UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
ISOLASI DAN ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA
METABOLIT SEKUNDER DARI EKSTRAK ETIL
ASETAT DAUN
Angiopteris palmiformis
(Cav.) C.Chr.
SKRIPSI
SALMA HANIFAH
1110102000057
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
2
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
ISOLASI DAN ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA
METABOLIT SEKUNDER DARI EKSTRAK ETIL
ASETAT DAUN
Angiopteris palmiformis
(Cav.) C.Chr.
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
SALMA HANIFAH
1110102000057
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
vi
Isolasi dan Elusidasi Struktur Senyawa Metabolit Sekunder dari Ekstrak Etil Asetat Daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr.
Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. merupakan tumbuhan paku pohon yang tergolong dalam famili Maratiaceae. Ekstrak etanol daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr memiliki aktifitas sitotoksik. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. serta mengetahui toksisitas ekstrak dan senyawa kimia yang terkandung di dalamnya. dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Senyawa metabolit sekunder diisolasi dengan menggunakan teknik kromatografi. Senyawa hasil isolasi dilakukan uji kemurnian dengan menggunakan alat pengukur melting point, Spektofotometri UV-Vis, dan
High Perfomace Liquid Chromatography (HPLC). Senyawa tersebut
diidentifikasi strukturnya dengan Spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance proton (1H-NMR), Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS), dan Spektroskopi Infrared (IR). Senyawa metabolit sekunder yang diperoleh adalah senyawa dengan nilai M+ pada m/z 410, titik leleh 128-1300C, analisis 1H-NMR menunjukkan bahwa senyawa ini memiliki rantai hidrokarbon alifatis dengan satu CH rangkap. Adapun nilai LC50 dari senyawa tersebut yakni 29,1810 ppm.
ABSTRACT Name :
Major : Title :
Salma Hanifah Farmasi
Isolation and Elucidation Structure of Secondary Metabolites Compound from Ethyl Acetate Extract of Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. Leaves
Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. is a giant fern in family of Maratiaceae. Ethanolic extract of Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. leaves has cytotoxic activity. The aim of this research are to isolate secondary metabolites compound from ethyl acetate extract of Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. leaves and determine its activity by using BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) method. Secondary metabolites compound was isolated by using chromatography method. The isolated compound was tested its purity by using melting point aparatus, Spectrophotometry UV-Vis, and High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC). Structure of isolated compounds was determined by using Spectroscopy Nuclear Magnetic Resonance proton (1H-NMR), Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS), and Spectroscopy Infrared (IR). The secondary metabolites compound that is isolated from ethyl acetate extract has M+ at m/z 410, melting point 128-1300C, analysis of NMR indicated that this compound has aliphatic chain with one CH double bound. BSLT assay indicated that this compound has LC50 value 29,1810 ppm.
viii KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkat dan
rahmat-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini
dilakukan dalam rangka untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah, Jakarta.
Kami menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak,
sejak masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini sangatlah sulit bagi
kami untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, kami mengucapkan terima
kasih kepada:
1. Bapak Prof. DR. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta.
2. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)
Syarif Hidayatullah Jakarta.
3. Ibu Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D, Apt selaku pembimbing I dan Bapak
Supandi, M.Si., Apt selaku pembimbing II yang telah meluangkan waktu,
tenaga dan pikiran untuk membimbing dan mengarahkan sejak penyusunan
proposal skripsi hingga penyusunan skripsi.
4. Bapak dan Ibu staf pengajar, kakak laboran, dan segenap staf akademik di
Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas
Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
5. Bapak Alm. Soebagiyo, Ibu Lilik Hariati, dan Bapak Fatkhul Huda Zaenal
Arifin selaku orang tua dan wali penulis, serta M. Labib Khusamudin selaku
adik penulis yang selalu mendukung dan mendoakan penulis dalam
penyusunan skripsi ini.
6. Teman-teman Andalusia, Farmasi 2010 yang senantiasa saling menyemangati
7. Teman-teman alumni PPMI Assalaam Surakarta 2010 terutama kelas Armada
yang senantiasa saling menyemangati dan mengingatkan akan menjaga
akhlak terpuji.
8. Serta semua pihak yang turut membantu penulis menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.
Oleh karena itu, kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis
harapkan guna tercapainya karya yang lebih baik di masa mendatang. Penulis
berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi penulis, kalangan
akademis, masyarakat, dan perkembangan ilmu pengetahuan.
Ciputat, 7 Juli 2014
xii
2.3.3.Faktor yang Mempengaruhi Mutu Ekstrak...
2.4. Metode Pemisahan ...
2.6.3. High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)... 2.6.4. Spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR)... 2.6.5. Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS)... 2.6.6. Spektroskopi Infrared (IR)... 2.7. Pengujian Toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT)...
BAB 3 METODE PENELITIAN... 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ...
3.2. Alat dan Bahan ...
3.3.5.Isolasi dan Pemurnian Senyawa...
3.3.6. Uji Kemurnian Senyawa………
3.3.7. Pengujian Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)……….... 3.3.8. Penentuan Struktur Molekul Senyawa Murni)...……..
4.5. Isolasi dan Pemurnian Senyawa……….……….
4.6.Uji Kemurnian Senyawa……...………...
4.6.1. Uji Titik Leleh………..
4.6.2. Uji Panjang Gelombang Maksimum dengan
Spektrofotometri UV-Vis………..
4.6.3. Uji Kemurnian dengan High Perfomance Liquid
Chromatography(HPLC)……….
4.7. Hasil Pengujian Toksisitas dengan Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT)………
4.8. Penentuan Struktur Molekul Senyawa………
BAB 5 PENUTUP... 5.1. Kesimpulan………
5.2. Saran………..
DAFTAR PUSTAKA...
30
34
34
34
34
35
35
37
37
37
xiv DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
4.1. Hasil rendemen ektrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol.
4.2. Hasil uji penapisan fitokimia dari ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr.
30
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi Daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr..
Lampiran 2. Foto Pohon Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr... Lampiran 3. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ...
Lampiran 4. Bagan Alur Ekstraksi Daun Angiopteris palmiformis (Cav.) Chr.. Lampiran 5. Bagan Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder
Ekstrak Etil Asetat Daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr.. Lampiran 6. Hasil BSLT Fraksi-Fraksi Kolom Pertama pada Konsentrasi 25
ppm...
Lampiran 7. Perhitungan Nilai LC50 ...
Lampiran 8. Spektrum Spektrofotometri UV-Vis...
Lampiran 9. Spektrum High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)... Lampiran 10. Spektrum Nuclear Magnetic Resonance (NMR)... Lampiran 11. Spektrum Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS)... Lampiran 12. Spektrum Infrared (IR)...
BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang
Indonesia adalah negara megabiodiversity yang kaya akan tanaman obat, dan sangat potensial untuk dikembangkan, namun belum dikelola
secara maksimal. Kekayaan alam tumbuhan di Indonesia meliputi 30.000
jenis tumbuhan dari total 40.000 jenis tumbuhan di dunia, 940 jenis
diantaranya merupakan tumbuhan berkhasiat obat (jumlah ini merupakan
90% dari jumlah tumbuhan obat di Asia). Berdasarkan hasil penelitian,
dari sekian banyak jenis tanaman obat, baru 20-22% yang dibudidayakan.
Sedangkan sekitar 78% diperoleh melalui pengambilan langsung
(eksplorasi) dari hutan. Potensi tanaman obat di Indonesia, termasuk
tanaman obat kehutanan, apabila dikelola dengan baik akan sangat
bermanfaat dari segi ekonomi, sosial budaya maupun lingkungan. Negara
berkembang mempunyai peranan penting dalam penyediaan bahan baku
produk farmasi, dimana 38% untuk medical dan aromatic plants, 24% untuk vegetables saps dan extract, serta 11% untuk vegetables alkaloids (Kementrian Kehutanan RI, 2010)
Senyawa bahan alam menyediakan berbagai obat yang bermanfaat
secara klinis. Dalam menghadapi berbagai tantangan penemuan obat
dalam tanaman, isolasi produk alam masih merupakan komponen esensial
dalam pencarian obat baru. Faktor utama untuk mempertahankan
kompetisi dengan obat modern meliputi kemajuan dalam isolasi, elusidasi
struktur, serta proses penyediaan senyawa dan seleksi target obat dengan
bijaksana untuk skrining produk alam (Soumya et al., 2009).
Tanaman paku (Pteridophyta) merupakan salah satu divisi
tumbuhan yang menjadi kekayaan alam hayati Indonesia. Dari sekitar
10.000 spesies tumbuhan paku di dunia, diperkirakan 1.300 spesies
diantaranya tumbuh di kawasan Indonesia. Berbagai jenis spesies
tumbuhan paku telah dikenal dan dimanfaatkan oleh masyarakat Indonesia
2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pelindung, dan pupuk hijau. Masyarakat pada umumnya menggunakan
tumbuhan ini sebagai obat tradisional (Susiarti, 2009).
Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. merupakan tumbuhan paku pohon yang tergolong dalam famili Maratiaceae. Tanaman ini umumnya
tumbuh ditemukan di ketinggian 1200-1300 m di atas permukaan,
penyebarannya di Indonesia terutama di Sumatra Utara (Daryanti, 2009).
Ekstrak etanol daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr memiliki aktifitas terhadap sel MCF-7 dengan waktu inkubasi selama 24
jam dengan nilai IC50 yang diperoleh sebesar 91,52 µg/mL (Sitorus, 2013).
Sedangkan kandungan kimia yang terkandung dalam ekstrak
metanol daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr adalah triterpenoid, yakni dua triterpenoid fernane baru, 7ahydroxyfern8en11one dan 11b
-hydroxyfern-8-en-7-one, dua triterpenoid filicane baru 3b
-hydroxyfilic-4(23)-ene dan filicenol, serta satu triterpenoid filicane yang telah diketahui
3a-hydroxyfilic-4(23)-ene (Chen et al., 2010). Karena daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr memiliki potensi sebagai obat antikanker maka perlu dilakukan isolasi lebih lanjut terhadap senyawa metabolit sekunder
yang terkandung di dalam ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. Pelarut etil asetat dipilih untuk menarik senyawa-senyawa
yang bersifat semi polar.
1.2. Rumusan Masalah
Rumusan masalah penelitian ini adalah :
1. Apa kandungan senyawa metabolit sekunder ekstrak etil asetat daun
Angiopteris palmiformis. (Cav.) C.Chr ?
2. Bagaimana toksisitas ekstrak dan senyawa kimia yang telah diisolasi
dari ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) ?
1.3. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah
1. Untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder ekstrak etil
2. Untuk mengetahui toksisitas ekstrak dan senyawa kimia yang telah
diisolasi dari ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test).
1.4. Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah diperoleh
struktur senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak etil
asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. Selain itu juga diketahui nilai toksisitas dari ekstrak dan senyawa kimia yang telah
4 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA 2.1.Tinjauan Botani
Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr. merupakan sinonim dari Angiopteris angustifolia C. Presl. Adapun klasifikasinya sebagai berikut
Spesies : Angiopteris palmiformis (The Global Biodiversity Information, 2013) 2.1.1. Deskripsi Tanaman
Merupakan paku yang besar, daun sampai 2-5 meter
menyirip ganda 2-4, anak daun menyerupai daun kedondong
(spondias dulcis), sorus memanjang, sporangium di dalamnya bebas, membuka dengan satu celah (Tjitrosoepomo, 2003).
Suku dari Maratiaceae ini memiliki daun amat besar,
menyirip ganda sampai beberapa kali. Sporangium pada sisi bawah
daun, mempunyai dinding yang tebal, tidak mempunyai cincin,
membuka dengan suatu celah atau liang. Kebanyakan paku ini
berupa paku tanah yang isospor. Protalium berumur panjang,
mempunyai mikoriza endofitik, tumbuh diatas tanah, berwarna
hijau, bentuknya menyerupai talus lumut hati yang terdiri atas
beberapa lapis sel (Tjitrosoepomo, 2003).
2.1.3. Aktifitas Biologi
Daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C.Chr memiliki aktifitas sitotoksik berdasarkan hasil penelitian uji sitotoksisitas
sel MCF-7 dengan waktu inkubasi selama 24 jam dengan nilai IC50
yang diperoleh sebesar 91,52 µg/mL (Sitorus, 2013).
2.1.4. Kandungan Kimia
Kandungan kimia yang terkandung dalam ekstrak metanol
daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. adalah triterpenoid, yakni dua triterpenoid fernane baru, 7a-hydroxyfern-8-en-11-one
dan 11b -hydroxyfern-8-en-7-one, dua triterpenoid filicane baru 3b
-hydroxyfilic-4(23)-ene dan filicenol, serta satu triterpenoid
filicane yang telah diketahui 3a-hydroxyfilic-4(23)-ene (Chen et al, 2010).
2.2. Simplisia
2.2.1. Pengertian Simplisia
Simplisia adalah bahan alam yang digunakan sebagai obat
yang belum mengalami apapun juga, kecuali dinyatakan lain,
berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi
simplisia nabati, simplisia hewani, simplisia pelikan, atau mineral
(Depkes, 1979).
a. Simplisia nabati
Simplisia nabati adalah simplisia berupa tanaman utuh,
bagian tanaman dan eksudat tanaman. Eksudat tanaman adalah isi
yang spontan keluar dari tanaman atau isi sel yang dikeluarkan dari
selnya dengan cara tertentu yang masih belum berupa zat kimia
murni (Depkes, 1979).
b. Simplisia hewani
Simplisia hewani adalah simplisia berupa hewan utuh,
bagian hewan, atau sel yang dihasilkan hewan yang masih belum
berupa zat kimia murni (Depkes, 1979).
c. Simplisia mineral
Simplisia mineral adalah simplisia berasal dari bumi, baik
yang telah diolah atau belum, tidak berupa zat kimia murni
6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Simplisia sebagai produk hasil pertanian atau pengumpulan
tumbuhan liar (wild crop) tentu saja kandungan kimianya tidak dapat dijamin selalu ajeg (konstan) karena disadari adanya variabel
bibit, tempat tumbuh, iklim, kondisi (umur dan cara) panen, serta
proses pasca panen dan preparasi akhir. Usaha untuk mengajegkan
variabel tersebut dapat dianggap sebagai usaha untuk menjaga
keajegan mutu simplisia (Depkes, 2000).
2.2.2. Tahapan Pembuatan Simplisia
Pada umumnya pembuatan simplisia melalui tahapan
seperti berikut (Hargono, Djoko. dkk., 1985) :
a. Pengumpulan bahan baku
Pengumpulan bahan baku atau waktu pemanenan yang
tepat adalah pada saat bagian tanaman tersebut mengandung
senyawa aktif dalam jumlah terbesar.
b. Sortasi basah
Sortasi basah dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran
atau bahan asing lainnya dari bahan simplisia.
c. Pencucian
Pencucian dilakukan untuk menghilangkan tanah dan
pengotor lainnya yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian
dilakukan dengan air bersih.
d. Perajangan
Perajangan simplisia dilakukan untuk mempermudah
proses pengeringan, pengepakan, dan penggilingan.
e. Pengeringan
Tujuan pengeringan adalah untuk mendapatkan simplisia
yang tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu
yang lebih lama.
f. Sortasi kering
Sortasi setelah pengeringan merupakan tahap akhir
benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak
diinginkan.
2.3. Ekstraksi
2.3.1. Pengertian Ekstraksi
Ekstraksi adalah pemisahan bagian jaringan tanaman (dan
hewan) yang aktif secara medis dengan menggunakan pelarut yang
selektif melalui prosedur standar (Tiwari et al., 2011). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat
aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan
pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut
diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan
sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes
RI, 1995).
2.3.2. Metode Ekstraksi
Menurut Departemen Kesehatan RI (2000), metode
ekstraksi dijabarkan sebagai berikut :
a. Cara dingin
1) Maserasi, adalah proses pengekstrakan simplisia dengan
menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau
pengadukan pada temperatur ruangan (kamar).
2) Perkolasi, adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru
sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan.
b. Cara panas
1) Refluks, adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik
didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas
yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
2) Soxhlet, adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu
baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga
terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan
8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3) Digesti, adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu)
pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan,
yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-500C.
4) Infus, adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur
penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air
mendidih, temperatur terukur 96-980C) selama waktu tertentu (15-20 menit).
5) Dekok, adalah infus pada waktu yang lebih lama dan
temperatur sampai titik didih air.
2.3.3. Faktor yang Mempengaruhi Mutu Ekstrak a. Faktor Biologi :
1) Identitas jenis (spesies)
2) Lokasi tumbuhan asal
3) Periode pemanenan hasil tumbuhan
4) Penyimpanan bahan tumbuhan.
5) Umur tanaman dan bagian yang digunakan.
b. Faktor Kimia :
1) Faktor internal seperti jenis, komposisi, kualitatif dan kuantitatif
serta kadar total rerata senyawa aktif dalam bahan.
2) Faktor eksternal seperti metode ekstraksi, perbandingan ukuran
alat ekstraksi, kekerasan dan kekeringan bahan, pelarut yang
digunakan dalam ekstraksi, kandungan logam berat dan
kandungan pestisida.
(Depkes RI, 2000)
2.4. Metode Pemisahan 2.4.1. Kromatografi
a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis merupakan bentuk kromatografi
planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada
kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam
Prinsip KLT yaitu perpindahan analit pada fase diam karena
pengaruh fase gerak. Proses ini biasa disebut elusi. Semakin kecil
ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran
ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal
efisiensi dan resolusinya. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut
pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh
kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending) (Rohman, 2007).
Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan suatu
adsorben yang disalutkan pada suatu lempeng kaca sebagai fase
stasionernya dan pengembangan kromatogram terjadi ketika fase
mobil tertapis melewati adsorben itu. Seperti dikenal baik,
kromatografi lapis tipis mempunyai kelebihan yang nyata
dibandingkan kromatografi kertas karena nyaman dan cepatnya,
ketajaman pemisahan yang lebih besar dan kepekaannya tinggi
(Pudjaatmaka, 1994).
Fase diam KLT merupakan sebuah lapisan dibuat dari salah
satu penyerap yang khusus digunakan untuk KLT yang dihasilkan
oleh berbagai perusahaan. Penyerap yang umum ialah silika gel,
aluminium oksida, kieselgur, selulosa dan turunannya, poliamida,
dan lain-lain. Dapat dipastikan silika gel paling banyak digunakan.
Panjang lapisan 200 mm dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk
analisis totalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelum digunakan,
lapisan disimpan dalam lingkungan yang baik lembab dan bebas dari
uap laboratorium (Stahl, 1985).
Menurut Rohman (2007), fase gerak pada KLT dapat dipilih
dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu
yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah
campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta b. Kromatografi Kolom
Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar
adalah menggunakan kromatografi kolom. Pada kromatografi kolom
fase diam yang digunakan dapat berupa silika gel, selulosa, atau
poliamida. Sedangkan fase geraknya dapat dimulai dari pelarut
nonpolar kemudian ditingkatkan kepolarannya secara bertahap, baik
dengan pelarut tunggal ataupun kombinasi dua pelarut yang berbeda
kepolarannya dengan perbandingan tertentu sesuai tingkat kepolaran
yang dibutuhkan (Stahl, 1969).
Fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi ditampung
dan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi-fraksi yang
memiliki pola kromatogram yang sama digabung kemudian
pelarutnya diuapkan sehingga akan diperoleh beberapa fraksi. Noda pada plat KLT dideteksi dengan lampu ultraviolet 254/365 untuk senyawa-senyawa yang mempunyai gugus kromofor, dengan
penampak noda seperti larutan Iod, FeCl3 dan H2SO4 dalam metanol
10% (Stahl, 1969).
2.5. Rekristalisasi
Rekristalisasi adalah pemurnian suatu zat padat dari
campuran atau pengotornya dengan cara mengkristalkan kembali zat
tersebut setelah dilarutkan dalam pelarut yang cocok. Prinsip
rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan antara zat yang akan
dimurnikan dengan kelarutan zat pencampur atau pencemarnya.
Larutan yang terjadi dipisahkan satu sama lain, kemudian larutan zat
yang diinginkan dikristalkan dengan cara menjenuhkannya (Svehla,
1979).
Untuk merekristalisasi suatu senyawa harus memilih
pelarut yang cocok dengan senyawa tersebut. Setelah senyawa
tersebut dilarutkan ke dalam pelarut yang sesuai, kemudian
dipanaskan sampai semua senyawanya larut sempurna. Apabila pada
temperatur kamar senyawa tersebut telah larut sempurna di dalam
hanya dilakukan apabila senyawa tersebut belum atau tidak larut
sempurna pada keadaan suhu kamar. Salah satu faktor penentu
keberhasilan proses kristalisasi dan rekristalisasi adalah pemilihan
zat pelarut (Svehla, 1979).
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam memilih pelarut
yang sesuai adalah sebagai berikut:
1) Pelarut tidak hanya bereaksi dengan zat yang akan dilarutkan.
2) Pelarut hanya dapat melarutkan zat yang akan dimurnikan dan
tidak melarutkan zat pencemarnya.
3) Titik didih pelarut harus rendah, hal ini akan mempermudah
pengeringan kristal yang terbentuk.
4) Titik didih harus lebih rendah dari titik leleh zat yang akan
dimurnikan agar zat tersebut tidak terurai.
Ukuran kristal yang terbentuk selama pengendapan,
tergantung pada dua faktor penting yaitu laju pembentukan inti
(nukleasi) dan laju pertumbuhan kristal. Jika laju pembentukan inti
tinggi, banyak sekali kristal akan terbentuk, tetapi tak satupun dari
inti akan tumbuh menjadi terlalu besar, jadi terbentuk endapan
yang terdiri dari partikel-partikel kecil. Laju pembentukan inti
tergantung pada derajat lewat jenuh dari larutan. Makin tinggi
derajat lewat jenuh, makin besarlah kemungkinan untuk
membentuk inti baru, jadi makin besarlah laju pembentukan inti.
Laju pertumbuhan kristal merupakan faktor lain yang
mempengaruhi ukuran kristal yang terbentuk selama pengendapan
berlangsung. Jika laju ini tinggi, kristal-kristal yang besar akan
terbentuk yang dipengaruhi oleh derajat lewat jenuh (Svehla,
1979).
2.6. Karakterisasi Senyawa 2.6.1. Penentuan Titik Leleh
Salah satu metode yang cepat dan mudah untuk memastikan
kemurnian dari suatu padatan adalah dengan mengukur titik
12
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta menunjukkan bahwa sampel telah murni, meski terdapat
kemungkinan yang rendah bahwa padatan merupakan campuran
eutektik. Jika sampel hasil rekristalisasi berubah rentang titik
lelehnya dari luas menjadi sempit, maka proses rekristalisasi tersebut
sukses. Teknik penentuan titik leleh dari senyawa organik yang
mudah, menggunakan sampel yang sedikit, dan datanya memuaskan
adalah dengan metode mikro dengan menggunakan pipa kapiler,
teknik ini banyak digunakan di laboratorium organik (Gilbert dan
Martin, 2011).
Ada beberapa pertimbangan dalam menentukan titik leleh.
Pertama, rentang titik leleh yang diamati bergantung pada beberapa
faktor yakni jumlah sampel, laju pemanasan selama penentuan, dan
kemurnian serta sifat kimia dari sampel. Akurasi dari pengukuran
suhu bergantung sepenuhnya pada kualitas dan kalibrasi dari
termometer (Gilbert dan Martin, 2011)
2.6.2. Spektrofotometri UV-Vis
Aplikasi analisis dari absorpsi radiasi dapat berupa analisis
kualitatif maupun kuantitatif. Aplikasi kualitatif dengan
spektrofotometri absorpsi bergantung pada kemampuan molekul
menyerap radiasi pada area tertentu spektrum dimana radiasi
memiliki energi yang dibutuhkan untuk meningkatkan molekul ke
kondisi tereksitasi. Tampilan absopsi terhadap panjang gelombang
disebut spektrum absorpsi dari molekul tersebut dan dijadikan sidik
jari untuk identifikasi (Willard et al., 1988)
Absorpsi terjadi ketika foton bertumbukan dengan molekul dan
meningkatkan kondisi molekul itu ke keadaan tereksitasi. Setiap
molekul memiliki cross-sectional area untuk menangkap foton dan foton harus melalui area ini untuk berinteraksi dengan molekul
tersebut (Willard et al., 1988).
Prinsip spektroskopi absorpsi adalah semakin besar angka
molekul yang mampu menyerap cahaya dari panjang gelombang
semakin efektif suatu molekul menyerap cahaya dari panjang
gelombang yang diberikan, semakin besar perluasan absorpsi cahaya
(Pavia et al., 2001).
Komponen spektrofotometri UV-Vis terdiri dari sumber
cahaya, monokromator, dan detektor. Sumber cahaya yang biasa
digunakan adalah lampu deuterium dan lampu tungsten.
Monokromator merupakan diffraction grating yang berperan untuk menyebarkan sinar beam ke komponen panjang gelombang. Cahaya yang melalui sampel mencapai detektor yang merekam intensitas
cahaya transmisi. Detektor yang sering digunakan untuk instrumen
modern adalah fotoioda (Pavia et al., 2001).
2.6.3. High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)
High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) dapat
digunakan untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Harborne,
1987). HPLC mampu memisahkan makromolekul dan ion, bahan
alam yang tidak stabil, bahan polimer, dan kelompok bahan dengan
berat molekul yang besar. Pemisahan dalam HPLC merupakan hasil
interaksi spesifik antara molekul sampel dengan fase diam dan fase
gerak (Willard et al., 1988).
Komponen HPLC terdiri dari kolom sebagai fase diam, eluen
sebagai fase gerak, pompa, injektor, dan detektor. Kolom untuk
pemisahan pada HPLC dibentuk oleh dinding yang berat, glass-lined metal tubing atau stainless steel tubing yang mampu menahan tekanan (hingga 680 atm) dan kerja kimia dari fase gerak. Interior
tubing harus halus dengan diameter yang sangat seragam. Umumnya panjang kolom bervariasi dari 10 hingga 30 cm. Pompa harus dapat
dioperasikan sedikitnya 100 atm (1500 psi), namun 400 atm (6000
psi) merupakan batas tekanan yang lebih diinginkan. Untuk injektor,
microsampling injector valves adalah yang paling luas digunakan. Sedangkan detektor yang banyak digunakan adalah spektrofotometer
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.6.4. Spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) merupakan metode spektroskopi yang lebih penting dalam kimia organik dibandingkan
spektroskopi inframerah. Banyak inti dapat dipelajari dengan teknik
NMR, namun hidrogen dan karbon yang paling banyak tersedia.
NMR memberikan informasi tentang jumlah atom magnetik yang
jelas. Ketika atom hidrogen (proton) dipelajari, sesorang dapat
menentukan jumlah dari tiap tipe yang jelas dari inti hidrogen.
Informasi yang sama juga dapat ditentukan untuk inti karbon.
Kombinasi data NMR dan spektroskopi inframerah sering digunakan
untuk menentukan struktur molekul yang belum diketahui (Pavia, et al., 2001).
Dalam spektroskopi NMR, karakteristik absorpsi energi
oleh perputaran inti dalam medan magnet yang kuat, ketika diiradiasi
oleh medan yang lebih lemah dan singkat, memungkinkan
identifikasi atom dalam molekul. Absorpsi terjadi ketika inti tersebut
bertransisi dari satu garis sejajar dalam medan ke garis sejajar lain
(Willard et al., 1988).
Prinsip dasar spektroskopi NMR yakni inti dari setiap
isotop tertentu memiliki gerakan berputar di sekeliling sumbunya.
Perputaran partikel berenergi atau sirkulasinya, menimbulkan
kejadian magnetis sepanjang sumbu perputaran. Jika inti diletakkan
di luar medan magnet maka momen magnetisnya dapat sejajar atau
melawan medan magnet (Willard et al., 1988).
Instrumen NMR terdiri dari magnet untuk memisahkan
ketetapan energi perputaran inti, sedikitnya dua rf channels dimana satu untuk medan atau stabilisasi frekuensi dan satu untuk
melengkapi energi iradiasi rf, sampel probe yang mengandung kumparan untuk coupling sampel dengan medan rf, detektor untuk memproses sinyal NMR, generator sapuan untuk menyapu baik
detektor, serta perekam untuk menampilkan spektrum (Willard et al., 1988).
Pada spektroskopi NMR untuk mendeteksi proton, sampel
dilarutkan di pelarut yang protonnya diganti atom deutrium,
misalnya kloroform-d (CDCl3), aseton-d6, dan benzena-d6 (Willard
et al., 1988).
2.6.5. Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS)
GC-MS merupakan sistem pengenalan sampel yang
menggabungkan antara GC dengan MS. Hasilnya, spektrometer
massa berfungsi sebagai detektor, aliran gas dari kromatografi gas
masuk melalui katup ke dalam pipa, dimana gas akan melewati
bocoran molekul. Beberapa aliran gas selanjutnya masuk ke ruang
ionisasi pada spektometer massa. Dengan cara ini memungkinkan
perolehan spektrum setiap komponen pada campuran yang
diinjeksikan ke dalam kromatografi gas tersebut (Pavia et al., 2001). Dengan sistem GC-MS, campuran dapat dianalisa dan
dilakukan pencarian pada library untuk tiap komponen penyusun campuran. Jika komponen merupakan senyawa yang diketahui,
senyawa tersebut dapat diidentifikasi sementara dengan
membandingkan antara senyawa-senyawa yang ditemukan di library komputer (Pavia et al., 2001).
Spektroskopi massa adalah suatu metode untuk mendapatkan
berat molekul dengan cara mencari perbandingan massa terhadap
muatan dari ion yang muatannya diketahui dengan mengukur
jari-jari orbit melingkarnya dalam medan magnetik seragam. Dari data
spektrum MS, bisa diperoleh informasi mengenai massa molekul
relatif dari senyawa sampel tersebut (Pavia et al., 2001). 2.6.6. Spektroskopi Infrared (IR)
Absorpsi molekul pada infrared atau infra merah terjadi ketika molekul tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi. Suatu
molekul hanya menyerap frekuensi (energi) tertentu dari radiasi infra
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta molekul dan untuk menentukan informasi struktural dari suatu
molekul. Absorpsi dari tiap tipe ikatan (N-H, C-H, O-H, C-X, C=O,
C-O, C-C, C=C, dan sebagainya) umumnya ditemukan hanya dalam
porsi yang sedikit dari area vibrasi inframerah. Rentang kecil dari
absorpsi dapat didefinisikan untuk tiap ikatan (Pavia et al., 2001). Instrumen yang menentukan spektrum absorpsi dari suatu
senyawa disebut spektrometer infra merah. Ada dua tipe spetrometer
inframerah yang umum digunakan di laboratorium organik, yakni
instrumen dispersif dan Fourier Transform (FT). Kedua tipe
instrumen tersebut menyediakan spektrum senyawa dalam area
umum 4000 hingga 400 cm-1. Meskipun kedunya menyediakan spektrum yang nyaris identik dari senyawa yang diuji, FT Infrared (FTIR) memberikan spektrum IR yang lebih cepat dari instrumen
dispersif (Pavia et al., 2001).
Untuk menentukan spektrum IR dari suatu senyawa, senyawa
harus ditempatkan di sampel holder atau sel. Sel harus terbuat dari bahan ionik seperti natrium klorida atau kalium bromida. Plat kalium
bromida (KBr) lebih mahal dan memiliki kelebihan dalam
penggunaan di rentang 4000 hingga 400 cm-1. Natrium klorida luas digunakan karena murah, penggunaannya dalam rentang 4000
hingga 650 cm-1 (Pavia et al., 2001).
2.7. Pengujian Toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Bioassay umum yang mampu mendeteksi spektrum luas
dari bioaktifitas yang terdapat pada ekstrak mentah adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Teknik ini mudah, murah, dan menggunakan bahan uji yang sedikit. Tujuan metode ini untuk
menyediakan penapisan awal yang dapat didukung dengan bioassay
yang lebih spesifik dan mahal setelah senyawa aktif telah diisolasi.
BSLT mampu memprediksikan aktifitas sitotoksisitas dan pestisidal
Salah satu metode awal yang sering dipakai untuk
mengamati toksisitas senyawa serta merupakan metode penapisan
untuk aktivitas antikanker senyawa kimia dalam ekstrak tanaman
adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan menggunakan cara Meyer. Metode ini ditujukan terhadap tingkat mortalitas larva
udang Artemia salina L. yang disebabkan oleh ekstrak uji. Hasil yang diperoleh dihitung sebagai nilai LC50 (Letha1 Concentration
50) ekstrak uji, yaitu jumlah dosis atau konsentrasi ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian larva udang sejumlah 50% setelah
masa inkubasi 24 jam. LC50 <100ppm dianggap aktif (Gupta et al.,
1996 dalam Olowa, Lilybeth F dan Olga M. Nufieza, 2013).
Menurut Meyer dan lainnya, senyawa dengan LC50 < 1000 µ g/rnl
dapat dianggap sebagai suatu senyawa aktif (Meyer et al, 1982; Olowa dan Nufieza, 2013). Aktifitas ekstrak dipertimbangkan
signifikan jika LC50<30 µg/rnl (Meyer et al., 1982).
Tahapan yang dilakukan dalam pengujian toksisitas dengan
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) meliputi penyiapan sampel, penetasan larva udang, bioassay, dan penentuan nilai LC50 (Meyer et
18 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3
METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan
Fitokimia, Laboratorium Analisis Obat dan Pangan Halal, serta
Laboratorium Kimia Obat Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada bulan Januari hingga Juni
2014. Pusat Penelitian Biologi di Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI) Cibinong pada Desember 2013 dan Pusat Penelitian
Kimia di LIPI Serpong pada Juni 2014. Serta Pusat Laboratorium
Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dan Badan Tenaga Nuklir
Nasional pada Juni 2014.
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Spektrofotometri UV-Vis Hitachi U-2910, Laminar Air Flow, High
Perfomance Liquid Chromatography Dionex, Gas
Chromatography Mass Spectrometry SHIMADZU, Nuclear
Magnetic Resonance JEOL JNMECA 500, Fourier Transform
Infrared (FTIR) SHIMADZU, alat pengukur melting point, timbangan digital AND, blender Panasonic, vacuum rotary evaporator Eyela, lampu UV-Vis ATTD, kolom kromatografi, statif, gelas ukur Pyrex, gelas beker Schott Duran, labu erlenmeyer
Schott Duran, corong Schott Duran, chamber, mikropipet Biorad, batang pengaduk, botol vial, tabung reaksi, pipet tetes, spatula, vial,
pipa kapiler.
3.2.2. Bahan
Ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. yang daunnya diperoleh dari Kebun Raya Bogor yang telah
dideterminasi di Lembaga Ilmu Pengerahuan Indonesia (LIPI)
alfakimia, silika gel, lempeng KLT, aquadest, reagen untuk
penapisan fitokimia (Dragendorf, Meyer, Bouchardat, HCl 2N,
etanol 96%, H2SO4, FeCl3, etil asetat, amonia, aluminium 1%, dan
kloroform), pereaksi godyns, H2SO4 1%, DMSO, larva Artemia
salina, air laut, kloroform pro-analisis, metanol HPLC grade, asetonitril HPLC grade, CDCl3.
3.3. Prosedur Keja
3.3.1. Pemeriksaan Sampel Tumbuhan
Sampel daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor dideterminasi di Pusat Penelitian
Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong,
Bogor.
3.3.2. Penyiapan Simplisia
Sampel daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. 3,5 kg disortasi basah dan dan dilakukan pencucian dengan menggunakan
air mengalir hingga bersih. Kemudian sampel dikeringkan dengan
diangin-anginkan dalam ruangan terhindar dari sinar matahari
langsung. Pengeringan dilakukan selama satu minggu hingga
sampel benar-benar kering. Sampel yang telah kering disortasi
kering, kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender. Serbuk
simplisia yang diperoleh kemudian ditimbang dan disimpan dalam
wadah yang tertutup rapat terlindung dari sinar matahari langsung.
3.3.3. Pembuatan Ekstrak
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi
cara dingin dengan teknik maserasi bertingkat. Pelarut yang
digunakan adalah n-heksan, etil asetat, dan metanol. Serbuk
simplisia sebanyak 944 g dimasukkan ke dalam wadah gelap
sehingga terlindung dari sinar matahari. Selanjutnya, pelarut
n-heksan dimasukkan ke dalam wadah yang berisi simplisia tersebut
hingga serbuk terendam + 3 cm di atas permukaan simplisia.
Volume total n-heksan yang digunakan untuk maserasi sebanyak 7
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Maserasi dilakukan selama 1-2 hari dengan beberapa kali
pengocokan. Maserasi dengan pelarut n-heksan dilakukan sebanyak
7 kali hingga pelarut bening.
Ampas yang tersisa dilakukan remaserasi dengan
menggunakan pelarut etil asetat. Pelarut etil asetat dimasukkan ke
dalam wadah yang berisi simplisia tersebut hingga serbuk terendam
+ 3 cm di atas permukaan simplisia. Maserasi dilakukan selama 1-2
hari dengan beberapa kali pengocokan. Hasil maserasi disaring
dengan menggunakan kapas kemudian dengan menggunakan kertas
saring untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Filtrat yang
diperoleh kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ampas yang tersisa dilakukan
maserasi kembali dengan menggunakan pelarut etil asetat. Maserasi
dengan pelarut etil asetat dilakukan sebanyak 14 kali hingga pelarut
bening, volume total etil asetat yang digunakan sebanyak 16 liter.
Selanjutnya ampas yang tersisa dilakukan remaserasi dengan
menggunakan pelarut metanol, volume metanol yang digunakan
sebanyak 10 liter.Prosedur ekstraksi sama dengan prosedur ekstraksi
sebelumnya. Maserasi dengan pelarut metanol dilakukan sebanyak 8
kali hingga pelarut bening.
3.3.4. Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan dengan menguji adanya
golongan senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, saponin, tanin,
fenolik, dan glikosida jantung. Prosedur pengujiannya adalah sebagai
berikut.
a. Identifikasi Alkaloid
Untuk mengidentifikasi alkaloid, ekstrak dilarutkan dengan
etanol 96% kemudian ditambahkan asam klorida encer 2N. Filtrat
yang diperoleh disaring kemudian diidentifikasi menggunakan
pereaksi Mayer LP, Bouchardat LP, Dragendorff LP. Pada
penambahan Mayer LP, hasil positif ditandai dengan terbentuknya
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan berwarna merah bata.
Penambahan Bouchardat LP memberikan hasil positif jika terbentuk
endapan coklat sampai hitam (Depkes RI, 1995).
b. Identifikasi Saponin
Ekstrak ditambahkan 5 mL aquadest panas, didinginkan
kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Hasil positif
ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil selama tidak
kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan pada penambahan 1 tetes
asam klorida 2 N buih tidak hilang (Depkes RI, 1995).
c. Identifikasi Flavonoid
Tiga metode yang digunakan untuk menguji flavonoid
diantaranya :
Pertama, amonia encer (5 mL) ditambahkan ke sebagian
filtrat encer dari ekstrak. Kemudian asam sulfat pekat (1 mL)
ditambahkan. Hilangnya warna kuning menunjukkan adanya
flavonoid.
Kedua, beberapa tetes larutan aluminium 1% ditambahkan ke
sebagian dari filtrat, terbentuknya warna kuning menunjukkan
adanya flavonoid.
Ketiga, sebagian dari ekstrak dipanaskan dengan 10 mL etil
asetat yang telah diuapkan selama 3 menit. Campuran kemudian
disaring dan 4 mL filtrat dikocok dengan penambahan 1 mL larutan
amonia encer, terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya
flavonoid (Ayoola et al., 2008). d. Identifikasi Terpenoid
Sejumlah 0,5 g ekstrak masing-masing ditambahkan dengan
2 mL kloroform. Kemudian dengan hati-hati ditambahkan 3 mL
H2SO4 pekat sampai membentuk lapisan. Terbentuknya warna
merah kecoklatan pada permukaan menunjukkan adanya terpenoid
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta e. Identifikasi Tanin
Sebanyak 0,5 g ekstrak dipanaskan dalam 10 mL air dalam
tabung reaksi dan kemudian disaring. Ditambahkan beberapa tetes
FeCl3 0,1% dan diamati perubahan warna menjadi hijau kecoklatan
atau biru kehitaman (Ayoola et al., 2008). f. Identifikasi Fenolik
Sejumlah ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan besi klorida.
Terbentuknya warna hitam kebiruan menunjukkan adanya fenolik
(Tiwari, et al., 2011).
g. Identifikasi Glikosida Jantung
0,5 g ekstrak dilarutkan ke campuran 5 mL air, 2 mL asam
asetat glasial, satu tetes larutan besi klorida. Sebelumnya dialasi 1
mL asam sulfat konsentrat. Cincin coklat pada interfase
mengindikasikan adanya gula deoksi dari kardenolid. Cincin ungu
dapat muncul di bawah cincin coklat, sementara pada lapisan asam
asetat muncul cincin kehijauan di atas cincin coklat dan
berangsur-angsur menyebar ke seluruh lapisan ini (Ayoola et al., 2008). 3.3.5. Isolasi dan Pemurnian Senyawa
a. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom
Pemisahan dengan kromatografi kolom diawali dengan
pembuatan kolom kromatografi dengan menggunakan silika gel 60
(0,063-0,200) sebagai fase diamnya dan perbandingan komposisi
pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol sebagai fase geraknya.
Pada pembuatan kolom kromatografi pertama, kolom yang
digunakan adalah kolom dengan diameter – cm dan panjang – cm.
Sejumlah kapas dimasukkan ke dalam bagian paling bawah dari
kolom, tidak terlalu padat atau terlalu longgar. Silika gel 140 gram
dibuat menjadi bubur silika dengan didispersikan dalam pelarut
n-heksan. Silika gel yang telah basah atau seperti bubur dimasukkan
dengan hati-hati ke dalam kolom, kemudian diketuk secara
perlahan agar diperoleh susunan yang rata di dalam kolom,
Selanjutnya, ekstrak kental 14 gram digerus dengan silika gel
12 gram sehingga diperoleh ekstrak kering, kemudian ekstrak
tersebut dimasukkan perlahan ke dalam kolom. Setelah kolom siap,
maka eluen dimasukkan perlahan-lahan dimulai dari n-heksan 100%
dan ditingkatkan kepolarannya menjadi n-heksan : etil asetat = 9:1
hingga etil setat 100% kemudian dilanjutkan dengan perbandingan
etil asetat : metanol = 9:1 hingga metanol 100%. Adapun jumlah
pelarut yang digunakan yakni 100 mL untuk tiap perbandingan.
Hasil pemisahan ditampung dalam botol vial, masing-masing
5 mL dan diberi nomor. Kemudian masing-masing fraksi pada vial
diuji dengan KLT untuk mengetahui botol vial yang memiliki bercak
yang sama. Fraksi yang menampakkan bercak yang sama
dikumpulkan dan disatukan dalam 1 vial.
Kemudian pada kromatografi kolom kedua, silika gel yang
digunakan sebanyak 15 gram yang dibuat bubur silika dan dilakukan
penyiapan kolom kedua seperti kolom pertama. Sebanyak 0,6 gram
fraksi D dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi bubur silika
yang telah dimampatkan, kemudian dialiri eluen n-heksan 100%
hingga hasil isolasi yang ditampung dalam vial berwarna bening.
Kemudian dilanjutkan dengan eluen n-heksan:etil asetat=9:1 hingga
hasil isolasi yang ditampung dalam vial berwarna bening. Kemudian
dilanjutkan dengan eluen heksan:etil asetat = 8:2 hingga eluen
n-heksan:etil asetat = 4:6 hingga hasil isolasi yang ditampung dalam
vial berwarna bening. Setelah itu, kolom dibilas dengan
menggunakan etil asetat 100 % sebanyak 120 mL.
Hasil pemisahan ditampung dalam botol vial, masing-masing
5 mL dan diberi nomor. Kemudian masing-masing fraksi pada vial
diuji dengan KLT untuk mengetahui botol vial yang memiliki bercak
yang sama. Fraksi yang menampakkan bercak yang sama
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta b. Pengujian dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Plat silika gel 60 F254 dibuat dengan ukuran lebar 5 cm dan
panjang 5 cm dan diberi garis batas awal dan batas akhir elusi 0,5
cm. Chamber dijenuhkan terlebih dahulu dengan eluen yang akan digunakan, untuk memilih eluen yang optimal dilakukan percobaan
terhadap beberapa komposisi dengan perbandingan bertingkat dari
eluen yang digunakan. Dimulai dengan percobaan n-heksan 100 %,
jika tidak terjadi pemisahan maka perbandingan eluen ditingkatkan
menjadi n-heksan : etil asetat = 4:1, jika masih tidak terjadi
pemisahan maka dinaikkan perbandingannya menjadi 3:2 dan 2:3.
Volume eluen yang digunakan yakni 5 mL.
Ekstrak dan fraksi yang akan diuji dilarutkan dalam pelarut,
kemudian ditotolkan pada garis batas awal elusi lalu dikeringkan.
Setelah totolan mengering, plat KLT ditempatkan dalam sebuah
chamber yang telah dijenuhkan, kemudian chamber ditutup rapat. Setelah eluen mencapai garis akhir elusi, plat KLT dikeluarkan dan
dikeringkan.
Bercak yang dihasilkan diamati di bawah lampu UV pada
panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Untuk menampakkan
bercak yang tidak berwarna dan tidak berfluorosensi dapat diamati
dengan penambahan pereaksi godyns (reagen A : 1% vanilin dalam
etanol 70% dan 3% asam perklorat dalam aquades = 1:1, reagen B :
H2SO4 1%) yang dilanjutkan dengan pemanasan.
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari
lapisan tipis menggunakan harga Rf. Harga Rf (Retardation factor) didefinisikan sebagai berikut (Sastrohamidjojo, 1985) :
Rf =
Nilai Rf yang diperoleh dibandingkan dengan literatur, untuk
mengetahui kemungkinan senyawa hasil pemisahan dengan KLT.
c. Rekristalisasi
Untuk senyawa berbentuk kristal dilakukan pemurnian
campuran pelarut yang cocok. Pelarut yang digunakan dipilih
berdasarkan kemampuan melarutkan zat yang akan dimurnikan.
Adanya perbedaan kelarutan akibat penambahan pelarut lain akan
menyebabkan senyawa utama akan mengkristal lebih dahulu. Kristal
direkristalisasi dengan pelarut n-heksan dan metanol sehingga
pengotornya hilang dan diperoleh kristal yang berwarna putih jernih
berbentuk jarum.
3.3.6. Uji Kemurnian Senyawa a. Uji Titik Leleh
Sampel dibuat dengan memasukkan kristal ke ujung pipa
kapiler yang nanti akan dimasukkan ke alat pengukur melting point. Kemudian dilakukan pengamatan rentang suhu ketika kristal
melebur mulai dari awal melebur hingga melebur sempurna.
b. Uji Panjang Gelombang Maksimum
Larutan induk konsentrasi 100 ppm dibuat dengan
melarutkan kristal 1 mg dalam n-heksan 10 mL kemudian
diencerkan menjadi 50 ppm dengan mengencerkan 5 mL larutan
induk dalam labu ukur dengan n-heksan 10 mL. Alat
Spektrofotometri UV-Vis diatur panjang gelombang deteksinya pada
200 hingga 800 nm. Pengukuran dilakukan pertama terhadap blanko
berupa pelarut n-heksan kemudian dilanjutkan dengan pengukuran
terhadap sampel. Kemudian dilakukan pengamatan terhadap
terbentuknya peak yang menunjukkan panjang gelombang maksimum dari senyawa tersebut.
c. Uji Kemurnian dengan High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)
Sampel dibuat dengan melarutkan 2 mg kristal dalam
kloroform pro-analisis 5 mL untuk konsentrasi 400 ppm. Kolom fase
diam yang digunakan adalah C18 panjang 15 cm, diameter 4,6 mm,
dan ukuran partikel 5 µm. Fase gerak yang digunakan adalah
asetonitril : metanol = 70: 30. Panjang gelombang deteksi diatur
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta deteksi 10 menit. Setelah kondisi base line stabil, larutan uji diinjekkan sebanyak 20 µ L. Kemudian alat dioperasikan untuk
melakukan deteksi, hasil deteksi senyawa yang telah murni
ditunjukkan dengan terbentuknya satu peak dengan waktu retensi
tertentu, kemudian identitas diberikan untuk senyawa tersebut
3.3.7. Pengujian Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) a. Penetasan larva Artemia salina Leach
Pembiakan udang dilakukan dalam kotak yang dibagi
menjadi 2 bagian dengan sekat berlubang, kemudian dimasukkan air
laut yang diambil dari Karangantu, Serang. Salah satu sisi kotak
dibuat gelap dengan ditutup aluminium foil dan sisi yang lain dibuat
terang. Telur udang Artemia salina L. dimasukkan ke dalam kotak berisi air laut tersebut. Kotak diletakkan di laminar air flow di bawah lampu selama 48 jam. Larva berumur 48 jam siap digunakan
untuk uji toksisitas.
b. Pembuatan seri konsentrasi
1) Untuk pengujian BSLT ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr dibuat larutan 10.000, 1.000, 100, dan 10 ppm untuk membuat larutan uji 1.000, 100, 10, dan 1
ppm yang bertujuan untuk mengetahui persentase kematian 90%
dan 10%.
2) Untuk pengujian BSLT fraksi hasil isolasi kromatografi kolom
pertama ekstrak etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. dibuat larutan induk 1000 ppm kemudian diencerkan
menjadi 250 ppm yang digunakan untuk membuat larutan uji 25
ppm.
3) Untuk pengujian kristal dibuat larutan induk 1.000 ppm
kemudian diencerkan menjadi 100, 200, 300, 400, dan 800 ppm
yang digunakan untuk membuat larutan uji 10 ppm, 20 ppm, 30
c. Prosedur pengujian toksisitas dengan metode BSLT
10 larva Artemia salina dimasukkan ke tiap tabung reaksi yang telah dikalibrasi 5 mL. Larutan sampel yang telah dibuat
ditambahkan sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi yang berbeda
pada tiap tabung reaksi, kemudian ditambahkan aquadest hingga
batas kalibrasi 5 mL, percobaan dilakukan secara triplo. Setelah 24
jam dihitung jumlah larva Artemia salina yang mati dan hidup pada tiap tabung reaksi kemudian dilakukan perhitungan LC50 dengan
menggunakan metode probit pada pengujian BSLT ekstrak dan
kristal. Sedangkan untuk pengujian BSLT fraksi hasil kromatografi
kolom pertama dihitung rata-rata persentase kematian larva udang
karena hanya dilakukan uji BSLT dengan satu konsentrasi saja.
3.3.8. Penentuan Struktur Molekul Senyawa Murni a. Spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Sampel dilarutkan di pelarut kloroform deuterium (CDCl3).
Kemudian dimasukan ke dalam tube NMR. Selanjutnya dimasukkan
ke alat NMR dan dilakukan analisis 1H.
b. Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS)
Sedikit sampel dilarutkan dalam pelarut n-heksan pro-analisis
di dalam vial. Kemudian vial dimasukkan ke alat GCMS. Alat GCMS
diatur metodenya untuk analisis dengan menggunakan kolom DB-5MS
dengan panjang 30 m, film 0,25 µm, dan diameter dalam 0,32 mm. Gas
pembawa yang digunakan yakni helium. Kondisi diatur dengan suhu
kolom 700C, suhu injeksi 2100C, mode injeksi split, tekanan 76,1 kPa, split ratio 100, suhu ion source 2100C, suhu interfase 2300C, laju alir 1,19 mL/menit. Setelah itu analisis mulai dilakukan dan hasil yang
diperoleh dibandingkan dengan library. c. Spektoskopi Infrared (IR)
Bubuk KBr dan sedikit kristal dihaluskan di mortar. Setelah
28 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Pemeriksaan Sampel Tumbuhan
Sampel daun yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor dideterminasi
di Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)
Cibinong, Bogor. Determinasi dilakukan untuk mengetahui keaslian
tumbuhan yang akan digunakan dan untuk menghindari kesalahan dalam
pemilihan tumbuhan. Hasil determinasi menunjukkan bahwa daun tersebut
merupakan Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr dari suku Maratiaceae yang memiliki sinonim nama Angiopteris angustifolia C. Presl. (Lampiran 1).
4.2. Penyiapan Simplisia
Daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr sebanyak 3,5 kg disortasi basah untuk memisahkan daun dengan kotoran dan benda asing.
Kemudian dilakukan pencucian dengan air mengalir untuk membersihkan
daun dari pengotor. Selanjutnya dilakukan pengeringan, pengeringan
dilakukan dalam ruangan untuk menjaga kandungan senyawa kimia dalam
daun. Setelah daun kering maka dilakukan sortasi kering untuk
memisahkan benda asing yang masih tersisa pada daun. Selanjutnya
dilakukan penghalusan dengan menggunakan blender. Penghalusan
bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel daun sehingga luas
permukaan meningkat dan mampu meningkatkan kontak simplisia dengan
pelarut sehingga proses ekstraksi dapat berjalan dengan maksimal.
Dari 3,5 kg daun Angiopteris palmiformis (Cav.). C. Chr. segar diperoleh 944 g simplisia kering. Simplisia kemudian disimpan di wadah
tertutup yang terlindung dari sinar matahari langsung.
4.3. Pembuatan Ekstrak
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ekstraksi cara dingin,
yakni dengan metode maserasi. Alasan pemilihan metode maserasi untuk
terhadap senyawa yang tidak tahan panas. Proses ekstraksi ini
menggunakan teknik maserasi bertingkat dengan pelarut yang memiliki
tingkat kepolaran yang berbeda, yakni n-heksan yang merupakan pelarut
nonpolar, kemudian dilanjutkan dengan etil asetat yang merupakan pelarut
semi polar, dan selanjutnya dengan menggunakan pelarut metanol yang
merupakan pelarut polar. Alasan penggunaan teknik maserasi bertingkat
yakni untuk memaksimalkan proses ekstraksi, dimana senyawa akan
terekstraksi berdasarkan sifat kepolarannya. Selain itu teknik ini juga
digunakan untuk memperoleh hasil rendemen yang lebih banyak.
Maserasi dilakukan selama 1-2 hari dengan beberapa kali
pengocokan, volume n-heksan yang digunakan sebanyak 7 liter Hasil
maserasi disaring dengan menggunakan kapas kemudian dengan
menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtrat dengan ampas.
Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ampas yang tersisa dilakukan maserasi kembali dengan menggunakan pelarut n-heksan. Maserasi dengan
pelarut n-heksan dilakukan sebanyak 7 kali hingga pelarut bening.
Ampas yang tersisa dilakukan remaserasi dengan menggunakan
pelarut etil asetat, volume etil asetat yang digunakan sebanyak 16 liter.
Prosedur ekstraksi sama dengan prosedur ekstraksi dengan menggunakan
pelarut n-heksan. Maserasi dengan pelarut etil asetat dilakukan sebanyak
14 kali hingga pelarut bening.
Selanjutnya ampas yang tersisa dilakukan remaserasi dengan
menggunakan pelarut metanol, volume metanol yang digunakan sebanyak
10 liter. Prosedur ekstraksi sama dengan prosedur ekstraksi sebelumnya.
Maserasi dengan pelarut metanol dilakukan sebanyak 8 kali hingga
pelarut bening.
Dari hasil maserasi diperoleh tiga ekstrak kental, yakni ekstrak
n-heksan 9,7329 g, ekstrak etil asetat 66,279 g, dan ekstrak metanol 95,789 g
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.1. Hasil rendemen ektrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak
metanol.
Total Simplisia Ekstrak Bobot Rendemen
944 g
n-heksan 9,7329 g 1,0310 %
Etil asetat 66,2791 g 7,0211 %
Metanol 95,7891 g 10,1471 %
4.4. Penapisan Fitokimia
Uji penapisan fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etil asetat daun
Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. Hasil uji penapisan fitokimia tersebut menunjukkan hasil positif untuk terpenoid, tanin, dan fenolik.
Hasil positif pada terpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna
kecoklatan, sedangkan pada tanin ditunjukkan dengan terbentuknya warna
hijau kecoklatan dan pada fenolik ditunjukkan dengan terbentuknya warna
hitam.
Tabel 4.2. Hasil uji penapisan fitokimia dari ekstrak etil asetat daun
Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr.
No Golongan Kimia Hasil Pengamatan
1 Alkaloid -
4.5. Isolasi dan Pemurnian Senyawa
Kromatografi lapis tipis pada awalnya dilakukan terhadap ekstrak
etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. dengan fase diam plat klt silika gel 60 GF254 serta fase gerak n-heksan dan etil asetat dengan
perbandingan 3:2. Nilai Rf yang diperoleh sebesar 0,25(Lampiran 3).
Setelah dilakukan kromatografi lapis tipis, dilakukan kromatografi
Chr. Kromatografi kolom merupakan metode pemisahan senyawa dalam
jumlah besar. Pada pemisahan senyawa yang terkandung dalam ekstrak etil
asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr., fase diam yang digunakan adalah silika gel sedangkan fase geraknya dimulai dari pelarut
non polar yakni n-heksan, kemudian ditingkatkan kepolarannya secara
bertahap dengan kombinasi pelarut n-heksan dan etil asetat serta etil asetat
dan metanol.
Pada pembuatan kolom, silika gel yang digunakan sebanyak 140
gram dan ekstrak yang digunakan sebanyak 14 gram. Selanjutnya dibuat
bubur silika dengan mendispersikan silika gel dengan n-heksan. Setelah
bubur silika terbentuk, bubur silika dimasukkan perlahan-lahan ke dalam
kolom kromatografi sambil diketuk-diketuk agar diperoleh susunan yang
rata. Kemudian dialiri eluen n-heksan dengan posisi kran terbuka sambil
diketuk-ketuk sehingga susunan silika dalam kolom rata dan mampat.
Selanjutnya ekstrak kental etil asetat daun Angiopteris palmiformis (Cav.) C. Chr. digerus bersama dengan silika gel sebanyak 12 gram
sehingga diperoleh ekstrak kering, kemudian ekstrak tersebut dimasukkan
perlahan ke dalam kolom.
Setelah kolom siap, maka eluen dimasukkan perlahan-lahan
dimulai dari heksan 100% dan ditingkatkan kepolarannya menjadi
n-heksan : etil asetat = 9:1 hingga etil setat 100% kemudian dilanjutkan
dengan perbandingan etil asetat : metanol = 9:1 hingga metanol 100%.
Adapun jumlah pelarut yang digunakan yakni 100 mL untuk tiap
perbandingan.
Hasil pemisahan ditampung dalam vial-vial yang sebelumnya telah
ditimbang dalam keadaan kosong dan diberi nomor. Vial yang telah terisi
kemudian ditutup dengan kertas aluminium foil dan diberi lubang-lubang
kecil. Proses pemisahan dengan kromatografi kolom menghasilkan fraksi
sebanyak 204 fraksi.
Selanjutnya dilakukan pengujian kromatografi lapis tipis terhadap
fraksi-fraksi yang yang dihasilkan dari kromatografi kolom. Fase diam
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta digunakan yaitu campuran pelarut yang dapat memberikan pemisahan
yang baik dimulai dari n-heksan 100 %. Jika tidak terpisah maka
ditingkatkan polaritasnya dengan menggunakan perbandingan
n-heksan:etil asetat. Proses elusi dilakukan di dalam chamber yang diisi eluen yang akan digunakan sebanyak 5 mL, selanjutnya dilakukan
penjenuhan dengan menggunakan kertas saring sambil chamber ditutup. Kondisi jenuh dalam chamber mencegah penguapan pelarut.
Kemudian dilakukan penyiapan sampel dengan menggunakan plat
KLT berukuran 5x5 cm dengan garis batas awal dan akhir masing-masing
0,5 cm. Fraksi kemudian ditotolkan di plat klt menggunakan pipa kapiler.
Adapun jarak antara totolan satu fraksi dengan fraksi lainnya adalah 0,5
cm. Setelah totolan mengering, plat KLT dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen. Setelah eluen mencapai garis akhir elusi, plat KLT
dikeluarkan dan dikeringanginkan. Kemudian dilakukan pengamatan di
bawah lampu UV 254 nm dan 365 nm, jika pola pemisahan tidak nampak
jelas maka diberi pereaksi godyns dan H2SO4 dilanjutkan dengan
pemanasan.
Fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama
digabung kemudian pelarutnya diuapkan sehingga diperoleh 10 fraksi.
Adapun fraksi A merupakan gabungan fraksi 1-30, fraksi B merupakan
gabungan fraksi 31-49, fraksi C merupakan gabungan fraksi 50-58, fraksi
D merupakan gabungan fraksi 59-65, fraksi E merupakan gabungan fraksi
66-73, fraksi F merupakan gabungan fraksi 74-81, fraksi G merupakan
gabungan fraksi 82-94, fraksi H merupakan gabungan fraksi 95-147, fraksi
I merupakan gabungan fraksi 148-166, serta fraksi J merupakan gabungan
fraksi 167-204 (lampiran 5). Selanjutnya 10 fraksi tersebut dilakukan KLT
kembali untuk melihat pola pemisahannya (Lampiran 3).
Dari proses isolasi dengan kromatografi kolom pertama, fraksi A
berupa kristal. Pada fraksi A ini dilakukan rekristalisasi dengan
menggunakan pelarut n-heksan dan metanol sehingga pengotornya hilang
dan diperoleh kristal yang berwarna putih jernih berbentuk jarum. Kristal
