PERUBAHAN PROPORSI JUMLAH Streptococcus mutans TERHADAP TOTAL BAKTERI PLAK GIGI MAHASISWA SETELAH
MENGKONSUMSI CAJUPUTS CANDY
AGUSTA PUTRI BALQIS LINDA SOEHARSO
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Perubahan Proporsi Jumlah Streptococcus mutans terhadap Total Bakteri Plak Gigi Mahasiswa Setelah Mengkonsumsi Cajuputs Candy adalah benar karya saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2014
Agusta Putri Balqis Linda Soeharso
ABSTRAK
AGUSTA PUTRI BALQIS LINDA SOEHARSO. Perubahan Proporsi Jumlah Streptococcus mutans terhadap Total Bakteri Plak Gigi Mahasiswa Setelah Mengkonsumsi Cajuputs Candy. Dibimbing oleh C.HANNY WIJAYA dan BOY M. BACHTIAR.
Pembentukan plak yang merupakan biofilm pemicu proses karies sangat dipengaruhi oleh keberadaan Streptococcus mutans (S. mutans) dan proporsinya terhadap total bakteri pada plak gigi. Salah satu metode menghambat aktivitas
S.mutans adalah dengan cara mengontrol potensi bakteri ini untuk membentuk koloni dan tumbuh sebagai bagian dari massa biofilm pada permukaan gigi (plak gigi). Upaya ini dapat dilakukan dengan memanfaatkan pangan fungsional
Cajuputs Candy yang memiliki komponen bioaktif bersifat antimikroba. Penelitian ini bertujuan menganalisis potensi Cajuputs Candy yang terdiri dari
Cajuputs Candy Sucrose (CCS) dan Cajuputs Candy Non Sucrose (CCNS) terhadap penurunan jumlah S.mutans dan proporsinya terhadap total bakteri pada plak gigi menggunakan teknik Real Time Polymerase Chain Reaction ( qPCR). Perlakuan berupa konsumsi 1 butir Cajuputs Candy Sucrose (CCS) atau Cajuputs Candy Non Sucrose (CCNS) masing-masing satu dan dua kali sehari.
Hasil yang diperoleh menunjukkan CCS dan CCNS berpotensi menurunkan kuantitas S. mutans dan proporsinya terhadap total bakteri pada plak gigi, serta menurunkan jumlah bakteri non-kariogenik lain di dalam plak gigi. Penurunan jumlah S. mutans dan proporsinya terhadap total bakteri oleh CCS lebih rendah dibandingkan dengan efek CCNS. Penggunaan bahan baku non sukrosa pada
Cajuputs Candy dapat meningkatkan efektifitas permen dalam menurunkan kuantitas S. mutans di dalam plak gigi. Konsumsi 1 butir CCNS 2 kali sehari mampu memberikan efek optimum dalam menurunkan kuantitas dan proporsi S. mutans terhadap total bakteri pada plak gigi.
ABSTRACT
AGUSTA PUTRI BALQIS LINDA SOEHARSO. Proportion Changes of the Amount of Streptococcus mutans to the Total Amount of Bacteria in Student’s
Dental Plaque after Consuming Cajuputs Candy. Supervised by C.HANNY WIJAYA and BOY M. BACHTIAR.
The formation of plaque which causes caries process is substantialy influenced by the presence of Streptococcus mutans (S. mutans)and its proportion to the total amount of bacteria in dental plaque. One of methods for caries preventing is by controlling the potential of these bacteria to form colonies and grow as part of the mass of biofilm on the surface of the tooth (dental plaque). This effort can be done by consuming Cajuputs Candy, a functional food in the form of candy which has antibacterial bioactive compounds. This reserch was aimed to analayze the potential of two type of Cajuputs Candy ,i.e. Cajuputs Candy Sucrose (CCS) and Cajuputs Candy Non Sucrose (CCNS) in decreasing the amount of S. mutans and its proportion upon the total amount of bacteria in dental plaque by Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) technique. The treatments studied were one grain of CCS and CCNS consumption respectively once and twice a day.
The results showed that both CCS and CCNS potentially reduced the quantity of S. mutans, its proportion to the total amount of bacteria, and the number of non- cariogenic bacteria in dental plaque. Non sucrose ingredient usage in Cajuputs Candy could increase the effectiveness in reducing the quantity of S. mutans in dental plaque. Consuming a CCNS twice per day has the optimum effect in reducing the quantity of S. mutans and its proportion to the total amount bacteria.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
AGUSTA PUTRI BALQIS LINDA SOEHARSO
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
2014
PERUBAHAN PROPORSI JUMLAH Streptococcus mutans TERHADAP
TOTAL BAKTERI PLAK GIGI MAHASISWA SETELAH
MENGKONSUMSI CAJUPUTS CANDY
PRAKATA
Alhamdulillahirabbil’alamin atas segala nikmat iman, Islam, kesempatan, serta kekuatan yang telah diberikan Allah Subhanahuwata’ala sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul ―Perubahan Proporsi Jumlah
Streptococcus mutans terhadap Total Bakteri Plak Gigi Mahasiswa Setelah Mengkonsumsi Cajuputs Candy‖ berhasil diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Ir. C. Hanny Wijaya dan Prof. drg. Boy M. Bachtiar, MS Ph.D selaku dosen pembimbing yang telah memberi ilmu, saran, dan doa dalam penyelesaian karya ilmiah ini. Terima kasih kepada Ibu Hanny dan Bapak Boy atas kesabaran dan bimbingan etika, moral, serta pengetahuan yang diberikan.
2. Prof. Dr. Ir. H. Rizal Sjarief Sjaiful N. DESS sebagai dosen penguji yang telah memberikan banyak masukan dalam penyelesaian penulisan skripsi ini. 3. Bapak Zairin Soeharso, Ibu Herlinda, dan Vikri Ramadhani Soeharso sebagai orang tua dan saudara yang selalu mendukung, membimbing, menasihati, dan mendoakan hingga saat ini.
4. Mbak Dessy Sulistya Ashari dan Mbak Maysyaroh yang selalu membantu dan mendampingi selama penelitian dilakukan.
5. Bachtiar, Norman, Tasya, Dini, Nyitnyit, Hamdani, dan Thaher yang telah bersedia membantu kelancaran penelitian ini.
6. Retno Wulandari, Arya Suryadilaga, Triatmaja Pramudhita Wisnu Kusuma, dan Mbak Prastitilaras Nugraheni atas semangat, persahabatan, kesabaran, dan bantuannya selama proses penelitian.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR ix
DAFTAR LAMPIRAN ix
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan 3
METODOLOGI 3
Subjek Penelitian 3
Alat 3
Bahan 4
Metode Penelitian 4
Pengambilan Sampel Plak Gigi 5
Ekstraksi DNA 6
Standardisasi Konsentrasi DNA 6
Kuantifikasi S. mutans dan Total Bakteri dengan qPCR 7
Perhitungan Jumlah dan Proporsi Bakteri 7
Analisis Statistik 9
HASIL DAN PEMBAHASAN 10
SIMPULAN DAN SARAN 17
Simpulan 17
Saran 18
DAFTAR PUSTAKA 18
LAMPIRAN 21
DAFTAR TABEL
1 Komponen volatil pada Cajuputs Candy 2
2 Primers S. mutans dan 16sRNA universal total bakteri 4
3 Pengukuran konsentrasi DNA dan perhitungan kebutuhan standardisasi 10 4 Pengaruh konsumsi CCS dan CCNS terhadap jumlah bakteri plak gigi 16
DAFTAR GAMBAR
1 Ilustrasi perlakuan dan sampling plak gigi 5
2 Letak gigi dan letak sumber plak gigi yang digunakan sebagai sampel 6
3 Ilustrasi tahapan kuantifikasi dengan qPCR 8
4 Kurva standar S. mutans dan total bakteri 9
5 Diagram penurunan proporsi S. mutans dan persentase penurunannya
setelah konsumsi CCS dan CCNS 12
6 Diagram Proporsi S. mutans sebelum dan sesudah mengkonsumsi CCS
dan CCNS 14
DAFTAR LAMPIRAN
1 Surat keterangan lolos komite etik FKG UI 21
2 Lembar informasi dan surat permohonan kesediaan berpartisipasi dalam
penelitian 22
3 Hasil pengukuran konsentrasi DNA sampel dan perhitungan kebutuhan
standardisasi 27
4 Data berat plak 29
5 Hasil Data nilai CTS. mutans dan total bakteri 30 6 Hasil uji sidik ragam dan uji lanjut Dunnett terhadap perubahan proporsi
jumlah S. mutans plak gigi 32
7 Hasil kuantifikasi proporsi S. mutans dan hasil uji sidik ragam
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mulut merupakan alat pencerna makanan pertama yang tidak hanya berperan sebagai pintu masuknya makanan dan minuman. Fungsi mulut besar kaitannya dengan status kesehatan dan kesejahteraan seseorang. Pemeliharaan kebersihan gigi dan mulut merupakan salah satu upaya menjaga dan meningkatkan kesehatan. Salah satu masalah kesehatan rongga mulut dan gigi adalah karies gigi. Karies merupakan kerusakan jaringan keras gigi akibat aktivitas fermentasi karbohidrat oleh mikroorganisme mulut ( Kidd dan Bechal 2004). Menurut Kidd dan Bechal (2004), karies gigi ditandai dengan peristiwa demineralisasi jaringan keras gigi. Proses demineralisasi jaringan keras gigi berkaitan dengan aktivitas metabolisme oleh Streptococcus mutans (S .mutans).
S. mutans adalah bakteri gram positif dengan sifat anaerob fakultatif, dapat menghasilkan asam asidurik (Samaranayake 2002), dan mampu memanfaatkan karbohidrat berupa sukrosa sebagai sumber karbon (Marsh et al. 2009). Bakteri ini memiliki enzim glucocyltransferase dan fructosyltransferase yang bersifat spesifik terhadap substrat sukrosa. Enzim-enzim ini mengubah sukrosa menjadi polisakarida glukan dan fruktan (Dennison dan Radolph, 1981). Glukan merupakan sumber makanan utama bakteri, sedangkan fruktan membantu adhesi dan agregasi baketri dalam pembentukan plak (Roeslan 2002).
Fenomena pembentukan plak gigi akibat aktivitas S. mutans dapat terjadi di sela-sela sempit antar gigi atau antara gigi dan gusi. Prosedur pembersihan secara mekanis terhadap plak secara total dirasa belum efektif untuk mengatasi masalahan kesehatan mulut akibat plak gigi (Bahar 2011). Salah satu metode menghambat aktivitas S. mutans adalah dengan cara mengontrol potensinya untuk membentuk koloni dan tumbuh sebagai bagian dari massa biofilm pada permukaan gigi (plak gigi). Upaya ini dapat dilakukan dengan memanfaatkan bahan alami sebagai asupan makanan, antara lain minyak kayu putih dan minyak
peppermint.
Pemanfaatan minyak kayu putih dan minyak pepeermint sebagai salah satu bahan pembuat permen - Cajuputs Candy sebelumnya telah diteliti oleh Wijaya et al. (2002). Cajuputs candy merupakan permen keras dengan kandungan minyak dasar isomalt dan acesulfame-k tanpa sukrosa.
Penggunaan minyak kayu putih dan minyak peppermint menjadikan
Cajuputs Candy berpotensi menjaga kesehatan rongga mulut (Wijaya et al 2011). Minyak kayu putih dan minyak peppermint telah diteliti sebelumnya mengandung senyawa volatil bersifat antimikroba. Dilaporkan sebelumnya oleh Sari et al.
(2013) bahwa komponen volatil bioaktif dari minyak kayu putih dan peppermint
1). Komponen volatil yang teridentifikasi merupakan senyawa-senyawa yang dapat digolongkan atas monoterpen, ester aromatik, dan seskuiterpen. Golongan monoterper teroksigenasi merupakan golongan yang paling banyak teridentifikasi (Iftari et al. 2013). Menurut Hart et al. (2000), golongan monoterpen teroksigenasi pada ekstrak minyak kayu putih Melaleuca alternifolia lebih bersifat antimikroba dibandingkan monoterpen hidrokarbon.
Tabel 1 Komponen volatil pada Cajuputs Candy
No Nama Senyawa Golongan Pustaka Sifat
Antimikroba
1 -pinene Monoterpen hidrokarbon Maggi et al. 2009
2 D-limonene Monoterpen hidrokarbon Inouye et al. 2001
3 1,8-cineole Monoterpen teroksigenasi Inouye et al. 2001; Maggi
et al. 2009
4 -terpinene Monoterpen hidrokarbon Inouye et al. 2001 5 Linalool Monoterpen teroksigenasi Dwivedi et al. 2012;
Maggi et al. 2009 6 Menthone Monoterpen teroksigenasi Inouye et al. 2001 7 Terpinen-4-ol Monoterpen teroksigenasi Jedlickova et al. 2001;
Maggi et al. 2009 8 α-terpineol Monoterpen teroksigenasi Inouye et al. 2001;
Dwivedi et al. 2012 9 -caryophyllene Seskuiterpen hidrokarbon Heleno et al. 2011 10 Viridiflorol Seskuiterpen teroksigenasi Maggi et al. 2009
Sumber : Iftari et al. (2013)
Senyawa volatil seperti 1,8-sineol, lilalool, terpineol dan terpinen-4-ol
yang diisolasi dari minyak kayu putih Vietnam dilaporkan memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan Streptococcus spp. (Jedlickova 1994). Sementara itu, menurut Inouye et al. (2001) kemampuan antimikroba minyak peppermint
ditentukan oleh keberadaan senyawa volatil mentol dan menton. Hal ini memperkuat hasil penelitian Wijaya et al. (2013) yang menunjukkan efektifitas minyak kayu putih sebagai komponen penyusun formula CCS dan CCNS dalam menekan pembentukan biofilim oleh S. mutans.
Meskipun CCS dan CCNS cukup efektif menghambat pertumbuhan S. mutans, namun karena penelitian sebelumnya dilakukan terhadap S.mutans strain laboratorium, sehingga masih diperlukan informasi yang mengungkapkan efektifitas CCS dan CCNS terhadap pertumbuhan S. mutans secera in vivo. Dengan demikian, perlu dilakukan pengujian potensi Cajuputs Candy terhadap pertumbuhan S. mutans pada plak gigi. Ditambah lagi, beberapa studi terakhir menunjukkan bahwa jenis makanan yang diasup mempengaruhi kesehatan rongga mulut seseorang (Bahar 2011). Oleh karena itu asupan pangan fungsional seperti
Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji potensi Cajuputs Candy, yang terdiri dari Cajuputs Candy Sucrose dan Cajuputs Candy Non Sucrose, dalam menurunkan kuantitas S. mutans pada plak gigi menggunakan teknik qPCR. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi ilmiah mengenai potensi
Cajuputs Candy sebagai asupan pangan fungsional dalam mengontrol pertumbuhan S. mutans, yang merupakan bakteri dominan di dalam plak gigi penyebab karies.
METODOLOGI
Subjek Penelitian
Penelitian dilakukan setelah mendapatkan persetujuan dari komite etik penelitian yang diperoleh dari komite etik riset FKGUI (Nomor : 46/ Ethical Clearance/ FKGUI/ VI/ 2014). Surat persetujuan oleh komite etik terlampir pada Lampiran 1. Subjek penelitian adalah mahasiswa/i Institut Pertanian Bogor yang telah menandatangani informed consent dan telah menyetujui semua peraturan selama penelitian (Lampiran 2). Usia subjek berkisar 20 sampai 22 tahun. Kategori inklusi berupa subjek tidak merokok, tidak menggunakan kawat gigi, dan tidak dalam keadaan hamil. Kriteria subjek penelitian seperti yang disebutkan, dimaksudkan untuk meminimalkan kemungkinan ragam yang tinggi. Pengetahuan subjek mengenai kebersihan mulut dan gigi diasumsikan sama (homogen) apabila subjek penelitian memiliki tingkat pendidikan yang setara mahasiswa/i.
Pada penelitian ini subjek terdiri dari 6 orang. Masing-masing subjek akan diberikan 4 perlakuan. Perilaku subjek terhadap pola makan tidak ditetapkan karena hasil penelitian ini diharapkan mampu menggambarkan potensi Cajuputs Candy Sucrose dan Cajuputs Candy Non Sucrose yang dapat dimanfaatkan tanpa dipengaruhi oleh pola makan.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung Eppendorf 1,5 ml (RNAse and DNAse free, ExtraGene Inc.), cotton bud (didapat secara komersial), kapas (didapat secara komersial di apotik), kain kasa (didapat secara komersial di apotik), semprotan angin, pipet mikro (Eppendorf, Rainin, Biorad), tip mikropipet (RNAse and DNAse free, ExtraGene Inc.), api bunsen, timbangan analitik (Ohauss), centrifuge (SORVALL® Legend RT), freezer -20 ˚C (GEA), vortex (Biorad BR-2000), Spektrofotometer (UV/Vis Ultraspace 4300 Pro), FG
Fast tube (MicroAmp® 48 Tubes, Applied Biosystems), Optical caps tube
(MicroAmp® 8-Cap Strip, Applied Biosystems), kotak pendingin, dan mesin
Bahan
Cajuputs Candy yang digunakan dalam penelitian ini adalah Cajuputs Candy Sucrose (CCS) dan Cajuputs Candy Non Sucrose (CCNS) komersial sebagai bahan yang diuji. Bahan yang digunakan pada tahap pengambilan sampel plak gigi adalah Phosphate Buffer Salin (PBS, pH 7,2) steril (didapat secara komersial dari stockroom IPB). Bahan yang digunakan dalam tahap kuantifikasi adalah akuabides steril (didapat secara komersial di toko kimia), alkohol 70% (didapat secara komersial di toko kimia), es batu, 16sRNA universal primers
(forwardprimer dan reverse primer, dibeli di PT. Genetika Science Indonesia), S. mtans primers (forward primers dan reverse primer dibeli di PT. Genetika Science Indonesia), not- DEPC water (Applied Biosystems), dan SYBR® Select Master Mix (Applied Biosystems). Urutan basa primers S. mutans dan 16sRNA bakteri disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 PrimerS. mutans dan 16sRNA universal total bakteri
Primer Sekuens Primer (5'-3')
S. mutans fwd GGTTTAACGTCAAAATTAGCTGTATTAGC
S. mutans rvs CTCAACCAACCGCCACTGTT
16s RNA fwd TTAAACTCAAAGGGATTGACGG
16s RNA rvs CTCACGACACGAGCTGACGAC
Sumber : Shemesh et al. (2007)
Metode Penelitian
Pada penelitian ini dilakukan analisis potensi Cajuputs Candy Sucrose
(CCS) dan Cajuputs Candy Non Sucrose (CCNS) terhadap kuantitas S. mutans
pada plak gigi menggunakan teknik Real Time-PCR atau disebut juga qPCR.
Teknik ini merupakan teknik kuantifikasi biomolekuler yang bekerja berdasarkan prinsip amplifikasi DNA (Yuwono 2006). Pemilihan teknik ini didasari oleh keuntungan utama dari penggunaan teknik ini dibandingkan dengan metode kultur konvensional, yaitu sensitifitas yang tinggi, lebih spesifik, dan cepat (Yano 2002).
Penelitian ini diawali dengan sampling (pengumpulan) plak gigi sebelum diberi perlakuan (mengkonsumsi 1 butir CCS atau CCSN), selanjutnya kepada subjek diberikan CCS dan CCNS yang dikonsumsi dengan cara dikulum hingga permen habis (tidak dikunyah). Pengambilam sampel plak gigi dilakukan kembali setelah mengkonsumsi CCS atau CCNS. Sampling awal dilakukan di kediaman setiap subjek, sedangkan sampling akhir dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan Institut Pertanian Bogor.
Perlakuan (P) yang dilakukan terhadap subjek penelitian berupa : K : Tanpa pemberian bahan uji (CCS atau CCNS).
P1 : Konsumsi 1 butir CCS 2 kali dalam sehari (1 jam dan 6 jam setelah menyikat gigi pada pagi hari).
P3 : Konsumsi 1 butir CCNS 2 kali dalam sehari (1 jam dan 6 jam setelah menyikat gigi pada pagi hari).
P4 : Konsumsi 1 butir CCNS 1 kali dalam sehari (6 jam setelah menyikat gigi menyikat gigi. Perlakuan dan pengambilan sampel plak gigi diilustrasikan melalui Gambar 1.
(a)
(b)
Gambar 1 Ilustrasi perlakuan dan pengambilan sampel plak gigi. (a) Kelompok perlakuan mengkonsumsi CCS atau CCNS 2 kali sehari. (b) Kelompok perlakuan mengkonsumsi CCS atau CCNS 1 kali sehari.
Pengambilan Sampel Plak Gigi (Pearson dan Hutton 2002)
Pengambilan sampel plak gigi dilakukan dengan metode swab pada permukaan bukal keempat gigi molar pertama rahang atas dan bawah (M1). Bila pada M1 telah dilakukan pengambilan plak gigi maka plak gigi dikumpulkan dari permukaan bukal gigi premolar 2 (P2). Menurut Reloy et al. (2009), gigi molar pertama dan premolar yang berfungsi untuk mengunyah makanan, memiliki bentuk permukaan yang memudahkan retensi sisa makanan sehingga sangat ideal untuk pertumbuhan bakteri penyebab karies. Kidd dan Bechal (2004) melaporkan gigi molar bersifat sangat rentan terhadap penyakit karies dan dapat meluas hingga ke bagian gigi premolar. Pemilihan letak pengambilan plak gigi pada penelitian ini didasari pada teori tersebut. Letak gigi yang dikoleksi plaknya ditunjukkan pada Gambar 2.
Metode swab dilakukan dengan mengusapkan cotton bud steril pada permukaan bukal gigi. Pengambilan plak gigi dilakukan dengan terlebih dahulu mengeringkan permukaan gigi dari saliva. Pengeringan dilakukan dengan cara
diangin-anginkan menggunakan semprotan angin. Pembendungan terhadap aliran saliva juga dilakukan dengan mengganjalkan kapas pada sela-sela pipi dan gigi. Plak gigi kemudian dikoleksi dan dimasukkan ke tabung Eppendorf yang telah diisi dengan Phosphat Buffer Salin (PBS pH 7,2) steril. Setiap sampel selanjutnya disimpan dalam lemari pendingin (-20oC) sampai digunakan pada tahapan selanjutnya.
Gambar 2 Letak gigi dan sumber plak gigi yang digunakan sebagai sampel (Anonim 2012).
Ekstraksi DNA (Jara et al. 2008)
Ekstraksi DNA adalah tahap awal dalam proses analisis dengan metode
qPCR. Ekstraksi DNA dilakukan dengan tahapan sebagai berikut: sampel plak dalam tabung Eppendorf divorteks lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 ×g selama 1 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang tertinggal ditambahkan 1 ml larutan PBS steril untuk dilakukan tindakan washing pada sampel, kemudian divortex selama 10 detik. Sampel dalam tabung disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 ×g selama 1 menit. Hasil sentrifugasi akan memisahkan kembali supernatan dan pelet di dalam tabung. Supernatan yang terbentuk selanjutnya dibuang dan ke dalam tabung Eppendorf ditambahkan akuabides sebanyak 100 µL. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 100˚C selama 20 menit dalam waterbath, tabung sampel dikeluarkan dan segera dibenamkan ke dalam kotak berisi pecahan es selama 10 menit. Sampel selanjutnya dihomogenisasi dengan vortex selama 10 detik kemudian disentrifugasi kembali selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 ×g. Sampel membentuk bagian pelet dan supernatan, bagian supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf yang baru sebagai sampel yang digunakan. Pada penelitian ini, DNA yang diekstraksi dari S. mutans ATCC 25175 digunakan sebagai kontrol positif pada setiap kali dilakukan amplikasi PCR.
Standardisasi Konsentrasi DNA (Li et al. 2003)
Tahap standardisasi diawali dengan mengukur konsentrasi hasil ekstraksi DNA dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm. Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan sebagai berikut: akuabides dimasukkan sebanyak 500 µl ke dalam kuvet pertama sebagai blanko. Akuabides dimasukkan ke dalam kuvet-kuvet berikutnya sebanyak 495 µl dan DNA hasil ekstraksi dari sampel plak gigi ditambahkan ke dalam kuvet sebanyak 5 µl. Kuvet dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer dan konsentrasinya diukur pada panjang
Gigi Premolar Kedua
gelombang 260 nm ( =260 nm). Konsentrasi DNA pada setiap dihitung dengan rumus:
Faktor pengali 50 pada rumus di atas adalah penyetara dengan 50 µg/ml untai ganda DNA (Thermo Scientific 2013). Sampel DNA yang sudah diketahui konsentrasinya lalu distandardisasi sehingga semua mempunyai konsentrasi sebesar 100µg/ml dengan rumus:
Keterangan:
V1 : Volume awal sampel
M1 : Konsentrasi DNA sampel yang terukur
V2 : Volume yang dibutuhkan untuk melakukan percobaan M2 : Konsentrasi DNA standar (100 µg/ml)
Kuantifikasi S. mutans dan Total Bakteri dengan qPCR ( Herold et al. 2004)
Kuantifikasi dilakukan dengan membuat campuran pereaksi sebanyak 10µL terlebih dahulu. Campuran pereaksi terdiri dari 5 l SYBR Green, 0,5 l forward primer gen (10mM), 0,5 l reverse primer gen (10mM), 3 µl sampel DNA
(100µg/ml), dan 1 l not-DEPC water. Campuran pereaksi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 1 menit. Primers yang digunakan untuk menganalisis DNA sampel dengan menggunakan qPCR disajikan pada Tabel 1 . Selama proses amplifikasi dengan qPCR berlangsung, dilakukan pengamatan terhadap nilai CT. Secara singkat tahap preparasi hingga kuantifikasi diilustrasikan pada Gambar 3.
Perhitungan Jumlah dan Proporsi Bakteri (Livak dan Schmittgen 2008)
Jumlah S. mutans dan total bakteri didapat berdasarkan korelasi nilai CT dan log cfu/ml pada kurva standar bakteri target. Kurva standar didapat dari kuantifikasi DNA standar S. mutans dan 16sRNA total bakteri untuk menentukan kuantitas S. mutans dan total bakteri dari sampel yang tidak diketahui melalui interpolasi. Hasil korelasi nilai CT dan log cfu/ml masing-masing target dapat dilihat pada Gambar 4.
Perhitungan proporsi S. mutans dilakukan secara relatif terhadap total bakteri menggunakan metode kuantitatif relatif. Perhitungan jumlah relatif DNA total (N) pada setiap perlakuan dinyatakan sebagai persentase S. mutans terhadap jumlah bakteri total disetiap pengkuran. Berikut ini adalah cara perhitungan proporsi jumlah relatif DNA total (N) :
Gambar 3 Ilustrasi tahapan kuantifikasi dengan qPCR
Pengambilan sampel plak gigi.
Ekstraksi DNA
Plak gigi
Sentrifugasi 10.000 ×g selama 1 menit, buang supernatan.
Washing dengan larutan PBS steril 1 mL.
Sentrifugasi 10.000 ×g selama 1 menit, buang supernatan.
Penambahan larutan dd(H2O) 100 µL.
Pemanasan dengan waterbath100 ˚C, 20 menit.
Pendinginan dengan es batu, 10 menit.
Pemindahan supernatan ke dalam tabung baru.
Penyimpanan DNA di suhu beku. Pengukuran dan
standardisasi konsentrasi DNA
bakteri
Deteksi dan kuantifikasi bakteri
dengan qPCR
Hasil
DNA bakteri + Campuran pereaksi qPCR.
Kuantifikasidengan alat qPCR.
500 µl dd(H2O) dimasukkan dalam kuvet (blanko).
495 µl dd(H2O) + 5 µl DNA sampel dimasukkan
dalam kuvet sebagai sampel.
Diukur konsentrasinya pada panjang gelombang 260 nm.
(a)
(b)
Gambar 4 Kurva standar S. mutans (a) dan total bakteri (b)
Sumbu X menunjukkan nilai CT yang didapat dari amplifikasi dan sumbu Y menunjukkan jumlah bakteri (cfu/ml) yang diubah ke dalam bentuk log cfu/ml . Nilai R2 = 0,9703 pada kurva standar S. mutans menunjukkan sebesar 97, 03 % kuantitas S. mutans (log cfu/ml) dapat diperoleh melalui model persamaan tersebut. Nilai R2 = 0,9435 pada kurva standar total bakteri menunjukkan sebesar 94,35 % kuantitas total bakteri (log cfu/ml) dapat diperoleh melalui model persamaan tersebut.
Analisis Statistik
Pada penelitian ini, perubahan proporsi S. mutans terhadap total bakteri dilakukan dengan menggunakan persamaan 2-ΔΔCT (Livak dan Schmittgen 2008). Perbedaan perubahan proporsi tiap perlakuan selanjutnya dibandingkan dan diuji dengan uji sidik ragam dengan membandingkan rata-rata nilai hasil perhitungan jumlah S. mutans dan proporsinya terhadap total bakteri menggunakan Paired-Sample T Test dan uji lanjut Dunnett. Analisis statistik dilakukan pada taraf kepercayaan 95% (α = 0,05) menggunakan program SPSS Inc. 20.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Salah satu metode menghambat aktivitas S. mutans adalah dengan cara mengontrol potensi mikroba tersebut untuk membentuk koloni dan tumbuh sebagai bagian dari massa biofilm pada permukaan gigi (Kidd dan Bechal 2004). Pada penelitian ini, dilakukan pengujian potensi Cajuputs Candy Sucrose (CCS) dan Cajuputs Candy Non Sucrose (CCNS) dalam menghambat jumlah S. mutans
dan proporsi terhadap total bakteri pada plak gigi. Perbedaan perlakuan yang diujikan terletak pada jenis permen dan frekuensi konsumsi permen tersebut. Perbedaan frekuensi konsumsi ini didasari pada teori pembentukan plak.
Metode kuantifikasi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah teknik
qPCR. Teknik ini merupakan teknik kuantifikasi biomolekuler yang bekerja berdasarkan prinsip amplifikasi DNA (Yuwono 2006). Kebutuhan sampel untuk teknik ini berupa untaian DNA yang telah terpisah dari komponen lain penyusun sel (Rudiretna dan Handoyo 2000). Tahapan ekstraksi DNA yang dilakukan bertujuan memperoleh untaian DNA, dilakukan dengan metode thermal shock.
Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan setelah ekstraksi DNA, bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dan kuantitas DNA (Yuwono 2006). Keberadaan dan kuantitas DNA diketahui sebagai hasil pengukuran konsentrasi DNA. Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan dengan teknik spektrofotometri (Yuwono 2006).
Hasil pengukuran konsentrasi DNA ditunjukkan pada Tabel 3 (Data lengkap terlampir pada Lampiran 3). Konsentrasi DNA yang terukur tampak beragam, dapat dikarenakan oleh banyaknya plak yang terambil (dalam gram) tidak sama. Data berat plak yang terambil terlampir pada Lampiran 4. Konsentrasi DNA standar yang dibutuhkan untuk kuantifikasi adalah 100 ng/µl. Konsentrasi sampel DNA yang terukur belum memenuhi standar yang dibutuhkan sehingga diperlukan standardisasi dengan metode pengenceran dengan akuabides steril. Sampel yang telah distandardisasi kemudian dilakukan kuantifikasi menggunakan teknik qPCR.
Tabel 3 (lanjutan) kelompok kontrol. ** = Sesudah mengkonsumsi CCS atau CCNS dan 8 jam setelah menyikat gigi pada kelompok kontrol.
Kuantifikasi terhadap S. mutans dilakukan dengan cara mengamati nilai CT yang merupakan data output dari teknik qPCR. Nilai CT ditentukan sebagai siklus saat perpendaran mulai terdeteksi diatas background dan secara proporsional berbanding terbalik dengan logaritma jumlah molekul DNA awal (Shemesh et al.
2007). Jika terdapat jumlah DNA yang besar maka nilai CTyang terukur berangka kecil, sebaliknya untuk jumlah DNA yang sedikit akan memiliki nilai CT yang besar (Handbook Life Technologies Realtime PCR 2012). Data nilai CT setiap sampel terlampir pada Lampiran 5. Hasil perhitungan proporsi S. mutans
Menurut Livak dan Schmittgen (2008), perubahan berupa penurunan proporsi suatu gen target ditunjukkan dengan nilai kelipatan relatif (N) dibawah 1 (N < 1). Pada Gambar 5 dapat dilihat bahwa proporsi S. mutans mengalami
penurunan setelah mengkonsumsi CCS atau CCNS. Kondisi ini berbeda nyata (α
< 0,05) dengan kelompok kontrol (hasil analisis statistik terlampir pada Lampiran 6). Besarnya penurunan proporsi S. mutans akibat mengkonsumsi CCS atau CCNS dinyatakan sebagai persentase penurunan proporsi yang diperoleh dengan membandingkan nilai proporsi S. mutans setiap kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol.
Konsumsi CCS atau CCNS 1 kali sehari dilakukan pada waktu 1 jam setelah menyikat gigi. Waktu 1 jam sesudah menyikat gigi dipilih karena 0-4 jam pertama bakteri streptococci tunggal sebagai koloni awal (fase adaptasi), membentuk koloni pada pelikel yang terbentuk pada permukaan gigi (Kidd dan Bechal 2004). Konsumsi CCS atau CCNS 2 kali sehari dikalukan pada waktu 1 dan 6 jam setelah menyikat gigi. Waktu 1 jam dipilih karena alasan yang sama dengan alasan pada perlakuan konsumsi CCS atau CCNS 1 kali sehari, sedangkan waktu 6 jam setelah menyikat gigi dipilih karena 2-8 jam pertama streptococci yang menempel menjenuhkan tempat perlekatannya (Sujana 2012). Perbedaan ini dimaksudkan sebagai bentuk peningkatan paparan kandungan bioaktif antimikroba dari CCS atau CCNS pada konsumsi 2 kali sehari.
Gambar 5. Proporsi S. mutans dan persentase penurunannya setelah konsumsi CCS dan CCNS. K = tanpa perlakuan pemberian CCS dan CCNS. Proporsi pada gambar merupakan hasil perhitungan menggunakan persamaan 2 –(∆∆CT). Persentase penurunan diperoleh dengan
membandingkan proporsi S. mutans setelah mengkonsumsi CCS atau CCNS dengan proporsi S. mutans pada kelompok kontrol.
Persentase penurunan proporsi S. mutans setelah mengkonsumsi CCS atau CCNS tampak memiliki nilai yang beragam. Hasil perhitungan menunjukkan persentase penurunan proporsi S. mutans terbesar merupakan perlakuan setelah
mengkonsumsi CCNS 2 kali sehari (89,32 %), kemudian akibat mengkonsumsi CCS 1 kali sehari (80, 48 %), selanjutnya akibat mengkonsumsi CCNS 1 kali sehari (62,56 %), dan persentase penurunan terendah akibat mengkonsumsi CCS 2 kali sehari (60,14 %). Keberagaman nilai ini diduga sebagai dampak perbedaan perlakuan yang diberikan kepada subjek. Hasil perhitungan ini mengindikasikan bahwa CCS atau CCNS berpotensi menurunkan proporsi S. mutans.
Penurunan kuantitas S. mutans diduga merupakan akibat adanya komponen bioaktif yang bersifat antimikroba pada CCS dan CCNS yang telah dilaporkan oleh Sari et al. (2013). Dilaporkan sebelumnya oleh Reichling et al. (2009), komponen 1,8-cineole dari minyak kayu putih, menthol, dan menthone dari minyak peppermint yang juga terkandung pada CCS maupun CCNS memiliki sifat hidrofobik yang mampu meningkatkan permeabilitas membran sitoplasma, menghambat respirasi sel, mengganggu pembentukan protein pengikat membran dan mengganggu proses transportasi ion yang akhirnya dapat menyebabkan kematian sel.
Menurut Oyedemi et al. (2009), mekanisme bakterisidal komponen α -terpineol dan -terpinen terhadap bakteri gram positif adalah dengan menyebabkan kebocoran membran luar bakteri yang akhirnya menyebabkan kematian. Diketahui bahwa S. mutans adalah bakteri gram positif (Samaranayake 2002), diduga mekanisme tersebut yang menyebabkan penurunan kuantitas S. mutans setelah mendapat paparan komponen bioaktif antimikroba dari CCS dan CCNS.
Menurut Jedlickova (1994), komponen α-terpineol dan terpinen-4-ol dari kandungan minyak kayu putih adalah senyawa yang efektif menurunkan pertumbuhan Streptococcus spp. Galvao et al. (2012) melaporkan bahwa ekstrak
peppermint memiliki sifat antimikroba terhadap S. mutans. Kandungan 1,8-cineole dan -caryophyllene dari ekstrak Curcuma longa L. dari India juga dilaporkan mampu menurunkan pertumbuhan dan produksi asam oleh S. mutans, kemampuan melekat serta pembentukan biofilm oleh bakteri tersebut ( Lee et al. 2011).
Penjelasan yang sama juga dilaporkan oleh Heleno et al. (2010) bahwa -caryophyllene dari bagian bunga Tithonia diversifolia dapat menghambat pertumbuhan S. mutans. Komponen terpen yang bersifat lipofilik dari minyak esensial Melaleuca alternifolia, tanaman khas Australia, bekerja terhadap lapisan
phospholipid membran sel dan dapat mengganggu struktur dan fungsi membran sel, termasuk di dalamnya adalah komponen terpinen-4-ol (Allaker and Douglas 2009). Aktivitas komponen-komponen tersebut yang juga terdapat dalam CCS dan CCNS diduga dapat merusak komponen dinding sel S. mutans sehingga diduga berakibat pada penurunan kuantitas bakteri tersebut, seperti yang terlihat pada hasil penelitian ini.
Perubahan proporsi S. mutans terbesar adalah akibat mengkonsumsi CCNS 2 kali sehari sedangkan perubahan proporsi terendah adalah akibat mengkonsumsi CCS 2 kali sehari. Hasil uji sidik ragam dan Paired Sample T-Test menunjukkan
adanya perbedaan yang signifikan (α < 0.05) antara proporsi S. mutans sebelum dan sesudah mengkonsumsi CCNS 2 kali sehari.
Gambar 6 Proporsi S. mutans sebelum dan sesudah mengkonsumsi CCS dan CCNS. Proporsi S. mutans sebelum dan sesudah mengkonsumsi CCS atau CCNS, serta proporsi S. mutans 1 jam dan 8 jam setelah menykat gigi pada kelompok kontrol, masing-masing dihitung dengan persamaan 2 –(∆CT). * = hasil uji sidik ragam dan paired –sample t test
terhadapperubahan proporsi S. mutans akibat konsumsi CCNS 2 kali sehari menunjukkan perbedaan yang signifikan atara proporsi sebelum
dan sesudah mengkonsumsi CCNS (α < 0,05).
Fenomena ini dapat dijelaskan dari variabel pembeda pada perlakuan, yaitu jenis dan frekunsi Cajuputs Candy yang dikonsumsi. CCS mengandung sukrosa sebagai pemanis sedangkan CCNS mengandung isomalt dan acesulfame-k sebagai pemanis. Sukrosa dikenal juga sebagai gula pasir mempunyai potensi kariogenik yang tinggi (Touger dan Loveren 2003). Sukrosa terdiri dari monosakarida glukosa dan fruktosa. Komponen ini dapat dengan cepat dimetabolisme oleh S. mutans menjadi energi dan polisakarida ekstraseluler yang berperan dalam proses pembentukan plak (Dennison and Radolph, 1981).
Mengkonsumsi makanan yang mengandung gula terutama sukrosa, dapat menyebabkan pembentukan glikoprotein yang lengket pada gigi (Bahar 2011). Peran enzim glucosyltransferase (GTF) dan fructosyltransferase (FTF) yang diproduksi S. mutans bersifat spesifik terhadap substrat sukrosa (Dennison dan Radolph, 1981). Enzim-enzim ini mengubah sukrosa menjadi polisakarida glukan (dekstran) dan fruktan (levan). Glukan merupakan sumber makanan utama bakteri, sedangkan fruktan membantu adhesi dan agregasi baketri dalam pembentukan plak (Roeslan 2002). Keberadaan sukrosa sebagai komponen pemanis pada CCS diduga masih mampu dimetabolisme oleh S. mutans. Dugaan ini terlihat dari 1 jam setelah menyikat gigi
8 jam setelah menyikat gigi
porporsi S. mutans yang mengalami penurunan namun dalam persentase yang rendah setelah mengkonsumsi CCS.
Penurunan proporsi S. mutans setelah mengkonsumsi CCS 2 kali sehari lebih rendah dibandingkan dengan konsumsi CCS 1 kali sehari. Dilihat dari perlakuan yang diberikan, perbedaan terletak pada frekuensi mengkonsumsi
Cajuputs Candy dan waktu konsumsi. Konsumsi CCS 1 kali sehari dilakukan pada waktu 1 jam sebelum makan siang, sedangkan CCS 2 kali sehari dilakukan 1 jam dan 6 jam setelah menggosok gigi . Bahar (2011) menyebutkan bahwa faktor frekuensi asupan makanan yang mengandung pemanis sukrosa lebih beresiko meningkatkan pembentukan plak dibandingkan dengan besarnya konsentrasi pemanis yang diasup itu sendiri. Hasil penelitian mengindikasikan adanya pengaruh frekuensi asupan sukrosa dari CCS.
Perbedaan frekuensi mengkonsumsi CCS diduga berdampak pada penurunan proporsi S. mutans yang berbeda, dimana proporsi S. mutans setelah mengkonsumsi CCS 1 kali sehari lebih rendah dibandingkan CCS 2 kali sehari. Perbedaan ini diduga akibat kemampuan S. mutans dalam manfaatkan sukrosa untuk menjadi massa dalam plak (Samaranayake 2002). Hasil sebaliknya terlihat akibat konsumsi CCNS 1 dan 2 kali sehari. Peningkatan frekuensi konsumsi CCNS menyebabkan penurunan proporsi S. mutans yang semakin besar. Isomalt adalah pemanis yang sulit dimetabolisme oleh mikroorganisme (Mayo and Ritchie 2009). Hasil penelitian ini mengindikasikan penggunaan bahan selain sukrosa pada CCNS memberikan efek penurunan proporsi S. mutans yang lebih tinggi dabiandingkan dengan pemakaian bahan berupa sukrosa pada CCS.
Dilaporkan sebelumnya oleh Iftari et al. (2013) bahwa penghambatan pembentukan massa biofilm akibat pemberian CCNS paling optimum adalah hingga 4 jam waktu inkubasi, dan potensi CCNS melemah setelah waktu 4 jam. Menurut Beckers dan Hoeven (1982), aktivitas pembentukan biofilm oleh S. mutans pada waktu 2 jam pertama masih sangat lemah dikarenakan pada waktu 2 jam pertumbuhan bakteri ini memasuki awal fase log. Fenomena ini diduga yang menjadi penyebab konsumsi CCNS 2 kali sehari pada waktu 1 dan 6 jam setelah menyikat gigi memiliki potensi penurunan proporsi S. mutans yang lebih optimum dibandingkan dengan konsumsi CCNS 1 kali sehari pada waktu 6 jam setelah menyikat gigi. Frekuensi paparan komponen bioaktif antimikroba pada perlakuan konsumsi CCNS 2 kali sehari diduga memperkuat efek antimikroba pada permen tersebut.
Pada perlakuan mengkonsumsi CCNS 1 kali sehari pada waktu 6 jam setelah menyikat gigi memiliki potensi penurunan proporsi S. mutans yang lebih rendah dibandingkan dengan konsumsi permen tersebut sebanyak 2 kali sehari. Diduga hasil ini desebabkan oleh pembentukan plak oleh S. mutans telah memasuki tahap pematangan sehingga sulit untuk menghambat aktivitas pertumbuhan bakteri tersebut dalam plak gigi. Hal ini diperkuat dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Mikx dan Svanberg (1978), dimana pada akhir fase log, biofilm melekat lebih kuat dan mulai memasuki tahap pematangan. Isomalt merupakan poliol atau gula alkohol. Poliol dikenal sebagai pemanis
dengan cepat karena difermentasi dalam waktu yang cukup lama. Menurut Imfeld (1999), biofilm yang dihasilkan akibat paparan gula alkohol mempunyai densitas yang lebih rendah dan lebih lama terbentuk dibandingkan dengan paparan sukrosa. Sifat Isomalt yang sulit dimetabolisme oleh S. mutans diduga menjadi peyebab penurunan proporsi S. mutans yang semakin tinggi dengan meningkatnya frekuensi konsumsi CCNS yaitu 2 kali sehari, seperti yang ditunjukkan dari hasil penelitian ini.
Tabel 4 Pengaruh konsumsi CCS dan CCNS terhadap jumlah bakteri
Perlakuan Total Bakteri (cfu/ml)* S. mutans (cfu/ml)*
K -34534,949 121,081
CCS 2x -29722,109 -897,871
CCS 1x 17826,654 -179,722
CCNS 2x -9472,632 -3724,737
CCNS 1x -244229,456 -19830,310
Ket: * = Nilai negatif menunjukkan adanya penurunan jumlah.
Keberadaan bakteri lain yang bersama S. mutans membentuk plak pada permukaan gigi juga mempengaruhi dinamika jumlah S. mutans. Data yang disajikan pada Tabel 4 menunjukkan bahwa pengaruh konsumsi CCS dan CCNS tidak hanya mengakibatkan penurunan kuantitas S. mutans namun juga penurunan kuantitas total bakteri pada plak. Pada kelompok kontrol, jumlah S. mutans
mengalami kenaikan sedangkan jumlah total bakteri mengalami penurunan jumlah (dalam cfu/ml).
Ketiga kelompok perlakuan pemberian CCS dan CCNS terlihat mengalami penurunan jumlah S. mutans dan bakteri lainnya pada plak. Hasil ini menunjukkan bahwa CCS maupun CCNS memiliki potensi antibakteri yang tidak spesifik terhadap S. mutans. Berbeda dengan kelompok perlakuan konsumsi 1 butir CCS 1 kali sehari dimana terjadi kenaikan jumlah total bakteri disaat jumlah S. mutans
mengalami penurunan jumlah. Perbedaan ini mengindikasikan bahwa terdapat spesis lain, bakteri non-kariogenik pada plak gigi yang mungkin lebih adaptif terhadap pemberian CCS 1 kali sehari. Diperlukan penelitian lanjut untuk mampu menjelaskan hipotesis ini.
Penelitian ini dilakukan secara in vivo dimana perilaku individu terhadap pola makan, frekuensi mengkonsumsi makanan atau minuman, serta jenis asupan yang dimakan merupakan faktor confounding (tidak diatur sebagai perlakuan), sehingga hasil yang telah dijelaskan sebelumnya juga dipengaruhi oleh faktor ini. Beberapa kemungkinan seperti jenis, bentuk, dan durasi kontak makanan dengan permukaan gigi sangat mempengaruhi proporsi S. mutans pada plak (Bahar 2011).
Pada penelitian ini tidak dilakukan pendataan terhadap jenis makanan yang dikonsumsi subjek sehingga tidak dapat ditentukan dengan pasti faktor lain selain konsumsi CCS dan CCNS yang telah mempengaruhi proporsi S. mutans pada plak setiap subjek penelitian.
permukaan gigi oleh pemanis pada makanan yang dikonsumsi. Panjangnya durasi kontak pemanis dengan permukaan gigi dapat menjebatani pembentukan plak gigi yang bersifat kariogenik (Touger dan Loveren 2003). Beberapa jenis makanan telah diketahui mempunyai faktor protektif terhadap pelekatan bakteri pada permukaan gigi. Adanya lemak dalam makanan yang dimakan seseorang dapat menurunkan kemampuan melekat suatu bakteri, kecuali produk susu seperti keju dan beberapa jenis kacang (Bahar 2011).
Makanan yang membutuhkan frekuensi kunyah lebih banyak dapat meningkatkan aliran saliva. Peningkatan aliran saliva merupakan salah satu mekanisme protektif terhadap resiko pembentukan plak (Bahar 2011). Pengaruh dari faktor confounding seperti beberapa diantaranya telah disampaikan tersebut, diduga ikut berperan dalam hasil ananilis terhadap potensi CCS atau CCNS pada penelitian ini.
Mengatur pola konsumsi merupakan salah saran yang dapat dilakukan untuk mengontrol keberadaan bakteri karogenik pada plak. (Bahar 2011) termasuk asupan pangan fungsional CCS atau CCNS. Prosedur pembersihan plak secara mekanis seperti menggososk gigi dengan benar tetap harus dilakukan untuk menjaga kebersihan rongga mulut (Kidd dan Bechal 2004).
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa CCS maupun CCNS memiliki potensi antibakteri tidak hanya terhadap S. mutans namun juga terhadap bakteri laindalam komunitas bakteri yang membentuk biofilm pada permukaan gigi (plak gigi). Efek antimikroba CCS dan CCNS berdampak pada penurunan jumlah bakteri non-karigenik penyusun plak. Penurunan jumlah dan proporsi akibat mengkonsumsi 1 butir CCNS 2 kali sehari memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan ketiga kelompok perlakuan lainnya. Hasil ini juga dipengaruhi oleh perilaku seseorang, sehingga untuk mendapatkan hasil yang lebih optimum dalam menurunkan kuantitas S. mutans dan pencegahan proses karies gigi, pola konsumsi makanan non kariogenik harus tetap diperhatikan.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Cajuputs Candy Sucrose (CCS) dan Cajuputs Candy Non Sucrose (CCNS) berpotensi menurunkan kuantitas S. mutans dan proporsinya terhadap total bakteri pada plak gigi, serta dapat menurunkan jumlah bakteri non-kariogenik lain di dalam plak gigi. Penurunan jumlah S. mutans dan proporsinya terhadap total bakteri pada plak gigi setelah mengkonsumsi CCS lebih rendah dibandingkan dengan setelah mengkonsumsi CCNS. Pengunaan bahan baku non sukrosa pada
Saran
Mengingat pada penelitian ini faktor confounding yang tidak tercatat juga mempengaruhi potensi CCS atau CCNS, baik untuk dilakukan penelitian lanjut mengenai potensi CCS atau CCNS dalam menurunkan kuantitas S. mutans pada plak gigi dengan menyertakan pencatatan terhadap faktor confounding. Perlu juga dilakukan penelitian lanjutan mengenai korelasi antara kuantitas S. mutans plak gigi dengan fungsi protektif saliva terhadap bakteri tersebut sebagai dampak dari asupan CCS atau CCNS.
DAFTAR PUSTAKA
Allaker R, Douglas CWI. 2009. Novel anti-microbial therapies for dental plaque-related diseases. Inter J Microbial. 33: 8-13. doi: 1 0.1016/j.ijantimicag.2008.07.014.
Anonim. 2012. Detail isi mulut kita. [Internet] http://onomenulis.wordpress.com/2012/01/11/detail-isi-rongga-mulut-kita/ (1 mei 2014)..
Bahar Armasastra. 2011. Paradigma Baru Pencegahan Karies Gigi. Jakarta: Lembaga Penerbitan Fakultas Ekonomi Universitas Indonesia.
Beckers HJA, van der Hoeven JS. 1982. Growth rates of Actinomyces viscosus and Streptococcus mutans during early colonization of tooth surfaces in Gnotobiotic rats. J Infection and Immunity. 38 (1): 8-13.
Herold S, Kuechler A,Liehr T,Laccone F. 2004. Rapid detection of subtelomeric deletion/duplication by novel real-time quantitative PCR using SYBR-green dye. Human Mutation. 23(4): 368-378. doi: 10.1002/humu.20011.
Hart PH, Brand C, Crson CF, Riley TV, Prager RH, Finlay-Jones JJ. 2000. Terpinen-4-ol, the main component of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil), suppresses inflammatory mediator production by activated human monocytes. J Inflamm Res. 49(11):619-26. doi: 10.1007/s000110050639.
Dennison I, Radolph. 1981. Diet Nutrition and Dentistry. Amazon. United Kingdom.
Dwivedi D, Khandelwal G, Patidar RK, Singh V. 2012. Antimicrobial activity of
Mentha arvensis against clinical isolates of human cariogenic pathogens- an in vitro study. Int J Pharmaceutic Sci & Res. 3(5):1355-1360. ISSN: 0975-8232.
Eka SBR, Wijaya CH, Bachtiar BM. 2013. Potency of Cajuputs Candy in Maintening the Competitive Capacity of Streptococcus sanguinis Upon
Streptococcus mutans. J Essential Oil Res, forthcoming.
Handoyo D, Rudiretna A. 2000. Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase chain reaction (PCR). Vol 9(1): 17-29.
Iftari W, Fardiaz D, Bachtiar BM, Wijaya CH, The potency of non-sucrose
cajuputs candy in inhibiting the formation of biofilm by Streptococcus mutans serotype c, 13th Asean Food Conference September 9-11, Singapore, 2013.
Imfeld T. 1999. Chewing Gum—Fact an Fiction: a Review of gum chewing and oral health. Crit Rev Oral Biol Med. 10:405-419, doi: 10.1177/10454411990100030901.
Inouye S, Takizawa T, Yamaguchi H. 2001. Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact. J Antimicrob Chemoter. 47(5):565-573. doi:10.1093/jac/47.5.565. Jara C, Mateo E, Guillamon JM, Torija MJ, Mas A. 2008. Analysis of several
methods for the extraction of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for characterization by PCR-based methods. Int J Microbiol. 128: 336-341. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.09.008
Jedlickova Z, Ery V, Motto O, Nguyen DC. 1994. Antibacterial properties of cajuput oil. Medicaments et Aliments: L’Approche Ethnopharmacologique. 293. ISBN 2-7099-1320-8.
Kidd EAM. Essentials of Dental Caries 3rd edition. New York: Oxford University Press; 2004.
Lee KH et al. 2011. Essential oil of Curcuma longa inhibits Streptococcus mutans
biofilm formation. J of Food Science. 76 (9): 226-230.doi: 10.1111/j.1750-3841.2011.02427.x.
Achillea ligustica All. (Asteraceae) naturalized in central Italy: ideal candidate for anti-cariogenic formulations. Fitoterapia. 80(6):313-9. doi: 10.1016/j.fitote.2009.04.004.
Marsh PD. 2006. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-implications for health and disease. Proceedings. BMC Oral Health, 6:S14. Mikx FHM, Svanberg, M. 1978. Considerations about microbial interactions in
relation to modification of the microflora of dental plaque. Di dalam: Bibby B, Shera R, editor. Methods of Caries Prediction Spec. Suppl. Microbiol. Washington DC (US): Information Retrieval Inc.
Oyedemi SO, Okoh AI, Mabinya LV, Pirochenva G, Afolayan AJ. 2009. The proposed mechanism of bactericidal action of eugenol, α-terpineol and γ -terpinene against Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Proteus vulgaris and Escherichia coli. Afican J Biotechnol, 8(7):1280-1286. ISSN: 1684-5315.
Pearson LS, Hutton JL. 2002. A controlled trial to compare the ability of foam swabs and toothbrushes to remove dental plaque. J Advanced Nursing.
39(5): 480-489. doi: doi 10.1046_j.1365-2648.2002.02313.x.
overview. Forschende Komplementarmedizin. 16(2): 79-90. doi: 10.1159/000207196.
Reloy R, Martens LC, Vaobbergen J, Bogaerts K, Declrck D. 2009. Caries experience and gingivitis levels of permanent first molars in relation to timing of emergence. OHDMBS. 8(3): 33-42.
Roeslan BO. 2002. Imunologi Oral – Kelainan dalam Rongga Mulut. Jakarta (ID): UI - Press.
Samaranayake LP. 2002. Essential Microbiology for Dentistry 2nd Edition. Churchill Livingstone, Edinburgh.
Shemesh M, Ashyalom T, Steinberg D. 2007. Expression of biofilm-associated genes of Streptococcus mutans in response to glucose and sucrose. J Medical Micobiol. 56:1528-1535. doi:10.1099/jmm.0.47146-0.
Sujana K, et al. 2012. Collection, isolation, characterization of helicobacter pylori from dental plaque and antibacterial activity of novel drug 1-phenyl-3(4’ -aminophenyl)-5-(2’’,4’’-dichlorophenyl)-2-pyrazoline. IJPCBS. 2(4):552-574.
[TFS] Thermo scientific. 2013. Technical Bulletin Nanodrop Spectrophothometers: Assesment of Nucleic Acid Purity. Wilmington (US): Thermo Fisher Scientific.
Touger R, Loveren CV. 2003. Sugars and dental caries. Am J clin nutr. 78(4): 8815-8825. ISSN: 1938-3207.
Wijaya CH, Halimah, Kindly, Taqi F, penemu: Institut Pertanian Bogor. 2002 nov 13.Komposisi permen cajuputs untuk pelega tenggorokan.Paten Indonesia ID 0 000 385 S.
Wijaya CH. 2011. Candy flavors [ulasan]. Food Review Indonesia. 6:26-30. Wijaya CH, penemu: Institut Pertanian Bogor. 2013 Mei 30. Komposisi permen
cajuputs yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba penyebab karies gigi dan proses pembuatannya. Paten Indonesia 2013/01638 A.
Yano A, Kaneko N, Ida H, Yamaguchi T, Hanada N. 2002. Real-time PCR for quantification of Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letter. 217:23-30.
Lampiran 2 Lembar informasi dan surat permohonan kesediaan berpartisipasi dalam penelitian
INFORMASI DAN SURAT PERMOHONAN KESEDIAAN BERPARTISIPASI DALAM PENELITIAN
Kepada Yth.
Calon Subjek Penelitian Di IPB Bogor
Dengan Hormat,
Yang bertanda tangan di bawah ini mahasiswa Program Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor:
Nama : Agusta Putri Balqis Linda Soeharso
NRP : F24100020
Akan mengadakan penelitian dengan judul ―Perubahan Proporsi Jumlah
Streptococcus mutans terhadap Total Bakteri Plak Gigi Mahasiswa Setelah Mengkonsumsi Cajuputs Candy”. Penelitian ini dilaksanakan sebagai salah satu kegiatan dalam menyelesaikan tugas akhir di Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Intitut Pertanian Bogor.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis potensi cajuputs candy
terhadap kuantitas S.mutans dan proporsinya terhadap total bakteri pada sampel plak gigi dengan menggunakan teknik Real Time Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR). Plak gigi yang akan digunakan dikoleksi dari mahasiswa Institut Pertanian Bogor sedangkan bahan uji adalah cajuputs candy sucrose (CCS) dan
cajuputs candy non sucrose (CCNS). Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi ilmiah mengenai potensi CCS dan CCNS dalam mengontrol pertumbuhan S.mutans yang telah diketahui sebagai mikroflora mulut dominan di dalam plak gigi penyebab karies.
Sebagai gambaran penelitian ini :
1. Latar belakang penelitian :
Penelitian sebelumnya yang terkait dengan potensi CCS dan CCNS dilakukan terhadap S. mutans strain laboratorium. Kondisi tersebut berbeda dengan kondisi S. mutans plak gigi sehingga hasil penelitian belum sepenuhnya mengungkapkan efektifitas Cajuputs Candy terhadap S.mutans
isolat mulut, yang secara alami terlibat dalam proses terjadinya karies gigi. Dengan demikian, dirasakan perlu dilakukan pengujian terhadap potensi
Cajuputs Candy terhadap pertumbuhan S.mutans pada plak gigi pada oral panelis. Hasil pengujian ini diharapkan mampu memberikan gambaran yang lebih nyata mengenai potensi penghambatan CCS dan CCNS terhadap S. mutans.
2. Lama Sampling dan jumlah subjek penelitian :
Sampling plak dilakukan selama 5 hari dengan jumlah subjek 6 orang.
3. Perlakuan terhadap subjek :
Subjek diharapkan mematuhi ketentuan-ketentuan sebagai berikut:
Lampiran 2 (lanjutan)
Subjek diinstruksikan membersihkan gigi dan mulut (menggosok gigi) pagi pada jam 06.00 WIB.
Jam 06.00 WIB, segera setelah menggosok gigi,dilakukan pengambilan sampel plak gigi dengan cara diusap.
Jam 07.00 WIB subjek diinstruksikan untuk mengkonsumsi CCS atau CCNS.
Jam 09.00 WIB subjek diinstruksikan untuk sarapan.
Jam 12.00 subjek diinstruksikan untuk mengkonsumsi CCS atau CCNS kembali.
Jam 14.00 WIB kembali dilakukan pengambilan sampel plak gigi subjek. Pemberian perlakuan dan jadwal pengambilan sampel plak gigi diilustrasikan pada Gambar 1.
4. Kemungkinan risiko kesehatan :
Permen Cajuputs Candy sejauh ini sudah banyak dikonsumsi dan tidak memberikan efek samping yang berarti. Permen ini telah diproduksi dan dipasarkan. Hingga saat ini belum ada komplain dari lembaga konsumen atau perorangan mengenai efek samping dari mengkonsumsi Cajuputs Candy, artinya permen ini bukan obat tapi makanan yg akan diuji efeknya terhadap Streptococcus mutans karena belum dikethui efeknya terhadap mikroflora mulut. Pengambilan sampel plak gigi akan dilakukan dengan metode swabbing, yaitu dengan mengusapkan cotton bud steril pada permukaan bukal gigi sehingga tidak menimbulkan rasa sakit dan tidak berefek samping.
5. Penjelasan kompensasi bagi subjek :
Saudara/i akan mendapatkan kompensasi pengganti penghasilan atau waktu yang hilang akibat berpartisipasi dalam penelitian ini.
6. Penjelasan terjaminnya subjek :
Semua informasi yang berkaitan dengan identitas subyek penelitian akan dirahasiakan dan hanya akan diketahui oleh peneliti. Hasil penelitian akan dipublikasikan tanpa identitas subyek penelitian.
Partisipasi dalam penelitian bersifat bebas untuk ikut atau tanpa paksaan apapun. Bila telah menjadi subjek peneltian dan terjadi hal-hal yang memungkinkan untuk mengundurkan diri, subjek penelitian berhak untuk mengundurkan diri sebagai subjek penelitian. Apabila Saudara/i memahami dan menyetujui maka saya mohon kesediaannya untuk menandatangani persetujuan dan bersedia untuk ikut dalam kegiatan selanjutnya ( rangkain penelitian).
Lampiran 2 (lanjutan) P4 : Konsumsi 1 butir CCNS 1 kali dalam sehari.
Lampiran 2 (lanjutan)
Disamarkan
Disamarkan
Disamarkan
Lampiran 2 (lanjutan)
Lampiran 3 Hasil pengukuran konsentrasi DNA sampel dan perhitungan
Lampiran 3 (lanjutan)
Lampiran 4 Data berat plak gigi yang terambil
Klp. Perlakuan
Eppendorf+Cotton bud+Plak+PBS 1,5
mL (mg) steril + PBS steril 1,5 mL Eppendorf + Cotton bud
Lampiran 5 Hasil nilai CTS. mutans dan total bakteri
Lampiran 5 (lanjutan) 2 25,453 undetermined 23,4375 23,3406
3 23,0842 22,836 19,7474 19,5251
4 24,8791 23,9462 27,6103 26,3111
5 16,3371 undetermined 19,2241 18,313
6 15,6249 14,8839 19,3616 18,6858
CCS 2x
1 18,439 18,1969 undetermined 20,3589
2 21,6558 21,4168 21,6118 21,7794
3 19,4453 18,9022 24,7403 undetermined
4 24,4947 21,9186 23,6873 23,9076
4 21,3077 21,4412 undetermined 22,2644
5 23,7821 24,0213 23,0937 22,3397
6 23,3978 undetermined 23,1646 22,4619
CCNS 1x
Lampiran 6 Hasil uji sidik ragam dan uji lanjut Dunnett terhadap perubahan proporsi jumlah S. mutans plak gigi
Univariate Analysis of Variance
Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower
The error term is Mean Square(Error) = ,073. *. The mean difference is significant at the 0,05 level.
Lampiran 7 Hasil kuantifikasi proporsi S. mutans dan hasil uji sidik ragam
Paired-Sample T Test
Tabel hasil kuantifikasi terhadap proporsi S. mutans
Perlakuan No. Proporsi Sebelum
Proporsi
Sesudah Perlakuan No.
Proporsi
Ket : K = Tanpa mengkonsumsi CCS dan CCNS, CCS 2x= Konsumsi 1 butir CCS 2 kali sehari, CCS 1x = Konsumsi 1 butir CCS 1 kali sehari, CCNS 2x = Konsumsi 1 butir CCNS 2 kali sehari, CCNS 1x = Konsumsi 1 butir CCNS 1 kali sehari.
T-Test
Paired Samples Statistics
Mean N Std. Deviation Std. Error Mean
Pair 1
Perlakuan1_0 ,059800 6 ,0536374 ,0218974
Perlakuan1_1 ,042550 6 ,0294980 ,0120425
Pair 2 Perlakuan2_0 ,053033 6 ,0579448 ,0236559
Perlakuan2_1 ,050467 6 ,0930023 ,0379680
Pair 3 Perlakuan3_0 ,181650 6 ,1370524 ,0559514
Perlakuan3_1 ,035667 6 ,0247279 ,0100951
Pair 4
Perlakuan4_0 ,216550 6 ,2629096 ,1073324
Lampiran 7 (lanjutan)
Paired Samples Correlations
N Correlation Sig.
Pair 1 Perlakuan1_0 & Perlakuan1_1 6 -,078 ,883
Pair 2 Perlakuan2_0 & Perlakuan2_1 6 ,928 ,008
Pair 3 Perlakuan3_0 & Perlakuan3_1 6 ,881 ,021
Pair 4 Perlakuan4_0 & Perlakuan4_1 6 -,141 ,790
Lampiran 7 (lanjutan)
Paired Samples Test
Paired Differences t df Sig.
(2-tailed
)
Mean Std.
Deviation
Std. Error
Mean
95% Confidence Interval
of the Difference
Lower Upper
Pair 1 Perlakuan1_0 -
Perlakuan1_1 ,0172500 ,0632098 ,0258053 -,0490846 ,0835846 ,668 5 ,533
Pair 2 Perlakuan2_0 -
Perlakuan2_1 ,0025667 ,0447270 ,0182597 -,0443715 ,0495048 ,141 5 ,894
Pair 3 Perlakuan3_0 -
Perlakuan3_1 ,1459833 ,1158720 ,0473046 ,0243831 ,2675836 3,086 5 ,027
Pair 4 Perlakuan4_0 -
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Banyuwangi, 30 Agustus 1992 dari ayah Zairin Soeharso dan ibu Herlinda. Penulis adalah anak kedua dari dua bersaudara. Penulis memulai pendidikan formal pada tahun 1996-1998 TK Aisyiyah Negara- Bali. Pendidikan SD ditempuh pada tahun 1998-2004 di SDN 1 Lelateng, Negara-Bali dan SMP pada tahun 2004-2007 di SMPN 1 Negara-Bali. Pendidikan SMA ditempuh di SMAN 1 Negara-Bali pada tahun 2007-2010. Pada tahun 2010, penulis diterima di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI.
Selama menempuh pendidikan di IPB, penulis terlibat pada beberapa kegiatan kepanitian antara lain BAUR (2012), ACCES (2012), dan Orde Keramat (2013). Selain itu penulis juga terpilih enjadi asisten praktikum Teknologi Pengolahan Pangan tahun ajaran 2014. Sebagai tugas akhir, penulis melakukan kegiatan penelitian selama dua bulan yang hasilnya kemudan disusun dalam bentuk skripsi dengan judul ―Perubahan Proporsi Jumlah Streptococcus mutans
