KERAGAMAN GEN TOLL-LIKE RECEPTOR 4 (TLR4) DAN
MYXOVIRUS (MX) PADA AYAM KAMPUNG SERTA
ASOSIASINYA TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN
PANDU PERMATASARI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Keragaman Gen Toll-like Receptor 4 (TLR4) dan Myxovirus (Mx) pada Ayam Kampung serta Asosiasinya terhadap Sifat Pertumbuhan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2015
Pandu Permatasari
RINGKASAN
PANDU PERMATASARI. Keragaman Gen Toll-like Receptor 4 (TLR4) dan
Myxovirus (Mx) pada Ayam Kampung serta Asosiasinya terhadap Sifat Pertumbuhan. Dibimbing oleh CECE SUMANTRI, SRI DARWATI dan NIKEN ULUPI.
Ayam kampung dipelihara untuk dua tujuan produksi, yaitu sebagai penghasil telur dan penghasil daging. Telur ayam kampung biasa dimanfaatkan sebagai jamu atau bahan campuran jamu. Telur ayam kampung yang dimanfaatkan sebagai jamu biasanya dikonsumsi dalam kondisi mentah sehingga perlu dijamin keamanannya dari bakteri Salmonella sp. Masalah yang terjadi pada industri ayam kampung adalah kematian ayam kampung yang sebagian besar disebabkan oleh infeksi virus Newcastle Disease (ND). Secara genetik, gen yang mengontrol ketahanan tubuh ayam kampung terhadap bakteri Salmonella sp
adalah gen Toll-like Receptor 4 (TLR4), sedangkan gen yang mengontrol ketahanan tubuh ayam kampung terhadap infeksi virus adalah gen Myxovirus
(Mx). Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung serta mengidentifikasi hubungan kedua gen tersebut terhadap sifat pertumbuhan.
Penelitian dilakukan dua tahap. Tahap pertama dilakukan mengenai keragaman gen TLR4 dan Mx, sedangkan penelitian tahap kedua dilakukan mengenai asosiasi kedua gen tersebut terhadap sifat pertumbuhan. Ayam kampung yang digunakan pada penelitian tahap 1 adalah 98 ekor, sedangkan yang digunakan pada tahap 2 adalah 45 ekor. Identifikasi keragaman gen TLR4 dan Mx menggunakan metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism). Analisis data yang dilakukan yaitu frekuensi genotipe, frekuensi alel, heterozigositas, keseimbangan Hardy-Weinberg, nilai
Polymorphics Informative Content dan asosiasi data genotipe terhadap sifat pertumbuhan menggunakan GLM (General Linear Model).
Hasil penelitian menunjukkan adanya mutasi GA pada gen TLR4 dan mutasi AG pada gen Mx. Gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung bersifat polimorfik. Tidak ditemukan asosiasi gen TLR4 terhadap sifat pertumbuhan. Terdapat hubungan antara genotipe gen Mx dengan sifat pertumbuhan. Ayam kampung dengan ketahanan terhadap Sallmonella sp dan infeksi virus memiliki bobot badan minggu ke-16, PBB total dan PBB mingguan yang rendah.
SUMMARY
PANDU PERMATASARI. Polymorphisms of Toll-like Receptor 4 (TLR4) and Myxovirus (Mx) Genes in Kampung chicken and The Association with Growth Traits. Supervised by CECE SUMANTRI, SRI DARWATI and NIKEN ULUPI.
Kampung chicken has two production purposes as meat and egg producer. As layer chicken, the egg of kampung chicken was used as jamu. So, the food security of kampung chicken egg needs to be guaranted especially from
Salmonella sp. The other problem which commonly happened in kampung chicken industry was the highest of mortality rate which caused by Newcastle Disease (ND) virus infection. Genetically, there were some gene that control self endurance against Salmonella sp and virus infection such as TLR4 and Mx genes. Research aimed to identify the polymorphisms of TLR4 and Mx genes in kampung chicken and the association with growth traits.
Research consisted of two steps. The first step was analysis of TLR4 and MX genes polymorphisms and the second step was the association of TLR4 and Mx genes with growth traits. A total of 98 bird of kampung chickens were used in the first procedure and 45 birds were used in the second procedure. Identification of TLR4 and Mx genes polymorphisms was done using PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) method. Data analysis were genotype frquency, allele frequency, heterozygosity, Hardy-Weinberg equilibrium, Polymorphics Informative Content value and association between genotype and growth used GLM (General Linear Model).
The result showed GA mutation on TLR4 gene and AG mutation on Mx gene. TLR4 and Mx gene were polymorphics. There was no association between TLR4 gene and growth traits in kampung chicken. Kampung chicken which resist to Salmonella sp and ND virus had low 16 weeks body weight, total average gain daily, and average weekly gain.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
KERAGAMAN GEN TOLL-LIKE RECEPTOR 4 (TLR4) DAN
MYXOVIRUS (MX) PADA AYAM KAMPUNG SERTA
ASOSIASINYA TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
PRAKATA
Alhamdulillahirrobbil’alamin, puji dan syukur Penulis panjatkan kehadirat
Allah SWT karena berkat rahmat dan hidayah-Nya Penulis berhasil
menyelesaikan tesis yang berjudul “Keragaman Gen Toll-like Receptor 4 (TLR4)
dan Myxovirus (Mx) pada Ayam Kampung serta Asosiasinya terhadap Sifat Pertumbuhan”. Tesis ini Penulis buat sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada program studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih Penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc, Dr Ir Sri Darwati, MSi dan Dr Ir Niken Ulupi, MS selaku komisi pembimbing atas curahan waktu, bimbingan, dukungan dan semangat yang diberikan selama penelitian hingga selesainya penulisan tesis ini. Terima kasih Penulis ucapkan kepada Dr Ir Rita Mutia, MAgr atas kesediaan waktunya menjadi penguji luar komisi pada ujian tesis serta atas saran dan masukannya pada penulisan tesis ini. Terima kasih juga Penulis ucapkan kepada Dr Ir Salundik, MSi selaku Ketua Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (ITP), Ibu Ade dan Mbak Okta selaku staf di sekretariat Pasca ITP atas pelayanan administrasi yang diberikan selama Penulis studi di ITP.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada ayahanda Sutarno, ibunda Yuli Sukarelawati, serta adinda Pandu Amalia atas doa, dukungan, semangat dan kasih sayang yang tak pernah padam. Terima kasih juga Penulis ucapkan kepada Achdyawan Wenda Keynesandy atas segala doa dan ketulusan hati yang diberikan kepada Penulis. Terima kasih kepada Ria Putri Rahmadani, sahabat sekaligus adik seperjuangan, atas segala bantuan dan letupan semangat yang diberikan kepada Penulis. Terima kasih kepada keluarga besar Animal Breeding and Genetics Student Community (ABGSCi), Kak Eryk, Kak Ferdy, Kak Irene, Kak Icha, Kak Ridho, Shelvi, Isyana, Alit, Roaslein, Furqon, Muhsinin, Nawal, Hadi, Rindang, Mujo, Riri, Ninin, dan Mumus atas segala bantuan yang diberikan selama penelitian hingga penulisan tesis. Terima kasih kepada sahabat tersayang Erren, Angga, Eka, Sri, Ndaru, Upi, Desi dan Ai serta teman-teman ITP 2012 dan 2013 atas hangatnya kebersamaan selama ini. Terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu Penulis yang tidak dapat Penulis sebutkan satu per satu. Semoga semua kebaikan yang telah diberikan dibalas oleh Allah SWT. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 3
Manfaat Penelitian 3
Ruang Lingkup Penelitian 3
2 METODE 3
Waktu dan Tempat Penelitian 3
Tahap 1: Identifikasi Keragaman Gen TLR4 dan Mx pada Ayam
Kampung 3
Tahap 2: Asosiasi Gen TLR4 dan Gen Mx terhadap Sifat Pertumbuhan 6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN 8
Keragaman Gen TLR4 dan Mx dengan Metode PCR RFLP 8 Frekuensi Genotipe dan Frekuensi Alel Gen TLR4 dan Mx 9
Derajat Polimorfisme Gen TLR4 dan Mx 10
Pertumbuhan Ayam Kampung Periode Grower 11
Asosiasi Gen TLR4 terhadap Sifat Pertumbuhan pada Periode Grower 11 Asosiasi Gen Mx terhadap Sifat Pertumbuhan pada Periode Grower 12 Asosiasi Kombinasi Gen TLR4 dan Mx terhadap Sifat Pertumbuhan
pada Periode Grower 14
4 SIMPULAN DAN SARAN 14
Simpulan 14
Saran 15
DAFTAR TABEL
1 Kandungan nutrisi pakan ayam kampung 7
2 Frekuensi genotipe dan alel gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung 9 3 Genotipe kombinasi gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung 9 4 Frekeunsi genotipe kombinasi gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung 10 5 Keseimbangan HW, Ho, He, dan PIC genotipe gen TLR4 dan Mx pada
ayam kampung 10
6 Pengaruh keragaman gen TLR4 terhadap sifat pertumbuhan ayam
kampung pada periode grower 12
7 Pengaruh keragaman gen Mx terhadap sifat pertumbuhan ayam
kampung pada periode grower 13
8 Pengaruh genotipe kombinasi gen TLR4 dan Mx terhadap sifat
pertumbuhan ayam kampung pada periode grower 14
DAFTAR GAMBAR
1 Bagan kerangka pemikiran penelitian 2
2 Visualisasi hasil PCR-RFLP gen TLR4 (a) dan Mx (b). M (marker); 1-3
(DNA ayam kampung) 8
3 Bobot badan ayam kampung pada periode grower 11
4 Bobot badan ayam kampung pada periode grower berdasarkan genotipe
gen TLR4 12
5 Bobot badan ayam kampung pada periode grower berdasarkan genotipe
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan produksi ayam kampung dapat dibedakan menjadi ayam kampung petelur dan ayam kampung pedaging. Meskipun memiliki tujuan produksi yang berbeda, belum ada ciri khusus yang membedakan kedua tipe ayam kampung tersebut (Sulandari et al. 2007). Terkait dengan tujuan produksi ayam kampung sebagai ayam petelur, keamanan konsumen dalam mengonsumsi telur ayam kampung perlu diperhatikan dari kasus Salmonellosis. Telur ayam kampung sering dimanfaatkan masyarakat Indonesia sebagai jamu atau campuran jamu. Sebagai jamu, telur ayam ini biasanya dikonsumsi dalam kondisi mentah sehingga perlu dijamin keamanannya dari bakteri Salmonella sp.
Secara genetik, ketahanan terhadap Salmonella sp dikontrol antara lain oleh gen TLR4. Berdasarkan data dari GenBank dengan nomor akses AY064697.1, gen TLR4 berada di kromosom 17. Gen tersebut bekerja mentranskripsi protein TLR4 yang berperan sebagai reseptor pada sel fagosit (Akira dan Takeda 2004). Ulupi et al. (2013) melaporkan bahwa gen TLR4|MscI dibuktikan dapat digunakan sebagai penciri genetik untuk sifat ketahanan tubuh ayam terhadap infeksi Salmonella sp.
Penelitian tersebut melaporkan bahwa ayam kampung dengan semua genotipe (GG, GA dan AA) memiliki ketahanan terhadap Salmonella enteritidis. Meskipun demikian, genotipe GG pada gen TLR4 menunjukkan respon fisiologis yang lebih baik dari pada genotipe GA pada saat ditantang dengan S. enteritidis. Hal ini menunjukkan bahwa alel G membawa sifat resisten.
Masalah lain yang terjadi pada industri ayam kampung adalah kematian ayam kampung yang sebagian besar disebabkan oleh infeksi virus Newcastle Disease (ND). Secara genetik, ketahanan terhadap virus, termasuk virus ND dikontrol oleh gen Mx. Berdasarkan data dari GenBank dengan nomor akses DQ788615, berada di kromosom 1. Gen Mx bekerja mentranskripsi protein Mx yang berfungsi sebagai promotor ketahanan terhadap infeksi virus. Gen Mx dilaporkan dapat digunakan sebagai penciri genetik untuk sifat ketahanan tubuh ayam terhadap infeksi virus, seperti virus Avian Influenza (AI) dan Newcastle Disease (ND). Pagala et al. (2013) melaporkan adanya asosiasi keragaman genotipe gen Mx|Hpy8I terhadap sifat antiviral pada ayam Tolaki. Genotipe gen Mx yang ditemukan pada ayam Tolaki adalah genotipe AA, AG, dan GG, genotipe yang memiliki alel A menampilkan ketahanan terhadap penyakit viral yang lebih baik dibandingkan dengan genotipe yang memiliki alel G. Maeda (2005) melakukan penelitian terhadap gen Mx pada ayam lokal Indonesia dan melaporkan bahwa sebesar 63% ayam lokal Indonesia tahan terhadap infeksi virus AI sedangkan 37% yang berada pada kategori tidak tahan. Pagala et al. (2013) melakukan penelitian pada ayam Tolaki dan melaporkan bahwa gen Mx|Hpy8I dapat digunakan sebagai penciri genetik untuk sifat ketahanan tubuh ayam terhadap infeksi virus Newcastle Disease (ND).
2
informasi tambahan dalam proses seleksi ayam kampung yang tahan terhadap
Salmonella sp atau pun virus Newcastle Disease (ND).
Perumusan Masalah
Kerangka penelitian dari penelitian ini disajikan pada Gambar 1. Ketahanan ayam terhadap infeksi bakteri Salmonella sp antara lain dikontrol oleh gen TLR4, sedangkan ketahanannya terhadap infeksi virus dikontrol oleh gen Mx. Hubungan ketahanan ayam kampung terhadap infeksi bakteri dan virus dengan sifat pertumbuhan ayam kampung adalah masalah utama yang ingin diteliti.
Penelitian dilakukan untuk menjawab permasalahan tersebut. Penelitian ini dilakukan melalui 2 tahapan pengujian, yaitu pengujian terhadap faktor genetik dan pengujian terhadap fenotipik. Pengujian terhadap faktor genetik bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman genotipe gen TLR4 dan gen Mx pada ayam kampung. Pengujian terhadap fenotipik dilakukan pada pertumbuhan ayam kampung. Kedua hasil pengujian tersebut kemudian digunakan untuk
3 mengasosiasi genotipe gen TLR4 dan Mx terhadap sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi keragaman genotipe gen TLR4 dan Mx serta asosiasinya terhadap sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah sebagai informasi tambahan untuk menseleksi ketahanan ayam terhadap infeksi Salmonella sp dan virus ND berdasarkan dari sifat pertumbuhannya.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini terdiri dari 2 tahap. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman genotipe gen TLR4 dan gen Mx yang terdapat pada ayam kampung. Penelitian tahap kedua bertujuan untuk menerangkan asosiasi sifat pertumbuhan ayam kampung terhadap genotipe pada gen TLR4 dan gen Mx.
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Juli sampai bulan Oktober 2014. Penelitian dilakukan pada dua tahap. Penelitian tahap 1 mengenai keragaman gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Fakultas Peternakan IPB, sedangkan penelitian tahap 2 mengenai asosasi gen TLR4 dan Mx terhadap sifat pertumbuhan dilaksanakan di Laboratorium Lapang Terpadu, Fakultas Peternakan IPB.
Tahap 1: Identifikasi Keragaman Gen TLR4 dan Mx pada Ayam Kampung
4
Total Sampel
Sampel ayam kampung yang digunakan sebanyak 98 ekor. Sampel ayam yang digunakan adalah ayam koleksi milik Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, IPB.
Pengambilan Sampel Darah
Sebanyak 1 mL darah diambil dari bagian vena axilaris dengan menggunakan syringe. Darah yang sudah diambil kemudian dimasukkan ke dalam tabung ependorf yang telah diisi EDTA.
Ekstraksi DNA
Sebanyak 50 µL sampel darah dimasukkan ke dalam tabung ependorf (1.5 mL) dan ditambahkan dengan 1 000 µL NaCl 0.2%, kemudian didiamkan 5 menit. Setelah didiamkan, disentrifugasi pada kecepatan 8 000 rpm selama 5 menit, kemudian bagian supernatan dibuang. Setelah bagian supernatan dibuang, larutan ditambahkan dengan 20 µL proteinase K 5 mg mL-1, 40µL sodium dodesil fosfat (SDS) 10% dan 30 µL 1 x STE (sodium tris EDTA). Selanjutnya campuran larutan tersebut dikocok pelan di dalam inkubator selama 2 jam pada suhu 55 oC. Setelah dikocok, campuran larutan tersebut ditambahkan dengan 400 µL phenol, 400 µL CIAA dan 40 µL 5 M NaCl sambil digoyang pelan selama 1 jam pada suhu ruang. Setelah itu, campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit.
Sebanyak 400 µL bagian yang berwarna bening (DNA) dipindahkan menggunakan pipet ke tabung baru (1.5 mL). Tabung yang sudah berisi DNA ini kemudian ditambahkan dengan 800 µL etanol absolut dan 40 µL 5 M NaCl lalu disimpan di dalam freezer selama semalam. Setelah itu, larutan disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit. Setelah disentrifugasi, bagian supernatan dibuang dan didiamkan dalam keadaan terbuka pada suhu ruang sampai etanol hilang. Selanjutnya ditambahkan 100 µL TE 80%. DNA yang diperoleh kemudian disimpan di freezer sampai siap untuk digunakan.
Amplifikasi PCR
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen TLR4 berdasarkan Ulupi (2013) adalah primer forward (5’-GCT CAA ATT ATT TTT CAT CAG Tgg CC-3’) dan primer reverse (5’-ATC TGG ACT GAA AGC TGC AC-3’). Primer tersebut mampu mengamplifikasi gen TLR4 sepanjang 220 pb yaitu dari basa ke 3 898-4 117 (exon 2). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen Mx berdasarkan Sironi et al. (2010) adalah primer forward (5’-GCA CTG TCA CCT CTT AAT AGA-3’) dan primer reverse(5’GTA TTG GTA GGC TTT GTT
GA-3’). Primer tersebut mampu mengamplifikasi gen TLR4 sepanjang 299 pb yaitu dari basa ke 20 670-20 968 (exon 13).
5 menit. Tahap kedua dilakukan 30 siklus. Tahap ketiga meliputi proses ekstensi akhir pada suhu 72 oC selama 7 menit. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 4 oC hingga digunakan untuk analisis lebih lanjut.
Amplifikasi DNA gen Mx dilakukan pada total volume 15 µL yang terdiri dari 1 µL DNA, 10.85 µL DW, 0.3 µL primer, 0.05 Taq polymerase, 1.5 µL buffer, 0.3 µL dNTPs dan 1 µL MgCl2. Metode amplifikasi dilakukan melalui tiga tahap. Tahap pertama meliputi proses denaturasi awal pada 95 oC selama 5 menit yang dilakukan 1 siklus. Tahap kedua meliputi proses denaturasi pada suhu 95 oC selama 10 detik, proses annealing suhu 60 oC selama 20 detik, dan proses ekstensi suhu 72 oC selama 30 detik. Tahap kedua dilakukan 35 siklus. Tahap ketiga meliputi proses ekstensi akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. Produk hasil PCR kemudian diinkubasi pada suhu 4 oC untuk kemudian digunakan pada proses RFLP.
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)
Penentuan genotipe gen TLR4 dan gen Mx menggunakan metode RFLP. Sebanyak 4 µL produk PCR gen TLR4 dan 5 µL gen Mx dipotong menggunakan 2 µL restriction endonuclease mix yang terdiri dari 0.9 µL dH2O, 0.7 µL buffer, dan 0.4 µL enzim pemotong, kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 oC. Enzim pemotong yang digunakan untuk gen TLR4 adalah MscI yang mengenali situs potong Tgg|CCA, sedangkan enzim pemotong yang digunakan untuk gen Mx adalah Hpy8I yang mengenali situs potong GTN|NAC.
Produk PCR yang sudah dipotong oleh enzim restriksi kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarose 2% dengan buffer 0.5 TBE (Tris Borat EDTA) yang dialiri arus listrik dengan tegangan 100 V selama 40 menit. Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan di bawah UV transiluminator.
Analisis Data
Setelah genotipe didapat melalui metode PCR-RFLP, nilai frekuensi alel, frekuensi genotipe, nilai keseimbangan Hardy-Weinberg, heterozigositas pengamatan, heterozigositas harapan, dan nilai Polymorphic Informative Content
(PIC) dihitung berdasarkan rumus berikut:
Frekuensi alel (Nei 1987)
Keterangan:
xi = frekuensi alel ke-i
nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij N = total sampel
6
Keterangan:
xii = frekuensi genotipe ii
ni = jumlah individu bergenotipe ii N = total sampel
Keseimbangan Hardy-Weinberg (H-W) (Hartl dan Clark 1997)
Keterangan:
x2 = chi-kuadrat
O = jumlah genotipe pengamatan E = jumlah genotipe harapan
Heterozigositas (Nei 1987)
Keterangan:
Ho = heterozigositas pengamatan
N1ij = jumlah individu heterozigot pada lokus ke-1 N = jumlah individu yang diamati
He = heterozigositas harapan
P1i = frekuensi alel ke-i pada lokus ke-1
Polymorphic Informative Content (PIC) (Bostein et al. 1980)
Keterangan:
PIC = Polymorphic Informative Content
pi = frekuensi alel ke-i pj = frekuensi alel ke-j n = jumlah alel per penciri
Tahap 2: Asosiasi Gen TLR4 dan Gen Mx terhadap Sifat Pertumbuhan
Penelitian tahap 2 dilakukan untuk melihat hubungan antara genotipe gen TLR4 dan Mx dengan sifat pertumbuhan pada periode grower. Penelitian tahap 2 dimulai dengan melakukan pemeliharaan hingga pengambilan data. Data sifat pertumbuhan yang didapat kemudian diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4 dan Mx yang didapat dari penelitian tahap 1.
7
Ternak
Ternak yang digunakan dalam tahap ini sebanyak 45 ayam kampung umur 9 minggu. Ayam kampung ini merupakan koleksi Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak IPB. Bobot rataan sampel ayam kampung yang digunakan adalah 571.32±108.70 g, dengan koefisien keragaman 19.03%.
Pemeliharaan
Seluruh ayam diberi nomor pada bagian sayap. Ayam kampung dikandangkan dalam kandang sistem terbuka yang diberi alas litter dan dilengkapi dengan lampu pemanas 5 watt. Pakan yang diberikan adalah pakan komersial untuk ayam ras pedaging fase starter dan dedak padi dengan rasio 60:40. Pakan komersial yang digunakan adalah produk PT Sinta Prima Feedmill dengan kode BR-21E dengan PK 20%-22%, sedangkan dedak padi yang digunakan didapat dari penggilingan padi di wilayah Bogor. Kandungan nutrisi pakan yang diberikan ditunjukkan pada Tabel 1. Pakan dan air minum diberikan ad libitum. Selama pemeliharaan dilakukan penimbangan bobot badan setiap minggu dan dilakukan perhitungan pertambahan bobot badannya.
Tabel 1 Kandungan nutrisi pakan ayam kampung
Kandungan Gizi Komposisi Nutrisi*
*Hasil analisis Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor (2015)
Analisis Data
8
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Gen TLR4 dan Mx dengan Metode PCR RFLP
Produk PCR yang didapatkan pada penelitian ini untuk gen TLR4 dan Mx masing-masing sepanjang 220 bp dan 299 bp. Gambar 2 menunjukkan hasil visualisasi PCR-RFLP gen TLR4 yang dipotong menggunakan enzim MscI dan gen Mx yang dipotong menggunakan enzim Hpy8I pada gel agarose 2%. Visualisasi PCR-RFLP gen TLR4 exon 2 genotipe AG dan AA menunjukkan adanya satu titik potong pada basa ke 196. Menurut Ulupi et al. (2013), hal tersebut terjadi karena adanya mutasi pada basa ke 196, mutasi diketahui merupakan perubahan basa dari guanin menjadi adenin (GA). Perubahasan basa tersebut menyebabkan perubahan asam amino dari asam glutamat (GAA) menjadi lisin (AAA).
Gambar 2 Visualisasi hasil PCR-RFLP gen TLR4 (a) dan Mx (b). M (marker); 1-3 (DNA ayam kampung)
Visualisasi PCR-RFLP gen Mx exon 13 menunjukkan adanya titik potong pada basa ke 99. Hal ini mengindikasikan adanya mutasi pada titik tersebut. Mutasi diketahui merupakan perubahan basa dari adenin menjadi guanin (AG) (Elfidasari et al. 2013). Perubahan basa tersebut menyebabkan perubahan asam amino asparagin (AAT) menjadi serin (AGT). Keberadaan asam amino asparagin mengindikasikan ayam tersebut resisten terhadap infeksi virus (Ko et al. 2002).
9 Genotipe yang ditemukan pada gen Mx adalah genotipe AA, AG dan GG, dengan 2 alel yaitu alel A dan G. Alel A jika basa tidak terpotong sehingga menampilkan panjang basa sebesar 299 bp, sedangkan alel G jika terpotong pada basa ke 200, sehingga muncul 2 pita pada basa ke 200 dan ke 99. Genotipe AA diidentifikasikan jika tidak ada pemotongan oleh enzim Hpy8I sehingga muncul pita hasil produk PCR dengan panjang 299 bp. Genotipe GG diidentifikasi dengan munculnya basa pada pita ke 200 bp dan ke 99 bp. Genotipe AG ditandai dengan munculnya pita pada basa ke 299, basa ke 200, dan basa ke 99.
Frekuensi Genotipe dan Frekuensi Alel Gen TLR4 dan Mx
Nilai frekuensi genotipe dan alel gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung ditunjukkan pada Tabel 2. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen TLR4 dan gen Mx pada ayam kampung bersifat polimorfik. Nei (1987) menjelaskan bahwa jika sebuah gen memiliki frekuensi alel kurang dari atau sama dengan 0.99 maka gen tersebut bersifat polimorfik. Hal ini menjelaskan bahwa gen TLR4 dan Mx berpotensi masing-masing menjadi kandidat SNP untuk sifat ketahanan terhadap bakteri S. enteritidis dan infeksi virus. Frekuensi genotipe tertinggi pada gen TLR4 adalah genotipe GG sedangkan pada gen Mx adalah genotipe AG. Frekuensi alel tertinggi pada gen TLR4 adalah alel G, sedangkan pada gen Mx adalah alel A.
Tabel 2 Frekuensi genotipe dan alel gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung Gen Genotipe Frekuensi Genotipe Alel Frekuensi Alel
TLR4 GG 0.745 (n=73) G 0.862 dua huruf selanjutnya adalah genotipe yang berasal dari gen Mx.
Tabel 3 Genotipe kombinasi gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung
Genotipe Gen Mx
10
kedua gen tersebut adalah genotipe AAAG dan AAGG. Hal ini berarti tidak ada ayam kampung yang membawa sifat rentan terhadap infeksi S. enteritidis dan virus ND sekaligus.
Tabel 4 Frekeunsi genotipe kombinasi gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung
Genotipe Gen Mx
Derajat Polimorfisme Gen TLR4 dan Mx
Nilai keseimbangan Hardy-Weinberg (HW), heterozigositas pengamatan (Ho), heterozigositas harapan (He) dan Polymorphic Informative Content (PIC) gen TLR4 dan Mx pada ayam kampung ditunjukkan pada Tabel 5. Nilai keseimbangan Hardy-Weinberg gen TLR4 dan Mx menunjukkan nilai chi-kuadrat hitung lebih rendah daripada chi-kuadrat tabel. Hal ini berarti bahwa frekeunsi gen TLR4 dan Mx berada dalam keadaan seimbang pada populasi ayam kampung. Keseimbangan tersebut menunjukkkan bahwa tidak terjadinya seleksi terutama seleksi yang dilakukan terhadap gen TLR4 dan Mx. Menurut Noor (2010), populasi yang besar tidak akan berubah dari satu generasi ke generasi lainnya jika tidak ada seleksi, migrasi, mutasi, dan genetic drift.
Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) gen TLR4 dan Mx ditemukan di bawah 0.5 (50%). Javanmard et al. (2005) menjelaskan bahwa jika ditemukan nilai heterozigositas pada sebuah populasi di bawah 0.5 (50%), maka dapat diindikasikan bahwa nilai keragaman pada populasi tersebut rendah. Hal tersebut juga tidak jauh berbeda dengan nilai yang ditemukan pada nilai heterozigositas harapan (He) gen TLR4 dan Mx. Nilai heterozigositas harapan (He) gen TLR4 dan Mx pada kedua populasi tersebut juga di bawah 0.5.
Tabel 5 Keseimbangan HW, Ho, He, dan PIC genotipe gen TLR4 dan Mx pada
Menurut Hildebrand et al. (1992) nilai Polymorphic Informative Content
11 yang dikoreksi. Hasil menunjukkan bahwa nilai PIC gen Mx lebih tinggi dibandingkan dengan TLR4. Hal ini berarti bahwa nilai keragaman gen Mx lebih tinggi dibandingkan dengan TLR4. Keragaman yang tinggi pada gen Mx menyebabkan gen Mx lebih berpotensi untuk diseleksi dibandingkan dengan gen TLR4.
Pertumbuhan Ayam Kampung Periode Grower
Pakan yang digunakan pada penelitian ini memiliki kandungan energi metabolisme sebesar 2 801 kkal kg-1 dan protein kasar sebesar 17.42%. Komposisi protein tersebut sesuai dengan yang disarankan oleh Leeson dan Summers (2005) yaitu sebesar 16%-18.5%.
Grafik pola pertumbuhan ayam kampung minggu 9 sampai minggu ke-16 ditunjukkan pada Gambar 3. Rataan bobot badan minggu ke-9 adalah 565.18±115.26 g dan rataan bobot badan minggu ke-16 adalah 1084.57±246.93 g sehingga pertambahan bobot badan total dari minggu ke-9 sampai minggu ke-16 adalah 519.39±131.67 g. Rataan bobot badan minggu ke 12 ayam kampung pada penelitian ini sebesar 720.38±158.50 g. Rataan bobot badan minggu ke 12 tersebut serupa dengan yang didapat oleh Sulandari et al. (2007) yang diberikan pakan dengan protein 16%-17% yaitu sebesar 708 g.
Gambar 3 Bobot badan ayam kampung
Asosiasi Gen TLR4 terhadap Sifat Pertumbuhan pada Periode Grower
12
Gambar 4 Bobot badan ayam kampung berdasarkan genotipe gen TLR4. GG, GA, AA.
Hasil yang sama juga didapat dari hasil analisis statistik yang dilakukan. Analisis statistik dilakukan pada geotipe GG dan AG, sedangkan genotipe AA tidak diikutkan pada analisis statistik karena tidak memiliki ulangan (n=1). Hasil uji statistik menunjukkan bahwa seluruh parameter, yaitu parameter bobot badan minggu ke-9 (BB 9), bobot badan minggu ke-12 (BB 12), bobot badan minggu ke-16 (BB 16), pertambahan bobot badan (PBB) total dan PBB mingguan pada genotipe GG dan AG gen TLR4 menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata (P>0.005). Hal ini berarti genotipe GG dan AG gen TLR4 tidak berpengaruh terhadap seluruh parameter sifat pertumbuhan yang diteliti. Menurut Ulupi et al. (2013), ayam kampung dengan semua genotipe gen TLR4 memiliki sifat tahan terhadap bakteri S. enteritidis. Hal tersebut yang menyebabkan sifat pertumbuhan ayam kampung pada genotipe GG dan AG tidak berbeda. Hasil asosiasi keragaman gen TLR4 terhadap sifat pertumbuhan ditampilkan pada Tabel 6. Tabel 6 Pengaruh keragaman gen TLR4 terhadap sifat pertumbuhan ayam BB 16 (g/ekor) 1105.08±35.05 1111.41±69.01 1000.0
* = tidak diikutkan dalam analisis statistik; n= jumlah sampel; PBB = pertambahan bobot badan, BB = bobot badan
Asosiasi Gen Mx terhadap Sifat Pertumbuhan pada Periode Grower
Pola pertumbuhan ayam kampung berdasarkan genotipe gen Mx ditunjukkan pada Gambar 5. Grafik tersebut memperlihatkan bahwa pertumbuhan
13 bobot badan memiliki pola yang hampir sama dari minggu ke-9 sampai minggu ke-16. Genotipe AA terlihat dalam grafik memiliki bobot badan yang lebih rendah dibandingkan dengan genotipe AG dan GG.
Gambar 5 Bobot badan ayam kampung berdasarkan genotipe gen Mx. AA, AG, GG.
Fenomena yang terlihat pada grafik juga sesuai dengan hasil uji statistik yang dilakukan. Hasil asosiasi keragaman gen Mx terhadap sifat pertumbuhan ditampilkan pada Tabel 7.
Tabel 7 Pengaruh keragaman gen Mx terhadap sifat pertumbuhan ayam kampung pada periode grower
Parameter Genotipe
AA (n=11) AG (n=21) GG (n=13) PBB total (g/ekor) 404.66±39.37a 577.19±28.36b 599.09±36.68b PBB mingguan (g minggu-1) 57.81± 5.62a 82.46± 4.05b 79.87± 5.24b BB 9 (g/ekor) 540.50±30.39 585.34±21.89 591.78±28.31 BB 12 (g/ekor) 655.07±40.07a 749.18±28.87ab 776.53±37.33b BB 16 (g/ekor) 945.17±55.86a 1162.53±40.25b 1150.87±52.05b
n = jumlah sampel; PBB = pertambahan bobot badan, BB = bobot badan,
Angka-angka pada baris yang sama diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%
Bobot badan ayam kampung minggu ke-9 berdasarkan gen Mx ditemukan tidak berbeda nyata. Parameter bobot badan minggu ke-12 dan bobot badan minggu ke-16 menunjukkan hasil statistik yang berbeda nyata antara genotipe AA dan GG. Bobot badan ayam kampung minggu ke-12 dan minggu ke-16 genotipe AA lebih rendah dibandingkan dengan ayam kampung bergenotipe GG. PBB total dan PBB mingguan ayam kampung bergenotipe AA pada gen Mx ditemukan berbeda nyata dibandingkan dengan genotipe AG dan GG. Ayam kampung bergenotipe AA memiliki PPB total dan PBB mingguan yang lebih rendah dibandingkan dengan ayam kampung bergenotipe AG dan GG. Menurut Pagala
et al. (2013), ayam yang membawa alel A pada gen Mx memiliki sifat ketahanan yang lebih baik terhadap penyakit viral dibandingkan dengan alel G. Ayam dengan ketahanan yang baik terhadap penyakit viral memiliki bobot badan yang
14
rendah. Hal tersebut dapat disebabkan karena nutrisi yang diserap ayam digunakan untuk ketahanan terhadap penyakit terlebih dahulu, setelah itu digunakan untuk produksi dan reproduksi (Despal et al. 2007).
Asosiasi Kombinasi Gen TLR4 dan Mx terhadap Sifat Pertumbuhan pada Periode Grower
Hasil analisis statistik menunjukkan adanya hubungan antara kombinasi genotipe kedua gen TLR4 dan Mx terhadap PBB total, PBB mingguan, bobot badan minggu ke-9, bobot badan minggu ke-12 dan bobot badan minggu ke-16. Pengaruh kombinasi gen TLR4 dan Mx terhadap sifat pertumbuhan ditunjukkan pada Tabel 8.
Tabel 8 Pengaruh genotipe kombinasi gen TLR4 dan Mx terhadap sifat pertumbuhan ayam kampung pada periode grower
Parameter AAAA * = tidak diikutkan dalam analisis statistik; n = jumlah sampel; PBB = pertambahan bobot badan, BB = bobot badan; Angka-angka pada baris yang sama diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%
Hasil analisis menunjukkan ayam kampung bergenotipe GGAA, yaitu ayam kampung yang tahan terhadap Salmonella sp dan tahan terhadap infeksi virus, memiliki nilai parameter sifat pertumbuhan yang paling rendah (Tabel 8). Hubungan antara kombinasi genotipe gen TLR4 dan Mx terhadap parameter sifat pertumbuhan yang diamati dapat disebabkan oleh pengaruh dari salah satu atau kedua gen tersebut.
4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
15 terhadap Salmonella sp dan infeksi virus memiliki nilai parameter sifat pertumbuhan yang rendah.
Saran
Penelitian asosiasi gen TLR4 dan Mx perlu dilakukan pada jumlah sampel yang lebih banyak. Jenis kelamin juga dapat dibedakan agar dapat diketahui perbedaan pengaruh genotipe gen TLR4 dan Mx terhadap sifat pertumbuhan pada jenis kelamin yang berbeda. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut di lapangan untuk mengetahui kondisi riil peternakan ayam kampung di lapangan.
DAFTAR PUSTAKA
Akira S, Takeda K. 2004. TLR signaling pathways. Nature Reviews Immunology.
4:449-511.
Bostein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. 1980. Construction of genetic linkage map in human using restriction fragmen lenght polymorphisms. Amer. J Hum Genet. 32:314-331.
Despal, Astuti DA, Suci DM, Evvyerni D, Permana IG, Sigit NE, Mutia R, Sumiati, Toharmat T, Hermana W. 2007. Pengantar Ilmu Nutrisi. Bogor (ID): Dept. Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan IPB.
Elfidasari D, Solihin DD, Soejoedono, Murtini S. 2013. Identification of gene resistance to avian influenza virus (Mx gene) among wild waterbirds.
Makara J Sci. 17(1):6-10.
Hartl DL, Clark AG. 1997. Principle of Population Genetic. Sinauer Associates. Sunderland. MA.
Hildebrand CE, Torney DC, Wagner RP. 1992. Informativeness of polymorphic DNA markers. Los Alamos Sci. 20:100-102.
Javanmard A, Asadzadeh N, Banabazi MH, Tavakolian J. 2005. The allele and genotype frequencies of bovine pituitary-specific transcription factor and leptin genes in Iranian cattle and buffalo populations using PCR-RFLP. Iran J Biotechol. 3(2):104-108.
Kaps M, Lamberson WR. 2004. Biostatistics for Animal Science. London (GB): CABI Publishing.
16
Noor RR. 2010. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Pagala MA, Muladno, Sumantri C, Murtini S. 2013. Association of Mx gene genotype with antiviral and production traits in Tolaki chicken. J Poult Sci.
12 (12):735-739.
Sironi L, Ramelli P, Williams JL, Mariani P. 2010. PCR-RFLP Genotyping protocol for chicken Mx gene G/A polymorphism associated with the S631N mutation. Gen and Mol Res. 9(2):1104-1108.
Sulandari S, Zein MSA, Paryanti S, Sartika T, Astuti M, Widjastuti T, Sujana E, Syafril D, Setiawan I, Garnida D. 2007. Sumberdaya genetik ayam lokal Indonesia. Keanekaragaman Sumber Daya Hayati Ayam Lokal Indonesia: Manfaat dan Potensi. Pusat Penelitian Biologi. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Bogor (ID). Hlm 45-104.
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Jakarta pada tanggal 10 Oktober 1990. Penulis merupakan anak pertama dari 2 bersaudara pasangan bapak Sutarno dan ibu Yuli Sukarelawati. Penulis menamatkan pendidikan di SMA Negeri 1 Pamulang (SMA Negeri 3 Kota Tangerang Selatan) pada tahun 2008. Selanjutnya pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) dan terdaftar sebagai mahasiswa Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.
