BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah analisis menggunakan
spectroscopy fourier transform infrared (FTIR) dapat digunakan untuk melakukan identifikasi bakteri melalui spektra FTIR asam lemak yang terdapat pada bakteri.
Analisis kandungan asam lemak bakteri dalam penelitian ini menggunakan
kombinasi metode FTIR dengan principle component analysis (PCA) secara kualitatif, yang bertujuan untuk mengetahui kemampuan metode tersebut dalam
menganalisis kandungan asam lemak bakteri, sehingga dapat digunakan untuk
identifikasi bakteri secara cepat.
Analisis asam lemak dalam bakteri menggunakan kombinasi antara FTIR
dengan PCA karena metode tersebut memiliki keuntungan berupa sensitifitas
yang tinggi, waktu analisis cepat, akurasi dan reprodusibilitas frekuensi yang baik.
Dengan menggunakan spektroskopi inframerah untuk mengukur getaran ikatan
gugus fungsional dalam asam lemak yang diperoleh dari sel-sel bakteri maka
diperoleh spektrum inframerah pada daerah sidik jari yang digunakan untuk
identifikasi. Untuk mengekstrak dan menganalisis informasi yang khas dari
kompleks asam lemak bakteri tertentu dari spektrum inframerah. metode statistik
juga diperlukan, algoritma yang tersedia secara komersial berbasis komputer
statistik yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis Principal component analysis (PCA). PCA pada dasarnya adalah teknik reduksi data multivariat, ketika antar variabel terjadi korelasi. Sampel dengan komponen utama yang hampir
sama mempunyai sifat fisika-kimia yang hampir sama, sehingga PCA dapat
digunakan untuk pengelompokan. Oleh karena itu, PCA sering disebut juga
sebagai variabel tersembunyi (latent variables) karena kemampuannya sebagai teknik untuk melakukan pengelompokan.
Penelitian sebelumnya pada isolat WK45 telah diuji biokimia yang
1. Uji Katalase
Isolat WK45 negatif mengandung H2O2. uji katalase untuk mengetahui
bakteri tersebut aerob atau tidak yang ditandai dengan ada tidaknya gas H2O2,
dengan adanya gas tersebut bakteri bersifat aerob yang dapat menghasilkan
enzim katalase.
2. Uji Oksidase
Isolat WK45 negatif mengandung enzim sitokrom C oksidase. Enzim
sitokrom C oksidase berperan penting dalam transport elektron selama respirasi
aerob. Enzim tersebut dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob dan
mikroaerofilik.
3. Uji Methyl Red
Isolat WK45 terbentuk cincin berwarna merah maka bakteri tersebut
positif dapat memfermentasikan glukosa untuk menghasilkan asam.
4. Uji Voges Proskauer
Isolat WK45 positif menghasilkan asetimetil karbinol dan fermentasi
glukosa karena larutan berubah menjadi merah. Asetilmetil karbinol dalam
lingkungan yang mengandung potasium hidroksida dan udara, teroksidasi
menjadi senyawa diasetil. Senyawa ini dengan alfa-naftol dan inti guanidine
serta asam-aminoorgania (dari pepton) menghasilkan warna merah.
Identifikasi bakteri isolat WK45 dilakukan berdasarkan buku identifikasi
bakteri dari Holt dkk (1994) dalam Bergey’s Manual Of Determinative
Bacteriology 9th. Identifikasi diawali dengan mengamati hasil uji katalase dan
oksidase dalam buku experimental mikrobiology. Bakteri negatif oksidase yaitu
bakteri streptococcus, leuconostoc, lactobacillus dan clostridium. Dengan demikian bakteri isolat WK45 termasuk dalam genus Streptococcus.
Kemudian penelitian selanjutnya yang dilakukan oleh Hendri pada tahun
dengan maker yaitu 1600bp (1,6 kbp). Yang kemudian dibandingkan dengan
genus streptococcus kemudian spesies bakteri yang dipilih sebagai pembanding
adalah Streptococcus pneumonia 102642 teramplifikasi pada ukuran 1,5Kbp dan
Streptococcus pneumonia 1055 teramplifikasi pada ukuran 1,4 Kbp. Hasil penelitian menunjukan bahwa enzim hindIII tidak berhasil memotong produk PCR dari 16S rRNA dari bakteri isolat WK45.
A. Ekstraksi Lemak Bakteri
Ekstraksi asam lemak bakteri menggunakan metode saponifikasi.
Saponifikasi adalah proses hidrolisis ester dengan alkali pada lemak, biasanya
dengan penambahan basa kuat hal ini sesuai dengan metode yang dilakukan
oleh Sasser (1990). Saponifikasi pada penelitian ini menggunakan larutan
NaOH 3,75N yang dilarutkan dalam metanol-air hal ini bertujuan untuk
melisiskan sel bakteri. Bakteri yang sudah ditumbuhkan pada media nutrient borth yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu optimal pertumbuhan bakteri tersebut pada suhu 37oC sambil dishaker. kemudian dipanen dengan cara bakteri yang sudah tumbuh pada media cair dimasukkan dalam tabung flakon
clonikal yang sudah steril lalu disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm
selama 15 menit maka bakteri akan mengendap. Endapan bakteri dimasukan
dalam mikrotube dan ditimbang antara 140-150 mg lalu ditambahkan dengan
cairan saponikasi sebanyak 1,0 ml kemudian divortex sebentar lalu
dimasukkan kedalam wadah yang berisi air mendidih selama ±5 menit.
Vortex kembali selama 5-10 detik kemudian masukan kembali kedalam
wadah berisi air mendidih untuk menyelesaikan pemanasan 30 menit.
B. Analisis lemak dengan FTIR
FTIR memiliki prinsip spektroskopi, yaitu memanfaatkan sinar cahaya
untuk analisis. Prinsip analisis FTIR adalah menggunakan sinar radiasi
inframerah. Signal yang ditangkap oleh detektor dikonversi menggunakan
merupakan spetra sidik jari yang berarti bahwa tidak ada 2 molekul yang
mempunyai spektrum IR yang sama, baik dari jumlah puncak, intensitas, atau
frekuensi eksak untuk tiap puncak.
Analisis spektroskopi FTIR didasarkan pada karakterisasi gugus
fungsi yang terdapat pada asam lemak bakteri. Data spektra IR
masing-masing sampel diperoleh dari hasil scanning dengan alat FTIR dengan asesoris ATR (Attenuated Total Reflectance) kemudian discaning 32 kali pada rentang bilangan gelombang 4.000-600 cm-1 dengan resolusi 16 cm-1
dan direkam dalam bentuk absorbansi. Keuntungan menggunakan ATR
adalah dapat digunakan untuk sampel yang mengandung air atau yang
bersifat asam di alam dengan data spektra inframerah yang optimal pada
rentang frekuensi antara 4000 cm-1 sampai 400cm-1, dan cara pengerjaan yang
mudah dengan cara meneteskan sampel diatas kristal ATR.
Asam lemak dari setiap bakteri dibaca dengan spektrokopi FTIR
menggunakan teknik penanganan ATR yang dilakukan dengan cara
meneteskan larutan hasil ekstraksi pada kristal ZnSe. Merupakan kristal yang
memiliki indeks bias yang tinggi. Spektroskopi inframerah ATR
menggunakan fenomena pemantulan internal total. Berkas radiasi yang
memasuki kristal akan mengalami pemantulan internal total ketika sudut
datang pada permukaan antara sampel dan kristal lebih besar dari sudut
kritisnya. Sudut kritis merupakan fungsi indeks bias dua permukaan. Berkas
sinar akan mempenetrasikan sebagian panjang gelombang di luar permukaan
yang memantul, dan ketika sesuatu bahan yang secara selektif mampu
menyerap radiasi berada di atas permukaan kristal ATR, maka berkas sinar
akan kehilangan energi pada panjang gelombang yang mana bahan (sampel)
menyerap pada panjang gelombang tersebut kemudian akan dibaca oleh
detektor dan diterjemahkan sebagai spektra FTIR.
Untuk menghindari adanya variasi spektra antara sampel yang satu
dengan yang lainnya, maka spektrum dasar (background) diukur setiap kali sebelum pengukuran dimulai. Pembacaan spektrum dasar dilakukan karena
dilakukan satu persatu. Pengukuran background ini merupakan pengukuran spektrum lingkungan, yang terdiri dari gas dan uap air yang dapat
mengabsorpsi sinar inframerah. Pada saat analisis sampel spektrum yang
diperoleh merupakan hasil rasio/pengurangan spektra sampel dikurangkan
dengan background udara secara otomatis untuk menghasilkan spektra sampel yang dianalisis. Pengukuran resolusi 16 cm-1 menunjukan setiap jarak
ukur 16cm-1 terdapat satu titik pengukuran intensitas. Resolusi akan
mempengaruhi pola pita yang terjadi, sehingga pemilihan resolusi yang kecil
bertujuan agar puncak terlihat jelas, karena semakin kecil resolusi maka
puncak akan semakin terlihat jelas dan memudahkan pengamatan.
Ada tiga teknik utama untuk identifikasi bakteri yaitu tes biokimia,
profil asam lemak, dan sekuensing DNA. Dalam MIDI Sherlock® digunakan
untuk identifikasi mikroba. Sherlock Sistem mengidentifikasi
mikroorganisme berdasarkan analisis kromatografi gas (GC) dengan
mengekstraksi asam lemak mikroba dalam bentuk metil esternya. Profil asam
lemak mikroba yang unik dari satu spesies ke spesies lain, dan ini telah
memungkinkan untuk melakukan identifikasi dan pembuatan data library
spesies mikroba. Saat ini Sherlock Sistem memiliki data library lebih dari 1.500 spesies bakteri dan 200 spesies ragi. Lebih dari 300 asam lemak dan
senyawa terkait ditemukan pada bakteri. Kekayaan informasi yang
terkandung dalam senyawa ini adalah baik dalam perbedaan kualitatif
(biasanya di tingkat genus) dan perbedaan kuantitatif (biasanya di tingkat
spesies).
Dengan demikian Spekra FTIR asam lemak dari setiap bakteri
(Gambar 1) dapat digunakan untuk melakukan identifikasi mikroba. Jika
diamati secara visual terlihat mirip namun tetap ada perbedaan antara
intensitas dan absorbansi maksimum antar spektra selain itu juga ada
peak-peak tertentu yang khas muncul pada spektrum FTIR asam lemak bakteri
tertentu. Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan komposisi asam lemak
pada bakteri. Kebanyakan asam lemak ditemukan dalam bentuk esterifikasi
lanjutan dalam sintesis triacylglycesol atau glycerophospholipid. Itu dibentuk
dari pemindahan gugus acyl dari molekul lemak acyl CoA pada atom C-1 dan
C-2 dari senyawa glycerol-3-phosphate. (Horton, 2006)
Gambar 1. Spektra FTIR asam lemak 1 (S. mutan), 2 (S. pneumonia), 3
(isolat WK 45), 4 (E. coli) pada bilangan gelombang 4000-600 cm-1.
Secara visual perbedaan spektrum FTIR asam lemak tiap bakteri yaitu
pada peak a yang khas dibilangan gelombang 2300-2337 cm-1 merupakan
Vibrasi P–H ulur,. Gugus pospat pada bakteri banyak terdapat pada bakteri
gram positif karena pada bakteri gram positif, pada dinding sel bakteri terdiri
atas beberapa lapis peptidoglikan dan senyawa nonpeptidoglikan. Senyawa
nonpeptidoglikan tersebut adalah asam teikoat, asam teikuronat, polisakarida,
asam lipotekoat, glikolipid, dan asam mikolat. Asam teikoat merupakan
polimer robitol fosfat atau gliserol fosfat. Fungsi utama asam teikoat adalah
memberikan bentuk sel bakteri. Polisakarida merupakan senyawa penting
dalam klasifikasi streptococcus spp yaitu untuk membedakan kelompok serologisnya. Asam lipoteikoat (LTA) merupakan polimer gliserol fosfat dan
lemak yang terikat secara kovalen. (Purwoko, 2009). Kemudian pada peak
bilangan gelombang 1735 cm-1 merupakan vibrasi ulur C=O, kemudian pada
peak bilangan gelombang 771 cm-1 merupakan pita karakteristik untuk
pada spektrum FTIR asam lemak bakteri dijadikan dasar untuk melakukan
identifikasi bakteri.
Adapun peak-peak yang lain muncul pada Spektrum FTIR asam lemak antara lain Vibrasi ulur –OH pada asam lemak yang muncul sebagai
serangkaian pita yang terdistribusi pada kisaran yang sangat lebar yaitu di
antara 3300-2500cm-1. Meskipun pita ulur O–H cukup lebar, vibrasi ulur C–H
alifatik yang karakteristik akan muncul di sekitar 2915cm-1. Vibrasi ulur C=C
diketahui pada bilangan 1600–1475 cm-1. Pita yang kuat di sekitar 706–771
cm-1 merupakan pita karakteristik untuk senyawa aromatik tersubtitusi mono.
Vibrasi P–H ulur terjadi di daerah 2320-2270 cm-1. Senyawa-senyawa fosfor
alifatik yang mengandung ikatan P–O–C menunjukan pita kuat antara
1050-950 cm-1 disebabkan oleh vibrasi asimetrik ulur. Dua buah pita yang
ditimbulkan oleh uluran C–O dan tekukan O–H dalam spektrum asam lemak
muncul di dekat 1320-1210cm-1 dan didekat 1440-1395 cm-1 berturut-turut.
Kedua buah pita tersebut melibatkan antaraksi-antaraksi antara uluran C–O
dan tekukan C–O–H pada bidang. Asam-asam lemak berantai panjang
biasanya muncul sebagai dwikembar. Pita tekukan C–O–H di dekat
1440-1395 cm-1 mempunyai kekuatan sedang dan terletak di daerah yang sama
dengan getaran gunting CH2 yang dilakukan oleh gugus CH2 tetangga
karbonil.
C. Analisis kualitatif asam lemak dengan principle component analysis
(PCA)
Peak dari spektrum FTIR yang diperoleh tersebut dimasukan ke
multivariat statistik Program MINITAB 16 dengan analisis menggunakan
teknik principle component analysis (PCA) merupakan teknik yang digunankan untuk mengklasifikasikam sampel berdasarkan kemiripan yang
terjadi diantara sampel, sehingga dapat digunakan untuk mengklasifikasi
antara setiap asam lemak bakteri menggunakan variabel intensitas puncak
(absorbansi) yang sesuai dengan hukum lamber beer hasil spektra FTIR.
terdapat pada setiap bakteri. Dengan dipilihnya daerah yang spesifik
bertujuan untuk mengurangi variabel data dan mempermudah pengelompokan
bakteri.
Nilai absorbansi pada daerah sidik jari berasal dari vibrasi-vibrasi
yang tidak sempurna, sehingga perubahan sterik atau elektrolik yang kecil
dapat mengakibatkan pergeseran intensitas puncak. Sehingga daerah ini
dipakai untuk klasifikasi dengan PCA karena pergeseran speksifik. PC1 yang
merupakan variabel terbesar untuk lemak dan PC2 yang merupakan variabel
terbesar kedua adalah lemak sampel.
Principal component analysis (PCA) pada dasarnya adalah teknik reduksi data multivariat, ketika antar variabel terjadi korelasi. Objek (sampel)
dengan komponen utama komponen utama (principle components, PCs) yang hampir sama mempunyai sifat fisika-kimia yang hampir sama, sehingga PCA
dapat digunakan untuk pengelompokkan. Oleh karena itu, PCA sering disebut
juga sebagai variabel tersembunyi (latent variables) karena kemampuannya
sebagai tetknik untuk melakukan pengelompokkan.
Dari spektrum FTIR terlihat bahwa secara umum sampel memiliki
puncak-puncak serapan pada bilangan gelombang yang hampir identik,
namun jika dibandingkan lebih rinci, diantara puncak-puncak serapan yang
dihasilkan (absorbansi) pada masing-masing bilangan gelombang secara
kualitatif relatif berbeda.
Berdasarkan kontribusi PC1 dan PC2 maka dapat dibuat kurva score plot. Kurva score plot digunakan untuk menaksir struktur data yaitu sebagai dasar perbedaan lemak pada setiap bakteri. Semakin dekat letak antara sampel
pada score plot, maka semakin besar pula kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama. Sampel dengan nilai score plot yang
hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir sama.
Gambar 2. Hasil analisis score plot asam lemak bakteri secara kualitatif dengan menggunakan PCA
Bedasarkan hasil kurva score plot diatas bakteri dibagi menjadi 4 kuadran. Semakin dekat jarak antara titik maka semakin dekat dengan pula
hubungan yang dimiliki oleh antara sampel yang dianalisis nampak bahwa S. pneumonia dan isolat WK45 terletak pada kuadran yang sama hal ini menunjukan bahwa isolat WK45 memiliki sifat fisika dan kimia asam lemak
yang hampir sama. Sedangkan E. coli dan S. mutan terletak pada kuadran yang berbeda hal ini menunjukan bahwa E. coli dan S. mutan meliki sifat fisika dan kimia asam lemak yang berbeda dari sempel bakteri yang lain.
