Konstruksi Peta Genetik Parsial dan Karakterisasi Sintasan Epifitik Muatan Non - Patogenik dari Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines YR32

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(92)

(93)

(94)

(95)

(96)

(97)

(98)

(99)

(100)

(101)

(102)

(103)

(104)

(105)

(106)

(107)

(108)

(109)

(110)

(111)

(112)

(113)

(114)

(115)

(116)

(117)

(118)

(119)

(120)

(121)

(122)

(123)

(124)

(125)

(126)

(127)

(128)

(129)

(130)

(131)

(132)

(133)

(134)

(135)

(136)

(137)

(138)

(139)

(140)

(141)

(142)

(143)

(144)

(145)

(146)

(147)

(148)

(149)

(150)

(151)

(152)

p4-J.

4%

KONSTRUKSI PETA GENETIK PARSIAL

DAN KARAKTERISASI SINTASAN EPlFlTlK MUTAN

NON-PATOGENI K DARl

Xanthomonas axonopodis

(campestris)

pv.

glycines

Y

R32

Oleh

:

YAYA RUKAYADI

PROGRAM PASCASARJANA

INSTlTUT PERTANIAN BOGOR

(153)

ABSTRACT

CONSTRUCTION OF PARTIAL GENETIC MAP AND EPlPHlTlC SURVIVAL OF NON-PATHOGENIC MUTANT OF Xanthomonas

axonopodis (campestris) pv. glycines YR32 YAYA RUKAYADI

S u p e ~ i s e d by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of Advisor), BUD1 TJAHJONO. MAGGY T. SUHARTONO, RNIANY WIDJAJAKUSUMA, and

ED1 GUHARDJA (Coadvlsors)

Pathogenesis of Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) on soybean has not been completely understood. The objective of this work is to construct partial-genetic mapping of Xag genome which will facilitate our understanding on the pathogenicity mechanism. and to construct non-pathogenic isogenic strain as a paradigm for biocontrol agent for the disease.

From this work, we were able to construct a 8.2 kb recombinant plasmid (pYR103) carrying Pacl and Pmel sites and TpR for transposon mutagenesis and gene localization in Xag. The transposable element (2.8 kb) also contains Asel site which will serve as landmark to locate transposon insertion in genomic DNA fragments generated by Asel-schizotyping. We employed transposon to generate non-xanthomonadin mutants (pig), non-pathogenic mutants (pat), protease negative mutants (ptf). auxotroph mutants (aus), and exopolysaccharide negative mutants (xan-). Southern hybridization analysis was performed following complete digestion of mutants using Asel. From the analysis using 2.8 kb-EcoRl fragment as probe, it was revealed that pig, pat, prt, aux, and xan- genes are located within 240-. 185-. 185. 148. and 97-kb Asel fragments respectively. We were also able to localize several unknown function genes marked by transposon insertions.

Using inaZ (pJL1703) as a reporter gene, we were able to demonstrate that the non-pathogenic mutant (M715) could reduce colonization of Xag YR32 wild type on soybean leaf surface. Based on competitive test using de Wit analysis, it was revealed that M715 mutant was non-pathogenic isogenic strain of YR32 which could compete within the same niche ecology with its wild type. Epiphytic fitness analysis performed in the greenhouse indicated that population dynamics of YR32, YR321ce+, and M715 were very similar. M715 mutant was able to survive until 16 days with population density of approximately 10' to 105 cells g*' of leaf wet weight. Our study indicated the M715 mutant strain could be developed for biocontrol

- _{directed against bacterial pustule disease on soybean plant.}

(154)

SUMMARY

YAYA RUKAYADI. Construction of partial genetic map and epiphytic survival

of non-pathogenic mutant of Xanthomonas axonopodis (campestris) pv.

glycines YR32. Supervised by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of

Advisor), BUD1 TJAHJONO. MAGGY T. SUHARTONO, REVIANY

WIDJAJAKUSUMA, and ED1 GUHARDJA (Coadvisors).

Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) is the

causal agent of bacterial pustule disease on soybean plant. The disease

could reduce total soybean production and the problem had not been solved

completely up to the present. To overcome the disease, there were two

approaches to be taken: (1) understanding the pathogenicity mechanism of

the disease, and (2) application of natural biocontrol based on ecological

principles, including interaction between the pathogen and the competitive

bacteria.

Pathogenicity mechanism on Xanthomonas was complicated and

poorly understood among enormous investigation to reveal the causes of the

disease. In this study, we showed that isogenic but non-pathogenic organism

could become a potential competitor for its parental pathogenic strain in a.

limited nutrient and space availability in the same habitats on soybean leaf

surface. One possible hypothesis that we brought into work was that the

perfect competitor for pathogenic organism could be constructed from the

pathogen itself such that it would be no longer pathogenic but still retains its

survival and fitness on soybean leaves. Therefore, we conducted work on

Xag pathogenicity mechanism and construction of non-pathogenic isogenic

strain to overcome bacterial pustule disease on soybean. The objectives of

this study are as follows : (i) To construct partial genetic map of Xag YR32

genome as one approach to understand Xag pathogenicity, and (ii) To

(155)

To achieve those objectives, series of experiment were conducted, which includes :

(1) Screening of transposon suitable for transposon mutagenesis on Xag YR32. This work was performed by either di- or triparental mating using plasmid donor as follows : pUTmini-Tn5KmR, pUTmini-Tn5SpR/SmR, pEP4351 (Tn4351TcR), and pUCD623 (Tn4431TcR).

(2) Construction of plasmid carrying particular transposon carrying restriction sites for two restriction endonucleases: Pacl and Pmel. This recombinant plasmid will be used as donor in transposon mutagenesis on Xag YR32. (3) Prototrophic and phenotypic of a number of mutants generated from

transposon mutagenesis. Minimal medium A (MinA) and M9 was used in prototrophic analysis. Phenotypic characters that were evaluated include :

exopolysaccharide production (mucoid appearance of the colonies). xanthomonadin production, catalase activity, protease production, pathogenicity analysis using cotyledon bioassay, and auxotrophic mutants analysis.

(4) Gene localization and partial genetic mApping of Xag YR32 genome. In this work, a combination of schizotyping and Southern hybridization was performed. Genomic DNA preparation and restriction enzyme digestion were done within agarose matrix and Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) was employed to separate large size DNA fragments. Southern hybridization analysis was performed by transferring of DNA from agarose gel onto nylon membrane (Photogene) using VacuGeneXL (Pharmacia Biotech). Non-radioactive probe was prepared from recovered 2.8 kb- EcoRl DNA fragment (pYRIO3). Probe labelling and hybridization detection were done directly using ECLTM (direct nucleic acid labelling and detection system) (Amersham LIFE SCIENCE).

(156)

plasmid. inaZ gene was used as reporter gene for further analysis. Ice nucleation activity in Xag YR321ce+ was performed using droplet-freezing

assay.

(6) Competition analysis between Xag M715 and Xag YR32 was conducted

in planta on two weeks old soybean plant inside a green house. Competition capability was examined based on the number of frozen

tubes divide by total number of tubes. For de Wit serial replacement

analysis, proportion of the mixture between M715 and YR321ce+ were

formufated as follows : 0:10, 1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1, 10:O. M715 and YR321ce+ were used at concentration around

5

x 10' cell ml-'.

Total concentration of the bacterial mixture was around

lo7

cell

mr'.

Fitness test of

M715

and YR321ce+ was conducted for 16 days after inoculation on 20 weeks old soybean plant. The experiment was

conducted with two different treatments : individual inoculation was 4.5 x

lo5

cell ml-' for each strain, or 1:l for co-inoculation. Total bacterial cell for each strain were counted using plate count method orestimated using

ice nucleation assay.

Our study indicated that transposon mutagenesis using pUTmini-

Tn5KmR in Xag YR32 yielded higher frequency of transconjugants than

transposon mutagenesis using either pUTmini-Tn5SpRiSmR, pUCD623-

Tn4431TcR, or pEP4351 -Tn4351TcR. Therefore pUTmini-Tn5KmR was used

for further work.

We have constructed a 8.2 kb pYR103 derived from of Tn5 pUTmini-

Tn5KmR with the addition of TpR marker and Pacl and Pmel restriction sites.

Frequency of conjugation of pYRIO3 in Xag YR32 was 8,3 x 10" per recipient which was consistently higher than that of other transposons that

(157)

cloning, physical as well as genetic mapping in Xag and related species or pathovars.

A total of 2187 mutant generated from transposon mutagenesis were collected and 1019 of randomly selected mutants had been phenotypically analyzed (47 %) from which a total 523 (23 %) mutants had been analysed by DNA profiling employing Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Among mutants which had been analysed for their genomic DNA profile, as much as 3 % were mutants with observable alteration in their phenotypic appearance while the rest of the mutants (97 %)were cryptic mutants which did not show any observable phenotypic alteration relative to that of the wild type.

Phenotypic mutants generated from this mutagenesis were: xanthomonadin-

(M216)

mutant, exopolysaccharide- (M180) mutant, protease-minus (M415) mutant, auxotroph (MI87 or M33) mutant, and non- pathogenic (M715) mutant. M715 did not show any phenotypic changes, but cotyledon bioassay showed that M715 did not cause yellow chlorotic spot on soybean cotyledon as its wild type. From 523 mutants that have been analyzed, none were catalase- (car). One possible explanation was that catalase might be encoded by more than one gene. Minimal medium A

contains no amino acids, therefore the media could be used for auxotroph analysis in this study.

(158)

been located in Asel-schizotypes which will be useful for construction of Xag YR32 genomic library.

Xag YR32 (pJL1703) carrying inaZ (Xag YR321ce+) constructed in this work was able to express ice nucleation protein with activity of 1-3 ice nuclei for every 10' bacterial cells at -45°C. Xag YR32, YR321ce+, and M715 growth curves indicated that those three strains possess the same growth patterns.

Competition analysis between M715 and YR321ce+ in frozen tube assay demonstrated that M715 population could suppress YR32 population. In line with this result, de Wit analysis indicated that the population of either YR321ce+ or M715 fell around isogenic line while the total population of the competing bacteria was relatively stable. Therefore the mutation in M715 did not reduce its capability to compete with its wild type in planta. The competition apparently was due to the ability of strains to occupy the same ecological niche.

(159)

phyllosphere might be due to the existence of cross-feeding mechanism on

(160)

RINGKASAN

YAYA RUKAYADI. Konstruksi peta genetik parsial dan karakterisasi sintasan epifitik mutan non-patogenik dari Xanthomonas axonopodis (campesfris) pv. glycines YR32. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO (Ketua Komisi Pembimbing), BUD1 TJAHJONO, MAGGY T. SUHARTONO, REVIANY WIDJAJAKUSUMA, dan ED1 GUHARDJA (Anggota Komisi Pembimbing).

Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) merupakan penyebab penyakit bisul bakteri pada kedelai. Penyakit bisul bakteri dapat menurunkan produksi kedelai dan sampai sekarang masih belum tertangani. Untuk mengatasi penyakit dapat dilakukan dengan dua pendekatan yaitu dengan : (1) memahami mekanisme patogenisitas penyakit, dan (2)

penggunaan musuh-musuh alami berdasarkan prinsip-prinsip ekologis termasuk faktor kompetisi antara organisme penyebab penyakit dengan pengendali.

Mekanisme patogenisitas pada Xag sangat kompleks dan belum banyak diteliti sehingga belum banyak dimengeiti dan pengetahuan mengenai bakteri patogen ini di taraf molekuler masih relatif sedikit. Sementara itu beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa bakteri-bakteri non-patogenik yang isogenik dengan bakteri patogennya memiliki potensi untuk saling menyingkirkan pada habitat yang sama, dengan tingkat persaingan yang tinggi. Maka dari itu perlu dilakukan penelitian tentang mekanisme patogenisitas Xag dan konstruksi galur non-patogenik yang isogenik untuk mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai. Penelitian ini bertujuan untuk: (i) Mengkonstruksi peta genetik secara parsial genom Xag

(161)

Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilakukan serangkaian percobaan yang meliputi :

1. Penapisan transposon untuk transposon mutagenesis pada Xag YR32. Tahap ini dilakukan dengan konjugasi dua atau tiga tetua menggunakan pUTmini-Tn5KmR, pUTmini-Tn5SpR/SmR, pEP4351 (Tn4351TcR), dan pUCD623 (Tn4431TcR) sebagai plasmid donor dengan plasrnid penolong pRK2013.

2. Konstruksi plasmid khusus yang membawa transposon terpilih dengan tambahan penanda antibiotika trimetoprim dan dua situs enzirn restriksi (Pacl dan Pmel). Plasmid rekombinan ini digunakan sebagai donor dalam transposon rnutagenesis pada Xag YR32.

3. Analisis prototrofi dan fenotipik terhadap sejumlah mutan hasil transposon mutagenesis. Medium minimal yang digunakan untuk uji prototrofi adalah medium minimal MinA dan M9. Analisis fenotipik mutan meliputi: penampilan eksopolisakarida (mukoiditas pada koloni), produksi pigmen xanthomonadin, aktivitas katalase, produksi protease, analisis patogenisitas dengan bioasai kotiledon, dan analisis auksotrofi.

(162)

5. lntroduksi inaZ ke Xag YR32. Pada tahap ini dilakukan konjugasi tiga tetua dengan pJL1703 (inaZ) sebagai donor dan pRK2013 sebagai penolong. Gen inaZ ini digunakan sebagai gen patapor pada analisis selanjutnya. Aktivitas nukleasi es pada YR321ce+ dilakukan dengan asai tetes beku.

6. Analisis kompetisi antara Xag M715 dengan YR321ce+ dilakukan secara

in

planta pada tanaman kedelai umur dua minggu di rumah kaca. Kemampuan kompetisi diamati berdasarkan persentase jumlah tabung beku dari seluruh jumlah tabung asai. Untuk analisis pergantian serial de Wit, proporsi campuran antara M715 dan YR321ce+ adalah sebagai berikut: 0:1, 1.9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3,8:2, 9:1, dan 10:O. Konsentrasi suspensi bakteri M715 dan YR321ce+ yang digunakan pada analisis pergantian serial de Wit masing-masing lebih kurang 5 x 10' sellmi, sehingga total campuran bakteri adalah lo7 sellml. Analisis kebugaran M715 dan YR321ce+ dilakukan selama 16 hari setelah inokulasi pada tanaman kedelai berumur dua minggu, dengan dua perlakuan yaitu: inokulasi secara terpisah dan ko-inokulasi. Konsentrasi suspensi set yang diinokulasi untuk inokulasi terpisah masing-masing adalah 4.5 x

l o 5

sellml, pada ko-inokulasi perbandingan antara M715 dengan YR321ce+ adalah 1:l. Populasi masing-masing bakteri dihitung dengan penghitungan cawan sebar dan asai nukleasi es.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa transposon mutagenesis dengan pUTmini-Tn5KmR memberikan frekuensi konjugasi rata-rata tertinggi dibandingkan dengan menggunakan pUTmini-Tn5SpR/SmR, pUCD623- Tn4431TcR, dan pEP4351-Tn4351TcR. Sehingga pUTmini-Tn5KmR digunakan untuk penelitian selanjutnya.

(163)

dikonstruksi dari pUTmini-Tn5KmR dengan tambahan penanda antibiotika trirnetoprirn yang mempunyai satu situs pengenal Pacl dan Pmel.

Frekuensi konjugasi pYR103 pada Xag YR32 adalah 8.3 x

lo4

per resipien, frekuensi ini secara konsisten lebih tinggi dibandingkan dengan menggunakan transposon lain pada percobaan yang sarna. Plasmid rekornbinan ini (pYRl03) dapat digunakan sebagai fasilitas untuk mengkonstruksi mutan-mutan khusus untuk keperluan lokalisasi gen, kloning molekuler, konstruksi peta fisik dan genetik pada Xag dan spesies-spesies atau patovar-patovar lain yang berhubungan.

Sebanyak 1019 (47 %) mutan dari total 2187 mutan hasil transposon mutagenesis telah berhasil dianalisis fenotipiknya, dan sebanyak 523 (23 %)

telah berhasil dianalisis DNA genornnya, yang terdiri dari : mutan-mutan dengan perubahan fenotipik yang diamati dalam penelitian ini (3 %) dan mutan-mutan kriptik yang tidak diketahui perubahan fenotipiknya (97 %).

Mutan fenotipik yang diperoleh antara lain : tidak rnernproduksi xantomonadin (M216), tidak mernproduksi eksopolisakarida (M180). tidak memproduksi protease (M415), auksotrof (MI87 atau M33) dan non- patogenik dengan bioasai kotiledon (M715). Meskipun M715 tidak menampilkan kelainan fenotipik, tetapi dengan bioasai kotiledon mutan ini kehilangan sifat patogennya. Hal tersebut terlihat dari tidak terbentuknya bercak kuning klorotik pada kotiledon kedelai, sedangkan rnutan pada gen- gen pig, prt, aux, dan xan tetap bersifat patogen dengan bioasai kotiledon. Dari 523 rnutan yang dianalisis, tidak satupun didapatkan mutan yang tidak mernproduksi katalase (car). Hal ini kernungkinan karena katalase pada Xag disandikan oleh lebih dari satu gen. Medium minimal MinA merupakan medium minimal bagi pertumbuhan Xag sehingga medium ini dapat digunakan untuk analisis auksotrofi.

(164)

memperoleh sisipan transposon pada lokasi yang berbeda. Hal tersebut ditunjukkan oleh adanya dua sinyal yang terletak pada posisi yang berbeda pada skizotipe-Asel krornosom Xag YR32. Data tersebut juga menunjukkan bahwa transkonjugan yang diperoleh pada penelitian ini hampir seluruhnya merupakan mutan hasil transposisi (95%). Gen-gen penyandi xanthomonadin (pig), patogenisitas (pat), protease (prt), auksotrof (aux) dan eksopolisakarida (xan) masing-masing terletak pada potongan 240-, 185, 1 8 5 , 148-, dan 97-kb-Asel pada krornosom Xag. Selain itu juga telah berhasil ditentukan lokasi sejumlah gen lain yang belum diketahui ekspresinya (kriptik), gen-gen ini sangat berguna untuk menyusun pustaka genom Xag.

XagYR32 (pJL1703) yang membawa inaZ (YR321ce+) temyata mampu mengekspresikan inti es dengan nilai aktivitas sebesar 1-3 inti es untuk setiap 10' sei bakteri pada suhu sekitar -4.5'C. Kuwa pertumbuhan YR32, YR321ce+ dan M715 memperlihatkan bahwa pertumbuhan ketiga isolat tersebut memiliki pola perturnbuhan yang sarna.

Analisis kemampuan kompetisi antara M715 dengan YR321ce+ dengan asai tabung beku memperlihatkan bahwa populasi M715 dapat menekan populasi YR32. Berdasarkan analisis pergantian serial de Wit, terlihat bahwa populasi kedua bakteri YR321ce+ dan M715 untuk setiap proporsi selalu terdapat disekitar garis isogenik dan jumlah total bakterinya relatif tetap. Ini rnenunjukkan bahwa mutasi pada M715 tidak menurunkan kemampuannya dalam berkompetisi atau kemungkinan penernpatannya pada relung ekologi yang sama.

(165)

dinamika yang sama dengan inokulasi terpisah, akan tetapi populasi

YR321ce+ secara keseluruhan menjadi berkurang. Hasil ini menunjukkan

bahwa M715 dapat menekan pertambahan populasi YR321ce+. Hal ini

diperjelas dengan melihat perbedaan (rasio) populasi antara YR321ce+

dengan M715. Perbedaan populasi hasil inokulasi terpisah lebih besar

dibandingkan dengan perbedaan populasi hasil ko-inokulasi, bahkan pada

hari ke-2, 3 dan 5 populasi M715 lebih besar dibandingkan populasi

YR321ce+. Meskipun secara keseluruhan populasi M715 lebih rendah

dibandingkan populasi YR321ce+, akan tetapi M715 mampu berkompetisi

dengan YR321ce+. Kemungkinan isolat M715 dapat mempertahankan hidup

karena isolat tersebut mempunyai sintasan yang relatif sama dengan tipe

liarnya di lingkungan filosfer. Kemungkinan lain karena adanya cross-feeding

mechanisms pada suatu faktor tumbuh tertentu antara M715 dengan tipe

(166)

KONSTRUKSI PETA GENETIK PARSIAL

DAN KARAKTERISASI SINTASAN EPlFlTlK MUTAN

NON-PATOGENI

K

DARl

Xanthomonas axonopodis

(campestris)

pv.

glycines Y

R32

Oleh :

YAYA RUKAYADI

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktor

dalam bidang Biologi (Mikrobiologi)

pada

Program Pascasarjana, lnstitut Pertanian Bogor

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(167)

J u d u l Konstruksi Peta Genetik Parsial dan Karakterisasi Sintasan Epifitik Mutan Non- Patogenik dari Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines YR32

Nama Mahasiswa : Yaya Rukayadi

Nomor Pokok : 95.576lBIOLOGI-MIKROBlOLOGl

Menyetujui

1. Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Antonius Suwanto, MSc. (Ketua)

-

iakusuma.MSc. Prof.Dr.lr. Edi Guhardia.MSc.

(Anggota) (Anggota)

~ r o f . ~ r . & v i a n v Widiaiakusuma.M ida Manuwoto,M.Sc.

(168)

RIWAYAT HlDUP

Penulis dilahirkan di Bumi Parahyangan Surnedang pada tanggal 17

Agustus 1964 dari pasangan Bapak Enco Suarma serta Ibu Enoh Menoh

sebagai anak bungsu dari delapan bersaudara.

Sekolah Dasar, Sekolah Menengah Pertarna, dan Sekolah Menengah

Atas diselesaikan pada tahun 1983 di Situraja, Surnedang, Jawa Barat. Pada

tahun 1983 penulis diterirna di Proyek Perintis I Departemen Farmasi lnstitut

Teknologi Bandung dan pada tahun berikutnya penulis rnelalui Sipenmaru di

terima di Jurusan Pendidikan Biologi FPMlPA IKlP Bandung. Tahun 1990

penulis lulus sebagai Sarjana Pendidikan Biologi.

Pada tahun 1991 penulis diterima sebagai staf pengajar Jurusan

Pendidikan Biologi FPMlPA IKlP Negeri Medan. Setahun kemudian penulis

melanjutkan Program Magister Sains pada Program Studi Biologi Sub

Program Studi Mikrobiologi Program Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor

dan lulus pada tahun 1995. Pada tahun itu juga atas dorongan dan saran

dari

Dr.

Ir. Antonius Suwanto, M.Sc., penulis mendapat kesernpatan untuk

rnelanjutkan pendidikan Program Doktor pada Program Studi dan Sub

(169)

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdullilah hirobbil a'lamin atas rahmat dan karunia-Nya penulis

dapat menyeiesaikan laporan penelitian ini dalam bentuk disertasi yang

berjudul "Konstruksi Peta Genetik Parsial dan Karakterisasi Sintasan

Epifitik Mutan Non-Patogenik dari Xanthomonas axonopodis

(campestris) pv. glycines YR32".

Penelitian ini terselesaikan atas bimbingan luar biasa dari

Dr.

Ir.

Antonius Suwanto, MSc. Untuk itu, dengan rasa rendah hati penulis

haturkan terima kasih dan penghargaan yang tak terhingga. Beliau telah

membimbing dengan luar biasa dari mulai penulis mengikuti Program

Magister Sains sampai terselesaikannya Program Doktor ini. Rasa hormat

dan kagurn penulis rasakan selarna beliau membimbing di dalam

laboratorium rnaupun di luar, beliau telah memberikan suri tauladan seorang

ilmuwan dan sejumlah kesempatan yang tak terhingga baik berupa diskusi

yang menarik, mengikuti dan memimpin suatu kursus dalam bidang biologi

molekuler, peminjaman buku-buku dan referensi yang diperlukan,

kesempatan rnenjadi asisten pada berbagai mata ajaran (Biologi Molekuler,

Genetika Mikroba, Rekayasa Genetika, dan Biologi Molekuler Keragaman

Bakteri) serta dana SPP pada waktu tahun pertarna penulis mengikuti

program doktor. Semoga Tuhan membalasnya yang setimpal. Amin.

Pada kesempatan ini juga perkenankan penulis menyampaikan

(170)

1. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, selaku anggota komisi pembimbing

yang sekaligus sebagai Kepala Lab. Mikrobiologi dan Biokimia PAU

Bioteknologi IPB tempat penulis melakukan penelitian atas bimbingan dan

kepercaan yang diberikan kepada penulis menjadi asisten pada mata ajaran

Biokimia Mikroba sejak tahun 1993. Beliau dengan sikap ilmuwan dan kasih

sayang yang tinggi telah berhasil menciptakan suasana ilmiah dan

kekeluargaan di laboratorium sehingga penulis merasa nyaman dan betah

untuk menyelesaikan penelitian.

2. Dr. Ir. Budi Tjahjono, M.Agr., selaku anggota komisi pembimbing dan Ketua Proyek Hibah Tim II atas segala birnbingan dan biaya penelitian

yang telah beliau berikan. Serta atas kesempatan mengikuti kegiatan

Overseas Visiting ke UC. Berkeley. USA.

3. Prof. Dr. drh. Reviany Widjajakusuma, M.Sc., selaku anggota komisi dan ketua program studi Biologi, atas bimbingan dan arahan selama

penulis rnenyelesaikan studi baik pada waktu S2 maupun S3. Selain itu

beliau telah memberikan contoh serta filosofi seorang ilmuwan yang baik.

4. Prof. Dr. Ir. Edi Guhardja, M.Sc., selaku anggota komisi atas segala bimbingan dan arahan yang sebesar-besarnya, terutama untuk

perbaikan yang sangat teliti akan penulisan disertasi ini.

5. Dr. Ir. Meity S. Sinaga, M.Sc dan Dr. M. Machmud, M.Sc., selaku dosen penguji di luar komisi atas saran untuk kesempurnaan penulisan

disertasi ini dan atas diskusi yang menarik selama penulis melakukan

(171)

6. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, atas dana Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dan Project University Research for Graduate Education (URGE)/ Proyek Hibah Tim II, yang diberikan selama penulis menyelesaikan studi.

7. Dr. Ir. Muhammad Yusuf dan Dr. Ir. A. Aziz Darwis, selaku mantan dan Direktur PAU Bioteknologi IPB atas izin dan penggunaan fasilitas selama penulis melaksanakan penelitian.

8. Prof. Steve E. Lindow, Ph.D., atas penggunaan gen inaZ

(pJL1703), fasilitas, bimbingan, arahan, dan segala bantuan lainnya selama penulis melakukan Overseas Visiting di Depattment of Plant and Microbial Biology University of California, Berkeley., USA.

9. Maria Brandl, Ph.D., atas segala bantuan selama penulis melakukan Overseas Visiting, tetutama atas arahan eksperimen mengenai

analisis kebugaran.

10. Jean-Michel Monier, Mavis Hansond Chong, Ph.D., dan Lai-

Mun Gong, atas bantuan selama penulis melakukan Overseas Visiting, diskusi melalui e-mail, kiriman journal atau paper aktual dan sejumlah referensi lain yang sangat membantu penulis menyelesaikan penulisan disertasi ini.

(172)

12. Moch. Firly Nurochman, SSi. dan Yogiara, SSi. (atas bantuannya pada waktu penyemprotan, sampling, dan penimbangan daun kedelai). Rudy Widjaya, STp. (atas bantuannya pada waktu pembuatan slide), Ir. Benny Tanudjaja (atas bantuannya pada waktu penggunaan program komputer SAS version 6.12), Ir. B. Junaidi Lee, Ir. Ricky Widjaja, M.Si, segenap rekan dan sejumlah teknisi di Lab. Mikrobiologi dan Biokimia khususnya dan PAU Bioteknologi IPB umumnya, atas motivasi,

bantuan tenaga dan pikiran, persaudaraan, persahabatan, dan kebersarnaan serta diskusi ilrniah yang menarik selama penulis melakukan penelitian.

13. Dr. Ir. Alex Hartana,M.Sc., atas izin pernakaian Rumah Kaca untuk pengujian in planta dan atas penggunaan alat blotting dan fiksasi membran.

14. Dr. Ir. Soni Suharsono, atas kelonggaran penggunaan E C L ~ ~

(direct nucleic acid labelling and detection system).

15. Dr. Dra. Anya Meryandini, M.Si., atas persahabatan dan motivasi yang diberikan.

16. Kedua orang tua penuiis (Bapak Enco dan Ma Enoh), Kakak- Kakak (Kang Enas, Kang Dede, Ceu Eruk, Ceu Wiwi, Ceu Cucu, Ceu

Yoyoh, serta Yuyu), segenap kakak ipar dan keponakan. Atas do'a, dorongan mental dan spiritual

,

kasih sayang yang telah, sedang dan akan diberikan pada penulis selamanya.

(173)

KATA PENGANTAR

Salah satu sumber protein nabati yang paling banyak dikonsumsi

masyarakat Indonesia adalah kedelai (Glycine max (L.) Merr), akan tetapi

produksi kedelai nasional masih belum mencukupi kebutuhan. Hal ini

disebabkan salah satunya karena adanya penyakit bisul bakteri pada kedelai

yang disebabkan oleh Xanthornonas axonopodis (campestris) pv. glycines

atau Xag. Akhir-akhir ini untuk mengatasi penyakit tanaman banyak

dilakukan dengan dua macam pendekatan yaitu : (i) memahami mekanisme

patogenisitas Xag, dan (ii) penggunaan agens biokontrol.

Tulisan ini berisi serangkaian hasil penelitian dengan penggunaan

pendekatan teknik-teknik molekuler, yang terdiri dari: (i) lokalisasi gen dan

pemetaan parsial gen-gen yang mungkin terlibat dalam mekanisme

patogenisitas Xag, dan (ii) konstruksi dan karakterisasi galur non-patogenik

yang isogenik dari Xag untuk agens biokontrol penyakit bisul bakteri pada

kedelai. Hasil yang menarik dari penelitian ini yaitu telah berhasilnya

dikonstruksi satu galur non-patogenik yang isogenik (M715) dengan tipe

liamya (Xag YR32). sehingga sudah hampir pasti dapat menempati relung

ekologi dan mampu berkompetisi pada sumber nutrisi yang sama. Galur

M715 non-patogenik yang isogenik ini mempunyai potensi sebagai agens

(174)

Hasil penelitian ini diharapkan dapat mernberikan informasi dan suatu

model pendekatan dalam mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai

khususnya dan penyakit tanaman pada urnumnya. Amin.

Bogor, Desember 1998

Yaya Rukayadi

(175)

DAFTAR

IS1

Halaman

KATA PENGANTAR

...

xxii

...

DAFTAR IS1 xxiv

...

DAFTAR TABEL xxvii

...

DAFTAR GAMBAR xxviii

...

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang

...

1 Tujuan Penelitian

...

6 TINJAUAN PUSTAKA

...

7

Biologi Molekuler Xanthomonas axonopodis (campestris)

pv

.

glycines

...

7

Studi Patogenisitas Molekuler Xanthomonas axonopodis

(campestris)

...

9 Mutagenesis Transposon

...

12

Tn5

...

13 Tn4431

...

15 Tn4351

...

15

Pemetaan Fisik dan Genetik DNA Genom

...

16 Biokontrol Penyakit Tanaman

...

19

...

Konstruksi Galur Non-Patogenik yang Isogenik 21

...

Mutagenesis terarah 21

Mutagenesis transposon

...

22 Gen inaZ Sebagai Gen Pelapor

...

24

...

(176)

Media dan Kondisi Perturnbuhan

...

Bahan dan Alat

Teknik Molekuler dan Mutagenesis Transposon

...

Penyiapan Kotiledon dan Tanaman Kedelai

Metodologi

...

Penapisan Transposon untuk Mutagenesis Transposon

Konstruksi Plasmid untuk Transposon Mutagenesis pada

.

...

X

.

axonopodis (campestris) pv glycines YR32

Mutagenesis Transposon Xag YR32 dengan pUTmini-

Tn5KmR-TpR (pYR103)

...

Uji Prototrofi dan Analisis Fenotipik Mutan

...

Lokalisasi Gen dan Pemetaan Genetika Parsial

A

.

Schizotyping

...

Penyiapan suspensi bakteri

...

Penyiapan DNA genom utuh Pernotongan DNA genom utuh

...

dengan enzim restriksi

Elektroforesis dengan PFGE

...

Visualisasi DNA

...

B

.

Analisis hibridisasi Southern

...

Proses blotting

...

Petabelan pelacak dan deteksi hibridisasi

lnstroduksi Gen Penyandi Nukleasi Es (inaZ)

ke dalam Xag YR32

...

Analisis Ekspresi Nukleasi es pada Xag YR32 (pJL1703)

Analisis Kompetisi

...

Karakterisasi galur bakteri yang berkompetisi (Xag YR32. YR321ce+. dan M715)

...

Asai tabung beku

...

Analisis pergantian serial de Wit

...

(177)

...

Analisis Kebugaran 45

Analisis Data

...

46

...

HASlL DAN PEMBAHASAN

...

Penapisan Transposon untuk Konstruksi Plasmid

Konstruksi Plasmid untuk Mutagenesis Transposon pada

X

.

axonopodis (campestris) pv

.

glycines YR32

...

Mutagenesis Transposon X axonopodis (campestris)

...

pv

.

glycines YR32 dengan pYR103

Uji Prototrofi dan Analisis Mutan

...

Lokalisasi Gen dan Pemetaan genetik Secara Parsial Genom

...

X

.

axonopodis (campestris) pv

.

glycines YR32

Karakterisasi Galur Non-patogenik yang isogenik dari Xag YR32

.

lntrodulsi inaZ pada Xag YR32

...

Karakterisasi galur bakteri yang berkompetisi: Xag YR32

.

YR321ce+. dan M715

...

Analisis kompetisi

...

Analisis pergantian serial de Wit

...

Analisis Kebugaran M715

...

KESIMPULAN DAN SARAN

(178)

DAFTAR TABEL

Nomor Tabel Teks Halaman

1. Galur bakteri, plasmid dan transposon

...

26

2. Frekuensi konjugasi hasil mutagenesis transposon pada Xag YR32 dengan transposon mini-Tn5KmR,

mini-Tn5SpR/SmR, Tn4431TcR, dan Tn4351TcR

...

..

....

...

47 3. Frekuensi konjugasi pYR103 pada X. axonopodis (campestris) pv.

glycines Y R32..

. .

.

. .

.

. . .

.

. . .

. . . .

. .

. . .

58

4. Penarnpilan fenotipik mutan-mutan Xag YR32 hasil rnutagenesis transposon

...

61

5. Hasil pengujian patogenesitas dengan bioasai kotiledon

...

68

6.

Hasil analisis aktivitas nukleasi es pada Xag YR321ce+

dengan asai tetes beku

...

78 7. Hasil analisis kompetisi bakteri M715 dan YR321ce+ dengan

asai tabung beku pada suhu 4.5"C

...

83

(179)

DAFTAR GAMBAR

3r Garnbar Teks Halarnan

Bagan alur penelitian

...

31 lnokulasi bakteri pada permukaan daun dengan

penyemprotan (A), dan tanaman kedelai setelah inokulasi (B)

...

43

Konstruksi plasmid pYR103 (pUTrnini-Tn5KrnR-TpR).

...

49 Hasil verifikasi plasmid (pNEB193-TpR): A. Plasmid pNEB193

dipotong dengan Smal (I), 1 kb DNA Ladder (2), dan dipotong dengan Asp7181 + Notl (3) B. Plasrnid pYR101 (pNEB193-Tp) intact (utuh) (1) dipotong dengan Kpnl

+

Pmel (3), 1 kb Ladder (4).

dan dipotong dengan Kpnl + Hindlll (5)

...

51 Hasil verifikasi plasrnid pYR102 (p~~18-Notl-TpR ): A. Plasmid

pYR101 yang dipotong dengan Kpnl

+

Hindll (I), 1 kb DNA Ladder (2). dan plasmid pUC18-Notl yang dipotong dengan Kpnl +

Hindll (3). B. Hasil pemotongan plasmid pYR102

(pUC18-Notl-TpR) dengan Pacl (I), Pmel (2). Pacl-Notl (3). 1 kb DNA ladder (4). Pmel + Notl(5), dan plasmid pYR102

utuh (6)

...

52 Hasil pernotongan pUTmini-Tn5KmR dan PYR102 dengan Notl:

A. Hasil pemotongan plasmid pUTmini-Tn5KrnR dengan Notl (1 dan 2). 1 kb DNA Ladder (3) B. plasrnid pYR102 utuh (1) 1 kb DNA ladder (2), dan hasil pernotongan pYR102 dengan

Notl (3)

...

53 Hasil verifikasi sejurnlah transforman pYR103: A. Plasrnid

transforman utuh (1-1 I), dan 1 kb DNA Ladder (12). B. Plasrnid transforman yang dipotong dengan EcoRl (I), (2), (3). (5), (6), (8).

(9). (1 1 ), (12), Pacl + Pmel (4), (lo), dan 1 kb DNA Ladder (7)

...

54 Hasil verifikasi plasrnid pYR103: A. Plasmid pYR103 yang

dipotong dengan EcoRl (I),

(2),

Pacl + EcoRl (3), Pmel +

EcoRl(4), dan 1 kb DNA Ladder (5). B. 1 kb DNA Ladder (I), plasmid pYR103 utuh (2), plasmid pYR?03 yang dipotong

(180)

9. Hasil pengujian pototrof Xag YR32 tipe liar : medium agar-

...

agar M9 (A), dan (b) medium agar-agar MinA (B) 6 1

10. Hasil pengujian katalasem adanya aktivitas katalase diperlihatkan dengan produksi gelembung (gas

0,)

pada koloni yang ditetesi 3% H,O,: tipe liar (I), M715 (2), dan sejurnlah rnutan (yang tidak

...

diberi nomor) 63

11. Uji proteolitik, adanya aktivitas protease ditandai dengan terbentuknya area bening disekitar koloni pada media LA

yang ditarnbah dengan 2% susu skim: tipe liar (I), mutan prt (2). dan M715 (3)

...

64

12. Penarnpilan koloni: tipe liar Xag YR32 (I), mutan pig atau atau

xanthomonadin (2). mutan pat (3), dan rnutan xan (3)

...

66 13. Hasil asai patogenisitas dengan bioasai kotiledon: galur

non-patogenik tidak menirnbulkan area kuning klorotik disekitar luka pada kotiledon kedelai (A.l), galur patogenik rnenimbulkan area kuning klorotik di sekitar luka pada kotiledon (A.2).

Xcc sebagai kontrol negatif (B.1). Xag YR32 sebagai kontrol positif (8.5). rnutan aux (M33) (B.2), mutan pig- (M216) (8.3). mutan prt- (M415) (8.4). mutan xan- (M 180) (B.6), mutan pat-

(M715) (B.7), dan YR321ce+ (Xag YR32 inaZ) (8.8). Umur kotiledon 7 hari, inkubasi 28-30°C selama 7 hari,

dan umur biakan bakteri 48 jam pada media agar-agar YDC.

...

67

14. Skizotipe-Asel sejurnlah mutan pada kondisi : 1% agar, waktu pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam, tegangan 5.0 volffcrn (25-33 mA), dan ternperatur

penyangga 14OC (A). Hasil analisis hibridisasi Southern

menggunakan pelacak 2.8 kb-EcoRI pYR103

...

71 15. Skizotipe-Asel M715 pada kondisi : 1% agar, waktu

pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam, tegangan 5.0 volffcrn (25-33 mA), dan temperatur penyangga

14OC (A). Hasil analisis hibridisasi Southern menggunakan

pelacak 2.8 kb-EcoRI pYR103 (B).

...

73 16. A. Skizotipe-Asel mutan: aux (I), prt- (2). xan- (3). pig- (4). dan

dan pat- (5) pada kondisi : 1 % agar, waktu pulsa ramping

(181)

B. Hasil analisis hibridisasi Southern menggunakan pelacak

...

2.8 kb-EcoRI pYR103 74

...

Lokalisasi gen pada skizotipe-Asel Xag YR32 75

...

Peta genetik parsial skizotipe-Asel Xag YR32 76

Analisis aktivitas nukleasi es dengan asai tetes beku, tetesan

...

yang membeku menunjukkan adanya aktivitas nukleasi es 77

Penampilan koloni: YR32 (1). YR321ce+ (2). dan M715 (3).

...

79 A. Skizotipe-Asel YR32 (2). YR321ce+ (3). dan M715 (4);

B. Skizotipe-Spel YR32 (2), YR321ce+ (3). dan M715 (4) pada kondisi : 1% agar, waktu pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam, tegangan 5.0 voltlcm (25-33 mA),

dan temperatur penyangga 14'C. Penanda ukuran molekul DNA: kromosom Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 yang dipotong

...

dengan Asel (A.1, B.l ).. 79

Kuwa pertumbuhan Xag YR32, YR321ce+, dan M715 pada

media LB dengan suhu inkubasi 2830% pada goyangan 200 rpm dan diukur pada OD

,,

...

80

Asai nukleasi es dengan asai tabung beku: YR32lce+(kontrol+) yang memiliki aktivitas nukleasi es (isi tabung yang membeku dan berwarna putih) dibandingkan dengan YR32 tipe liar (kontrol -) (A), dan hasil asai dengan dua puluh tabung reaksi masing-

masing berisi daun kedelai di dalam 10 ml penyangga fosfat

(10 mM; pH 7.0) (B)

...

82

Analisis pergantian serial de Wit antara X. axonopodis (campestris) pv. glycines YR321ce+ dan M715, garis diagonal (...) merupakan

...

garis isogenik. 85

Dinamika populasi YR321ce+ dan M715 pada daun kedelai dengan inokulasi secara terpisah (individu), konsentrasi sel bakteri yang

...

diinokulasikan masing-masing 4.5 x

lo5

sellml 86 Dinamika populasi YR321ce+ dan M715 pada daun kedelai secara KO-inokulasi dengan perbandingan antara YR321ce+ dengan M715 adalah 1 : 1. Konsentrasi total populasi bakteri yang diinokulasikan

(182)

27

.

Dinamika perbedaan populasi (rasio populasi) antara YR321ce+ dan M715 yang diinokulasikan secara terpisah dan ko-inokulasi dengan perbandingan 1 : 1

...

88

28

.

Dinamika populasi YR32 : dengan inokulasi terpisah (a) dan

...

dengan ko-inokulasi

(b)

89

29

.

Dinamika populasi M715 : dengan inokulasi terpisah (a) dan

dengan koinokulasi (b)

...

91

(183)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kedelai (Glycine max (L.) Merr) merupakan salah satu sumber protein

nabati yang paling banyak dikonsumsi masyarakat Indonesia. Produksi

kedelai nasional sampai saat ini masih belum mencukupi kebutuhan. Data

Direktorat Bina Program Tanaman Pangan dan Hortikultura (TPH),

memperlihatkan bahwa produksi kedelai pada tahun 1998 diperkirakan

1.875.558 ton, sernentara kebutuhan pada tahun yang sama mencapai

2.361.497 ton. Sehingga terdapat kesenjangan antara produksi dan

kebutuhan sekitar 500.000 ton (Adnyana, 1998). Kesenjangan itu dapat

ditutupi dengan mengirnpor kedelai dari luar negeri, tetapi sekarang harga

kedelai impor sangat tinggi akibat depresiasi rupiah terhadap dolar. Harga

kedelai impor yang lebih tinggi dibandingkan harga kedelai lokal, ha1 ini

merupakan peluang bagi petani untuk meningkatkan produksi dan kualitas

kedelai lokal. Tetapi dalam usaha meningkatkan produksi dan kualitas

kedelai lokal seringkali serangan harna dan penyakit menjadi kendala.

Salah satu penyakit kedelai di lndonesia yang belum tertangani adalah

penyakit bisul bakteri (bacterial pustule) yang disebabkan oleh Xanthomonas

campestris pv. glycines (Moffet dan Croft, 1983). Penyakit bisul bakteri ini

(184)

tersebar di Pulau Jawa, Larnpung, Sulawesi Selatan (Machmud. 1987). dan

di Kalimantan Selatan (Aini, 1993). Berdasarkan analisis hibridisasi DNA-

DNA bakteri ini lebih dekat hubungannya dengan X. axonopodis sehingga

Vauterin et a/. (1995) mengusulkan narnanya menjadi X. axonopodis pv.

glycines.

Akhir-akhir ini, untuk rnengatasi suatu penyakit dapat dilakukan

dengan dua pendekatan yaitu dengan memahami mekanisme patogenisitas

penyakit itu, dan penggunaan musuh-musuh alami (agens biokontrol)

berdasarkan prinsip-prinsip ekologis terrnasuk faktor kompetisi antara

organisme penyebab penyakit dengan pengendali. Maka dari itu, untuk

mengatasi penyakit bisul bakteri diperlukan suatu telaah untuk memahami

faktor-faktor yang terlibat dalam mekanisme patogenisitas dan penggunaan

agens biokontrol.

Studi fisiologis yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi faktor-

faktor yang terlibat dalam mekanisme patogenisitas X. axonopodis

(campestris) pv. glycines (Xag) banyak memberikan hasil yang meragukan

atau menemui jalan buntu. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme

patogenisitas sangat kompleks sehingga muncul pertanyaan-pertanyaan,

antara lain : Apakah enzim ekstraseluler patogen m e ~ p a k a n ha1 yang

terpenting dalam proses patogenisitas? Berapa banyaknya gen yang terlibat

dalam proses patogenisitas? Serta bagaimana hubungan antara faktor-faktor

(185)

lsolasi dan karakterisasi gen-gen yang terlibat dalam proses

patogenisitas merupakan tahap awal guna memahami mekanisme

patogenisitas bakteri tersebut. Meskipun demikian tahap ini dalam waktu

relatif singkat sudah cukup banyak memberikan informasi yang dapat

menunjang untuk memahami mekanisme patogenisitas suatu penyakit

(Gerhold dan Stacey, 1990). Oleh karena itu data yang rinci mengenai

genetika molekuler Xag, termasuk organisasi genom, peta fisik dan genetik

genomnya merupakan ha1 yang sangat penting untuk mengungkapkan

mekanisme biologis dalam ha1 ini mekanisme patogenisitas penyakit.

Sampai saat ini belum tersedia informasi mengenai struktur genom

maupun peta fisik dan genetik dari Xag yang memadai, bahkan sejauh

pengetahuan penulis peta fisik dan genetik bakteri tersebut belum ada selain

peta fisik dan genetik yang dikonstruksi oleh Widjaja (1996). Padahal,

informasi mengenai struktur genom merupakan suatu kerangka kerja yang

berguna untuk penelitian patogenisitas. Seiring dengan penelitian yang

sedang dilakukan untuk mengidentifikasi faktor-faktor yang berperan dalam

mekanisme patogenisitas, struktur genom dapat menyediakan informasi

mengenai peta fisik kromosom, peta fisik plasmid, serta lokasi relatif dari

masing-masing gen yang diperkirakan berperan pada proses patogenisitas

Xag pada tanaman inangnya.

Untuk menunjang pemetaan fisik yang beresolusi tinggi, perlu

(186)

memotong total genom bakteri itu lebih sering, seperti Asel dan Spel (Rosana

et a/., 1995; Rukayadi, 1995; Wahidin, 1996; Widjaja, 1996). Fragmen-

fragmen yang dihasilkan oleh pernotongan enzim yang memotong lebih

sering berukuran relatif lebih kecil sehingga memudahkan dalam

penanganan maupun untuk pekerjaan sub-kloning fragmen restriksi tersebut.

Selain itu. peta fisik juga memerlukan lebih banyak penanda-penanda

genetik yang spesifik untuk rnelengkapi peta genetiknya. Hal ini dapat

dilakukan antara lain dengan menghasilkan mutan-mutan auksotrof, mutan

yang kehilangan sifat proteolitiknya (protease negatif), xantornonadin negatif,

katalase negatif, dan lain-lain dengan cara rnutagenesis transposon dan

kemudian menentukan lokasinya pada peta fisik dengan analisis hibridisasi

Southern menggunakan transposon yang bersangkutan sebagai pelacaknya

(probe).

Di lain pihak, penelitian agens biokontrol untuk mengatasi penyakit

bisul bakteri pada kedelai belum banyak dilakukan. Penelitian yang selama

ini telah dilakukan menunjukkan bahwa Pseudomonas fluorescen 829

merupakan agens biokontrol yang potensial untuk mengatasi penyakit bisul

bakteri pada kedelai (Mariani. 1995; Suwanto et a/., 1996; Manuella et a/.

.

1997; Nawangsih et a/., 1997; Suwanto dan Tjahjono, 1998). Sekarang

banyak dikembangkan penggunaan galur non-patogenik yang isogenik untuk

menekan perkembangan populasi patogen (Hirano et a/., 1997; Brandl dan

(187)

hidup pada relung ekologi yang sama dengan tipe liarnya sehingga kompetisi

antara organisme penyebab penyakit dengan pengendali dapat ditingkatkan.

Lindow (1987) melaporkan bahwa faktor kornpetisi antar mikroorganisme

memegang peranan penting dalam pengendalian hayati bakteri filosfer,

sehingga bakteri-bakteri yang isogenik memiliki potensi untuk saling

rnenyingkirkan pada habitat yang sarna, dengan tingkat persaingan yang

tinggi. Mengingat penggunaan agens biokontrol mensyaratkan prinsip-prinsip

ekologis termasuk faktor kompetisi maka perlu dikonstruksi galur non-

patogenik yang isogenik dengan tipe liarnya.

Lindow (1990) juga rnelaporkan bahwa Pseudomonas syringae yang

defisien dalarn kernarnpuan rnernbentuk kristal es telah memberikan bukti

langsung bahwa kornpetisi pada sumber daya lingkungan yang terbatas

merupakan penentu koeksistensi bakteri-bakteri pada permukaan daun.

Galur non-patogenik yang isogenik dari P. syringae pv. tomato dan P.

syringae pv. syringae telah dilaporkan mampu rnereduksi terjadinya infeksi

pada tomat dan penyakit bintik coklat pada buncis (Cooksey, 1988; Lindow et

a/.,

1987). Untuk itu konstruksi galur non-patogenik yang isogenik dengan bantuan teknik biologi molekuler perlu dipelajari kemungkinannya untuk

(188)

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk: (i) melakukan konstruksi peta genetik

parsial genom Xag YR32, dan (ii) mengkonstruksi galur non-patogenik yang

isogenik dari Xag YR32. Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilakukan

serangkaian percobaan yang meliputi: (1) skrining transposon untuk

transposon mutagenesis pada Xag YR32, (2) mengkonstruksi plasmid

rekombinan (plasmid khusus) yang membawa transposon terpilih untuk

transposon mutagenesis pada Xag YR32, (3) uji prototrofi serta analisis

fenotipik dan genetik terhadap sejumlah mutan hasil mutagenesis

transposon, (4) lokalisasi gen dan pemetaan gen menggunakan kombinasi

antara schizotyping (Suwanto dan Kaplan. 1992a) dengan hibridisasi

Southern menggunakan pelacak 2.8 kb-EcoRI dari plasmid khusus, (5)

introduksi gen inaZ sebagai gen pelapor pada Xag YR32. (6) analisis

kompetisi in planta antara Xag YR321ce+ dengan galur non-patogenik yang

isogenik (M715) menggunakan asai tabung beku, dan (7) analisis kebugaran

dengan cara inokulasi terpisah dan ko-inokulasi antara galur non-patogenik

(189)

TINJAUAN PUSTAKA

Biologi Molekuler Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines X. campesfris pv. glycines merupakan bakteri penyebab penyakit bisul

baMeri pada tanaman kedelai (Moffet dan Croft, 1983). Sinonimnya adatah X.

campesfris pv. phaseoli (Semangun, 1991). Selain itu, menurut Bradbury

(1986) sinonim lainnya adalah Pseudomonas glycines Nakano 1919,

Bacterium glycines (Nakano) Elliot 1930, Phytomonas phaseoli (Nakano)

Magrou in Haudoroy, Bacterium phaseoli var. sojensis Hedges 1922,

Phytomonas phaseoli var. sojensis (Hedges) Burkholder 1930, Pseudomonas

phaseoli var. sojensis (Hedges) Stapp 1928, dan Xanthomonas phaseoli

var. sojensis (Hedges) Starr dan Burkholder 1942. Berdasarkan hornologi

DNA-DNA X. campestris pv. glycines diusulkan narnanya menjadi X.

axonopodis pv. glycines (Vauterin et a/., 1995)

Sel X. axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) berukuran (0.5

-

0.9

x 1.4

-

2.3) pm, berbentuk batang, mempunyai satu flagelum polar, dan bersifat Gram-negatif. Pada medium Beef Infusion Agar koloninya berwarna

kuning pucat dan semakin lama akan menjadi kuning tua, berukuran kecil.

dan sirkuler dengan tepian yang halus. Bakteri ini dapat mencairkan gelatin,

menghasilkan asam dari sukrosa dan sangat cepat menghidrolisis pati,

menghasilkan auksin, bakteriosin, dan eksopolisakarida dalam kultur (

(190)

maka bakteri ini bersifat oksidatif, tidak ferrnentatif dan aerobik obfigat

(Briyant et a/., 1979). Sedangkan Lelliott dan Stead (1987) mendeskripsikan

sifat-sifat patovar-patovar X. campestris sebagai berikut: Gram-negatif, reaksi

oksidase negatif, katalase positif, pertumbuhan terharnbat oleh 0.02

-

0.1%

TZC (triphenyl tetrazolium chloride), koloni betwarna kuning madu pada

medium kentang, dan rnelakukan respirasi aerobik.

Temperatur optimum pertumbuhan bakteri ini adalah 30-33OC,

temperatur maksimum 38OC dan minimum 10°C. Dengan demikian bakteri ini

sangat sesuai untuk berkembang di daerah beriklim panas yang berbeda

dengan lingkungan hidup

P.

syringae pv. glycines bakteri penyebab hawar

daun kedelai, yang mempunyai temperatur optimum pada kisaran 24

-

26OC

(Kennedy dan Tachibana. 1973).

Struktur genom Xag terdiri dari kromosom dan dilaporkan beberapa

spesies Xanthomonas mengandung plasmid-plasmid yang bersifat kriptik

(Kado, 1992). Sedangkan Rosana et a/. (1995) melaporkan bahwa Xag Bra mempunyai satu kromosom sirkuler dan diduga memiliki plasmid

endogenous. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian yang dilaporkan Widjaja

(1996) bahwa Xag YR32 mempunyai satu kromosom sirkuler dengan ukuran

sekitar 5020 kilo pasangan basa (kb) dan Sharma et al. (1994) melaporkan

bahwa pada Xag yang diisolasi dari pertanaman kedelai di Maharashtra India

memiliki dua buah plasmid kriptik masing-masing yang kecil berukuran 1.5

(191)

Genom X. campesfris mengandung mol % (G+C) DNA-nya berkisar

antara 63

-

71 (Tm) (Bradbury, 1984). Kandungan mol % (G + C) DNA genom sangat penting untuk pemilihan enzim restriksi yang akan digunakan

untuk memotong DNA genom tersebut. Rosana et a/. (1995) melaporkan

untuk memotong jarang DNA genom X. campestris sebaiknya digunakan

Asel dan Spel. X. campestris pv. campestris dengan X. campestiis pv.

glycines yang menampilkan fenotipik sama telah dapat dibedakan dengan

jelas dengan analisis DNA genom utuh menggunakan Pulsed-Field Gel

Electrophoresis (PFGE) (Rosana et a/., 1995). Teknik PFGE dan ribotyping

bahkan mampu membedakan galur-galur X. campestris di dalam satu patovar

(pv. glycines) (Rukayadi. 1995; Wahidin. 1996).

Studi Patogenisitas Molekuler Xanthomonas axonopodis (campestris)

Berbagai penelitian telah dilakukan untuk rnengetahui patogenisitas

bakteri X. axonopodis (campestris), namun masih banyak informasi yang

dibutuhkan untuk menerangkan mekanismenya. Menurut Sigee (1993),

kemampuan bakteri untuk menimbulkan suatu penyakit pada tanaman

inangnya tergantung pada banyak aspek diantaranya aspek lingkungan,

perkernbangan dan fisiologis inang dan patogen, serta ekspresi dari faktor

patogenisitas bakteri tersebut. Akan tetapi, banyak studi fisiologis untuk

mengidentifikasi faktor-faktor yang terlibat dalam penyakit yang disebabkan

oleh patovar-patovar X. axonopodis (campestris) pada umumnya masih

(192)

Analisis genetika molekuler telah menunjukkan bahwa gen-gen yang bertanggung jawab untuk proses patogenisitas terletak di dalam kromosom, walaupun ada bukti bahwa beberapa spesies Xanthomonas mengandung plasmid-plasmid yang bersifat kriptik (Kado, 1992; Sharma et a/., 1994). Kebanyakan penelitian yang mendalam tentang genetika molekuler

mekanisme patogenisitas X. axonopodis (campestris) (dalam ha1 ini pv. campestris) dilakukan di laboratorium Daniels (Barre're et a/., 1986; Daniels

et a/., 1983, 1984, 1988; Dow et a/., 1987, 1989, 1990, 1995; Gough et a/., 1988; Osborn et a/., 1990; Rosato et a/., 1994; Tang et a/., 1987, 1991; Turner et a/., 1985; Wilson et a/., 1998). Dari studi tersebut antara lain mereka telah mengisolasi sekitar 10-kb kurnpulan gen-gen yang terlibat dalam proses patogenisitas, dan telah diidentifikasi bahwa gen-gen patogen di dalam potongan DNA tersebut mungkin terlibat dalam proses sekresi protein, yaitu dengan mengontrol translokasi protein melewati membran luar sel. Sedangkan Hu et a/. (1992) dan Chen et a/. (1996) telah berhasil mengisolasi dan mengkarakterisasi gen xpsD yang terlibat dalam proses sekresi enzim ekstraselular melewati membran luar sel mutan X. axonopodis

(campestris) pv. campestris non-patogenik. Selain itu, telah diisolasi dan dikarakterisasi gen-gen yang terlibat dalam mekanisme patogenisitas X.

(193)

1990). Meskipun demikian mekanisme patogenisitas Xag penyebab penyakit

bisul pada kedelai belum banyak diteliti. Fett et a/. (1987) melaporkan

kemungkinan adanya peranan auksin dalam pembentukan penyakit bisul

bakteri, namun nampaknya tidak mungkin kalau hormon tersebut memainkan

peranan penting dalam pengembangan penyakit ini. Sebab, meskipun Xag

menghasilkan asam indol asetat (IAA) dari triptofan, tetapi galur yang

patogenik maupun non-patogenik juga memproduksi hormon tersebut secara

in vitm (Fett et a/., 1987).

Hwang et a/. (199213) telah berhasil mengidentifikasi dan

mengkarakterisasi potongan DNA yang terdiri dari gen-gen yang terlibat