BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Tumbuhan
Uraian tumbuhan meliputi daerah tumbuh (habitat), nama daerah, nama asing, sistematika tumbuhan, morfologi tumbuhan, kandungan kimia dan kegunaan dari tumbuhan.
2.1.1 Daerah tumbuh
Labu siam merupakan tumbuhan yang mudah ditemukan di hutan-hutan jati, hutan campuran, tepi-tepi jalan, atau sawah dan kebun. Tanaman ini dapat tumbuh pada ketinggian 50 meter sampai 500 meter di atas permukaan laut (Prahasta, 2009).
2.1.2 Nama daerah
Tanaman labu siam memiliki nama daerah sebagai berikut (Prahasta, 2009): Sumatera : Labu siam (Melayu)
Aceh : Labu jipang
Karo : Ropah
Jawa (Sunda) : Gambas, waluh siam
Jawa Tengah : Waluh jipang, labu jipang Jawa Timur : Manisah
Manado : Ketimun jepang Minangkabau : Japan
2.1.3 Nama asing
Sayuran ini dikenal dengan nama asing chayote (Prahasta, 2009). 2.1.4 Sistematika tumbuhan
Tumbuhan labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) diklasifikasikan sebagai berikut (Prahasta, 2009). Kerajaan : Plantae Divisio : Spermatophyta Subdivisio : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Bangsa : Cucurbitales Suku : Cucurbitaceae Marga : Sechium
Jenis : Sechium edule ( Jacq.) Sw.
2.1.5 Morfologi tumbuhan
Tumbuhan labu siam memiliki morfologi sebagai berikut (Prahasta, 2009). Batang : Lunak, beralur, cabang banyak, serta memiliki sulur batang untuk membelit pada benda lain. Permukaan umumnya kasap atau agak kasar, berwarna hijau, dan berbulu. Berbentuk segi lima dan melilit, dengan panjang batang 50-2.500 cm dan memiliki tunas yang keluar dari ketiak daun.
Daun : Tunggal yang berbentuk jantung bertulang, tepi bertoreh, dengan ujung yang meruncing, permukaan kasar, panjang 4-25 cm dengan lebar antara 3-20 cm, berwarna hijau, dengan tangkai berbentuk bulat, panjang tangkai daun berkisar 5-10 cm.
Bunga : Majemuk yang keluar dari ketiak daun, dengan kelopak bertajuk lima, mahkota beralur, lima benang sari, kepala sari jingga, satu putik yang berwarna kuning. Benang sari dan kepala sari berlekatan.
Buah : Menggantung ditangkai, dengan permukaan berlekuk berwarna hijau ketika muda dengan larik-larik putih kekunigan, semakin matang warna bagian luar buah berubah menjadi hijau pucat sampai putih, bentuk lonjong, dengan ukuran ujung berbeda.
Biji : Pipih, berkeping dua, berwarna putih.
Akar : Berwarna putih kecoklatan, tunggang, bercabang banyak, berbentuk bulat sampai agak persegi, dan berbatang lemah, akar menyebar tetapi dangkal, akar-akar cabang, rambut-rambut akar terdapat dekat permukaan tanah karena hanya dapat menembus tanah 30-40 cm.
2.1.6 Kandungan kimia
Buah Sechium edule (Jacq.) Sw., mengandung saponin, alkaloid dan tanin sedangkan daunnya mengandung saponin, flavonoid dan polifenol (Pratiwi, 2011).
2.1.7 Kegunaan labu siam
1. Diuretik: kandungan air pada labu siam memiliki efek diuretik yang baik sehingga melancarkan buang air kecil
2. Menurunkan tekanan darah: melalui urin yang banyak dibuang akibat sifat diuretik dari labu siam, kandungan garam di dalam darah akan berkurang. Berkurangnya kadar garam yang bersifat menyerap atau menahan air ini akan meringankan kerja jantung dalam memompa darah
sehingga tekanan darah menurun. Kandungan alkaloidnya berfungsi sebagai vasodilator maka labu siam bisa menurunkan darah tinggi.
3. Buah tanaman ini baik untuk menyembuhkan gangguan sariawan, panas dalam serta menurunkan demam pada anak-anak karena mengandung banyak air
4. Gangguan asam urat
5. Penderita diabetes mellitus juga cocok mengkonsumsi labu siam yang telah dikukus. Kandungan patinya mengenyangkan sehingga perderita diabetes mellitus tidak lagi mengosumsi makanan pokok secara berlebihan (Pratiwi, 2011).
Labu siam memiliki kadar vitamin C yang tinggi, rendah kalori, rendah sodium, tidak mengandung kolesterol, dan merupakan sumber serat yang baik. Berbagai kandungan gizi labu siam dan manfaat kesehatannya antara lain sebagai berikut (Anonim2, 2012).
1. Asam folat: labu siam adalah sumber folat, vitamin B yang sangat bermanfaat bagi ibu hamil dan kesehatan kardiovaskuler
2. Vitamin C: vitamin C adalah salah satu antioksidan kuat yang dapat melindungi sel dari kerusakan oleh radikal bebas
3. Mineral: mineral dalam labu siam membantu tubuh mengubah protein dan lemak menjadi energi
4. Serat: membantu mencegah sembelit dan melancarkan pencernaan 5. Tembaga: membantu iodium dalam menjaga kesehatan tiroid 6. Zinc: membantu menyehatkan kulit
Buah labu siam memiliki kadar serat yang cukup baik, yaitu 1,7 g per 100 g. Konsumsi serat dalam jumlah yang cukup, sangat baik untuk mengatasi sembelit dan aman untuk lambung yang sensitif atau radang usus. Serat pangan dapat mengurangi risiko penyakit kanker yang disebabkan sistem pencernaan yang tidak sempurna (Anonim2, 2012).
Tabel 2.1 Komposisi gizi per 100 gram labu siam Komposisi gizi Kadar
Energi (kkal) 17 Protein (g) 0,82 Lemak (g) 0,13 Karbohidrat (g) 3,9 Serat (g) 1,7 Gula (g) 1,85 Kalsium (mg) 17 Besi (mg) 0,34 Magnesium (mg) 12 Fosfor (mg) 18 Kalium (mg) 125 Natrium (mg) 2 Seng (mg) 0,74 Tembaga (mg) 0,12 Mangan (mg) 0,19 Selenium (mg) 0,2 Vitamin C 7,7 Tiamin (mg) 0,03 Riboflavin (mg) 0,03 Niacin (mg) 0,47 Vitamin B6 (mg) 0,08 Folat (mkg) 93 Vitamin E (mkg) 0,12 Vitamin K (mkg) 4,6 Sumber: Anonim2, 2012.
Serat pangan mampu mengurangi waktu tinggal makanan sejak dari rongga mulut hingga sisa makanan dikeluarkan dalam bentuk feses. Selama tinggal di saluran pencernaan, serat pangan akan mengikat zat-zat karsinogenik. Berkat singkatnya transit time sisa makanan di saluran pencernaan, waktu zat
karsinogenik bermukim dalam tubuh juga makin pendek, sehingga peluang terjadinya kanker menjadi sangat kecil (Anonim2, 2012).
2.2 Uraian Kandungan Kimia Tumbuhan 2.2.1 Alkaloida
Alkaloida merupakan golongan zat tumbuhan sekunder yang terbesar. Alkaloida mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya sebagai bagian dari sistem siklik. Alkaloida mempunyai aktivitas fisiologi yang menonjol sehingga banyak yang diantaranya digunakan secara luas dalam bidang pengobatan (Harborne, 1987).
Ada tiga pereaksi yang sering digunakan dalam skrining fitokimia untuk mendeteksi alkaloida sebagai pereaksi pengendapan yaitu pereaksi Mayer, pereaksi Bouchardat, dan pereaksi Dragendorff (Farnsworth, 1966).
Kegunaan alkaloida pada tanaman (Anonim4, 2011):
1. Sebagai racun untuk melindungi tanaman dari serangga dan binatang pemakan serangga
2. Sebagai hasil akhir dari reaksi detoksifikasi yang merupakan hasil metabolit akhir dari komponen-komponen yang membahayakan bagi bagi tanaman 3. Sebagai faktor pertumbuhan tanaman
4. Sebagai zat cadangan makanan untuk memenuhi kebutuhan nitrogen atau unsur lain yang dibutuhkan tanaman.
2.2.2 Flavonoida
Golongan flavonoida dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C
3-C6, artinya kerangka karbonya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzena
tersubstitusi) disambungkan oleh rantai alifatik tiga karbon (Robinson, 1995).
Gambar 2.1 Kerangka dasar flavonoid
Flavonoida mencangkup banyak pigmen yang banyak terdapat pada tumbuhan mulai dari jamur sampai angiospermae. Pada tumbuhan tinggi, flavonoida terdapat baik dalam bagian vegetatif maupun dalam bunga. Fungsi flavonoida pada tumbuhan adalah dapat menarik burung dan serangga yang membantu proses penyerbukan, pengatur tumbuh, pengatur fotosintesis, kerja antimikroba dan antivirus (Robinson, 1995).
Sedangkan fungsi flavonoid pada manusia dalam dosis kecil adalah flavon bekerja sebagai stimulan pada jantung, hisperidin mempengaruhi pembuluh darah kapiler, flavon terhidroksilasi bekerja sebagai diuretik dan sebagai antioksidan pada lemak (Sirait, 2007).
2.2.3 Saponin
Saponin mula-mula diberi nama demikian karena sifatnya yang menyerupai sabun (bahasa latin sapo berarti sabun). Saponin tersebar luas diantara tumbuhan tinggi. Saponin merupakan senyawa berasa pahit, menusuk, menyebabkan bersin dan mengakibatkan iritasi terhadap selaput lendir. Saponin adalah senyawa aktif permukaan yang kuat yang menimbulkan busa jika dikocok. Dalam larutan yang sangat encer saponin sangat beracun untuk hewan berdarah
dingin, dan tumbuhan yang mengandung saponin telah digunakan sebagai racun ikan selama beratus-ratus tahun (Robinson, 1995; Gunawan, et al., 2004).
Saponin dibedakan menjadi dua golongan berdasarkan struktur kimia dari aglikonnya (Sirait, 2007):
1. Saponin netral dengan inti steroid
2. Saponin asam dengan struktur triterpenoid
2.2.4 Tanin
Tanin merupakan salah satu senyawa yang termasuk ke dalam golongan polifenol yang terdapat dalam tumbuhan, mempunyai rasa sepat dan memiliki kemampuan menyamak kulit. Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae terdapat khusus dalam jaringan kayu (Harborne, 1987).
Salah satu fungsi tanin dalam tumbuhan adalah sebagai penolak herbivora karena rasanya yang pahit (Harborne, 1987).
Sifat-sifat tanin (Anonim3, 2011):
1. Dalam air membentuk larutan koloidal yang bereaksi asam dan sepat 2. Mengendapkan larutan gelatin dan larutan alkaloid
3. Tidak dapat mengkristal
4. Larutan alkali mampu mengoksidasi oksigen
5. Mengendapkan protein dari larutannya dan bersenyawa dengan protein tersebut sehingga tidak dipengaruhi oleh enzim protiolitik.
Tanin dapat dibagi menjadi 2 kelompok (Anonim3, 2011):
1. Tanin terkondensasi (tanin katekol) berwarna hijau dengan FeCl3 dan
2. Tanin terhidrolisis (pirogalol) berwarna biru dengan FeCl3 dan mempunyai
tiga gugus fenol.
2.2.5 Glikosida
Glikosida adalah suatu golongan senyawa bila dihidrolisis akan terurai menjadi gula (glikon) dan senyawa lain (aglikon atau genin). Umumnya glikosida mudah terhidrolisis oleh asam mineral atau enzim. Hidrolisis oleh asam memerlukan panas, sedangkan hidrolisis oleh enzim tidak memerlukan panas (Sirait, 2007).
Berdasarkan ikatan antara glikon dan aglikon, glikosida dapat dibedakan menjadi (Sirait, 2007):
a. Tipe O-glikosida, ikatan antara bagian glikon dengan aglikon melalui jembatan O
b. Tipe S-glikosida, ikatan antara bagian glikon dengan aglikon melalui jembatan S. Contoh: sinigrin
c. Tipe N-glikosida, ikatan antara bagian dari glikon dengan aglikon melalui jembatan N. Contoh: nikleosidin, krotonosidin
d. Tipe C-glikosida, ikatan antara bagian glikon dengan aglikon melalui jembatan C. Contoh: aloin, viteksin.
2.2.6 Glikosida antrakuinon
Golongan kuinon alam terbesar adalah antrakuinon. Beberapa antrakuinon merupakan zat warna penting dan sebagai pencahar. Khasiat dari antrakuinon sebagai pencahar pada prinsipnya antrakuinon harus memiliki paling sedikit 2 gugusan hidroksil fenolis pada atom C no.1 dan no.8 atau C no.3.
Keluarga tumbuhan yang kaya akan senyawa jenis ini adalah Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae, Caesalpiniaceae dan Liliaceae. Antrakuinon biasanya berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi, aglikonnya larut dalam pelarut organik, senyawa ini berwarna merah, kuning atau coklat, dalam larutan basa membentuk warna violet merah (Robinson, 1995).
2.2.7 Steroid/triterpenoid
Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik,
yaitu skualen. Senyawa tersebut mempunyai struktur siklik yang relatif kompleks, kebanyakan merupakan suatu alkohol, aldehid atau asam karboksilat. Triterpenoid adalah senyawa tanpa warna, berbentuk kristal, sering kali bertitik leleh tinggi dan aktif optik, dapat dibagi atas 4 kelompok senyawa yaitu triterpen sebenarnya, steroid, saponin dan glikosida jantung. Uji kualitatif yang banyak digunakan ialah reaksi Liebermann-Burchard (asam asetat anhidrida-H2SO4 pekat) yang
kebanyakan triterpena dan steroida memberikan warna hijau biru (Harborne, 1987).
Steroida adalah triterpena yang kerangka dasarnya sistem cincin siklopentana perhidrofenanten (Harborne, 1987). Dapat dilihat pada gambar berikut ini:
Dahulu steroida dianggap sebagai senyawa yang hanya terdapat pada hewan tetapi sekarang ini makin banyak senyawa steroida yang ditemukan dalam tumbuhan (fitosterol). Fitosterol merupakan senyawa steroida yang berasal dari tumbuhan. Senyawa fitosterol yang biasa terdapat pada tumbuhan tinggi yaitu sitosterol, stigmasterol dan kampesterol (Harborne, 1987).
2.3 Metode Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Depkes, 2000). Ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu:
Cara dingin
a. Maserasi
Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan perendaman menggunakan pelarut yang sesuai dengan sesekali pengadukan pada temperatur ruangan (Depkes, 2000). Hasilnya disebut maserat, maserat diuapkan pelarutnya sebagian atau seluruhnya menjadi ekstrak.
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses ini terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan perkolat) (Depkes, 2000). Hasil disebut perkolat, perkolat diuapkan pelarutnya sebagian atau seluruhnya sehingga diperoleh ekstrak.
Cara panas
a. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna (Depkes, 2000).
b. Sokletasi
Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Depkes, 2000).
c. Digestasi
Digestasi adalah maserasi dengan pengadukan kontinu pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50℃ (Depkes, 2000).
d. Infustasi
Infustasi adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia nabati dengan air pada suhu 90℃ selama 15 menit (Depkes, 1979).
e. Dekoktasi
Dekoktasi adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia nabati dengan air pada waktu yang lebih lama ± 30 menit dan temperatur sampai titik didih air (Depkes, 2000).
2.4 Kromatografi
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan perpindahan dari komponen-komponen senyawa diantara dua fase yaitu fase diam (dapat berupa zat cair atau zat padat) dan fase gerak (dapat berupa gas atau zat cair) (Depkes, 1995). Fase diam berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan, jika zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi. Karena fase gerak dapat berupa zat cair dan gas maka ada empat macam sistem kromatografi (Sastrohamidjojo, 1985):
1. Fase gerak zat cair–fase diam padat: - Kromatografi lapis tipis
- Kromatografi penukar ion 2. Fase gerak gas–fase diam padat:
- Kromatografi gas padat
3. Fase gerak zat cair–fase diam zat cair: - Kromatografi cair kinerja tinggi 4. Fase gerak gas–fase diam zat cair:
- Kromatografi gas cair - Kromatografi kolom kapiler
Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan dilakukan dengan menggunakan salah satu atau gabungan dari beberapa teknik tersebut dan dapat digunakan pada skala mikro maupun makro (Harborne, 1987).
2.4.1 Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis ialah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan pemisah terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga
berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan yang ditotolkan baik berupa bercak ataupun pita, setelah plat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (Stahl, 1985).
Pendeteksian bercak hasil pemisahan dapat dilakukan dengan beberapa cara. Untuk senyawa tak berwarna cara yang paling sederhana adalah dilakukan pengamatan dengan sinar ultraviolet. Beberapa senyawa organik bersinar atau berfluorosensi jika disinari dengan sinar ultraviolet gelombang pendek (254 nm) atau gelombang panjang (366 nm), jika dengan cara itu senyawa tidak dapat dideteksi maka harus dicoba disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak yaitu pertama tanpa pemanasan, kemudian bila perlu dengan pemanasan (Gritter, et al., 1991; Stahl, 1985).
a. Fase diam (lapisan penjerap)
Kromatografi lapis tipis, fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri atas bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca, dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam. Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum. Penjerap yang umum dipakai untuk kromatografi lapis tipis adalah silika gel, alumina, kieselgur dan selulosa (Gritter, et al., 1991).
Dua sifat yang penting dari fase diam adalah ukuran partikel dan homogenitasnya, karena adesi terhadap penyokong sangat tergantung pada kedua sifat tersebut. Ukuran partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Partikel
yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu cara untuk memperbaiki hasil pemisahan adalah dengan menggunakan fase diam yang butirannya lebih halus. Butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih lambat dan resolusi yang lebih baik (Sastrohamidjojo, 1985).
b. Fase gerak (pelarut pengembang)
Fase gerak ialah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut, jika diperlukan sistem pelarut multi komponen, harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1985).
Pemisahan senyawa organik selalu menggunakan pelarut campur. Tujuan menggunakan pelarut campur adalah untuk memperoleh pemisahan senyawa yang baik. Kombinasi pelarut adalah berdasarkan atas polaritas masing-masing pelarut, sehingga dengan demikian akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. Pelarut pengembang yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis antara lain: n-heksan, karbontetraklorida, benzen, kloroform, eter, etilasetat, piridian, aseton, etanol, metanol dan air (Gritter, et al., 1991).
c. Harga Rf
Mengidentifikasi noda-noda dalam kromatografi lapis tipis sangat lazim menggunakan harga Rf (Retordation Factor) yang didefinisikan sebagai:
Jarak titik pusat bercak dari titik awal Rf =
Jarak garis depan pelarut dari titik awal
Harga Rf beragam mulai dari 0 sampai 1. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf (Sastrohamidjojo, 1985):
b. Sifat penjerap
c. Tebal dan kerataan dari lapisan penjerap d. Pelarut dan derajat kemurniannya
e. Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f. Teknik percobaan
g. Jumlah cuplikan yang digunakan h. Suhu
i. Kesetimbangan.
2.4.2 Kromatografi cair vakum
Cara ini pertama kali dipublikasikan oleh Coll dkk., pada tahun 1977 dengan menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek untuk mengisolasi diterpena sembrenoida dari terumbu karang Australia. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dihisap sampai kering dan sekarang siap dipakai (Hostettmann, et al., 1995).
Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau pada lapisan penjerap dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dari pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi, oleh karena itu kromatografi cair vakum menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak (Hostettmann, et al., 1995).
2.4.3 Kromatografi kolom
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 g), kadang-kadang cara ini disebut kromatografi cair preparatif (KCP = PLC). Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada pada tabung kaca, tabung logam, atau tabung plastik. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom, karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa bergerak melalui melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom (Sastrohamidjojo, 1985).
2.4.4 Kromatografi lapis tipis preparatif
Kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif merupakan salah satu metode pemisahan dengan menggunakan peralatan sederhana. Ketebalan penjerap yang sering dipakai adalah 0,5-2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 20x20 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel (Hostettmann, et al., 1995).
Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan jarak sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pelarut yang baik untuk melarutkan cuplikan adalah pelarut yang atsiri. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap
jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang diletakkan berdiri disekeliling permukaan bagian dalam bejana (Hostettmann, et al., 1995).
Kebanyakan penjerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita yang terpisah pada senyawa yang menyerap sinar ultraviolet. Untuk mendeteksi senyawa yang tidak menyerap sinar ultraviolet yaitu dengan cara menutup plat dengan sepotong kaca lalu menyemprot kedua sisi dengan penyemprot (Hostettmann, et al., 1995).
Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak maka senyawa yang tidak berwarna dengan penjerap dikerok dari plat kaca. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran beberapa senyawa sehingga diperoleh senyawa murni (Gritter, et al., 1991).
2.4.5 Kromatografi lapis tipis dua arah (two-dimensional TLC)
KLT dua arah atau KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama, selain itu dua sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama (Rohman, 2009).
KLT dua arah dilakukan dengan melakukan penotolan sampel disalah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa dengan eluen pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dipindahkan dari chamber yang menggunakan eluen kedua sehingga pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama. Suksesnya pemisahan
tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi selektifitas eluen kedua dibandingkan dengan selektifitas eluen pertama (Rohman, 2009).
2.5 Spektrofotometri
Spektrofotometri adalah metode pengukuran dimana sumber energinya berupa sinar/cahaya dan sistem detektornya menggunakan sel fotolistrik (Noerdin, 1985).
2.5.1 Spektrofotometri sinar ultraviolet
Spektrum ultraviolet adalah suatu gambaran yang menyatakan hubungan antara panjang gelombang atau frekuensi serapan terhadap intensitas serapan (transmitansi atau adsorbansi) (Sastrohamidjojo, 1985). Apabila suatu molekul menyerap radiasi ultraviolet, di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan tingkat energi elektron-elektron ikatan pada orbital molekul paling luar dari tingkat energi yang lebih rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi (Noerdin, 1985).
Pelarut yang banyak digunakan untuk spektrofotometri sinar UV adalah etanol 95% karena kebanyakan golongan senyawa larut dalam pelarut tersebut. Alkohol absolut komersial harus dihindari karena mengandung benzena yang dapat menyerap di daerah sinar UV pendek. Pelarut yang sering digunakan ialah air, etanol, metanol, n-heksana, eter minyak bumi dan eter (Harborne, 1987).
2.5.2 Spektrofotometri sinar inframerah
Sinar inframerah bila dilewatkan melalui cuplikan senyawa organik maka sejumlah frekuensi akan diserap sedangkan frekuensi yang lain diteruskan tanpa
diserap. Daerah inframerah terletak antara spektrum elektromagnetik cahaya tampak dan spektrum radio, yakni antara 4000-400 cm-1 (Noerdin, 1985).
Daerah pada spektrum inframerah di atas bilangan gelombang 1200 cm-1 menunjukkan pita spektrum atau puncak yang disebabkan oleh getaran ikatan kimia atau gugus fungsi dalam molekul yang ditelaah. Daerah di bawah 1200 cm-1 menunjukkan pita yang disebabkan oleh getaran seluruh molekul, dan karena kerumitannya dikenal sebagai daerah sidik jari. Intensitas berbagai pita direkam secara subjektif pada skala sederhana (Noerdin, 1985).
Kenyataan yang menunjukkan bahwa banyak gugus fungsi dapat diidentifikasi dengan menggunakan frekuensi getaran khasnya mengakibatkan spektrofotometri inframerah merupakan cara paling sederhana dan paling terandalkan dalam menentukan golongan senyawa yang terkandung dalam sebuah molekul (Harborne, 1987).
