Identifikasi Senyawa yang Memiliki Aktivitas Antibakteri pada Getah Pelepah Pisang Manggala (Musa X Paradisiaca L.) dengan Metode Bioautografi Kontak
1Muhanad Ramdan A., 2Kiki Mulkiya Y, 3Esti Rachmawati S
1,2,3
Prodi Farmasi, Fakultas MIPA, Unisba, Jl. Tamansari No. 1 Bandung 40116 e-mail: 117algipar@gmail.com, 2qqmulkiya@gmail.com, 3esti_sadiyah@ymail.com
Abstrak: Telah dilakukan penelitian mengenai identifikasi senyawa yang memliki aktivitas antibakteri pada getah pelepah pisang Manggala dengan metode bioautografi kontak. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi bertingkat dengan pelarut n-heksan (MH), etil asetat (MEa),dan etanol 70% (MEt).
Setiap ekstrak diuji aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar sumur. Hasilnya menunujukan bahwa pada MH dan MEt baik dengan konsentrasi 5%, 10%, 15%,20% tidak terbentuk zona hambat. Sebaliknya, pada MEa terbentuk zona hambat dengan diameter 0,845cm (5%); 1,35cm (10%); 1,245cm (15%); dan 1,190 (20%). Ekstrak terpilih yaitu MEa dipantau dengan Kromatografi Lapis Tipis menggunakan fase diam silika gel Gf 254 fase gerak kloroform : etanol (9 : 1). Fraksinasi dilakukan dengan metode Kromatografi Cair Vakum menghasilkan 11 fraksi. Pemantauan fraksi hasil KCV menggunakan fase diam silika gel Gf 254 fase gerak kloroform : etanol (9 : 1). Fraksi 2-11 hasil KCV diuji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak. Hasilnya menunjukan adanya bercak yang menghasilkan zona hambat pada fraksi 4. Pemantauan KLT pada fraksi 4 dilakukan dengan menggunakan fase diam silika gel Gf 254 fase gerak toluen : kloroform : metanol (5 : 4 : 1) menghasilkan pemisahan bercak pada Rf 0,14 ; 0,30 ; 0,50 dan 0,62. Setelah dilakukan kembali pengujian dengan bioautografi kontak, menunjukan bahwa bercak pada Rf 0,62 menghasilkan zona hambat. Karakterisasi bercak yang dilakukan dengan penampak bercak FeCl3 dan Folin Ciocalteu menunjukan dugaan bahwa bercak adalah senyawa fenol.
Kata kunci : Getah, pelepah, pisang Manggala, bioautografi kontak, kromatografi cair vakum, FeCl3,
folin ciocalteu
A. Pendahuluan
Salah satu tanaman yang memiliki potensi untuk meningkatkan kesehatan yaitu pisang (Musa x paradisiaca L.). Pemanfaatannya tidak hanya sebagai bahan pangan namun juga dapat digunakan sebagai bahan pengobatan. Tanaman pisang memiliki banyak kandungan senyawa aktif (metabolit sekunder) yang berperan sebagai senyawa antimikroba dan agen kemoterapi. Beberapa penelitian mengenai pisang telah dilakukan, antara lain mengenai ekstrak bonggol pisang yang memiliki kandungan metabolit sekunder senyawa fenol sepertisaponin dalam jumlah yang banyak, glikosida dan tanin (Soesanto dan Ruth, 2009). Pelepah pisang diketahui memiliki kandungan metabolit sekunder saponin dalam jumlah banyak, flavonoid dan tanin (Priosoeryanto dkk., 2006).
Getah pohon pisang mengandung senyawa saponin, antrakuinon dan kuinon yang berfungsi sebagai antibakteri dan penghilang rasa sakit. Terdapat pula kandungan lektin yang berfungsi untuk menstimulasi sel kulit, tanin yang bersifat antiseptik, dan kalium yang bermanfaat untuk melancarkan air seni, serta saponin yang berkhasiat untuk mengencerkan dahak. Penelitian yang telah dilakukan menyatakan bahwa ekstrak batang pisang mengandung beberapa jenis senyawa fitokimia yaitu saponin, tannin,dan flavonoid (Wijaya, 2010).
Maka rumusan masalah dalam penelitian ini penulis tertarik untuk melakukan pengujian dan identifikasi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dari getah pelepah daun pisang, dan pemanfatan apa yang dapat deberikan setelah pengujian.
dalam hal ini pisang yang digunakan adalah pisang Manggala.
Tujuan dari penelitian ini mengidentifikasi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dari getah pelepah daun pisang Manggala melalui metode isolasi senyawa yang disertai pemantauan aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus.
Penelitian ini diharapkan memberikan informasi ilmiah akan kegunaan pohon pisang sebagai antibakteri berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan.
B. Landasan Teori
1.1 Pisang (Musa x paradisiaca)
Pisang yang tergolong tanaman buah berupa herba tidak asing lagi bagi sebagian besar masyarakat. Tumbuhan ini berdasarkan klasifikasi ilmiahnya tergolong dalam keluarga besar Musaceae, Tanaman pisang termasuk dalam golongan terna monokotil tahunan berbentuk pohon yang tersusun atas batang semu. Batang semu ini merupakan tumpukan pelepah daun yang tersusun secara rapat teratur. Percabangan tanaman bertipe simpodial (Suhardiman, 1997 dan Cronquist, 1981).
Getah batang herba pisang mengandung beberapa jenis senyawa fitokimia yaitu saponin dengan kandungan yang paling banyak, kemudian flavonoid dan tanin, alkaloid dan tidak mengandung steroid dan triterpenoid. Polifenol dan flavono merupakan golongan fenol yang telah diketahui memiliki aktivitas antiseptik (Suhardiman, 1997 dan Cronquist, 1981).
1.2 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat berdiameter 0,7-1,2 μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar. Infeksi oleh Staphylococcus aureus ditandai dengan kerusakan jaringan yang disertai abses bernanah. Beberapa penyakit infeksi yang disebabkan oleh S. aureus adalah bisul, jerawat, impetigo, dan infeksi luka. (Jawetz dkk.,1995).
1.3 Bioautografi KLT
Bioautografi adalah suatu metode pendeteksian untuk menemukan suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan cara melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pada suatu kromatogram hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Pada bioautogafi ini didasarkan atas efek biologi berupa antibakteri, antiprotozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi yang diteliti. Bioautografi dapat dibagi atas tiga kelompok yaitu bioautografi kontak, bioautografi langsung, bioautografi pencelupan.
(Akhyar, 2010).
C. Metode Penelitian
Tahap penelitian dimulai dengan pengumpulan getah pelepah pisang Manggala, penapisan fitokimia terhadap getah pisang, fraksinasi bahan, Pengujian aktivitas antibakteri, Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada ekstrak terpilih, fraksinasi bahan dengan metode Kromatografi Cair Vakum (KCV), bioautografi terhadap fraksinat, pemantauan KLT, identifikasi senyawa.
Penyiapan bahan meliputi determinasi dan pengumpulan getah. Penapisan fitokimia terhadap getah pisang Manggala meliputi pemeriksaan golongan alkaloid, flavonoid, saponin, kuinon, polifenolat, tanin, monoterpen dan seskuiterpen serta steroid
penetapan kadar abu total, kadar abu tidak larut air, kadar sari larut air dan kadar sari larut etanol pada simplisia, sedangkan evaluasi parameter spesifik dilakukan pemeriksaan secara makroskopik dan mikroskopik.
Proses penelitian dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu pengumpulan getah pelepah pisang Manggala yang dilakukan dengan cara menampung getah yang keluar dari bagian pelepah pisang yang telah dipotong, kemudian getah di ekstraksi menggunakan metode maserasi bertingkat terhadap tiga ekstrak yang diperoleh (MH, MEa, Met) kemudian dilakukan pengujian aktifitas antibakteri menggunakan metode difusi agar untuk mendapat nilai KHM. Ekstrak dengan nilai KHM paling tinggi kemudian di pantau menggunakan KLT, dan difraksinasi menggunakan KCV. Terhadap fraksinat yang diperoleh kemudian dilakukan pengujian bioautografi untuk memantau aktifitas antibakteri, fraksinat yang terpilih dipantau kembali dengan KLT, setelah didapat pemisahan yang baik dilakukan kembali uji bioautografi. Dan identifikasi senyawa melalui penambahan penampak bercak.
D. Hasil Dan Pembahasan
Getah pelepah pisang Manggala yang didapat sebanyak 517 gram merupakan simplisia yang akan digunakan pada penelitian. Simplisia yang diperoleh kemudian ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi bertingkat dengan tiga pelarut yang memiliki perbedaan sifat kepolaran yaitu N-Heksan, Etil asetat dan etanol 70%. Hingga diperoleh ekstrak cair N-Heksan (MH), ekstrak cair etil asetat (MEa), ekstrak cair etanol 70% (Met). Pemekatan ekstrak cair dilakukan menggunakan alat evaporator dengan mekanisme kerja menekan suhu dengan menggunakan bantuan alat vakum sehingga titik didih pelarut dapat diturunkan dan penguapan terjadi lebih cepat. Hasil ekstrak pekat yang diperoleh adalah sebagai berikut : MH sebanyak 0 g (tidak terukur), MEa sebanyak 1,2030 g dan Met sebanyak 14,16 g. Dilihat dari jumlah randemennya MEt merupakan ekstrak yang diperoleh paling banyak. Hal ini menunjukan bahwa lebih banyak senyawa yang tertarik kedalam pelarut etanol dibanding kepada pelarut etil asetat dan N-Heksan. Hal ini didukung pula dengan data hasil penetapan kadar sari larut etanol yang menunjukan angka lebih tinggi dibandingkan angka kadar sari larut air.
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode Konsentrasi Hambat Minimum (KHM). Dalam metode ini dibuat seri konsentrasi dari setiap ekstrak sebanyak empat konsentrasi yaitu 5% ; 10% ; 15% ; 20% dibuat dalam 2 mL dengan pengenceran bertingkat.
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar sumur menggunakan bakteri Staphylococcus aureus yang mana bakteri ini merupakan flora normal pada kulit, jika bakteri S. aureus terdapat pada luka maka bisa menjadi bakteri patogen yang dapat menimbulkan infeksi. S. aureus disuspensikan pada media cair NB dengan pengukuran transmitan 25% untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang maksimal. Sementara itu dibuat media dengan cara melarutkan agar NA dalam aquadest. Setelah media NA pada cawan petri memadat dibuat lubang sumur menggunakan perforator sebagai tempat penyimpanan seri konsentrasi yang telah dibuat. Kemudian cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu 370 C, yang ini diketahui merupakan suhu tumbuh bakteri dan menyerupai suhu tubuh manusia.
Hasil inkubasi kemudian diamati dalam waktu 24 jam. Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak pada semua konsentrasi ekstrak etil asetat yang diuji terdapat zona bening dibandingkan ekstrak etanol yang tidak menghasilkan zona
bening. Dengan demikian, dapat terlihat bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri yang dapat menarik senyawa antibakteri lebih baik dibanding ekstrak etanol.
Pemantauan KLT ekstrak etil asetat dilakukan untuk melihat seberapa komplek senyawa yang terkandung pada ekstrak etil asetat menggunakan fase diam plat KLT silika gel GF 254 dengan fase gerak kloroform : etanol (9 : 1). Hasil pemantauan KLT menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat masih memiliki banyak komponen sehingga diperlukan pemisahan lebih lanjut
Fraksinasi dengan Kromatografi Cair Vakum (KCV) dilakukan untuk memisahkan komponen dalam ekstrak etil asetat getah pelepah pisang Manggala.
Fraksinasi dengan KCV ini menggunakan fase diam silika gel 60 H dan dielusi secara gradien menggunakan 11 fase gerak yang meningkat kepolarannya Tabel D.1
Tabel D.1 : Pelarut KCV
Pengujian Bioautografi Kontak dilakukan terlebih dahulu terhadap 10 fraksi hasil KCV yang telah dipantau dengan KLT. Hal ini dimaksudkan untuk melihat fraksi mana yang memilki aktivitas antibakteri. Hasil pengujian menunjukan bahwa fraksi ke 4 adalah fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri.
Kemudian dilakukan kembali pengujian bioautografi pada fraksi terpilih yang sebelumnya telah dilakukan optimasi eluen untuk mendapatkan pemisahan yang baik, Pemantauan dilakukan dengan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak Toluen : Kloroform : Metanol (5 : 4 : 1) yang menghasilkan bercak (1 – 4) dengan Rf 0,14 ; 0,3
; 0,5 ; 0,62. Hasil bioautografi fraksi terpilih dapat dilihat pada Gambar D.1
Gambar D.1 Kromatogram KLT fraksi etil asetat ke 4 getah pelepah pisang Manggala, fase diam : silika gel GF 254, fase gerak : Toluen : kloroform : metanol (5 : 4 : 1) a. Secara visual ; b. Penampak bercak sinar UV 254 nm ; c. Penampak bercak sinar UV 366 nm ; d. Uji bioautografi sebelum inkubasi ; e. Uji bioautografi setelah inkubasi.
Dari hasil bioautografi menunjukan bahwa senyawa yang memiliki aktifitas antibakteri terdapat pada bercak 4 dengan Rf 0,62. Dengan demikian, bercak 4 merupakan target uji yang kemudian diidentifikasi dengan pemberian penampak bercak pada plat KLT
Berdasarkan hasil identifikasi dengan penampak bercak, dapat dilihat bahwa pada plat b menggunakan reagen folin ciocalteu menunjukan perubahan yang cukup jelas dimana yaitu terbentuknya warna kuning yang mendadak jelas pada bercak no 4.
Senyawa yang terdapat pada lingkaran merah (bercak ke 4) merupakan senyawa target yang diduga memiliki aktivitas antibakteri. Senyawa tersebut memiliki nilai Rf yang sama dengan bercak yang menunjukan positif terhadap uji bioautografi yaitu dengan nilai Rf 0,62. Diduga senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri pada Rf 0,62 tersebut adalah senyawa fenol. Senyawa fenol ini berinteraksi dengan sel bakteri melalui proses adsorbsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar rendah terbentuk kompleks protein fenol dengan ikatan yang lemah dan segera mengalami peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan denaturasi protein (Pelczar dan Chan,1988).
E. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri pada getah pelepah pisang Manggala “ABB”
terdapat pada fraksi etil asetat.
Pemantauan aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode bioautografi kontak menunjukan adanya senyawa yang berpotensi menghasilkan aktivitas antibakteri yaitu pada Rf 0,62. Setelah dilakukan identifikasi dengan penampak bercak folin ciocalteu senyawa tersebut diduga sebagai senyawa fenol.
Daftar Pustaka
Akhyar. (2010). Uji Daya Hambat dan Analisis KLT Bioautografi Ekstrak Akar dan Daun Buah Bakau (Rhizophora stylosa Griff.) terhadap Vibrio harveyi,[skripsi] Universitas Hasanudin, Makasar.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta.
Dwidjoseputro, D. (1985). Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Gramedia, Jakarta
Farnsworth, N.R., (1996). Biological and Phytochemical Screening of Plants, J. Pharm.
Sci.
Fidrianny, I. Ruslan, K. Diani, R. (2012) antioxidant capacities of various exstracts from purple sweet potatoes (Ipomoea batatas (L)Lamk.) tubers and isolation of antioxidant coumpound. [Jurnal] Institut Teknologi Bandung. Bandung.
Harborne. (1987). Metode Fitokimia : Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan.
Edisi II. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Penerbit ITB, Bandung.
Hostettmann. K, Marston, A. (1995). Preparative Chromatography Techniques:
Applications in Natural Product Isolation. University of Lausanne. Switzerland.
Jawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F. Brooks., J.S. Butel., dan L.N. Ornston.
(1995). Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20 (Alih bahasa : Nugroho &
R.F.Maulany). Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Prasetyo, T. (2009). Pola resistensi bakteri dalam darah terhadap kloramfenikol, trimetroprim/sulfametoksazol, dan tetrasiklin di Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas Ke dokteran Univertsitas Indonesia (LMK FKUI). [skripsi]
Fakultas kedokteran. Jakarta.
Priosoeryanto, B. P., Huminto, H., Wientarsih, I.,S. Estuningsih. (2006). Aktifitas Getah Batang Pohon Pisang Dalam Proses Persembuhan Luka Dan Efek Kosmetiknya Pada Hewan. http://repository.ipb.ac.id. 11 desember 2015.
Rostinawati. T (2009) Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella (Hibiscus Sabdariffa L) Terhadap Escherichia coli, Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dengan Metode Difusi Agar, [Skripsi] Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, Bandung.
Rukmana, R. (1999). Usaha Tani Pisang. Kanisius. Yogyakarta.
Ryan, K.J., Champoux, J.J, Falkow, S, Plonde, J.J, Drew, W.L, Neidhardt, F.C and Roy, C.G. (1994). Medical Microbiology An Introduction to Infectious Diseases. 3rd ed. Connecticut: Appleton&Lange.
Septyaningsih, D, (2010). Isolasi dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Biji Buah Merah (Pandanus conoideus Lamk.), [Skripsi] Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Pelczar,M.J., (1986), Dasar-Dasar Mikrobiologi , Jilid 1 dan 2, : UI Press, Jakarta.
Suhardiman, P. (1997). Budidaya Pisang Cavendish. Penerbit Kansius. Yogyakarta
