BAB IV
METODELOGI PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian eksperimental (laboratorik) 4.2 Populasi
Stok kultur C.Tropicalis yang sudah siap diujikan dan sudah di standartkan 4.3 Sampel
Sebagian stok kultur C.Tropicalis yang sudah siap diujikan 4.4 Ukuran Sample
Jumlah perlakuan dalam metode ini sebanyak 5 buah dengan jumlah pengulangan yang dihitung menggunakan rumus minimal sample sebanyak 4 kali
4.5 Variabel Penelitian 4.5.1 Variabel Bebas
Ekstrak biji mahoni (Swieetenia Mahogany)
4.5.2 Variabel Terikat
Koloni C.tropicalis
4.5.3 Variabel Kendali
Sabouroud Dextrose Agar (SDA), sterilisasi alat dan bahan, waktu inkubasi, suhu inkubasi, pembiakan inokulum Candida Tropicalis, teknik pembuatan ekstrak
4.6 Definisi Operasional
1. Koloni Candida tropicalis adalah koloni yang berwarna krem sampai abu – abu, kasar pada media Saboroud Dextrose Agar (SDA). Dengan melihat MIC, yang dikultur dari stok di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Airlangga.
2. Ekstrak biji mahoni adalah ekstrak yang di ambil biji mahoni kering, yang diekstrak dengan teknik maserasi dengan alkohol 96%
(Sahgal,2008) dengan kosentrasi 1,56%, 3,125%, 6,25%, 12,5%, 25%
dam 50%
4.7 Lokasi dan Waktu Penelitian
Pembuatan ekstrak dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.
Penyimpanan stok kultur Candida tropicalis. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran gigi Universitas Airlangga pada bulan juli hingga september 2014
4.8 Alat dan Bahan a. Alat
1) Timbangan analitik (Sartorius, USA) 2) Tabung reaksi
3) Labu alas bulat 4) Rak tabung
5) Alat refluks (STAHL) 6) Kertas label
7) Kertas saring 8) Spoit (One Med) 9) Corong Buchner 10) Neer bekken
11) Alat rotavapor (RE-3000) 12) Paper point
13) Cawan porselen
14) Anaerobic jar (OXOID) 15) Cawan petri
16) Ose terkalibrasi 17) Mikropipet (Nesco)
18) Autoklaf (AU – American) 19) Diagnostik set
20) Gelas kimia
21) Inkubator (Incubator Natural Convection IL – 21A) 22) Alat tulis
23) Dry Heat Sterilizator (AU – American) b. Bahan
1) Ekstrak biji mahoni 100%
2) Aquades steril
3) Medium Saboroud Dextrose Agar 4) Jamur Candida Tropicalis 5) Etanol 96%
6) Media Saboroud Broth cair
7) Media Saboroud Agar miring
4.9 Cara Kerja
4.9.1 Tahap Persiapan A. Sterilisasi alat
Sebelum penelitian dilaksanakan, semua alat dan media yang akan digunakan disterilisasi dengan memasukkannya ke dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan sebesar 1 atm selama 15 menit, kemudian didinginkan.
B. Pembuatan Ekstrak Biji Mahoni (Sahgal,2008)
1. Biji mahoni dicuci bersih kemudian di potong – potong tipis 2. Biji mahoni yang sudah di potong – potong tadi dimasukkan ke
dalam bejana maserasi
3. Tambahkan etanol 96% hingga sampel terendam semua
4. Wadah ditutup dan disimpan pada tempat yang terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk – aduk
5. Kemudian biarkan selama 5 hari
6. Ekstrak lalu disaring, diulangi perendaman dengan etanol 96%
sebanyak 3 kali sehingga zat yang berkhasiat didalam tanaman biji mahoni tidak ada yang tersisa atau tersaring dengan sempurna.
7. Selanjutnya pelarut di uapkan dengan bantuan alat destilisasi pada suhu tertentu sehingga di peroleh ekstrak yang kental
C. Pengenceran Serial Ekstrak Biji Mahoni
1. Pada proses pengenceran ekstrak biji mahoni, disediakan 6 buah tabung reaksi yang diletakkan pada rak tabung
2. Setiap tabung reaksi diberi nomer secara berurutan.
3. Pada tabung 1 diisi 10 ml ekstrak biji mahoni 100%
4. Kemudian pada tabung II hingga tabung VI diisi 5 ml media Saboroud Broth cair steril.
5. Untuk mendapatkan ekstrak biji mahoni dengan konsentrasi 50%
pada tabung II, diambil 5 ml esktrak biji mahoni pada tabung I untuk dimasukkan ke tabung II sehingga konsentrasi ekstrak biji mahoni pada tabung II menjadi 50%
6. Pada tabung III, diambil 5 ml ekstrak biji mahoni dari tabung II, kemudian dicampurkan dengan saboroud broth cair steril pada tabung III, sehingga konsentrasi menjadi 25%.
7. Pada tabung IV, diambil 5 ml ekstrak biji mahoni dari tabung III, kemudian dicampurkan dengan saboroud broth cair steril pada tabung IV, sehingga konsentrasi menjadi 12,5%.
8. Pada tabung V, diambil 5 ml ekstrak biji mahoni dari tabung IV, kemudian dicampurkan dengan saboroud broth cair steril pada tabung V, sehingga konsentrasi menjadi 6,25%
9. Tabung I tidak digunakan, hanya tabung II-VI yang digunakan.
D. Pembuatan Kultur C.Tropicalis
Stok Candida Tropicalis diambil dari refrigrator kemudian ditanam pada media Saboroud Broth cair dan diinkubasi pada suhu 37oC
selama 24 jam di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga.
E. Standarisasi McFarland
1. Siapkan tabung standard McFarland 0,5
2. Suspensi jamur Candida Tropicalis di tampung pada tabung denngan diameter yang sama dengan standar McFarland (kurang lebih 16 mm).
3. Pegang standar McFarland, suspensi C. Tropicalis di depan kartu Wicherham untuk dibandingkan secara visual
4. Amati hilangnya atau distorsi garis hitam sambil melihat kedua tabung secara berdampingan
5. Tambahkan inokulum atau encerkan suspensi C. Tropicalis hingga sesuai dengan standar
4.9.2 Prosedur Pelaksanaan Penelitian (Metode Broth Dillution) 1. Disiapkan tabung reaksi sebanyak 6
2. Pada tabung pertama diisi 10 ml, sedangkan pada tabung kedua hingga kedelapan diisi 5 ml media Saboroud Brothi cair dan steril,
3. Kemudian dilakukan pengenceran serial 5 ml dari tabung I ke tabung II, 5 ml dari tabung II ke tabung III dan demikian seterusnya hingga tabung V, volume dibuang sebanyak 5 ml agar volume yang digunakan pada tiap tabung sama
4. Dari pengencceran serial tersebut didapatkan konsentrasi ekstrak biji mahoni pada tabung I.II.III.IV, dan V adalah 100%,50%,25%, 12,5%.,6,25%
5. Tabung pertama pada konsentrasi 100% tidak dipakai, sehingga konsentrasi yang dipakai 50%,,25%,12,5% dan 6,25%.
6. Setelah itu pada tabung II hingga V ditambahkan 0,1 ml inokulum berupa kultur cair dengan standar McFarland 0,5.
7. Tabung VI digunakan sebagai kontrol negatif. tabung VI hanya diisi media Saboroud Broth cair tanpa inokulum.
8. Setelah diinkubasikan selama 24 jam dengan suhu 37oC
9. Kemudian inokulum pada media yang telah diinkubasikan tersebut diambil dengan osse dan dilakukan penanaman pada media Saboroud Dextrose Agar dengan teknik streaking.
10. Dinkubasikan kembali selama 48 jam pada suhu 37oC.
11. Setelah itu, konsentrasi yang dianggap sebagai KHM, dilakukan penanaman kembali pada media Saboroud Dextrose Agar dengan teknik Streaking dan diinkubasikan selama 48 jam dengan suhu 37oC.
12. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah koloni.
4.10 Analisis Data
Data penelitian ini dianalisis dengan uji One-Sample Kolmogorov Test untuk melihat distribusinya dan uji Lavene Test untuk melihat homogenitas varian.
Untuk menguji hipotesa digunakan uji Kruskal. Apabila terdapat perbedaan
yang signifikan, maka dilakukan uji Post-Hoc untuk melihat perbedaan efektivitas pada kelompok perlakuan dengan data yang berdistribusi normal.
Ditambahkan 0.1 ml inokulum Candida Tropicalis
Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC
Tanam pada media SDA yang telah dibagi menjadi 6 bagian sesuai konsentrasi
Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC
Diamati konsentrasi ekstrak biiji mahoni yang masih bisa ditumbuhi Candida Tropicalis dan dilakukan cross check hasil pertumbuhan
Koloni pada konsentrasi dicurigai MIC, konsentrasi sebelum dan konsentrasi setelah ditanam pada media SDA dengan teknik streaking
Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC
Hitung koloni
Cross check dengan replikasi Siapkan 7 buah tabung diberi label I-VII
5 ml
Tabung II 5 ml
Saboroud Broth + Ekstrak 50%
Tabung III 5 ml
Saboroud Broth + Ekstrak 25%
Tabung IV 5 ml
Saboroud Broth + Ekstrak 12,5%
Tabung I 10 ml
Tabung II – VI diisi 5 ml media Saboroud Broth cair steril
Tabung VIi 5 ml
Saboroud Broth
(-)
5 ml 5 ml 5 ml
Tabung V 5 ml
Saboroud Broth + Ekstrak 6,25%
5 ml
