KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2012
ABSTRACT
EDWIN THOMAS APITULEY. Cloning of Termophilic Lipase Gene from a Bacterium Isolated from Hot Spring at Seram Island, Molluccas. Under direction of ANTONIUS SUWANTO, and NISA RACHMANIA MUBARIK
Thermophilic bacteria often possess enzymes that are stable and active at high temperature which are valuable for some biotechnological and industrial applications such as lipase enzyme for lipid hydrolysis and esterification reactions. The objectives of this research were to isolate and characterize lipase produced by the thermophilic bacterium, and to isolate and cloned its lipase encoding gene. Isolat T I.2 was thermophilic bacterium isolated from hot spring at Seram island, which had temperature 89°C and pH 6,3. Comparison of 16SrDNA sequence to GenBank database using Basic Local Alignment Search Tools for nucleotides (BLASTn) showed that isolat T I.2 was cosely related to Geobacillus stearothermophilus with 99% homology. The phylogenetic tree for 16S rRNA which was constructed using Neighbour Joining Method and distance was estimated using Kimura’s two parameter method with one hundred bootstrap replicates showed that the thermophile isolat T I.2 is clustered to other members of Geobacillusand closely related to Geobacillus stearothermophilus.Titrimetric method was used to measure activity of crude lipase preparation of isolat T I.2 at various temperature and pH with the result showed that optimum temperature and pH of lipase activity were 80°C and 6,5. Isolation of lipase gene was conducted using degenerate primers pair, primers pairs F1-R1 and primers pair F2-R1. Primer pair F1-R1 could amplified only 600 bp of DNA fragment however 1180 bp of isolat T I.2 lipase gene amplified by primer pair F2-R1 was successfully cloned to pGEM-T Easy and transformed to E.coli TOP 10. Crude lipase preparation of E. coli TOP 10 transforman which carry recombinan plasmid, and measured under optimal temperature 80°C and optimal pH 8,5, was 3,11 Unit/ml. Sequence of 390 amino acids deduced from lipase gene of isolat T I.2 was compared to GeneBank database using Basic Local Alignment Search Tools for protein (BLASTp) and the result showed that it was closely related to lipase of Geobacillus stearothermophilusL1 with 90% homology.
RINGKASAN
EDWIN THOMAS APITULEY. Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO, and NISA RACHMANIA MUBARIK
Bakteri termofilik seringkali memiliki enzim yang stabil dan aktif pada suhu tinggi yang bermanfaat untuk diaplikasikan dalam bidang bioteknologi dan industri, seperti enzim lipase yang digunakan dalam reaksi hidrolisis dan esterifikasi. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi bakteri termofilik penghasil lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengisolasi serta mengklon gen penyandi lipase.
Isolat T I.2 adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber mata air panas yang terdapat di pulau Seram yang memiliki suhu 89°C dan pH 6,3. Isolasi dilakukan menggunakan media Basal Salt Mediumdengan minyak zaitun sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase. Pembandingan sekuen 16S rDNA terhadap basis data pada GenBank menggunakan Basic Local Alignment Search Tools for nucleotides (BLASTn) menunjukkan bahwa isolat T I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus stearothermophilus dengan homologi 99%. Primer yang digunakan dikonstruksi oleh Marchesi et al untuk amplifikasi gen 16S rRNA dan merupakan primer universal yang spesifik terhadap domain bakteri,. Analisis filogenetik untuk 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan metode Neighbour Joining, dengan jarak diperkirakan menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates. Pohon filogenetik yang dikonstruksi menunjukkan bahwa isolat T I.2 mengelompok di antara anggota dari genus Geobacillus dan memiliki kemiripan yang lebih dekat terhadap Geobacillus stearothermophilus.
8,5, hal ini menunjukkan bahwa gen lipase pada plasmid rekombinan dapat terekspresi dengan baik.
Sekuen yang terdiri dari 390 asam amino hasil deduksi gene lipase isolat T I.2 dibandingkan terhadap basis data GenBank menggunakan Basic Local Alignment Search Tools for protein (BLASTp) menunjukkan bahwa gen lipase isolat T I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus stearothermophilus L1 dengan tingkat keidentikan mencapai 90%. Berdasarkan hasil pembandingan BLASTp tingkat keidentikan maksimal antara sekuen asam amino protein lipase T I.2 terhadap sekuen asam amino protein lipase Geobacillus yang lain adalah sebesar 93%, meskipun demikian berdasarkan skor maksimal pada hasil pembandingan dengan BLASTp, dapat disimpulkan bahwa isolat T I.2 memiliki kedekatan secara evolusi terhadap Geobacillus stearothermophilus L1 meskipun hanya memiliki tingkat keidentikan 90%. Analisis filogenetik sekuen asam amino hasil deduksi gen lipase dilakukan dengan menggunakan metode Neighbour Joining, dimana jarak diperkirakan dengan metode Poisson dan menggunakan 100 bootstrap replicates. Hasil analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa lipase yang berasal dari isolat T I.2 memiliki kemiripan yang lebih dekat kepada lipase dari genus Geobacillus dan dikelompokkan ke dalam Family I.5 dari enzim lipolitik. Analisis filogenetik protein lipase T I.2 terhadap beberapa proein enzim lipase yang berasal dari beberapa spesies Geobacillus dengan menggunakan Neighbour Joining Method menunjukkan bahwa enzim lipase isolat T I.2 terletak pada percabangan awal dari pohon filogenetik bersama dengan sumber awal lipase dari beberapa Geobacillus yang lain dalam pohon filogenetik.
Pemadanan sekuen lipase T I.2 terhadap sekuen dan elemen struktur sekunder lipase L1 dari G. stearothermophilus L1 menunjukkan bahwa daerah pentapeptida terkonservasi, triad katalitik dan daerah pengikatan ion Ca2+ dan Zn2+ bersifat identik pada kedua lipase tersebut. Kedua sekuen tersebut menunjukkan perbedaan hingga 43 asam amino, dan memiliki 346 asam amino yang identik. Hasil pemadanan sekuen asam amino lipase T I.2 terhadap lipase L1 juga menunjukkan bahwa terdapat subtitusi asam amino ke 190 pada daerah heliks α6, yaitu asam glutamat (G) yang bersifat polar negatif pada lipase L1, menjadi lisin (K) yang bersifat polar positif. Heliks α6 akan berfungsi sebagai tudung (lid) yang dapat membuka selama aktivasi enzim lipase Geobacillus stearothermophilus.Subtitusi juga terjadi pada Histidin (H) 87 yang bersifat polar netral pada daerah domain ekstra pada lipase L1, menjadi asam aspartat (D) yang bersifat polar negatif pada lipase dari isolat T I.2. Protein enzim lipase dari Geobacillusmemiliki suatu domain ekstra, yang memiliki situs pengikatan Zn2+, yang membentuk ikatan koordinasi dengan domain ekstra (Histidin 81 dan Histidin 87) dan domain inti dari protein (Aspartat 61 dan Aspartat 238). Adanya ikatan koordinasi ini berperan untuk meningkatkan termostabilitas enzim.
©
Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat dan anugerahnya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema
yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2010
adalah kloning gen lipase, dengan judul Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik
dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius
Suwanto, M.Sc dan Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku pembimbing,
bapak Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA yang telah banyak memberikan saran dan
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi. Penulis
juga ingin mengucapkan terima kasih kepada PT. Wilmar Benih Indonesia atas
bantuan dana dan kesempatan untuk memanfaatkan fasilitas penelitian, kepada
Ibu Esti Puspitasari, M.S, Bapak Cahya Priatna, M.Sc, Bapak Yeppi Hardi
Rustam, S.Si, Griselda Herman S.Si beserta seluruh staf Departemen Research
and Development, PT Wilmar Benih Indonesia yang telah membantu selama
dilakukannya penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan staf Jurusan
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Universitas Pattimura,
dan kepada rekan-rekan angkatan 2009 pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah
Pascasarjana IPB. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada ibu dan
kakak-kakak, serta seluruh keluarga atas segala doa, kasih sayang dan dukungan
yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2012
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Ambon pada tanggal 1 Mei 1974 dari ayah Jacob J. H. Apituley (Alm) dan ibu Merry Z. Apituley. Penulis merupakan putra bungsu dari lima bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB, lulus pada tahun 2000. Pada tahun 2002, penulis melanjutkan pendidikan pada program Magister Manajemen, Universitas 17 Agustus, Surabaya dan menyelesaikannya pada tahun 2004. Pada tahun 2009, penulis memperoleh kesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB.
DAFTAR ISI
Struktur dan Mekanisme Reaksi Enzim Lipolitik ……….. 5Klasifikasi Enzim Lipolitik Bakteri ……….. 9
EnzimTermostabil dari Mikroorganisme Termofilik ...………... 10
Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen 16S rRNA …………. 11
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ……….. 13
Bahan dan Alat ………... 13
Metode Penelitian ..………. 13
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase ……….. 19
Identifikasi Bakteri ………. 21
Analisis Filogenetik 16S rRNA ……….. 24
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar ……… 25
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase ………. 28
Isolasi Gen Lipase ……….. 29
Kloning Gen Lipase ……… 31
Analisis Filogenetik Protein Lipase ...……… 37
SIMPULAN ………... 45
DAFTAR PUSTAKA ……… 47
DAFTAR TABEL
Halaman
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Diagram topologi pelipatan umum dan minimal dari struktur
pelipatan protein enzim α/β hidrolase ………... 5 2 Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase ………... 7 3 Mekanisme reaksi hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase ………… 8 4 Peta pulau Seram yang terletak di Provinsi Maluku ………... 19 5 Tempat pengambilan sampel dari sumber mata air panas …………... 20 6 Koloni isolat T I.2 yang ditumbuhkan pada media yang mengandung
rhodamin B ………. 21
7 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan primer 63f dan 1387r ………... 22 8 Posisi filogenetik dari isolat T I.2 di antara spesies Geobacillus……. 24 9 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar ………... 26 10 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar ……….. 27 11 Hasil amplifikasi genom isolat termofilik T I.2 dengan menggunakan
primer OXF-ACR ……….. 28
12 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dengan menggunakan primer
degenerate ………... 30
13 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dari isolat T I.2 dengan
menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 ………. 30 14 Hasil amplifikasi PCR untuk verifikasi transforman dengan
menggunakan pasangan primer M13f dan M13r ………... 32 15 Peta plasmid rekombinan pGEM-T Geolip-Full ………. 32
16 Peta plasmid pGEM-T Easy ……… 33
17 Sekuen promotor dan situs multiple cloningdari plasmid
pGEM-TEasy ..……… 33
18 Koloni E. coli TOP 10 transforman ditumbuhkan pada media rhodamin B yang diberi Ampisilin (100 µg/ml), X-Gal 80µg/ml
dan IPTG (0,1 mM) ……… 34
19 Posisi filogenetik protein lipase T I.2 di antara protein enzim
Halaman
20 Posisi filogenetik protein lipase T I.2 di antara protein enzim lipase
dari beberapa spesies Geobacillus ……….. 39 21 Sekuen konsensus lipase dari beberapa spesies Geobacillus ……….. 42 22 Pembandingan sekuen asam amino protein lipase T I.2 terhadap
Halaman
1 Matriks subtitusi BLOSUM62 ………... 55 2 Sekuen 16S rRNA isolat T I.2 ……… 56 3 Hasil pengukuran aktivitas enzim lipase isolat T I.2 pada kisaran
suhu 50°C hingga 90°C dan pH 7 ……….. 57 4 Hasil pengukuran aktivitas enzim lipase pada kisaran pH 5 hingga 9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Minyak dan lemak berperan penting dalam diet manusia, dengan menyediakan kalori dan asam lemak yang esensial. Asam lemak yang teresterifikasi ke gliserol merupakan komponen utama penyusun minyak dan lemak (Shahidi 2005). Minyak dan lemak digolongkan sebagai lipid sederhana dan digunakan dalam industri untuk menghasilkan produk berupa makanan maupun produk oleokimia. Berdasarkan karakteristik minyak dan lemak sebagai bahan baku yang sesuai dengan kebutuhan perakitan suatu produk berbasis minyak dan lemak dan perubahan persepsi tentang kandungan nutrisinya mendorong dilakukannya modifikasi terhadap minyak dan lemak untuk memenuhi kebutuhan tersebut.
Enzim lipase (EC 3.1.1.3, triasilgliserol asilhidrolase) menghidrolisis lemak dan minyak m asam lemak dan gliserol. Enzim lipase j dapat mensintesis ester dan reaksi interesterifikasi. Oleh karena kemampuan katalisis terhadap reaksi-reaksi tersebut, enzim lipase digunakan s luas dalam industri untuk menghasilkan d proses pengolahan makanan, sintesis kimia dan farmasi, sintesis surfaktan, industri oleokimia, dan agrokimia (Vjs 1994).
Proses katalisis menggunakan enzim lipase memiliki beberapa keuntungan dibandingkan proses katalisis s km seperti tingkat kespesifikan yang tinggi terhadap substrat maupun situs target yang dikatalisis, proses pemurnian yang lebih sederhana dan murah, aktivitas katalitik yang relatif lebih tinggi, proses yang lebih bersahabat dengan lingkungan, dan bersifat biodegradable( et al. 2008).
Beberapa lipid terutama yang mengandung asam lemak rantai p tidak j bersifat padat pada suhu ruang sehingga harus diubah ke dalam bentuk pada suhu di atas 50°C untuk dapat diproses lebih lanjut, karenanya
dibutuhkan enzim lipase yang stabil pada suhu tinggi (Cho et al. 2000). Enzim lipase yang stabil pada suhu tinggi dimanfaatkan untuk proses pengolahan limbah
yang mengandung lipid dalam jumlah yang tinggi, yang dihasilkan oleh proses
2
Kandungan lipid yang tinggi pada limbah sering menimbulkan masalah seperti bau tidak sedap yang dihasilkan, penyumbatan pipa saluran pembuangan, dan menghambat proses pengolahan limbah biologis karena lipid akan membentuk lapisan pada permukaan air sehingga menurunkan transfer oksigen pada proses aerobik (Lemus & Lau 2002). Aplikasi mikroorganisme termofilik dan enzim lipase untuk pengolahan limbah dengan kandungan lipid tinggi memiliki keuntungan karena pada suhu di atas 50°C, lipid yang membentuk agregat akan mencair dan akan terbentuk emulsi substrat yang stabil dengan luas
permukaan yang meningkat selama proses agitasi sehingga ketersediaan substrat
untuk dimanfaatkan oleh enzim maupun mikroorganisme menjadi meningkat.
Pada suhu tinggi laju difusi dan transfer massa akan meningkat dan mengurangi
jumlah patogen (Markossian et al.2000).
Enzim lipase yang stabil pada suhu tinggi (termostabil) seringkali dapat
diperoleh dari mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu menengah
(mesofilik), maupun dari mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu tinggi
(termofilik). Meskipun demikian, enzim dari mikroorganisme yang bersifat
termofilik bersifat lebih stabil pada kisaran pH yang lebar dalam pelarut organik
dan menunjukkan aktivitas yang relatif lebih tinggi pada suhu tinggi dibandingkan
mikroorganisme nontermofilik (Jiang et al. 2010).
Meskipun memiliki stabilitas yang tinggi pada kisaran pH yang luas dan
suhu yang tinggi, lipase yang berasal dari bakteri termofilik secara normal
dihasilkan dalam jumlah yang rendah sehingga dibutuhkan rekayasa secara
genetik untuk mengisolasi, mengubah regulasi gen dan untuk meningkatkan
produksi protein enzim. Informasi mengenai sekuen nukleotida suatu gen
memungkinkan untuk menentukan sekuen asam amino dari protein suatu enzim.
Berdasarkan sekuen asam amino akan dapat diperkirakan pelipatan tiga dimensi
polipeptida untuk menciptakan struktur tersier yang stabil. Salah satu metode
yang dapat digunakan untuk melakukan isolasi gen lipase ialah dengan
menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode PCR telah berhasil digunakan untuk melakukan isolasi gen lipase dari beberapa bakteri termofilik
antara lain dari genus Bacillus subtilis (Ma et al. 2006), maupun dari genus
3
Lingkungan dengan kondisi suhu tinggi sering ditemukan pada berasosiasi dengan fenomena vulkanik, seperti sumber air panas, fumarol maupun geothermal vents (Madigan et al. 2009). Indonesia merupakan negara yang memiliki banyak lokasi hidrotermal yang merupakan habitat bagi beragam mikroorganisme termofilik sehingga merupakan salah satu sumber bagi enzim yang stabil pada suhu tinggi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini b !" !#n untuk mengisolasi bakteri termofilik penghasil lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengklon gen penyandi lipase.
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Struktur dan Mekanisme Reaksi Enzim Lipolitik
Enzim lipolitik $ % ') *) struktural dikelompokan ke dalam protein superfamili α/β hidrolase. Anggota kelompok ini memiliki karakteristik yang sama yaitu:memiliki kesamaan arsitektur protein berupa pelipatan α/β h +, * - .)$ % / kesamaan unsur penyusun utama situs katalitik enzim, yaitu katalitik triad yang umumnya tersusun dari residu serin, aspartat dan histidin, kesamaan motif urutan pentapeptida terkonservasi pada residu serin situs aktif, yang umumnya tersusun atas Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (Arpigny 0 J)%1%* 1999). Beberapa enzim yang memiliki struktur pelipatan dan mekanisme katalitik yang sama, yaitu enzim lipase (E.C.3.1.1.3), esterase (E.C.3.1.1), asetilkolinesterase (E.C.3.1.1.7), kutinase (E.C.3.1.1.74), karboksil- esterase (E.C.3.1.11), arilesterase (E.C.3.1.1.2), fosfolipase A1 (E.C.3.1.1.32), kolinesterase (E.C.3.1.1.8) dan
2 3 4%5+ .% hormone esterase (E.C.3.1.2.14) 6 7+ $'her 0Pleiss, 2003).
Anggota kelompok protein enzim α/β hidrolase memiliki kesamaan struktur pelipatan protein yang $ % ' ) *) umum merupakan suatu struktur pelipatan yang tersusun dari 8 untaian lembaran β (β-sheet) yang hampir seluruhnya pararel, dan diselingi oleh 6 untaian heliks α (α-8 9 ;<=) (Gambar 1) (Kim et al. 1997).
Gambar 1 > + )1* )? topologi pelipatan umum dan minimal dari struktur pelipatan protein enzim α/β hidrolase. Warna hitam ? %535 2 3@ @)5 pelipatan
minimal, w) *5)abu-abu ? %535 2 3@ @)5pelipatan umum. Katalitik triad ditandai sebagai N3:Nukleofil,
6
Struktur pelipatan yang minimal dibutuhkan oleh suatu protein untuk dapat dikelompokan dalam protein enzim α/β hidrolase adalah memiliki minimal 5 rantai β, dimulai dari rantai β3 (Heikenheimo et al. 1999). Struktur pelipatan umum α/β hidrolase memiliki untaian lembaran β2 yang antipararel terhadap untaian lembaran β yang lain, dengan pola untaian α-heliks diikuti lembaran β (α turn β). Stuktur katalitik pada enzim α/β hidrolase memiliki katalitik triad yang terdiri atas nukleofil, asam dan histidin. Nukleofil pada struktur katalitik tidak sama pada tiap enzim α/β hidrolase dan dapat berupa serin, sistein atau asam aspartat.
Berdasarkan substratnya, enzim lipase dibedakan dari esterase. Substrat enzim lipase adalah asilgliserida rantai B C E F C E G yang bersifat tidak larut di dalam air dan karenanya akan membentuk misel. Asilgliserida rantai pendek yang bersifat lebih larut dalam air merupakan substrat untuk enzim esterase. Kontak antara lipase dengan antarmuka (iI KM O PQ RM) misel yang terbentuk dari substrat berupa asilgliserol rantai B CE FCE G yang tidak larut dalam air akan menyebabkan perubahan konformasi enzim ST E FCU X konformasi yang aktif, fenomena pengaktifan ini dikenal sebagai iIKMO PQRiQ Y activation. ZIKM OPQR iQ Y activationpada lipase melibatkan reorganisasi struktur sekunder dan pembukaan suatu struktur yang dibentuk oleh untaian α heliks yang menutup situs aktif enzim ([CT GT\et al. 1994, Kim et al. 1997).
7
Gambar 2 Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase (`a ce f g l 1994). Rn, R’n adalah residu asam lemak, ROH umumnya adalah metanol.
Mekanisme reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase ini digunakan dalam aplikasi untuk memproses lemak dan minyak, antara lain hidrolisis lemak atau minyak untuk membuat sabun, gliserolisis untuk produksi monogliserida yang dimanfaatkan sebagai pengemulsi pada produk makanan, kosmetik dan farmasi. Reaksi esterifikasi dimanfaatkan untuk menghasilkan gliserida seperti monogliserida melalui proses esterifikasi asam lemak ke gliserol, sedangkan reaksi interesterifikasi digunakan dalam transformasi minyak dengan nilai ekonomi rendah, seperti fraksi menengah dalam pemrosesan minyak sawit menjadi trigliserida cocoanbutter yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Proses alkoholisis gula alkohol dengan minyak yang berasal dari tanaman maupun hewan
Alkoholisis Hidrolisis
Gliserolisis Asidolisis
8
Gambar 3 Mekanisme reaksi hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase (Jaeger et al 1999): (1) Pengikatan lipid (substrat) dan aktivasi
residu nukleofilik serin oleh histidin, diikuti oleh serangan terhadap atom karbon pada gugus karbonil oleh O- dari serin, (2) Terbentuk intermediet tetrahedral sementara dengan O- distabilkan oleh interaksi dengan dua gugus NH pada peptida. Histidin mendonasikan satu proton kepada komponen alkohol dari bagian substrat yang memisah, (3) Terbentuk intermediet kovalen (asil-enzim) yaitu komponen asam dari substrat teresterifikasi ke residu serin dari enzim. Molekul air akan diaktifkan oleh residu histidin
dan menghasilkan ion hidroksil yang kemudian melakukan serangan nukleofilik ke atom karbon dari gugus karbonil dari senyawa intermediet kovalen, (4) Residu histidin mendonasikan
9
akan menghasilkan ester asam lemak pada gula (Jaeger et al. 1994). Mekanisme reaksi katalitik hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase terdiri atas empat tahapan reaksi oqr tur v3).
Klasifikasi Enzim Lipolitik Bakteri
x y z {t lipolitik pada bakteri dikelompokkan ke dalam | family berdasarkan motif urutan asam amino terkonservasi dan karakteristik biologis enzimo }v ~{yJaeger 1999). rt{I merupakan kelompok yang terbesar dan dikelompokkan lagi ke dalam 6 subfamily. Termasuk ke dalam family ini ialah enzim lipase yang berasal kelompok bakteri qram negatif seperti dan maupun bakteri qram positif seperti Bacillus maupun .x y z {tlipase dari kelompok bakteri termofilik aerobik dari genus Bacillus yang diklasifikasikan ulang sebagai Geobacillus (Nazina et al. dikelompokkan ke dalam subfamily
rt{ II merupakan kelompok enzim lipolitik dari bakteri yang memiliki motif urutan pentapeptida q-} ~-¡¢v-o£¢ ¤atau oq¥ ¡o£ enzim pada residu serin dari situs aktif, yang membedakannya dari motif pentapeptida dari kelompok family lain, yang ¢ ¦r vr umum adalah q-§-¡¢v-§-q Termasuk ke dalam family ini ialah asiltransferase dari ¨ hila dan esterase yang dihasilkan © ª Salmonella dan © luminescens. xy z{t lipolitik yang memiliki kemiripan urutan asam amino terhadap enzim platelet activating « pada manusia, dikelompokkan ke dalam family III, termasuk dalam kelompok ini ialah enzim lipase dari ¬«us dan albus, serta enzim esterase 1 dari ¬ sp. xnzim lipolitik yang memiliki kemiripan urutan asam amino terhadap enzim hormone sensitive lipase o ®¡ £pada mamalia, di kelompokkan kedalam family ¯°termasuk di dalamnya ialah enzim lipase yang berasal dari sp± ²°enzim esterase 2 yang berasal dari bakteri psikrofilik ¬ sp, esterase dari bakteri mesofilik Escherichia coli dan ¨ ª eutrophus, dan bakteri termofilik ¨
10
Kelompok enzim lipolitik dari family ³ ´ µ¶ µ· µ¸ ¹ º oleh kemiripan sekuen asam amino terhadap beberapa enzim bukan lipolitik yang berasal dari bakteri, seperti hidrolase » ¼½ ¾µ´¹¿dehalogenase dan haloperoksidase. Termasuk ke dalam family ini ialah enzim esterase dari bakteri psikrofilik Moraxella sp. (esterase 3 dan Psychrobacter immobilis, esterase dari bakteri mesofilik Haemophilus influenza dan Acetobacter pasteurianus maupun esterase yang dihasilkan bakteri termofilik Sulfolobus acidocaldarius.
ÀºÁµÂ lipolitik yang dimasukkan ke dalam kelompok family ³Ã ialah enzim karboksilesterase, dan memiliki kemiripan urutan asam amino dengan lysophospholipase pada eukariot, termasuk ke dalam kelompok ini ialah enzim karboksilesterase yang dihasilkan oleh Pseudomonas fluorescens. ĻŽ  ¼ ½¸ family ³Ãà dari enzim lipolitik asal bakteri memiliki kemiripan sekuen asam amino dengan enzim asetilkolin esterase dan µ ºÆ»Ç Ƶº»È ŵɻ·karboksilesterase pada eukariot. Ê»Ëerapa enzim lipolitik dari anggota kelompok ini memiliki manfaat untuk aplikasi dalam industri, seperti karbamat hidrolase yang dihasilkan
Arthrobacter oxydansyang bersifat aktif terhadap herbisida ¼ Ì»ºÍ Ŷ ¹ · Ë ¹Â¹Æ» dan p-nitrobenzil yang dihasilkan Bacillus subtilis dan dimanfaatkan untuk sintesis antibiotik β-lactam. Family VIII merupakan family terakhir dalam pengelompokan enzim lipolitik yang berasal dari bakteri, dan memiliki kemiripan
dengan kelompok C dari enzim β-laktamase, termasuk ke dalam kelompok ini
ialah esterase yang dihasilkan oleh Arthrobacter geobiformis dan Streptomyces
chrysomalis.
EnzimTermostabil dari Mikroorganisme Termofilik
Suhu merupakan salah satu faktor lingkungan yang sangat mempengaruhi
pertumbuhan dan kemampuan organisme untuk bertahan hidup. Beberapa jenis
mikroorganisme diketahui dapat hidup dan tumbuh pada lingkungan yang
memiliki kisaran suhu yang tinggi dan digolongkan sebagai mikroorganisme
termofilik (kisaran suhu 45 hingga 80ºC) dan hipertermofilik (kisaran suhu di atas
80ºC, hingga suhu tertinggi yang diketahui masih dapat mendukung pertumbuhan
yaitu 113ºC) (Stetter 1999, Dehouck et al 2008 ). Secara umum dengan
peningkatan suhu akan menyebabkan kenaikan laju reaksi kimia dan enzimatik
11
suhu tertentu, komponen sel seperti protein dan asam nukleat akan mengalami denaturasi dan menyebabkan sel berhenti berfungsi. Enzim yang berasal dari mikroorganisme termofilik pada umumnya memiliki aktivitas yang optimum pada suhu antara 60 hingga 80ºC dan tidak berfungsi dengan baik pada suhu di bawah 40ºC (Vieille & Zeikus 2001). Agar dapat mempertahankan suatu keadaan
fungsional pada kondisi yang ekstrem seperti pada suhu yang tinggi, dibutuhkan
kestabilan protein (Jaenicke & Bohm 1998).
Mekanisme mempertahankan kestabilan protein pada suhu yang tinggi
ditunjang oleh beberapa faktor, baik yang bersifat intrinsik maupun ekstrinsik
(Vielle & Zeikus 2001). Faktor penstabil yang bersifat intrinsik antara lain:
komposisi asam amino, ikatan disulfide, interaksi hidrofobik, interaksi aromatik
dan ikatan hidrogen. Faktor ekstrinsik merupakan faktor penstabil yang berasal
dari lingkungan dalam sel yaitu garam, substrat maupun tekanan.
Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen 16S rRNA
Sebelum perangkat untuk analisis biologi molekuler berkembang, ahli
taxonomi hanya bertumpu kepada karakteristik fenotip, yaitu penampakan secara
fisik untuk menarik kesimpulan tentang genotip, yaitu gen-gen yang
menyebabkan penampakan fenotip tersebut. Meskipun demikian, terdapat
keterbatasan karena kemiripan fenotip tidak selalu merefleksikan kemiripan
genotip. Metode identifikasi mikroorganisme secara tradisional yang bertumpu
pada karakterisasi fenotip dari organisme juga memberikan hasil identifikasi
yang cenderung bervariasi yang disebabkan oleh pengaruh kondisi pertumbuhan,
fase pertumbuhan dan terjadinya mutasi spontan (Tenover et al. 1997). Dengan
berkembangnya biologi molekuler, data molekuler digunakan untuk menentukan
hubungan filogenetik antara semua mahluk hidup dengan didasarkan pada
hipotesis jam molekuler yang diajukan oleh Emile Zuckerkandl dan Linus Pauling
(Woese et al. 1990). Hipotesis jam molekuler menyatakan bahwa laju subtitusi
sangat konstan di antara protein-protein yang homolog selama masa jutaan tahun
sehingga akumulasi perubahan asam amino berlaku seperti gerakan jam
12
molekuler yang tinggi diharapkan mempunyai hubungan yang lebih dekat dibandingkan dengan organisme yang tingkat kemiripan molekulernya rendah.
Ribosom merupakan molekul yang secara luas digunakan untuk
menentukan hubungan evolusi di antara mahluk hidup (Madigan et al. 2009).
Ribosom merupakan molekul yang berperan penting dalam proses sintesis protein,
telah ada sejak lama sebagai komponen penting di dalam sel, memiliki fungsi
yang konstan, terdistribusi secara universal dan secara moderat memiliki sekuen
yang terkonservasi. 16S rRNA merupakan salah satu dari 3 molekul RNA
ribosomal yang terdapat pada prokaryot dengan ukuran panjang ±1550 bp dan
terdiri atas sekuen daerah variabel dan daerah terkonservasi (Clarridge 2004).
Daerah variabel pada 16S rRNA bakteri menunjukkan keragaman di antara
spesies bakteri yang berbeda dan dapat digunakan untuk identifikasi genus
BAHAN DAN
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Research and Development PT.
Wilmar Benih Indonesia, Bekasi, yang dimulai dari bulan September 2010 sampai
bulan Desember 2011.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan antara lain Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen), plasmid pGEM-T Easy (Promega), Agarose (Gibco), PCR GoTaq®Green Master
Mix (Promega), enzim T4 DNA ligase (New England Biolabs), marker molekuler
100 bp DNA ladder (Vivantis), Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega),
QIAquick PCR Purification kit (Qiagen).
Alat utama yang digunakan ialah sentrifuge (Sorval Biofuge Primo R),
mesin PCR (BIO RAD Thermal Cycler C1000), sequencer (AB Applied
Biosystems Hitachi 3130 Genetic Analyzer), perangkat elektroforesis (BIO RAD),
shaker waterbath (Yih Der).
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase. Isolasi dilakukan dengan
menginokulasikan sebanyak satu lup air dan tanah yang diambil dari mata air
panas ke dalam media Basal Salt Solution (BSM) (0,8 g/l K2HPO4; 0,6 g/l KH2PO4; 1 g/l (NH4)2SO4; 0,2 g/l MgSO4 ·7H2O; 0,05 g/l CaCl2 ·2H2O; 3 g/l NaCl
dan 0,001 g FeCl3) yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 1% minyak zaitun,
kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan penggoyangan 175 rpm selama
48 jam. Setelah inkubasi, kultur disebar pada media Rhodamin B (0,01 g/l
(NH4)2SO4; 0,01 g/l K2HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05 g/l MgSO4·7H2O; 0,01 g/l
FeSO4·7H2O; 0,05 g/l ekstrak khamir, 0,05 g/l tripton, 0,01% Rhodamin B
(Kouker & Jaeger 1987) dan 2% Polyvinil alkohol (PVA)/minyak zaitun (3:1).
dan diinkubasikan pada suhu 60°C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh diamati di
14
Produksi Enzim Ekstrak Kasar. Inokulum untuk produksi enzim dibuat dengan mengambil 1 lup biakan bakteri dan diinokulasikan pada 10 ml media
produksi yang mengandung 0,5% ekstrak khamir, 0,5% tripton dan 2% minyak zaitun kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan digoyang 175 rpm selama
12 jam. Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan inokulum ke dalam 50 ml media produksi: 0,01 g/l (NH4)2SO4; 0,01 g/l K2HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05 g/l MgSO4.7H2O; 0,01 g/l FeSO4.7H2O yang diberi 0,5% ekstrak khamir, 0,5% tripton dan 2% minyak zaitun, kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan
digoyang 175 rpm selama 48 jam. Kultur hasil inkubasi disentrifugasi pada 4000 rpm (nomor rotor 7591) selama 40 menit. Supernatan yang mengandung enzim ekstrak kasar dipisahkan dan digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim.
Pengukuran Aktivitas Enzim. Aktivitas enzim lipase diukur dengan menggunakan metode Xu et al. (2002) yang telah dimodifikasi; 4 ml campuran 2% Polivinyl alcohol (PVA)/ minyak zaitun (3:1) dicampurkan dengan 2 ml 0,2 M bufer natrium fosfat pH 7, 2,5 ml dH2O dan 0,5 m 0,1 M CaCl2. Supernatan yang mengandung enzim ekstrak kasar ditambahkan sebanyak 1 ml dan diinkubasikan selama 15 menit pada 60°C dengan digoyang pada 175 rpm. Reaksi dihentikan dengan penambahan 10 ml etanol 95%. Campuran reaksi diberi 25 μl phenolphtalein dan dititrasi dengan 0,05 M NaOH. Tiga ulangan dilakukan untuk
tiap pengukuran aktivitas enzim. Satu unit aktivitas enzim lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 μmol asam lemak per menit pada kondisi dilakukannya pengukuran aktivitas. Aktivitas enzim relatif adalah persentase aktivitas enzim pada tiap hasil pengukuran, dibandingkan terhadap nilai tertinggi dari hasil pengukuran aktivitas enzim.
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar. Suhu optimum untuk aktivitas enzim ditentukan dengan melakukan pengukuran aktivitas pada suhu yang berbeda, yaitu 50°C, 60°C, 70°C, 80°C dan 90°C pada 0,2 M bufer natrium fosfat pH 7. Penentuan pH optimum untuk aktivitas enzim dilakukan pada suhu optimum dengan melakukan pengukuran aktivitas enzim pada kisaran pH 5 hingga pH 9 dengan menggunakan bufer natrium asetat 0,2 M untuk pH 5 hingga
15
Identifikasi Bakteri. Identifikasi bakteri dilakukan dengan metode PCR koloni, untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA; 1 koloni tunggal diambil dan
dicampurkan ke dalam 25 μl campuran reaksi PCR GoTaq® Green Master Mix (Promega). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah primer universal yang spesifik terhadap domain bakteri (Marchesi et al. 1998) yaitu primer 63f CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan 1387r (5’-GGGCGGAWGTGTACAAGGC-3’). Kondisi PCR adalah pre PCR (94°C, 7 menit), denaturasi (94°C, 30 detik), penempelan (56°C, 30 detik), pemanjangan (72°C, 1 menit dan 30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7 menit). Hasil PCR diimigrasikan pada gel elektroforesis dengan konsentrasi 1,5 % pada 80 volt selama 50 menit. Gel direndam dalam larutan 0,5 mg/l larutan etidium bromida selama 15 menit dan kemudian dalam air selama 10 menit. Gel kemudian divisualisasi di atas UV transiluminator. Untuk sekuensing, hasil PCR dimurnikan dengan QIAquick PCR Purification Kit dan selanjutnya disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen 16S rRNA yang terdapat pada GenBank menggunakan BLASTn (Basic Local Alignment Search Tools for nucleotida).
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase. Isolasi genom total bakteri dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Identifikasi keberadaan gen lipase dilakukan berdasarkan metode Bell
et al. (2002), dengan menggunakan primer OXF1 (5’-CCYGTKGTSYTNG TNCAYGG-3’), OXF2 (5’-CCRATMRTWYTNGTNCAYGG-3’), OXF3 (5’-CC KYTWGTKYTNATHCAYGG-3’), ACR1 (5’-AGGCCNCCCAKNGARTGNS C-3’), ACR2 (5’-AGRCCNCCCAKRCTRTGNSC-3’), ACR3 (5’-AGGCCRCC NTGNGARTGNSC3’), ACR4 (5’AGGCCNCCNTGRCTRTGNSC3’). Kondi -si PCR yang digunakan ialah: segmen 1 (94ºC, 1 detik), segmen 2 (94ºC, 1 menit), segmen 3 (37ºC, 1 detik), segmen 4 (37ºC, 30 detik), segmen 5 (72ºC, 2 menit dan 20 detik), segmen 6 (72ºC, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari: segmen 1 (95ºC, 1 menit), segmen 2 (50ºC, 1 menit) dan segmen 3 (72ºC, 1 menit).
16
(2010), yaitu pasangan primer degenerate (5’-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG-3’ dan 5’-TTAAGGSHSSAARCTYGCCA-(5’-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG-3’), primer F1 (5’-GGAATTCCATA TGATGAAATGCTGCCGGGTGATG-3’), primer F2 (5’-GGAATTCCATATGG CAGCTTCACGCGCCAAT-3’) dan primer R1 (5’-CGCGGATCCTTAAGGG TCCAAGCTCGCCAAC-3’). Kondisi PCR untuk amplifikasi dengan menggunakan primer degenerate ialah: segmen 1 (94°C, 1 detik), segmen 2 (94°C, 1 menit), segmen 3 (37°C, 1 detik), segmen 4 (37°C, 30 detik), segmen 5 (72°C, 2 menit dan 20 detik), segmen 6 (72°C, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari segmen 1 (95°C, 1 menit), segmen 2 (50°C, 1 menit) dan segmen 3 (72°C, 1 menit). Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer degenerate digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1. Kondisi PCR untuk amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 ialah pre PCR (94°C, 7 menit), denaturasi (94°C, 30 detik), penempelan (60°C, 30 detik), pemanjangan (72°C, 1 menit dan 30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7 menit). Hasil PCR kemudian diimigrasikan pada gel elektroforesis, diberi perlakuan dengan etidium bromida dan kemudian divisualisasi pada UV transiluminator. Hasil PCR juga disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada GenBank.
Kloning Gen Lipase. Gen lipase hasil pemurnian diligasikan ke plasmid pGEM-T Easy (Promega) dengan menggunakan enzim T4 DNA ligase (New England Biolab), pada suhu 4°C selama 12 jam, kemudian ditransformasikan ke
17
disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada GenBank menggunakan BLASTp (Basic Local Alignment Search Tools for protein). Aktivitas enzim lipase yang dihasilkan oleh E. coliTOP 10 transforman diukur pada suhu 80°C dan pH 8,5.
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase
Sampel berupa air dan tanah diambil dari mata air panas di pulau Seram,
Maluku (Gambar 4), yang memiliki suhu 89 °C dan pH 6,3. Suhu pertumbuhan
mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu lebih dari 80°C berada pada
kisaran pertumbuhan mikroorganisme yang bersifat hipertermofilik (Stetter 1995).
Gambar 4 Peta pulau Seram yang terletak di Provinsi Maluku.
Tanah yang terdapat pada lokasi mata air tersebut berwarna hitam, tercium
bau belerang dan terdapat daun-daun kering maupun ranting pohon yang gugur
dari pepohonan yang tumbuh di sekitar aliran air dari mata air panas tersebut
(Gambar 5). Lokasi mata air panas terdapat di daerah dataran rendah dan bukan
pada daerah gunung berapi. Menurut Kristjansson dan Hreggvidsson (1995)
sumber mata air panas yang terdapat di luar zona aktif vulkanik biasanya memiliki
20
telah padam atau oleh ruang magma yang telah padam. Suhu air pada kedalaman
500 hingga 3000 meter seringkali di bawah 150°C, air tanah yang dipanaskan
kemudian akan kembali ke permukaan dengan membawa mineral terlarut seperti
silika dan gas terlarut seperti karbondioksida, dan gas H2S dalam jumlah yang
kecil sehingga oksidasi pada permukaan tidak terlalu mempengaruhi pH.
Gambar 5 Tempat pengambilan sampel dari sumber mata air panas.
Bakteri termofilik penghasil lipase diisolasi dengan menginokulasikan air
dan tanah yang diambil dari sumber mata air panas ke media Basal Salt Solution
(BSM), yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 0,1% minyak zaitun sebagai
sumber karbon satu-satunya untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase.
Pencawanan sampel secara langsung pada media seleksi yang kaya dan
mengandung sumber karbon dalam jumlah banyak akan menyebabkan tumbuhnya
mikroorganisme termofilik nonlipolitik dalam jumlah banyak dan dalam waktu
yang relatif cepat. Bakteri penghasil lipase akan membentuk koloni berwarna
21
Gambar 6 Koloni isolat T I.2 yang ditumbuhkan pada media yang mengandung rhodamin B.
Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan pembandingan sekuen gen 16S
rRNA isolat T I.2 terhadap basis data gen 16S rRNA pada GenBank. Amplifikasi
gen 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r
yang dikonstruksi oleh Marchesi et al. (1998) dan diharapkan menghasilkan
fragmen DNA dengan ukuran sekitar 1324 bp. Amplifikasi gen 16S rRNA dari
isolat T I.2 dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r menghasilkan
fragmen dengan ukuran yang berada pada kisaran 1200 bp hingga 1500 bp
(Gambar 7), yang menunjukkan bahwa gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dapat
teramplifikasi dengan baik. Fragmen gen 16S rRNA hasil amplifikasi kemudian
disekuensing dan diperoleh hasil berupa sekuen fragmen DNA berukuran 540 bp
yang selanjutnya digunakan untuk analisis filogenetik (Lampiran 2). Sekuen
fragmen tersebut dimulai dari basa ke-72 yang terdapat pada ujung ÙÚdari sekuen utuh gen 16S rRNA. Sekuen 500 bp awal dari 16S rRNA diketahui memberikan cukup perbedaan untuk tujuan identifikasi antar galur karena memiliki
keragaman yang lebih tinggi untuk tiap kilobasa dari sekuen (Clarridge 2004).
22
1324 bp 1500 bp 1200 bp
Gambar 7 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan
primer 63f dan 1387r (S : fragmen gen 16S rRNA Isolat T I.2, M : Marker 100 bp Vivantis).
Hasil BLASTn untuk pembandingan terhadap sekuen GenBank menunjukkan homologi hingga 99% terhadap Geobacillus stearothermophilus
Tapo3 (Tabel 1). G. stearothermo- philusTapo3 adalah spesies Geobacillusyang diisolasi dari mata air panas di daerah Himalaya, India. Basic Local Alignment Search ÛÜÜÝ (BLAST) adalah alat yang digunakan untuk menemukan
sekuen-sekuen yang sesuai dalam suatu basis data sekuen-sekuen terhadap suatu sekuen-sekuen yang ingin dibandingkan dengan cara membandingan daerah lokal yang memiliki kemiripan yang tinggi antara sekuen-sekuen pada basis data dengan sekuen yang dibandingkan tersebut (Altschul et al. 1997). BLASTn membandingkan suatu sekuen nukleotida pada NCBI terhadap suatu basis data sekuen nukleotida. Hirarki taksonomi isolat T I.2 berdasarkan ribosomal database ÞßÜàá âã(Cole et al.
2005) :
domain Bacteria
phylum äåßæåâçã áè
classBacilli
order Bacillales
familyBacillaceae
genusGeobacillus
23
Tabel 1 Hasil BLASTn sekuen 16S rRNA isolat T I.2 pada NCBI
Accession Description Max AM159506.1 Geobacillus stearothermophilusTapo3 965 965 99% 0.0 99%
HE575191.1 Geobacillussp. JC107 959 959 99% 0.0 99%
HE575190.1 Geobacillus sp. JC106 959 959 99% 0.0 99%
JN692247.1 Bacillussp. SP50 959 959 99% 0.0 99%
GU121478.1 Geobacillus sp. D3198 959 959 99% 0.0 99%
EU740981.1 Geobacillussp. TC-S8 959 959 99% 0.0 99%
EU248957.1 Geobacillussp. H6a 959 959 99% 0.0 99%
AM749791.1 Geobacillussp. K8 955 955 99% 0.0 99%
AY491497.1 Geobacillus stearothermophilus 953 953 99% 0.0 99%
EU740983.1 Geobacillussp. G1 948 948 99% 0.0 99%
DQ836047.1 Geobacillus kaustophilus KKUA1 948 948 99% 0.0 99%
DQ642091.1 Geobacillussp. I112 948 948 99% 0.0 99%
AB680834.1 Geobacillussp. NBRC 15315 944 944 99% 0.0 99%
JN366780.1 Bacillaceaebacterium 55AA1-1 942 942 99% 0.0 99%
JQ311985.1 Geobacillus kaustophilusAIMST TP 942 942 99% 0.0 99%
AB680832.1 Geobacillussp. NBRC 15313 942 942 99% 0.0 99%
CP003125.1 Geobacillus thermoleovoransCCB US3
UF5 942 8441 99% 0.0 99%
JN087511.1 Geobacillussp. HET24 942 942 99% 0.0 99%
JN692244.1 Geobacillus sp. SP45 942 942 99% 0.0 99%
JN692242.1 Geobacillussp. SP37 942 942 99% 0.0 99%
JN036603.1 Geobacillus kaustophilusMAz 942 942 99% 0.0 99%
JF320000.1 Geobacillus thermoleovoransLM 942 942 99% 0.0 99%
HQ891030.1 Geobacillus sp. XT15 942 942 99% 0.0 99%
HM596428.1 Geobacillussp. PZH1 942 942 99% 0.0 99%
HM217764.1 Geobacillus thermocatenulatus UiTMGeo3
942 942 99% 0.0 99%
GU994001.1 Geobacillussp. 49 942 942 99% 0.0 99%
FN666246.1 Geobacillus lituanicusAE8 942 942 99% 0.0 99%
FN428696.1 Geobacillus thermoleovoransR -35650 942 942 99% 0.0 99%
FN428689.1 Geobacillus subterraneusR-35641 942 942 99% 0.0 99%
FN428688.1 Geobacillus uzenensisR-35640 942 942 99% 0.0 99%
FN428686.1 Geobacillus thermoleovoransR -35638 942 942 99% 0.0 99%
FN428684.1 Geobacillus thermoleovoransR -35636 942 942 99% 0.0 99%
FN428671.1 Geobacillussp. R-32630 942 942 99% 0.0 99%
FN428636.1 Geobacillus uzenensisLMG 24726 942 942 99% 0.0 99%
FN428635.1 Geobacillus uzenensisLMG 24535 942 942 99% 0.0 99%
FN428634.1 Geobacillus uzenensisLMG 24725 942 942 99% 0.0 99%
FJ796073.1 Geobacillus thermoparaffinivoransZLG 942 942 99% 0.0 99%
FJ422279.1 Geobacillus sp. GXS1 942 942 99% 0.0 99%
24
Analisis Filogenetik 16S rRNA
Pohon filogenetik yang dikonstruksi menggunakan éêëì íî ïð ñ òïë óë óì
Method menunjukkan bahwa isolat T I.2 mengelompok di antara anggota dari genus Geobacillusdan memiliki kemiripan yang lebih dekat terhadap Geobacillus stearothermophilus(Gambar 8).
Gambar 8 Posisi filogenetik dari isolat T I.2 di antara spesies Geobacillus. Nomor akses pada GenBank untuk galur yang digunakan, ditunjukkan di dalam tanda kurung. Nilai jarak (ôëõðñö÷ parameter
method) dilambangkan oleh garis skala. Nilai Bootstrap ditunjukkan pada titik-titik percabangan.
Spesies G. stearothermophilus termasuk ke dalam genus Geobacillus, yang terdiri atas spesies bakteri yang bersifat obligat termofilik yang sebelumnya dikenal sebagai grup 5 dari genus Bacillus (Nazina et al. 2001, 2004), seperti
-25
sius, G. thermodenitirificans, G. subterraneus, G. caldoxylosilyticus, G. debilis, G. gargensis, G. jurassicus, G. lituanicus, G. pallidus, G. tepidamans, G. toebii,
G. vulcani, danG. uzenensis. Kisaran suhu untuk pertumbuhan genus Geobacillus
ialah 37-75°C, dengan suhu optimum pada kisaran 55-65°C, kisaran pH 6,0 hingga 8,5, dan pH optimum pada kisaran pH 6,2-7,5.
Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan metode Neighbour Joiningdan nilai jarak ditentukan dengan Kimura 2 parameter method. Nilai jarak dilambangkan oleh garis skala yang menunjukkan jumlah subtitusi nukleotida
untuk tiap posisi sekuen. Nilai jarak sebesar 0,005 pada hasil konstruksi pohon filogenetik menunjukkan rendahnya subtitusi nukleotida pada sekuen 16S rRNA
Geobacillus. Metode bootstrap digunakan untuk menguji keakuratan suatu titik cabang dalam suatu pohon filogenetik. Nilai bootstrap sebesar 94 untuk titik cabang menunjukkan tingkat kepercayaan yang tinggi bahwa sekuen 16S rRNA isolat T I.2 memiliki kemiripan terhadap Geobacillus stearothermophilus.
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar
Suhu dan pH merupakan faktor yang berpengaruh terhadap aktivitas enzim lipase. Laju semua reaksi, termasuk reaksi yang dikatalisis enzim akan meningkat sejalan dengan peningkatan suhu, dan dijelaskan oleh Arrhenius berdasarkan persamaan k üAe
-∆G*/RT
dengan A adalah konstanta Arrhenius, ∆G* adalah energi
bebas standar untuk aktivasi, R adalah konstanta gas dan T adalah suhu absolut.
Pada suhu rendah, peningkatan suhu akan menyebabkan peningkatan laju reaksi
dan karenanya terjadi peningkatan aktivitas enzim tetapi peningkatan suhu di atas
suhu lingkungan alami kerja enzim akan menyebabkan denaturasi enzim (Chaplin
& Bucke 1990).
Suhu optimum untuk aktivitas lipase ekstrak kasar ialah 80°C pada pH 7,
dan pada suhu 90°C aktivitasnya hanya sebesar 47 % dari aktivitas pada suhu
optimum, meskipun demikian tidak terdapat aktivitas yang dapat diukur pada
suhu 50°C yang menunjukkan bahwa aktivitas dari lipase isolat T I.2 bersifat
obligat termofilik. Pada suhu 60°C dan 70°C, enzim memiliki aktivitas sebesar
26
Gambar 9 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar. Aktivitas enzim
diukur pada pH 7.
Suhu optimum untuk aktivitas enzim lipase dari isolat T I.2 relatif tinggi
dibandingkan lipase dari bakteri termofilik yang berasal dari Geobacillus stearothermophilussepertiG. stearothermophilusL1 (Kim et al. 2000), G. stearo -thermophilusJC (Jiang et al. 2010), danG. stearothermophilusTW1 (Li & Zhang
2005) yang masing-masing memiliki suhu optimum 68°C, 55°C, dan 40°C.
Geobacillus thermoleovorans ID-1 (Cho et al. 2000) dan dua spesies bakteri
anaerobik termofilik Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus SOL 1 dan
Caldananaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis (Royter et al. 2009)
memiliki suhu optimum 75°C. Thermosyntropha lipolytica adalah bakteri
anaerobik termofilik yang memiliki suhu optimum 96°C, dan merupakan suhu
optimum tertinggi untuk aktivitas lipase yang telah dilaporkan (Salameh &
Wiegel 2007).
Umumnya aktivitas enzim menunjukkan hubungan berupa pola kurva
menyerupai lonceng terhadap pH dengan puncak adalah pH optimum. Penurunan
aktivitas enzim pada kedua sisi dari pH optimum dapat disebabkan oleh pengaruh
pH terhadap kestabilan enzim yang menyebabkan enzim tidak aktif, maupun
pengaruh pH terhadap parameter kinetik reaksi enzim seperti kestabilan dalam
27
mengandung gugus asam maupun basa yang bersifat dapat terionisasi. Perubahan
pH dapat menyebabkan perubahan keadaan ionisasi dari gugus asam dan basa
yang terlibat dalam proses katalisis, pengikatan substrat maupun pada gugus yang
terdapat pada substrat (Marangoni 2003).
Gambar 10 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar. Aktivitas
enzim diukur dengan menggunakan bufer natrium asetat ( ),
bufer natrium fosfat ( ) dan bufer Tris-HCl ( ).
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim lipase menunjukkan pH optimum
untuk aktivitas enzim lipase ialah 8,5 pada suhu inkubasi 80°C, dan pada pH 9
aktivitasnya adalah sebesar 74 % dari aktivitas pada suhu optimum. Pada kisaran
pH 7 hingga 8, enzim memiliki aktivitas sebesar 50 % hingga 60 % dari aktivitas
pada suhu optimum, dan tidak menunjukkan aktivitas pada pH 5 (Gambar 10,
Lampiran 4). Hampir semua lipase termofilik diketahui aktif pada kisaran pH
netral hingga basa. Kisaran pH tersebut juga berlaku pada spesies dari
Geobacillus, seperti G. stearothermophilus L1 (Kim et al. 2000),G. stearother -mophilus JC (Jiang et al. 2010) dan G. thermoleovorans ID-1 (Lee et al. 1999),
yang memiliki pH optimum 8, 9 and 7,5. Beberapa bakteri termofilik anaerobik
seperti Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricusSOL 1, Caldananaerobacter
28
subteraneus subsp. tengcongensisdan Thermosyn-tropha lipolytica memiliki pH optimum 8, 7 dan 9,4-9,6.
Isolat T I.2 memiliki aktivitas enzim lipase yang relatif tinggi
dibandingkan aktivitas enzim lipase beberapa spesies lain dari genus Geobacillus,
yaitu sebesar 3 U/ml pada suhu 80°C dan pH 8,5.G. thermoleovorans ID-1 (Lee
et al.1999) and IHI-91 (Markossian et al. 2000) memiliki aktivitas lipase sebesar
0,52 U/ml and 0,3 U/ml ketika diukur pada kondisi optimal, sedangkan G.
stearothermophilus L1 memiliki aktivitas lipase di bawah 0,2 U/ml (Kim et al.
2000).
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase
Prakiraan adanya gen lipase dilakukan dengan mengamplifikasi fragmen
gen lipase menggunakan kombinasi primer ýþÿdan ACR yang dikonstruksi oleh Bell et al.(2002).
Gambar 11 Hasil amplifikasi genom isolat termofilik T I.2 dengan menggunakan
primer ýþ ÿ-ACR ( Marker 100 bp V A primer ýþÿO -ACR3, Býþÿ -ACR3, Cýþÿ-ACR3).
1000 bp 900 bp 500 bp
M A B C
3000 bp
29
Amplifikasi dengan menggunakan kombinasi primer dan ACR memberikan hasil berupa terbentuknya pita-pita DNA dengan ukuran 500bp, 900
bp dan 1000 bp pada gel elektroforesis untuk hasil amplifikasi dengan
menggunakan kombinasi primer -ACR3, -ACR3 dan -ACR3 (Gambar 11). Primer dan ACR akan mengamplifikasi fragmen DNA yang berada pada daerah oxyanion holehingga situs aktif, yang secara umum memiliki
ukuran 180 hingga 320 bp. Hasil sekuensing terhadap fragmen berukuran 500 bp
menunjukkan bahwa fragmen tersebut bukan merupakan fragmen gen lipase.
Terbentuknya fragmen pada hasil elektroforesis disebabkan primer
mengamplifikasi bukan pada situs yang dikehendaki, terutama amplifikasi
fragmen dari gen yang menyandikan enzim lain dari keluargaα/β hidrolase, dan
fragmen non-open reading frame. Tidak terdeteksinya gen lipase menunjukkan
bahwa primer yang dikonstruksi oleh Bell et al. (2002) tidak dapat dipergunakan
untuk prakiraan keberadaan gen lipase pada isolat T I.2.
Isolasi Gen Lipase
Gen lipase dari isolat T I.2 diisolasi dengan menggunakan primer yang
dikonstruksi oleh Jiang et al. (2010). Jiang et al. (2010) mengisolasi fragmen
DNA berukuran 1248 bp yang mengandung open reading frame (ORF) yang
menyandikan 416 asam amino, sedangkan Kim et al. (1998) dengan
menggunakan primer yang berbeda, mengisolasi open reading frame berukuran
1254 yang menyandikan polipeptida yang terdiri atas 417 asam amino. Primer
degenerate digunakan untuk menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang
bervariasi (Gambar 12) untuk kemudian digunakan sebagai template untuk
amplifikasi dengan menggunakan primer F1, F2 dan R1. Fragmen DNA hasil
amplifikasi dengan primer degenerate yang digunakan sebagai template DNA
berukuran antara 1200 hingga 1500 bp. Pasangan primer F1-R1 dirancang untuk
amplifikasi gen lipase utuh pada G. stearothermophilus yang berukuran sekitar
1200 bp, sedangkan primer F2-R1 untuk amplifikasi gen lipase tanpa
mengikutsertakan sekuen DNA yang menyandikan peptida signal (Jiang et al.
2010).
M S
30
Gambar 12 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dengan menggunakan primer
degenerate Marker 100 bp S fragmen gen lipase isolat T I.2).
Gambar 13 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dari isolat T I.2 dengan
menggunakan pasangan primer F -R1 dan F -R1 Marker 100 bp S fragmen hasil amplifikasi dengan menggunakan
primer F-R1, Sfragmen hasil amplifikasi dengan menggunakan primer F-R1).
M S
M S
600 bp
M S1 S2 1200 bp
1500 bp
1000 bp
1200 bp 3000 bp
100 bp
31
Peptida signal berfungsi mengarahkan protein untuk sekresi baik pada prokariot maupun eukariot dan akan dihilangkan oleh protease yang terikat pada membran sel, yang mengenali pola sekuen asam amino yang terkonservasi dengan
baik pada ujung C terminal dari sekuen asam amino yang terdapat setelah peptida
signal tersebut (von Heijne 1986; Bilgin et al. 1990). Sekuen peptida signal pada gen lipase dari G. stearothermophilustersusun atas 29 asam amino, dan memiliki situs pemotongan untuk protease yang terletak antara asam amino alanin ke-29
dan asam amino alanin ke-30 (Kim et al.2000; Jiang et al. 2010).
Amplifikasi dengan menggunakan primer F1-R1 dan F2-R1 menghasilkan
fragmen DNA berukuran sekitar 200 bp, 600 bp, dan 1200 bp (Gambar 13). Hasil
amplifikasi primer F1-R1 yang berukuran hanya 200 bp dan 600 bp diduga karena
penempelan yang bersifat tidak spesifik oleh primer F1 pada situs bukan target
pada sekuen gen lipase, dan terdapat variasi pada sekuen yang menyandikan
peptida signal sehingga primer F1 tidak dapat melakukan penempelan pada situs
tersebut. Hal ini menyebabkan kombinasi primer F1-R1 tidak dapat digunakan
untuk amplifikasi gen lipase dari isolat T I.2. Amplifikasi dengan menggunakan
primer F2-R1 digunakan lebih lanjut untuk proses kloning.
Kloning Gen Lipase
Fragmen DNA berukuran 1200 bp dari hasil amplifikasi (Gambar 13)
dimurnikan dengan menggunakan QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) dan
diligasikan ke plasmid pGEM-T Easy dengan menggunakan enzim T4 ligase
(New England Biolabs). Hasil ligasi kemudian ditransformasikan ke E. coliTOP 10. Verifikasi koloni transforman dilakukan dengan PCR koloni E. coliTOP 10 hasil transformasi, menggunakan primer M13f dan Mn13r untuk memastikan
bahwa fragmen DNA yang diklon telah terligasi pada situs pengklonan. DNA
hasil amplifikasi berukuran sekitar 1400 bp diperoleh dari koloni transforman 1
dan 3, sedangkan fragmen DNA hasil amplifikasi transforman 2 berukuran sekitar
1000 bp. Hasil ini menunjukkan bahwa koloni transforman membawa vektor
pGEM-T Easy yang telah disisipi oleh insert (Gambar 14). Situs untuk
penempelan primer M13f dan M13r terletak masing-masing pada kedua sisi yang
32
Gambar 14 Hasil amplifikasi PCR untuk verifikasi transforman dengan menggunakan pasangan primer M13f dan M13r (M: Marker 100
bp Vivantis, T1: Transforman 1, T2: Transforman 2, T3:
Transforman 3).
Gambar 15 Peta plasmid rekombinan pGEM-TGeolipFull.
T1 T2 T3 M
1200 bp 1500 bp
1000 bp
33
Gambar 16 Peta plasmid pGEM-T Easy.
Gambar 17 Sekuen promotor dan situs multiple cloning dari plasmid pGEM-T Easy.
berlawanan dari situs pengklonan pada plasmid pGEM-TEasy, sehingga kedua
primer tersebut akan dapat mengamplifikasi fragmen DNA insert yang tersisip
pada situs pengklonan (Gambar 15). Sekuensing hasil amplifikasi dari
transforman 1 menunjukkan bahwa insert gen lipase utuh berukuran 1180 bp telah
berhasil diklon pada T Easy dan diperoleh plasmid rekombinan
pGEM-TGeolipFull dengan ukuran 4204 bp (Gambar 15). Plasmid pGEM-T Easy adalah
34
linier (Gambar 16). Ujung 3’ timidin memudahkan ligasi produk PCR dengan
mencegah vektor untuk membentuk konformasi sirkuler, dan menyediakan ujung
yang sesuai untuk produk PCR yang dihasilkan polimerase termostabil tertentu.
Situs pengklonan pada plasmid pGEM-T Easy terdapat di dalam daerah yang
mengkodekan α-peptida dari enzim β-galaktosidase. Penyisipan fragmen gen pada
situs pengklonan akan menyebabkan α-peptida menjadi tidak aktif sehingga dapat
digunakan untuk identifikasi rekombinan berdasarkan seleksi warna koloni
biru/putih pada media seleksi. Pada kedua sisi yang berlawanan pada situs
pengklonan terdapat sekuen promotor RNA polimerase T7 dan SP6 (Gambar 17),
sehingga memungkinkan untuk mengekspresikan gen yang telah tersisipi pada
situs pengklonan dengan menggunakan kedua enzim polimerase tersebut. E. coli
TOP 10 transforman tumbuh dengan baik pada media rhodamin B yang diberi
Ampisilin (100 µg/ml), X-Gal 80 µg/ml dan IPTG (0,1 mM) dan membentuk
koloni yang berwarna merah (Gambar 18).
Gambar 18 Koloni E. coli TOP 10 transforman ditumbuhkan pada media rhodamin B yang diberi Ampisilin (100 µg/ml), X-Gal 80µg/ml dan
35
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) berfungsi untuk menginduksi
promotor lac, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) adalah jenis pewarna yang akan menghasilkan warna biru ketika dihidrolisis oleh
β-galaktosidase. Aktivitas enzim lipase ekstrak kasar yang dihasilkan E.coli TOP 10 transforman sebesar 3,11 U/ml pada kondisi optimal yaitu suhu 80°C dan pH 8,5.
Hal ini menunjukkan bahwa gen lipase pada plasmid rekombinan dapat
terekspresi dengan baik.
Hasil BLASTp untuk pembandingan sekuen asam amino hasil deduksi
pada lipase T I.2 terhadap sekuen lipase pada GenBank menunjukkan homologi
90 % terhadap G. stearothermophilus L1 (Tabel 2). BLASTp membandingkan suatu sekuen asam amino terhadap suatu basis data sekuen protein. Pada tabel
hasil BLASTp, nilai E adalah suatu nilai kemungkinan bahwa terdapat pemadanan
(alignment) lain dengan kemiripan yang lebih besar dibandingkan nilai skor S. S adalah ukuran kemiripan antara sekuen pada basis data dengan sekuen yang
dibandingkan terhadap basis data tersebut. Nilai E akan memiliki makna biologi
yang berarti, jika lebih kecil dari 1. Semakin besar nilai E menunjukkan bahwa
semakin besar kemungkinan bahwa kemiripan antara sekuen pada basis data
terhadap sekuen yang dibandingkan terhadap basis data tersebut merupakan suatu
kebetulan. Nilai E dihitung berdasarkan persamaan : E = mn2-S. Tiga faktor yang
mempengaruhi nilai E tersebut ialah : (1) Nilai S, semakin besar nilai S akan
menghasilkan semakin kecil nilai E; (2) ukuran efektif sekuen yang dibandingkan
(m), semakin besar ukuran efektif sekuen akan menghasilkan semakin besar nilai
E; dan (3) ukuran basis data (n), dengan semakin besar ukuran basis data akan
menghasilkan semakin besar nilai E (Campbell & Heyer 2002). Nilai m dan n
untuk BLASTp lipase T I.2 sebesar 248 dan 3490918789.
Nilai S dipengaruhi oleh nilai R yaitu nilai mentah ukuran kemiripan
antara antara sekuen pada basis data dengan sekuen yang dibandingkan terhadap
basis data tersebut. Pada BLASTp, penghitungan R dilakukan dengan
memberikan nilai pembobotan yang berasal dari matriks subtitusi terhadap tiap
pemadanan individu asam amino, misalnya dengan menggunakan matriks
36
Tabel 2 Hasil BLASTp sekuen lipase isolat T I.2 pada GenBank
Accession Description Max
Lipase From Geobacillussp. SBS-4S 720 720 99% 0.0 92%
gi|375009045|YP
W47928.1 thermostable lipase [Bacillussp. L2] 721 721 98% 0.0 93% gi|377656427|3U
thermoleovorans] 720 720 98% 0.0 92%
gi|60729700|JC8 061
triacylglycerol lipase (EC 3.1.1.3)
-Geobacillussp. (Strain T1) 720 720 98% 0.0 92%
gi|159795726|2Z 5G_A
Chain A, Crystal Structure Of T1
Lipase F16l Mutant 718 718 98% 0.0 93% gi|59896056|AAX
tolerant lipase [Bacillus sp. 42] 717 717 98% 0.0 92% gi|328963134|AE
82869.1 lipase [Geobacillus sp. SF1] 714 714 98% 0.0 91%
gi|24987388|1JI3
S93141.1 lipase, partial [Geobacillus sp. RD-2] 712 712 98% 0.0 91% gi|20501953|AA
M21775.1 lipase [Bacillus sp. Tosh] 712 712 98% 0.0 91% gi|113431924|CA
thermoleovorans] 711 711 98% 0.0 91%
gi|23200288|1KU 0_A
Chain A, Structure Of The Bacillus
