Analisis Keragaman Genetik Bawang Merah (Allium ascalonicum L.) pada Beberapa Aksesi di Samosir Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

(1)

LAMPIRAN

Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer

A. LARUTAN STOK

CTAB 5 % (100 ml)

-

Ditimbang NaCl sebanyak 2.0 gram

-

Ditimbang CTAB sebanyak 5.0 gram.

-

Dimasukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml

aquades.

Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml)

-

Ditimbang Tris sebanyak 12.114 gram.

-

Dimasukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk

di atas hot plate menggunakan stirrer.

-

Diatur pH mencapai 8 dengan HCl (4.2 ml)

-

Dimasukkan ke dalam gelas ukur, lalu ditambahkan aquades hingga volume

larutan mencapai 100 ml.

-

Disterilisasi dengan autoklaf.

Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m)

-

Ditimbang Tris sebanyak 6.057 gram.

-

Dimasukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades, diaduk

di atas hot plate menggunakan stirrer.

-

Diatur pH mencapai 7.4 dengan NaOH 2.5 M.

-

Dimasukkan ke dalam gelas ukur lalu ditambahkan aquades hingga volume

larutan mencapai 50 ml.

-

Disterilisasi dengan autoklaf.

EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml)

(2)

-

Ditimbang NaOH sebanyak 2.0 gram.

-

Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di

atas hot plate menggunakan stirrer.

-

Diatur pH mencapai 8 dengan HCl.

-

Dimasukkan ke dalam gelas ukur, lalu ditambahkan aquades hingga volume

larutan mencapai 100 ml.

-

Disterilisasi dengan autoklaf.

NaCl 5 M pH 7.7 (l00 ml)

-

Ditimbang NaCl sebanyak 29.22 gram.

-

Masukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di atas

hot plate menggunakan stirrer.

-

Dimasukkan ke dalam gelas ukur, , lalu ditambahkan aquades hingga volume

larutan mencapai 100 ml.

-

Disterilisasi dengan autoklaf.

B. LARUTAN BUFFER

Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml)

-

Dicampurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl 5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10

ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.

Buffer TAE 50 X (100 ml)

-

Dicampurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml Asam Asetat Glasial, 10 ml

EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

Buffer TAE 1X (700 ml)

-

Dilarutkankan 70 ml Buffer TAE 10 X dengan dan 630 ml aquades.

Buffer TE (50 ml)

-

Dicampurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M pH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5 M pH 8.0 dan 49.4

ml aquades.

(3)

KIAA (Kloroform : Isoamilalkohol = 24 : 1 (50 ml)

-

Dicampurkan 48 ml Kloroform dan 2 ml Isoamilalkohol.

Etanol 70 % (100 ml)

-

Dicampurkan 70 ml Etanol dengan 30 ml aquades.

(4)

Lampiran 2. Alur Penelitian

Sampel Daun Bawang Merah

Isolasi DNA

Uji Kuantitas

PCR-RAPD

Elektroforesis

Analisis Hasil mplifikasi PCR

(5)

Lampiran 3. Proses Isolasi dan Purifikasi

Sterilisasi alat dan bahan dengan autoklaf (121

o

C 1 atm)

Daun dibersihkan dan ditimbang sampel 3 gr

Daun digerus ditambahkan 0.1 g PVPP dan 0.5 ml b.e CTAB

Dimasukkan ke tabung mikro 2 ml yang diisi 1 ml b.e CTAB

Ditambahkan 10 µl

β

-mercaptoetanol, lalu divortex hingga rata.

Tabung diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 65

0

C, setiap

10 menit sekali tabung dibolak balik dengan perlahan

Ditambahkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung dan dikocok hingga homogen.

Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan 13.000 rpm

Fase atas dipindahkan ke tabung lain, ditambahkan 1 ml larutan KIAA.

Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan 13.000 rpm

Fase atas dipindahkan ke tabung lain, ditambahkan 1 ml isopropanol dingin

Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih

yang muncul. Inkubasi suhu 4

o

C selama 30 menit.

Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan 13.000 rpm,

lalu cairan isopropanol dibuang

Setelah cairan dibuang, kemudian pellet dicuci dengan etanol absolut

lalu dikeringanginkan

(6)

Ditambahkan 30 µl buffer TE dan pellet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok

DNA yang diperoleh disimpan salam freezer pada

suhu ± 20

o

C bila tidak digunakan.

(7)

Lampiran 4. Proses PCR-RAPD

Komposisi Master Mix volume 25 µl

Go Taq PCR

12.5

µl

Nuclease free wter

8.0

µl

Primer c.p 2.5 µl

DNA templak 2.0 µl

Tabel 1. Proses Amplifikasi PCR

No.

Tahapan

Suhu

Jumlah Siklus

Waktu

1 Denaturasi awal

94

o

C

1 2 menit

2 Denaturasi

94

o

C

45 1 menit

3 Annealing

36

o

C

45 1 menit

4 Ekstension

72

o

C

45 2 menit

5 Ekstension akhir

72

o

C

1 10 menit

6 Kondisi akhir PCR

4

o

C

1 Tak terbatas

Total waktu

± 3 jam 51 menit