adanya zona bening disekitar senyawa uji pada media agar, dimana besarnya diameter zona bening tersebut menandakan daya hambat dari aktivitas senyawa uji fraksi etanol Limonia acidissima L.
4.5 Definisi Operasional
(1) Senyawa uji pada penelitian ini adalah senyawa yang terdapat pada fraksi etanol buah Limonia acidissima L. yang dipisahkan dengan teknik pewarnaan.
(2) Diagonal zona hambat adalah zona bening yang dihasilkan oleh aktivitas senyawa uji fraksi etanol buah Limonia acidissima L., dimana besarnya diagonal zona bening tersebut menandakan daya hambat dari aktivitas senyawa uji fraksi etanol buah Limonia acidissima L.
4.6 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat yang akan digunakan awalnya disterilkan dengan proses sterilisasi yaitu dengan cara sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Alat dan bahan yang akan disterilkan antara lain yaitu cawan petri, penjepit, erlenmeyer, spatula, Nutrient Agar (NA) dan bahan lain yang akan digunakan dengan sterilisasi di autoklaf.
4.6.1 Sterilisasi Kering
Sterilisasi kering meliputi cara sterilisasi dengan api langsung dan cara sterilisasi dengan oven pemanas.
(1) Sterilisasi dengan api langsung
Sterilisasi ini dilakukan untuk peralatan seperti spatel, pinset, jarum ose, mulut tabung dan batang pengaduk.
(2) Sterilisasi dengan oven pemanas
Penggunaan oven pemanas ini dilakukan untuk sterilisasi peralatan gelas yang tidak memiliki skala seperti tabung reaksi, cawan petri, dan pipet. Alat-alat yang disterilkan dimasukkan dalam oven ketika mencapai suhu 160º C selama 1-2 jam.
4.6.2 Sterilisasi Basah
Metode sterilisasi ini menggunakan autoklaf. Peralatan yang disterilkan dengan metode sterilisasi basah diantaranya adalah gelas ukur, pipet tetes, dan erlenmeyer, serta bahan yang harus disterilkan untuk media pertumbuhan yaitu Nutrien Agar (NA) Proses sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121º C selama 15-20 menit.
4.7 Metode Penelitian 4.7.1 Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan bersifat eksperimental yang bertujuan untuk memperoleh data terkait diameter zona hambat senyawa yang terdapat dalam fraksi Etanol daging Limonia acidissima L. terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes secara in-vitro dengan metode difusi cakram. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni kelompok uji dengan
konsentrasi 10%, 15%, dan 20% yaitu kelompok kontrol yaitu klindamisin dan fraksi etanol. Penelitian ini melalui beberapa tahapan yaitu :
(1) Persiapan simplisia
(2) Penarikan komponen senyawa/fraksinasi (3) Identifikasi kandungan kimia ekstrak
(4) Pengujian antibakteri dengan metode difusi cakram 4.7.2 Kerangka Operasional
Gambar 4. 1 Skema Kerangka Operasional
4.8 Prosedur Kerja 4.8.1 Penyiapan Simplisia
Sampel yang dilakukan penelitian adalah buah Limonia acidissima L. buah dicuci menggunakan air hingga dirasa telah bersih kemudian dilakukan pengeringan pada suhu ruang dengan cara diangin-anginkan tanpa terkena sinar matahari langsung. Setelah kering kemudian langkah selanjutnya dihaluskan
Preparasi Sterilisasi alat
dan bahan
Pengujian antibakteri dengan metode difusi cakram fraksi Limonia acidissima L. konsentrasi
10%, 15%, 20%
Kelompok kontrol
+ (Positif) : Klindamisin 30 μg/cakram
- (Negatif) : DMSO 0,1 ml + aquadest ad 1 ml Diukur luas area
yang bening dan dianalisis data
Preparasi bakteri Propionibacterium acnes Penyiapan simplisia serbuk
daging buah Limonia acidissima L.
Pembuatan fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L.
Optimasi eluen dan eluasi
Identifikasi senyawa dengan KLT
dengan bantuan mesin penggiling, sehingga diperoleh serbuk halus. Kemudian diayak dengan bantuan Shieve Shaker dengan derajat kehalusan tertentu.
4.8.2 Proses Ekstraksi Bahan Uji dengan Pelarut Etanol
Dalam penelitian kali ini menggunakan metode fraksinasi bertingkat dengan 3 pelarut berdasarkan kepolarannya yakni n-heksan, etil asetat, dan etanol.
Fraksinasi dimulai dari pelarut non-polar yaitu n-heksana, kemudian dilanjutkan dengan pelarut semipolar yaitu etil asetat, dan selanjutnya dengan pelarut polar yaitu etanol. Dalam pembuatan fraksi etanol digunakan serbuk daging buah Limonia acidissima L. sebanyak 1300 gram dengan menggunakan metode maserasi (perendaman) selama 24 jam dengan cara sebagai berikut :
(1) Masukkan residu serbuk daging buah Limonia acidissima L. Seberat 1300 gram yang sebelumnya telah difraksinasi terlebih dahulu dengan pelarut n- heksan dan etil asetat ke dalam sebuah bejana bermulut besar.
(2) Serbuk daging buah ditambahkan dengan 13000 ml (Perbandingan 1:10) etanol direndam selama 24 jam dan disaring dengan corong buchner dan tampung filtratnya (filtrat 1 dan residu 1).
(3) Residu 1 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml (Perbandingan 1:5) direndam selama 24 jam. Saring dengan corong buchner dan tampung filtratnya (filtrat 2 dan residu 2).
(4) Residu 2 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml (Perbandingan 1:5) direndam selama 24 jam. Saring dengan corong buchner dan tampung filtratnya (filtrat 3 dan residu 3).
(5) Metode ini dikerjakan secara berulang sampai filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan pelarut etanol. Pada pengujian KLT dilakukan penotolan sebanyak 5 µl pada masing-masing filtrat untuk melihat kepekatan dari filtrat yang didapat. Hal ini ditandai dengan tidak adanya lagi pembentukan noda pada plat KLT.
(6) Filtrat digabungkan kemudian dipekatkan dengan Rotary evaporator vacuum memakai suhu 40°C hingga didapatkan larutan ekstrak kental. Lalu
ekstrak kental dipindahkan ke cawan porselen. Ekstrak kental dikeringkan di oven dengan suhu 40ºC sampai bobot konstan.
(7) Setelah konstan, ekstrak disimpan dilemari pendingin sampai siap digunakan.
4.8.3 Skrining Fitokimia Senyawa dengan KLT
Fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. disiapkan dengan cara ditimbang menggunakan timbangan kasar sejumlah 50 mg kemudian dilarutkan dalam 1 ml etanol di wadah tertutup rapat. Setelah itu, ditotol sebanyak 5 μl pada lempeng KLT, kemudian dieluasi dengan berbagai macam fase gerak. Eluen yang memiliki kemampuan terbaik dalam memisahkan komponen senyawa, akan digunakan pada pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram (Depkes RI, 2008).
(1) Fase diam : Silika Gel TLC 60 F254
(2) Optimasi fase gerak :
a. n-Heksan : etil asetat = 5 : 5 b. n-Heksan : etil asetat = 2 : 8 c. n-Heksan : etil asetat = 7 : 3 d. n-Heksan : etil asetat = 3 : 7 4.8.4 Identifikasi Komponen Senyawa
Senyawa komponen yang terpisah dengan metode KLT, diidetifikasi senyawa metabolit sekundernya yang terdapat pada ekstrak etanol dengan diberikan penampak noda sebagai berikut :
(1) Terpenoid : anisaldehida-asam sulfat.
Panaskan lempeng pada suhu 100°C selama 5-10 menit. Hasil positif terpenoid ditunjukkan dengan adanya noda berwarna ungu
(2) Alkaloid : dragendorff
Hasil positif alkaloid ditunjukkan dengan adanya noda berwarna jingga (3) Flavonoid : uap amonia atau asam sulfat 10 %
Hasil positif flavanoid ditunjukkan dengan adanya noda berwarna kuning intensif
(4) Antrakuinon : larutan kalium hidroksida 10% dalam etanol
Hasil positif antrakuinon ditunjukkan dengan adanya noda berwarna kuning, kuning coklat, merah ungu atau hijau ungu.
(5) Polifenol dan Tanin : besi (III) klorida 1%
Hasil positif polifenol ditunjukkan dengan adanya noda berwarna hitam (6) Saponin : Ekstrak sebanyak 0,3 gram di tambahkan air suling 10 ml, di
kocok kuat selama 30 detik. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya buih yang stabil selama 30 menit dengan tinggi 3 cm di atas permukaan cairan.
(Jaya, 2010)
4.8.5 Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji
Pembuatan konsentrasi larutan uji dibuat dengan cara sebagai berikut :
(1) Fraksi etanol buah Limonia acidissima L. ditimbang sebanyak 100 mg larutkan dalam 0,1 DMSO, ditambahkan aquadest steril hingga 1,0 ml untuk memperoleh larutan uji 10 %
(2) Fraksi etanol buah Limonia acidissima L. ditimbang sebanyak 150 mg larutkan dalam 0,1 DMSO, ditambahkan aquadest steril hingga 1,0 ml untuk memperoleh larutan uji 15 %
(3) Fraksi etanol buah Limonia acidissima L. ditimbang sebanyak 200 mg larutkan dalam 0,1 DMSO, ditambahkan aquadest steril hingga 1,0 ml untuk memperoleh larutan uji 20 %
4.8.6 Preparasi Media
Untuk pembiakan bakteri Propionibacterium acnes, ini media yang digunakan adalah media nutrien agar yang dibuat dengan melarutkan bahan nutrien agar dengan jumlah 5,6 gram ke dalam 200 ml pada gelas ukur kapasitas 250 ml, untuk mempermudah kelarutannya gelas ukur dapat diletakkan diatas pengaduk magnet. Setelah larut, dituangkan kedalam labu erlenmeyer, disumbat kapas dan ditutup dengan aluminium foil kemudian disterilkan menggunakan alat autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C. Dituang ke masing-masing cawan petri hingga memadat pada suhu kamar.
4.8.7 Pembuatan Suspensi Bakteri Propionibacterium acnes
Pada proses peremajaan, bakteri Propionibacterium acnes berasal dari biakan murni, dalam NaCl fisiologis steril biakan murni disterilkan selama 2 jam.
Kemudian diambil 1 ml biakan dan dimasukkan ke cawan petri berisi media nutrient broth sebanyak 20 ml, diaduk secara perlahan dengan memutar-mutarkan cawan hingga agar dan suspensi bakteri homogen, setelah itu dibekukan dan dilakukan inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C.
Bakteri yang diperoleh dari peremajaan bakteri diambil menggunakan jarum ose steril dan dimasukkan ke tabung reaksi yang telah berisi 9 ml aquadest steril.
Kemudian divorteks agar suspensi bakteri Propionibacterium acnes homogen.
Kekeruhan dari bakteri dapat dibandingkan dengan standart McFarland. Standart McFarland merupakan standarisasi konsentrasi mikroba dengan menggunakan larutan BaCl2 1% dan H2SO4 1%. Standart kekeruhan McFarland dimaksudkan untuk menggantikan perhitungan mikroba satu per satu secara visual mendekati konsentrasi sel dalam suspensi dengan menggunakan skala mewakili konsentrasi tertentu dari CFU/ml dan untuk memperkirakan kepadatan sel yang akan digunakan pada prosedur pengujian antimikroba (Sutton, 2011).
Apabila kekeruhan masih belum sama, dapat ditambahkan aquadest steril atau bakteri Propionibacterium acnes lagi, hingga diperoleh kekeruhan yang sama. Dari kesamaan kekeruhan dengan standart yang telah ditetapkan tersebut, sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan tingkat kekeruhan 108 CFU/ml (Colony Forming Unit / mililiter) dan sesuai dengan standart McFarland. Setelah itu siapkan 2 tabung kosong yang masing-masing diisi 9 ml aquadest steril (tabung 2 dan tabung 3). Selanjutnya, dipipet 1 ml pada tabung 1 dan dimasukkan pada tabung 2 kemudian divorteks hingga homogen. Hasil dari tabung 2 tersebut didapatkan tingkat kekeruhan bakteri 107 CFU/ml. Kemudian dari tabung 2 dipipet 1 ml dan dimasukkan dalam tabung 3 lalu divorteks hingga homogen.
Hasil dari tabung 3 didapatkan tingkat kekeruhan bakteri 106 CFU/ml.
Tabel IV. 1 Standar Kekeruhan McFarland
No. Standard
McFarland
1% BaCl2
(ml)
1% H2SO4
(ml) CFU/ml
TM50 0.5 0.05 9.95 1.5 x 108
TM51 1.0 0.10 9.90 3.0 x 108
TM52 2.0 0.20 9.80 6.0 x 108
TM53 3.0 0.3 9.7 9.0 x 108
TM54 4.0 0.4 9.6 1.2 x 109
TM55 5.0 0.5 9.5 1.5 x 109
TM56 6.0 0.6 9.4 1.8 x 109
TM57 7.0 0.7 9.3 2.1 x 109
TM58 8.0 0.8 9.2 2.4 x 109
TM59 9.0 0.9 9.1 2.7 x 109
TM60 10.0 1.0 9.0 3.0 x 109
Sumber : (Dalynn Biologicals, 2014)
Kemudian diambil dengan cotton bud steril yang telah ditiriskan terlebih dahulu pada dinding tabung, kemudian ditanam pada media agar dengan metode streak plate (metode cawan gores) dengan cara digoresan secara kontinyu sampai setengah permukaan agar, membentuk garis horizontal disatu cawan petri.
Kemudian putar cawan 180° dan lanjutkan goresan sampai habis. Dilanjutkan goresan dari arah yang berlawanan dengan cara yang sama, dan diakhiri dengan memutar cotton bud pada tepi cawan membentuk arah 180°. Goresan yang berkesinambung bertujuan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru. Setelah itu, media dibiarkan selama 15 menit agar bakteri dapat berdifusi ke media.
4.8.8 Identifikasi Karakteristik Propionibacterium acnes
Identifikasi bakteri dilakukan bertujuan untuk membuktikan bahwa biakan bakteri yang digunakan dalam penelitian merupakan bakteri Propionibacterium acnes. Karakteristik bakteri Propionibacterium acnes dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu pewarnaan gram dan uji biokimia.
(1) Pewarnaan Gram
1 ose biakan yang tumbuh pada Nutrient agar miring diletakkan pada object glass kemudian dilakukan fiksasi. Setelah itu, sediaan ditetesi dengan crystal violet dan didiamkan 2-3 menit kemudian dibilas dengan air.
Selanjutnya ditetesi dengan larutan iodin dan di diamkan 1 menit. Setelah itu dibilas dengan alkohol 96% selama 5-10 detik sambil digoyang- goyangkan hingga tidak terdapat zat warna yang mengalir diatas sediaan, lalu dibilas lagi dengan air. Kemudian ditetesi lagi dengan larutan safranin, didiamkan selama 30 detik, cuci dengan air, keringkan di udara, lalu diamati di bawah mikroskop.
(2) Uji Biokimia Uji Katalase
1 ose biakan murni bakteri murni Propionibacterium acnes yang telah diinkubasi selama 24 jam, kemudian diletakkan pada object glass.
Kemudian ditetesi dengan H2O2 3%. Apabila terdapat buih maka menunjukkan adanya bakteri Propionibacterium acnes karena menghasilkan enzim katalase.
4.8.9 Pengujian Difusi Cakram
Proses pengujian antibakteri untuk metode difusi cakram antara lain sebagai berikut :
(1) Siapkan tabung ependorf yang berisi larutan uji berkonsentrasi 10%, 15%, dan 20%. Totolkan pada kertas cakram kosong sebanyak 10 µl dengan menggunakan mikropipet. Kemudian dikeringkan pada oven dengan suhu 37°C selama 20 menit. Dilakukan pengulangan hingga larutan yang ditotolkan dalam disk sebanyak 50 µl. Sehingga konsentrasi pada kertas cakram untuk larutan uji 10% yaitu 5 mg/cakram, pada konsentrasi 15%
yaitu 7,5 mg/cakram, dan pada konsentrasi 20% yaitu 10 mg/cakram.
Setelah itu dilakukan sterilisasi cakram dengan menggunakan UV selama 1 jam hal ini mengurangi kontaminasi pada fraksi etanol.
(2) Disiapkan preparasi bakteri dalam media cair dengan tingkat kekeruhan CFU/ml yang telah dibandingkan dengan standart McFarland.
(3) Bakteri yang telah dipreparasi diambil dengan cara mencelupkan cotton bud steril satu kali, lalu diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian cotton bud steril tersebut diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak.
Setelah itu inokulum diratakan ke seluruh permukaan media sebanyak 3 kali dengan memutar cawan dengan sudut 60° untuk setiap pengolesan. Lalu oleskan cotton bud steril ke sekeliling pinggiran permukaan agar. Biarkan inokulum mengering selama beberapa menit pada suhu ruang dengan cawan tertutup (World Health Organization (WHO), 2009).
(4) Media nutrien agar yang telah dioleskan bakteri Propionibacterium acnes dibiarkan dahulu 5 menit supaya mengering. Kertas cakram dengan diameter 6 mm sebanyak 3 buah yang telah ditetesi sampel uji, kontrol negatif, dan kontrol positif yaitu klindamisin 30 μg/cakram 1 buah kemudian diletakkan pada media nutrien agar dengan jarak tiap cakram 3 cm dan dari tepi lempeng sebesar 2 cm. Kertas cakram saring ditekan lembut dengan menggunakan pinset pada permukaan media sehingga terdapat kontak yang baik antara dengan media nutrien agar. Jarak diatur sedemikian rupa sehingga satu cakram dengan cakram lainnya berjauhan.
(5) Langkah selanjutnya semua media nutrien agar diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
(6) Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan yang dilakukan setiap 24 jam dengan melihat adanya zona jernih di sekitar kertas cakram. Zona hambatan yang terbentuk diukur dengan jangka sorong dalam satuan millimeter (mm).
(7) Lakukan replikasi sebanyak 3 kali.
4.9 Bagan Alur Penelitian
(1) Proses Pembuatan Fraksi Etanol Daging Buah Limonia acidissima L.
Gambar 4. 2 Bagan Alur Proses Pembuatan Fraksi Etanol Daging Buah Limonia acidissima L.
Ditimbang serbuk daging buah Limonia acidissima L. sebanyak 1300 gram yang telah difraksinasi terlebih dahulu dengan pelarut n-heksan dan etil asetat kemudian dilanjutkan dengan pelarut etanol dengan menggunakan metode maserasi (perendaman) selama 24 jam.
Residu serbuk daging buah ditambahkan dengan 13000 ml (Perbandingan 1:10) etanol direndam selama 24 jam dan disaring dengan corong buchner dan tampung filtratnya.
Maserasi kembali dengan etanol sejumlah 6500 ml (1:5) direndam selama 24 jam. Saring dengan corong buchner dan tampung filtratnya.
Residu 1
Maserasi kembali dengan etanol sejumlah 6500 ml (1:5) direndam selama 24 jam. Saring dengan corong buchner dan tampung filtratnya.
Residu 2
Proses maserasi ini dilakukan dengan metode yang sama secara berulang sampai pada filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan pelarut etanol, ditandai dengan tidak ada noda yang terbentuk pada plat KLT.
Residu 3
Pekatkan seluruh filtrat dengan rotary evaporator vacuum sampai diperoleh larutan kental dan
dikeringkan di oven pada suhu 40oC.
Fraksi etanol
Filtrat 1
Filtrat 2
Filtrat 3
(2) Proses Pengujian Antibakteri dengan Metode Difusi Cakram
Gambar 4. 3 Prosedur Pengujian Antibakteri dengan Metode Difusi Cakram Uji
Fraksi 1 (10%)
K+
K + (Klindamisin 30 μg/cakram) K – (Aquades +
DMSO 1%)
K- 2
1 3
3 cm
2 cm
Media uji ini diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
Dilakukan replikasi tiga kali untuk tiap konsentrasi uji
Analisis data Uji
Fraksi 2 (15%)
Uji Fraksi
3 (20%)
4.10 Analisis Data
Analisis data dilakukan secara deskriptif yaitu dengan melakukan pengukuran diameter zona hambat yaitu area bening dari masing–masing sampel uji fraksi etanol Limonia acidissima L.
