Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Research and Development PT. Wilmar Benih Indonesia, Bekasi, yang dimulai dari bulan September 2010 sampai bulan Desember 2011.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan antara lain Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen), plasmid pGEM-T Easy (Promega), Agarose (Gibco), PCR GoTaq®Green Master Mix (Promega), enzim T4 DNA ligase (New England Biolabs), marker molekuler 100 bp DNA ladder (Vivantis), Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega), QIAquick PCR Purification kit (Qiagen).
Alat utama yang digunakan ialah sentrifuge (Sorval Biofuge Primo R), mesin PCR (BIO RAD Thermal Cycler C1000), sequencer (AB Applied Biosystems Hitachi 3130 Genetic Analyzer), perangkat elektroforesis (BIO RAD), shaker waterbath (Yih Der).
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase. Isolasi dilakukan dengan menginokulasikan sebanyak satu lup air dan tanah yang diambil dari mata air panas ke dalam media Basal Salt Solution (BSM) (0,8 g/l K2HPO4; 0,6 g/l KH2PO4; 1 g/l (NH4)2SO4; 0,2 g/l MgSO4 ·7H2O; 0,05 g/l CaCl2 ·2H2O; 3 g/l NaCl dan 0,001 g FeCl3) yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 1% minyak zaitun, kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan penggoyangan 175 rpm selama 48 jam. Setelah inkubasi, kultur disebar pada media Rhodamin B (0,01 g/l (NH4)2SO4; 0,01 g/l K2HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05 g/l MgSO4·7H2O; 0,01 g/l FeSO4·7H2O; 0,05 g/l ekstrak khamir, 0,05 g/l tripton, 0,01% Rhodamin B (Kouker & Jaeger 1987) dan 2% Polyvinil alkohol (PVA)/minyak zaitun (3:1). dan diinkubasikan pada suhu 60°C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh diamati di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 350 nm.
14
Produksi Enzim Ekstrak Kasar. Inokulum untuk produksi enzim dibuat dengan mengambil 1 lup biakan bakteri dan diinokulasikan pada 10 ml media produksi yang mengandung 0,5% ekstrak khamir, 0,5% tripton dan 2% minyak zaitun kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan digoyang 175 rpm selama 12 jam. Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan inokulum ke dalam 50 ml media produksi: 0,01 g/l (NH4)2SO4; 0,01 g/l K2HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05 g/l MgSO4.7H2O; 0,01 g/l FeSO4.7H2O yang diberi 0,5% ekstrak khamir, 0,5% tripton dan 2% minyak zaitun, kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan digoyang 175 rpm selama 48 jam. Kultur hasil inkubasi disentrifugasi pada 4000 rpm (nomor rotor 7591) selama 40 menit. Supernatan yang mengandung enzim ekstrak kasar dipisahkan dan digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim.
Pengukuran Aktivitas Enzim. Aktivitas enzim lipase diukur dengan menggunakan metode Xu et al. (2002) yang telah dimodifikasi; 4 ml campuran 2% Polivinyl alcohol (PVA)/ minyak zaitun (3:1) dicampurkan dengan 2 ml 0,2 M bufer natrium fosfat pH 7, 2,5 ml dH2O dan 0,5 m 0,1 M CaCl2. Supernatan yang mengandung enzim ekstrak kasar ditambahkan sebanyak 1 ml dan diinkubasikan selama 15 menit pada 60°C dengan digoyang pada 175 rpm. Reaksi dihentikan dengan penambahan 10 ml etanol 95%. Campuran reaksi diberi 25 μl phenolphtalein dan dititrasi dengan 0,05 M NaOH. Tiga ulangan dilakukan untuk tiap pengukuran aktivitas enzim. Satu unit aktivitas enzim lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 μmol asam lemak per menit pada kondisi dilakukannya pengukuran aktivitas. Aktivitas enzim relatif adalah persentase aktivitas enzim pada tiap hasil pengukuran, dibandingkan terhadap nilai tertinggi dari hasil pengukuran aktivitas enzim.
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar. Suhu optimum untuk aktivitas enzim ditentukan dengan melakukan pengukuran aktivitas pada suhu yang berbeda, yaitu 50°C, 60°C, 70°C, 80°C dan 90°C pada 0,2 M bufer natrium fosfat pH 7. Penentuan pH optimum untuk aktivitas enzim dilakukan pada suhu optimum dengan melakukan pengukuran aktivitas enzim pada kisaran pH 5 hingga pH 9 dengan menggunakan bufer natrium asetat 0,2 M untuk pH 5 hingga pH 6, bufer natrium fosfat 0,2 M untuk pH 6,5 hingga 7,5 dan bufer Tris-HCl 0,2 M untuk pH 8 hingga pH 9.
15
Identifikasi Bakteri. Identifikasi bakteri dilakukan dengan metode PCR koloni, untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA; 1 koloni tunggal diambil dan dicampurkan ke dalam 25 μl campuran reaksi PCR GoTaq® Green Master Mix (Promega). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah primer universal yang spesifik terhadap domain bakteri (Marchesi et al. 1998) yaitu primer 63f CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan 1387r (5’-GGGCGGAWGTGTACAAGGC-3’). Kondisi PCR adalah pre PCR (94°C, 7 menit), denaturasi (94°C, 30 detik), penempelan (56°C, 30 detik), pemanjangan (72°C, 1 menit dan 30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7 menit). Hasil PCR diimigrasikan pada gel elektroforesis dengan konsentrasi 1,5 % pada 80 volt selama 50 menit. Gel direndam dalam larutan 0,5 mg/l larutan etidium bromida selama 15 menit dan kemudian dalam air selama 10 menit. Gel kemudian divisualisasi di atas UV transiluminator. Untuk sekuensing, hasil PCR dimurnikan dengan QIAquick PCR Purification Kit dan selanjutnya disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen 16S rRNA yang terdapat pada GenBank menggunakan BLASTn (Basic Local Alignment Search Tools for nucleotida).
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase. Isolasi genom total bakteri dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Identifikasi keberadaan gen lipase dilakukan berdasarkan metode Bell
et al. (2002), dengan menggunakan primer OXF1 (5’-CCYGTKGTSYTNG TNCAYGG-3’), OXF2 (5’-CCRATMRTWYTNGTNCAYGG-3’), OXF3 (5’-CC KYTWGTKYTNATHCAYGG-3’), ACR1 (5’-AGGCCNCCCAKNGARTGNS C-3’), ACR2 (5’-AGRCCNCCCAKRCTRTGNSC-3’), ACR3 (5’-AGGCCRCC NTGNGARTGNSC3’), ACR4 (5’AGGCCNCCNTGRCTRTGNSC3’). Kondi -si PCR yang digunakan ialah: segmen 1 (94ºC, 1 detik), segmen 2 (94ºC, 1 menit), segmen 3 (37ºC, 1 detik), segmen 4 (37ºC, 30 detik), segmen 5 (72ºC, 2 menit dan 20 detik), segmen 6 (72ºC, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari: segmen 1 (95ºC, 1 menit), segmen 2 (50ºC, 1 menit) dan segmen 3 (72ºC, 1 menit).
Isolasi Gen Lipase. Isolasi genom total bakteri dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Gen lipase diisolasi dengan menggunakan pasangan primer yang dikonstruksi oleh Jiang et al
16
(2010), yaitu pasangan primer degenerate (5’-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG-3’ dan 5’-TTAAGGSHSSAARCTYGCCA-(5’-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG-3’), primer F1 (5’-GGAATTCCATA TGATGAAATGCTGCCGGGTGATG-3’), primer F2 (5’-GGAATTCCATATGG CAGCTTCACGCGCCAAT-3’) dan primer R1 (5’-CGCGGATCCTTAAGGG TCCAAGCTCGCCAAC-3’). Kondisi PCR untuk amplifikasi dengan menggunakan primer degenerate ialah: segmen 1 (94°C, 1 detik), segmen 2 (94°C, 1 menit), segmen 3 (37°C, 1 detik), segmen 4 (37°C, 30 detik), segmen 5 (72°C, 2 menit dan 20 detik), segmen 6 (72°C, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari segmen 1 (95°C, 1 menit), segmen 2 (50°C, 1 menit) dan segmen 3 (72°C, 1 menit). Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer degenerate digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1. Kondisi PCR untuk amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 ialah pre PCR (94°C, 7 menit), denaturasi (94°C, 30 detik), penempelan (60°C, 30 detik), pemanjangan (72°C, 1 menit dan 30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7 menit). Hasil PCR kemudian diimigrasikan pada gel elektroforesis, diberi perlakuan dengan etidium bromida dan kemudian divisualisasi pada UV transiluminator. Hasil PCR juga disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada GenBank.
Kloning Gen Lipase. Gen lipase hasil pemurnian diligasikan ke plasmid pGEM-T Easy (Promega) dengan menggunakan enzim T4 DNA ligase (New England Biolab), pada suhu 4°C selama 12 jam, kemudian ditransformasikan ke
E. coli TOP 10 dengan menggunakan metode Sambrook et al. (2001). Seleksi untuk transforman menggunakan metode seleksi biru/ putih pada media Luria agar yang diberi antibiotik Ampisilin (100 μg /ml), 0,1 mM IPTG, 80 μg/ml X-Gal dan diinkubasikan selama 12 jam pada suhu 37°C. Transforman yang membawa plasmid rekombinan yang tersisipi oleh gen lipase akan membentuk koloni berwarna putih. Transforman kemudian diverifikasi dengan PCR koloni, menggunakan primer M13f (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’) dan M13r (5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’) (Moffett et al. 2000), Hasil PCR kemudian dimigrasikan pada gel elektroforesis, diberi perlakuan dengan etidium bromida dan divisualisasi pada UV transiluminator. Hasil PCR juga
17
disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada GenBank menggunakan BLASTp (Basic Local Alignment Search Tools for protein). Aktivitas enzim lipase yang dihasilkan oleh E. coliTOP 10 transforman diukur pada suhu 80°C dan pH 8,5.
Analisis Filogenetik. Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Analisis filogenetik untuk 16S rRNA menggunakan metode Neighbour Joining, jarak diperkirakan dengan menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates. Analisis filogenetik sekuen asam amino hasil deduksi gen lipase menggunakan metode Neighbour Joining, jarak diperkirakan dengan metode Poisson dengan 100 bootstrap replicates.
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase
Sampel berupa air dan tanah diambil dari mata air panas di pulau Seram, Maluku (Gambar 4), yang memiliki suhu 89 °C dan pH 6,3. Suhu pertumbuhan mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu lebih dari 80°C berada pada kisaran pertumbuhan mikroorganisme yang bersifat hipertermofilik (Stetter 1995).
Gambar 4 Peta pulau Seram yang terletak di Provinsi Maluku. Tanah yang terdapat pada lokasi mata air tersebut berwarna hitam, tercium bau belerang dan terdapat daun-daun kering maupun ranting pohon yang gugur dari pepohonan yang tumbuh di sekitar aliran air dari mata air panas tersebut (Gambar 5). Lokasi mata air panas terdapat di daerah dataran rendah dan bukan pada daerah gunung berapi. Menurut Kristjansson dan Hreggvidsson (1995) sumber mata air panas yang terdapat di luar zona aktif vulkanik biasanya memiliki pH yang berkisar pada netral hingga alkalin, air dipanaskan oleh aliran lava yang
20
telah padam atau oleh ruang magma yang telah padam. Suhu air pada kedalaman 500 hingga 3000 meter seringkali di bawah 150°C, air tanah yang dipanaskan kemudian akan kembali ke permukaan dengan membawa mineral terlarut seperti silika dan gas terlarut seperti karbondioksida, dan gas H2S dalam jumlah yang kecil sehingga oksidasi pada permukaan tidak terlalu mempengaruhi pH.
Gambar 5 Tempat pengambilan sampel dari sumber mata air panas.
Bakteri termofilik penghasil lipase diisolasi dengan menginokulasikan air dan tanah yang diambil dari sumber mata air panas ke media Basal Salt Solution (BSM), yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 0,1% minyak zaitun sebagai sumber karbon satu-satunya untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase. Pencawanan sampel secara langsung pada media seleksi yang kaya dan mengandung sumber karbon dalam jumlah banyak akan menyebabkan tumbuhnya mikroorganisme termofilik nonlipolitik dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang relatif cepat. Bakteri penghasil lipase akan membentuk koloni berwarna merah jika ditumbuhkan pada media yang mengandung rhodamin B (Gambar 6).
21
Gambar 6 Koloni isolat T I.2 yang ditumbuhkan pada media yang mengandung rhodamin B.
Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan pembandingan sekuen gen 16S rRNA isolat T I.2 terhadap basis data gen 16S rRNA pada GenBank. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r yang dikonstruksi oleh Marchesi et al. (1998) dan diharapkan menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran sekitar 1324 bp. Amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berada pada kisaran 1200 bp hingga 1500 bp (Gambar 7), yang menunjukkan bahwa gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dapat teramplifikasi dengan baik. Fragmen gen 16S rRNA hasil amplifikasi kemudian disekuensing dan diperoleh hasil berupa sekuen fragmen DNA berukuran 540 bp yang selanjutnya digunakan untuk analisis filogenetik (Lampiran 2). Sekuen fragmen tersebut dimulai dari basa ke-72 yang terdapat pada ujung ÙÚdari sekuen utuh gen 16S rRNA. Sekuen 500 bp awal dari 16S rRNA diketahui memberikan cukup perbedaan untuk tujuan identifikasi antar galur karena memiliki keragaman yang lebih tinggi untuk tiap kilobasa dari sekuen (Clarridge 2004).
22
1324 bp 1500 bp 1200 bp
Gambar 7 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan
primer 63f dan 1387r (S : fragmen gen 16S rRNA Isolat T I.2, M : Marker 100 bp Vivantis).
Hasil BLASTn untuk pembandingan terhadap sekuen GenBank menunjukkan homologi hingga 99% terhadap Geobacillus stearothermophilus
Tapo3 (Tabel 1). G. stearothermo- philusTapo3 adalah spesies Geobacillusyang diisolasi dari mata air panas di daerah Himalaya, India. Basic Local Alignment Search ÛÜÜÝ (BLAST) adalah alat yang digunakan untuk menemukan sekuen-sekuen yang sesuai dalam suatu basis data sekuen-sekuen terhadap suatu sekuen-sekuen yang ingin dibandingkan dengan cara membandingan daerah lokal yang memiliki kemiripan yang tinggi antara sekuen-sekuen pada basis data dengan sekuen yang dibandingkan tersebut (Altschul et al. 1997). BLASTn membandingkan suatu sekuen nukleotida pada NCBI terhadap suatu basis data sekuen nukleotida. Hirarki taksonomi isolat T I.2 berdasarkan ribosomal database ÞßÜàá âã(Cole et al.
2005) : domain Bacteria phylum äåßæåâçã áè classBacilli order Bacillales familyBacillaceae genusGeobacillus S M
23
Tabel 1 Hasil BLASTn sekuen 16S rRNA isolat T I.2 pada NCBI
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident AM159506.1 Geobacillus stearothermophilusTapo3 965 965 99% 0.0 99%
HE575191.1 Geobacillussp. JC107 959 959 99% 0.0 99%
HE575190.1 Geobacillus sp. JC106 959 959 99% 0.0 99%
JN692247.1 Bacillussp. SP50 959 959 99% 0.0 99%
GU121478.1 Geobacillus sp. D3198 959 959 99% 0.0 99%
EU740981.1 Geobacillussp. TC-S8 959 959 99% 0.0 99%
EU248957.1 Geobacillussp. H6a 959 959 99% 0.0 99%
AM749791.1 Geobacillussp. K8 955 955 99% 0.0 99%
AY491497.1 Geobacillus stearothermophilus 953 953 99% 0.0 99%
EU740983.1 Geobacillussp. G1 948 948 99% 0.0 99%
DQ836047.1 Geobacillus kaustophilus KKUA1 948 948 99% 0.0 99%
DQ642091.1 Geobacillussp. I112 948 948 99% 0.0 99%
AB680834.1 Geobacillussp. NBRC 15315 944 944 99% 0.0 99%
JN366780.1 Bacillaceaebacterium 55AA1-1 942 942 99% 0.0 99%
JQ311985.1 Geobacillus kaustophilusAIMST TP 942 942 99% 0.0 99%
AB680832.1 Geobacillussp. NBRC 15313 942 942 99% 0.0 99%
CP003125.1 Geobacillus thermoleovoransCCB US3
UF5 942 8441 99% 0.0 99%
JN087511.1 Geobacillussp. HET24 942 942 99% 0.0 99%
JN692244.1 Geobacillus sp. SP45 942 942 99% 0.0 99%
JN692242.1 Geobacillussp. SP37 942 942 99% 0.0 99%
JN036603.1 Geobacillus kaustophilusMAz 942 942 99% 0.0 99%
JF320000.1 Geobacillus thermoleovoransLM 942 942 99% 0.0 99% HQ891030.1 Geobacillus sp. XT15 942 942 99% 0.0 99% HM596428.1 Geobacillussp. PZH1 942 942 99% 0.0 99% HM217764.1 Geobacillus thermocatenulatus UiTMGeo3 942 942 99% 0.0 99% GU994001.1 Geobacillussp. 49 942 942 99% 0.0 99%
FN666246.1 Geobacillus lituanicusAE8 942 942 99% 0.0 99%
FN428696.1 Geobacillus thermoleovoransR -35650 942 942 99% 0.0 99% FN428689.1 Geobacillus subterraneusR-35641 942 942 99% 0.0 99% FN428688.1 Geobacillus uzenensisR-35640 942 942 99% 0.0 99% FN428686.1 Geobacillus thermoleovoransR -35638 942 942 99% 0.0 99% FN428684.1 Geobacillus thermoleovoransR -35636 942 942 99% 0.0 99% FN428671.1 Geobacillussp. R-32630 942 942 99% 0.0 99% FN428636.1 Geobacillus uzenensisLMG 24726 942 942 99% 0.0 99% FN428635.1 Geobacillus uzenensisLMG 24535 942 942 99% 0.0 99% FN428634.1 Geobacillus uzenensisLMG 24725 942 942 99% 0.0 99% FJ796073.1 Geobacillus thermoparaffinivoransZLG 942 942 99% 0.0 99% FJ422279.1 Geobacillus sp. GXS1 942 942 99% 0.0 99%
24
Analisis Filogenetik 16S rRNA
Pohon filogenetik yang dikonstruksi menggunakan éêëì íî ïð ñ òïë óë óì
Method menunjukkan bahwa isolat T I.2 mengelompok di antara anggota dari genus Geobacillusdan memiliki kemiripan yang lebih dekat terhadap Geobacillus stearothermophilus(Gambar 8).
Gambar 8 Posisi filogenetik dari isolat T I.2 di antara spesies Geobacillus. Nomor akses pada GenBank untuk galur yang digunakan, ditunjukkan di dalam tanda kurung. Nilai jarak (ôëõðñö÷ parameter
method) dilambangkan oleh garis skala. Nilai Bootstrap ditunjukkan pada titik-titik percabangan.
Spesies G. stearothermophilus termasuk ke dalam genus Geobacillus, yang terdiri atas spesies bakteri yang bersifat obligat termofilik yang sebelumnya dikenal sebagai grup 5 dari genus Bacillus (Nazina et al. 2001, 2004), seperti
-25
sius, G. thermodenitirificans, G. subterraneus, G. caldoxylosilyticus, G. debilis, G. gargensis, G. jurassicus, G. lituanicus, G. pallidus, G. tepidamans, G. toebii, G. vulcani, danG. uzenensis. Kisaran suhu untuk pertumbuhan genus Geobacillus
ialah 37-75°C, dengan suhu optimum pada kisaran 55-65°C, kisaran pH 6,0 hingga 8,5, dan pH optimum pada kisaran pH 6,2-7,5.
Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan metode Neighbour Joiningdan nilai jarak ditentukan dengan Kimura 2 parameter method. Nilai jarak dilambangkan oleh garis skala yang menunjukkan jumlah subtitusi nukleotida untuk tiap posisi sekuen. Nilai jarak sebesar 0,005 pada hasil konstruksi pohon filogenetik menunjukkan rendahnya subtitusi nukleotida pada sekuen 16S rRNA
Geobacillus. Metode bootstrap digunakan untuk menguji keakuratan suatu titik cabang dalam suatu pohon filogenetik. Nilai bootstrap sebesar 94 untuk titik cabang menunjukkan tingkat kepercayaan yang tinggi bahwa sekuen 16S rRNA isolat T I.2 memiliki kemiripan terhadap Geobacillus stearothermophilus.
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar
Suhu dan pH merupakan faktor yang berpengaruh terhadap aktivitas enzim lipase. Laju semua reaksi, termasuk reaksi yang dikatalisis enzim akan meningkat sejalan dengan peningkatan suhu, dan dijelaskan oleh Arrhenius berdasarkan persamaan k üAe-∆G*/RT dengan A adalah konstanta Arrhenius, ∆G* adalah energi bebas standar untuk aktivasi, R adalah konstanta gas dan T adalah suhu absolut. Pada suhu rendah, peningkatan suhu akan menyebabkan peningkatan laju reaksi dan karenanya terjadi peningkatan aktivitas enzim tetapi peningkatan suhu di atas suhu lingkungan alami kerja enzim akan menyebabkan denaturasi enzim (Chaplin & Bucke 1990).
Suhu optimum untuk aktivitas lipase ekstrak kasar ialah 80°C pada pH 7, dan pada suhu 90°C aktivitasnya hanya sebesar 47 % dari aktivitas pada suhu optimum, meskipun demikian tidak terdapat aktivitas yang dapat diukur pada suhu 50°C yang menunjukkan bahwa aktivitas dari lipase isolat T I.2 bersifat obligat termofilik. Pada suhu 60°C dan 70°C, enzim memiliki aktivitas sebesar 57 % dan 68 % dari aktivitas pada suhu optimum (Gambar 9, Lampiran 3).
26
Gambar 9 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar. Aktivitas enzim diukur pada pH 7.
Suhu optimum untuk aktivitas enzim lipase dari isolat T I.2 relatif tinggi dibandingkan lipase dari bakteri termofilik yang berasal dari Geobacillus stearothermophilussepertiG. stearothermophilusL1 (Kim et al. 2000), G. stearo -thermophilusJC (Jiang et al. 2010), danG. stearothermophilusTW1 (Li & Zhang 2005) yang masing-masing memiliki suhu optimum 68°C, 55°C, dan 40°C.
Geobacillus thermoleovorans ID-1 (Cho et al. 2000) dan dua spesies bakteri anaerobik termofilik Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus SOL 1 dan
Caldananaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis (Royter et al. 2009) memiliki suhu optimum 75°C. Thermosyntropha lipolytica adalah bakteri anaerobik termofilik yang memiliki suhu optimum 96°C, dan merupakan suhu optimum tertinggi untuk aktivitas lipase yang telah dilaporkan (Salameh & Wiegel 2007).
Umumnya aktivitas enzim menunjukkan hubungan berupa pola kurva menyerupai lonceng terhadap pH dengan puncak adalah pH optimum. Penurunan aktivitas enzim pada kedua sisi dari pH optimum dapat disebabkan oleh pengaruh pH terhadap kestabilan enzim yang menyebabkan enzim tidak aktif, maupun pengaruh pH terhadap parameter kinetik reaksi enzim seperti kestabilan dalam pembentukan kompleks enzim-substrat. Enzim adalah molekul amfoterik yang
57.82 68.25 100 47.39 0 20 40 60 80 100 120 40 50 60 70 80 90 100 Suhu (°C) A k ti vi ta s re la ti f (% )
27
mengandung gugus asam maupun basa yang bersifat dapat terionisasi. Perubahan pH dapat menyebabkan perubahan keadaan ionisasi dari gugus asam dan basa yang terlibat dalam proses katalisis, pengikatan substrat maupun pada gugus yang terdapat pada substrat (Marangoni 2003).
Gambar 10 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar. Aktivitas enzim diukur dengan menggunakan bufer natrium asetat ( ), bufer natrium fosfat ( ) dan bufer Tris-HCl ( ).
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim lipase menunjukkan pH optimum untuk aktivitas enzim lipase ialah 8,5 pada suhu inkubasi 80°C, dan pada pH 9 aktivitasnya adalah sebesar 74 % dari aktivitas pada suhu optimum. Pada kisaran pH 7 hingga 8, enzim memiliki aktivitas sebesar 50 % hingga 60 % dari aktivitas pada suhu optimum, dan tidak menunjukkan aktivitas pada pH 5 (Gambar 10, Lampiran 4). Hampir semua lipase termofilik diketahui aktif pada kisaran pH netral hingga basa. Kisaran pH tersebut juga berlaku pada spesies dari Geobacillus, seperti G. stearothermophilus L1 (Kim et al. 2000),G. stearother -mophilus JC (Jiang et al. 2010) dan G. thermoleovorans ID-1 (Lee et al. 1999), yang memiliki pH optimum 8, 9 and 7,5. Beberapa bakteri termofilik anaerobik seperti Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricusSOL 1, Caldananaerobacter
37 51.7 37 51.7 52 59.3 100 74 0 20 40 60 80 100 120 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 A k ti v it a s re la ti f (% ) pH
28
subteraneus subsp. tengcongensisdan Thermosyn-tropha lipolytica memiliki pH optimum 8, 7 dan 9,4-9,6.
Isolat T I.2 memiliki aktivitas enzim lipase yang relatif tinggi dibandingkan aktivitas enzim lipase beberapa spesies lain dari genus Geobacillus, yaitu sebesar 3 U/ml pada suhu 80°C dan pH 8,5.G. thermoleovorans ID-1 (Lee
et al.1999) and IHI-91 (Markossian et al. 2000) memiliki aktivitas lipase sebesar 0,52 U/ml and 0,3 U/ml ketika diukur pada kondisi optimal, sedangkan G. stearothermophilus L1 memiliki aktivitas lipase di bawah 0,2 U/ml (Kim et al. 2000).
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase
Prakiraan adanya gen lipase dilakukan dengan mengamplifikasi fragmen gen lipase menggunakan kombinasi primer ýþÿdan ACR yang dikonstruksi oleh Bell et al.(2002).
Gambar 11 Hasil amplifikasi genom isolat termofilik T I.2 dengan menggunakan primer ýþ ÿ-ACR ( Marker 100 bp V A primer ýþÿO -ACR3, Býþÿ -ACR3, Cýþÿ-ACR3).
1000 bp 900 bp 500 bp M A B C 3000 bp 100 bp
29
Amplifikasi dengan menggunakan kombinasi primer dan ACR memberikan hasil berupa terbentuknya pita-pita DNA dengan ukuran 500bp, 900 bp dan 1000 bp pada gel elektroforesis untuk hasil amplifikasi dengan menggunakan kombinasi primer -ACR3, -ACR3 dan -ACR3 (Gambar 11). Primer dan ACR akan mengamplifikasi fragmen DNA yang berada pada daerah oxyanion holehingga situs aktif, yang secara umum memiliki ukuran 180 hingga 320 bp. Hasil sekuensing terhadap fragmen berukuran 500 bp menunjukkan bahwa fragmen tersebut bukan merupakan fragmen gen lipase. Terbentuknya fragmen pada hasil elektroforesis disebabkan primer mengamplifikasi bukan pada situs yang dikehendaki, terutama amplifikasi fragmen dari gen yang menyandikan enzim lain dari keluargaα/β hidrolase, dan fragmen non-open reading frame. Tidak terdeteksinya gen lipase menunjukkan bahwa primer yang dikonstruksi oleh Bell et al. (2002) tidak dapat dipergunakan untuk prakiraan keberadaan gen lipase pada isolat T I.2.
Isolasi Gen Lipase
Gen lipase dari isolat T I.2 diisolasi dengan menggunakan primer yang dikonstruksi oleh Jiang et al. (2010). Jiang et al. (2010) mengisolasi fragmen DNA berukuran 1248 bp yang mengandung open reading frame (ORF) yang menyandikan 416 asam amino, sedangkan Kim et al. (1998) dengan menggunakan primer yang berbeda, mengisolasi open reading frame berukuran 1254 yang menyandikan polipeptida yang terdiri atas 417 asam amino. Primer degenerate digunakan untuk menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi (Gambar 12) untuk kemudian digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan menggunakan primer F1, F2 dan R1. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan primer degenerate yang digunakan sebagai template DNA berukuran antara 1200 hingga 1500 bp. Pasangan primer F1-R1 dirancang untuk amplifikasi gen lipase utuh pada G. stearothermophilus yang berukuran sekitar 1200 bp, sedangkan primer F2-R1 untuk amplifikasi gen lipase tanpa mengikutsertakan sekuen DNA yang menyandikan peptida signal (Jiang et al. 2010).
M S
30
Gambar 12 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dengan menggunakan primer degenerate Marker 100 bp S fragmen gen lipase isolat T I.2).
Gambar 13 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dari isolat T I.2 dengan menggunakan pasangan primer F -R1 dan F -R1 Marker 100 bp S fragmen hasil amplifikasi dengan menggunakan
primer F-R1, Sfragmen hasil amplifikasi dengan menggunakan primer F-R1). M S M S 600 bp M S1 S2 1200 bp 1500 bp 1000 bp 1200 bp 3000 bp 100 bp 100 bp 3000 bp
31
Peptida signal berfungsi mengarahkan protein untuk sekresi baik pada prokariot maupun eukariot dan akan dihilangkan oleh protease yang terikat pada membran sel, yang mengenali pola sekuen asam amino yang terkonservasi dengan baik pada ujung C terminal dari sekuen asam amino yang terdapat setelah peptida signal tersebut (von Heijne 1986; Bilgin et al. 1990). Sekuen peptida signal pada gen lipase dari G. stearothermophilustersusun atas 29 asam amino, dan memiliki situs pemotongan untuk protease yang terletak antara asam amino alanin ke-29 dan asam amino alanin ke-30 (Kim et al.2000; Jiang et al. 2010).
Amplifikasi dengan menggunakan primer F1-R1 dan F2-R1 menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 200 bp, 600 bp, dan 1200 bp (Gambar 13). Hasil amplifikasi primer F1-R1 yang berukuran hanya 200 bp dan 600 bp diduga karena penempelan yang bersifat tidak spesifik oleh primer F1 pada situs bukan target pada sekuen gen lipase, dan terdapat variasi pada sekuen yang menyandikan peptida signal sehingga primer F1 tidak dapat melakukan penempelan pada situs tersebut. Hal ini menyebabkan kombinasi primer F1-R1 tidak dapat digunakan untuk amplifikasi gen lipase dari isolat T I.2. Amplifikasi dengan menggunakan primer F2-R1 digunakan lebih lanjut untuk proses kloning.
Kloning Gen Lipase
Fragmen DNA berukuran 1200 bp dari hasil amplifikasi (Gambar 13) dimurnikan dengan menggunakan QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) dan diligasikan ke plasmid pGEM-T Easy dengan menggunakan enzim T4 ligase (New England Biolabs). Hasil ligasi kemudian ditransformasikan ke E. coliTOP 10. Verifikasi koloni transforman dilakukan dengan PCR koloni E. coliTOP 10 hasil transformasi, menggunakan primer M13f dan Mn13r untuk memastikan bahwa fragmen DNA yang diklon telah terligasi pada situs pengklonan. DNA hasil amplifikasi berukuran sekitar 1400 bp diperoleh dari koloni transforman 1 dan 3, sedangkan fragmen DNA hasil amplifikasi transforman 2 berukuran sekitar 1000 bp. Hasil ini menunjukkan bahwa koloni transforman membawa vektor