ABSTRACT
THE STABILITY INCREASE OF LIPASE FROM THE Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
WITH IMMOBILIZATION USING BENTONITE
By NOPIANI
The aim of this research is to increase the stability of lipase from Pseudomonas aeruginosa ATCC 27583 using immobilization method with bentonite. Several procedures were performed to achieve the aim, which were optimum growth condition, production, isolation, purification, immobilization and characterization of the purified enzyme before and after immobilization. Lipase enzyme activity was determined by Titrimetic method. Protein content was determined by Lowry method. The results showed that the optimum condition of P. aeruginosa ATCC 27583 to produce the lipase with the highest activity was at pH 7, temperature 35°C and incubation time for 48 hour. The specific activity of purified lipase was 520.000 U/mg, an increase of 9.2 times compared to that of the crude extract which has 56.491 U/mg. The characteristics of purified lipase were optimum temperature of 35°C; KM 86.177 mg/mL-1substrate; Vmax 35.714 μmol/mL-1min-1; ki = 0.023 min-1, t1/2 = 30.130 minutes, and ΔGi = 95.669 kJ mol-1. The characteristics of the immobillized lipase were optimum temperature of 35°C; KM-1 4.742 mg/mL-1 substrate; Vmax 4.854 μmol/mL-1 min-1 , ki = 0.018 min-1, t1/2 = 38.500 minutes, and ΔGi = 96.296 kJ mol-1. Immobilization using bentonite was able to increase the stability of lipase.
ABSTRAK
PENINGKATAN KESTABILAN ENZIM LIPASE DARI Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
DENGAN AMOBILISASI MENGGUNAKAN BENTONIT
Oleh NOPIANI
Pada penelitian ini telah dilakukan amobilisasi enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 menggunakan bentonit untuk meningkatkan kestabilan enzim. Tahapan prosedur yang dilakukan pada penelitian ini meliputi : kondisi pertumbuhan optimum, produksi, isolasi, pemurnian, amobilisasi dan karakterisasi enzim lipase hasil pemurnian sebelum dan sesudah amobilisasi. Aktivitas enzim lipase ditentukan dengan metode Titrimetri. Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry. Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimum pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 menghasilkan enzim lipase dengan aktivitas tertinggi pada pH 7, temperatur 35°C dan waktu inkubasi selama 48 jam. Aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian sebesar 520,000 U/mg, meningkat kemurniannya 9,2 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim lipase dengan aktivitas spesifik sebesar 56,491 U/mg. Enzim lipase hasil pemurnian mempunyai suhu amobilisasi enzim lipase menggunakan matriks bentonit dapat meningkatkan kestabilan enzim dibandingkan dengan enzim tanpa amobilisasi.
PENINGKATAN KESTABILAN ENZIM LIPASE DARI Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
DENGAN AMOBILISASI MENGGUNAKAN BENTONIT
Oleh NOPIANI
TESIS
Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Sains
Pada
Program Pascasarjana Magister Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Lampung
PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
PENINGKATAN KESTABILAN ENZIM LIPASE DARI Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
DENGAN AMOBILISASI MENGGUNAKAN BENTONIT
(Tesis)
Oleh NOPIANI
PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Teori “Lock and Key” dan “Induced Fit”... 7
2. Diagram Lineweaver-Burk ... 14
3. Gram strain sel Pseudomonas aeruginosa ... 17
4. Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dengan dialisis... 27
5. Reaksi hidrolisis triasilgliserol oleh lipase... 29
6. Struktur Montmorillonit / Bentonit... 36
7. Tipe Bentonit : non swelling dan swelling... 37
8. Skema proses pengendapan protein enzim dengan pengendapan Ammonium sulfat ... 46
9. Diagram alir penelitian... 51
10. Hubungan antara aktivitas enzim dengan suhu fermentasi……….. 52
11. Hubungan antara aktivitas enzim dengan pH fermentasi……….. 53
12. Hubungan antara aktivitas enzim dengan waktu inkubasi………. 54
13. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat (0-20 %; (20-40)%; (40-60)%; (60-80)%; dan (80-100)%.dengan aktivitas enzim Lipase... 58
14. Hubungan antara tingkat kejenuhan amonium sulfat pada fraksi (0-20)% dan (20-90)% dengan aktivitas spesifik enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ... ... 59
16. Suhu optimum enzim lipase hasil pemurnian dan hasil amobilisasi .... 65 17. Grafik Lineweaver-Burk Enzim hasil pemurnian... . 68
18. Grafik Lineweaver-Burk Enzim hasil amobilisasi... 69
19. Hubungan antara stabilitas termal enzim hasil pemurnian dan hasi
Amobilisasi pada suhu 35°C pH 8 ... 70 20. Grafik Ln(Ei/E0) enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi untuk
DAFTAR ISI
D. Pseudomonas aeruginosa... 16
E. Enzim lipase ... 19
F. Isolasi dan pemurnian enzim ... 22
G. Pengujian aktivitas enzim lipase ... 28
H. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry... 29
I. Amobilisasi Enzim... .. 31
J. Bentonit... ... 35
III. METODE PENELITIAN ... 40
A. Waktu dan Tempat Penelitian ... 40
B. Alat dan Bahan ... 40
C. ProsedurPenelitian ... 41
1. Pembuatan media dan Larutan pereaksi... 41
2. Penentuan kondisi optimum pertumbuhan bakteri Pseudomonas eruginosa ATCC 27853 ... 43
3. Produksi enzim lipase ... 43
4. Isolasi Enzim lipase ... 43
5. Uji aktivitas enzim lipase metode titrimetri ... 44
6. Penentuan kadar protein enzim lipase metode Lowry ... 45
8. Amobilisasi enzim lipase menggunakan bentonit ... 47
9. Karakterisasi enzim lipase sebelum dan sesudah amobilisasi . 49 a. Penentuan suhu optimum ... 49
b. Penentuan data kinetika enzim (nilai KM dan Vmaks) ... 49
c. Uji stabilitas termal enzim lipase ... 49
d. Penentuan waktu paruh, konstanta laju inaktivasi dan perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) ... 50
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 52
A. Penentuan kondisi optimum ... 52
B. Produksi dan isolasi enzim lipase ... 55
C. Pemurnian enzim lipase ... 56
1. Fraksinasi dengan Ammonium sulfat... .... 57
2. Dialisis ... 59
D. Amobilisasi enzim lipase menggunakan bentonit ... 62
E. Karakterisasi enzim lipase sebelum dan sesudah amobilisasi ... 65
SIMPULAN DAN SARAN ... 73
A. Simpulan ... 73
B. Saran ... 74
DAFTAR PUSTAKA ... 75
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Data penentuan suhu optimum……… 83
2. Data penentuan pH optimum……….. 83 3. Data penentuan waktu inkubasi optimum……… 83 4. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat
(0-20 %; (20-40)%; (40-60)%; (60-80)%; dan (80-100)%.
dengan aktivitas enzim lipase ... 84 5. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat pada fraksi (0-20)%
dan (20-90)%... 84 6. Hubungan antara suhu dengan aktivitas unit dan aktivitas sisa
enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi ... 84 7. Hubungan antara aktivitas Unit enzim lipase pada beberapa pH
Pengikatan untuk amobilisasi ... 85 8. Hubungan antara pengulangan enzim lipase dengan aktivitas Unit
dan aktivitas sisa pada suhu 35ºC pH 8,0 ... 85 9. Data penentuan KM dan Vmaks enzim lipase berdasarkan persamaan
Lineweaver-Burk ... 85 10. Hubungan antara aktivitas sisa enzim hasil pemurnian dan hasil
amobilisasi selama inaktivasi termal pada suhu 35ºC ... 86 11. Perhitungan ∆Gi enzim hasil pemurnian ... 86 12. Perhitungan ∆Gi enzim hasil amobilisasi ... 87 13. Absorbansi serum albumin sapi (BSA) pada berbagai konsentrasi
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Aktivitas enzim lipase pada beberapa kondisi fermentasi………. 56
2. Pemurnian enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ... 60
3. Nilai konstanta laju inaktivasi termal (nilai ki), waktu paruh (t1/2), dan perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi ... 71
4. Data penentuan suhu optimum……… 83
5. Data penentuan pH optimum……….. 83
6. Data penentuan waktu inkubasi optimum……… 83
7. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat (0-20 %; (20-40)%; (40-60)%; (60-80)%; dan (80-100)%. dengan aktivitas enzim lipase ... 84
8. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat pada fraksi (0-20)% dan (20-90)%... 84
9. Hubungan antara suhu dengan aktivitas unit dan aktivitas sisa enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi ... 84
10. Hubungan antara aktivitas Unit enzim lipase pada beberapa pH Pengikatan untuk amobilisasi ... 85
11. Hubungan antara pengulangan enzim lipase dengan aktivitas Unit dan aktivitas sisa pada suhu 35ºC pH 8,0 ... 85
12. Data penentuan KM dan Vmaks enzim lipase berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk ... 85
13. Hubungan antara aktivitas sisa enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi selama inaktivasi termal pada suhu 35ºC ... 86
MOTO
“
Our parents are the
greatest gift in a life”
Learn from the mistakes in the past, try by using a different way,
and always hope for a successful future
The more you give, the more you wil get
“ Every action has a reaction, every act has a consequence
and every kindness has kind reward”
When You Feel Down Because You Didnt Get What You Want... Just sit down, take a deep breath....
And say “ SubhanaAllah” !!!’’
Dengan Menyebut Nama Allah Yang Maha Pengasih Lagi Maha Penyayang
Kupersembahkan karya ini kepada:
Allah s.w.t
Rosulullah S.A.W beserta keluarganya
Junjunganku, suri tauladanku, yang kunantikan syafa’atnya di hari Yaumil kelak, Amin Ya Robal Alamin.
Kedua orang tua ku,
Ayah dan Ibu tercinta merupakan jembatan kesuksesan yang mengantarkan penulis hingga sampai tahap ini. Terimakasih kepada Ayah yang selalu memberikan motivasi, sabar dan bekerja keras untuk kebahagiaan anak-anaknya. Terimakasih kepada Ibu yang selalu memberikan kasih sayang dan bimbingan disetiap langkahku, Ayah dan Ibu kalianlah sumber kebahagiaan dan kesuksesan, sehingga penulis bisa menyelesaikan karya ini dengan baik, dan
karya ini penulis persembahkan kepada Ayah dan Ibu tercinta.
Suami dan Anak-anakku,
Terimakasih kepada suamiku Gatot Sumali, Anak - anakku M. Farhan Sumali dan Adinda Farhani Sumali, yang telah memberikan semangat motivasi dan pengertiannya selama penulis menyelesaikan perkuliahan, oleh karena itu penulis
persembahkan karya ini kepada suami dan anak-anak ku yang tersayang.
Saudaraku:
Adik-adik ku tersayang ( Deni & Mike, Leli & Nano, Erni & Warno, Erna ) yang selalu memberikan keceriaan disaat penulis merasa jenuh, terimakasih untuk
saudara-saudaraku.
Dosen- dosen yang selalu membagi ilmunya untuk penulis Seluruh sahabat yang selalu berbagi rasa suka duka selama perkuliahan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Teluk Betung Bandar Lampung pada tanggal 26 November 1977, sebagai anak sulung dari lima bersaudara putri dari Bapak Muhammad Asyik dan Ibu Ensi Warni.
Jenjang Pendidikan Sekolah Dasar (SD) di SDN 2 Sukaraja Teluk Betung diselesaikan pada tahun 1990, SMP Negeri 1 Teluk Betung diselesaikan pada tahun 1993, Sekolah Menengah Analis Kesehatan Poltekes Tanjung Karang diselesaikan pada tahun 1996, D3 Analis Kesehatan Poltekes Tanjung Karang tahun 2001 – 2004, S1 Kesehatan Masyarakat UMITRA Lampung pada tahun 2009 - 2011, dan pada tahun 2013 terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Unila.
SANWACANA
Assalammualaikum Wr.Wb.
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, karena berkat rahmat, ridho, dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan Tesis ini. Shalawat dan Salam tidak lupa penulis panjatkan kepada Rosullullah Nabi Muhammad SAW sebagai suri tauladan yang dinantikan syafa’at nya.
Tesis dengan judul “ Peningkatan Kestabilan Enzim Lipase Dari Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 Dengan Amobilisasi Menggunakan Bentonit”
merupakan syarat untuk mencapai gelar Magister Sains pada Program Pascasarjana Magister Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada:
menyelesaikan tesis ini.
3. Bapak Dr. Eng.Suripto Dwi Yuwono, selaku Ketua Jurusan dan Pembahas yang telah banyak memberikan petunjuk, arahan, saran, kritik dan nasehat dalam menyelesaikan tesis ini.
4. Bapak Prof.Suharso, Ph.D. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
5. Bapak Mulyono,Ph.D. selaku Sekretaris Jurusan dan Dosen yang selalu sabar dalam menyampaikan ilmu pengetahuan kepada penulis.
6. Pak Hardoko, Pak Andi, Pak Wasinton, Bu Rina, Bu Tati, dan segenap dosen yang telah mendidik dan memberikan ilmu pengetahuan kepada penulis. 7. Pak Gani, Mba Nora, Mas Nomo dan seluruh staf jurusan Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
8. Ayah dan Ibu tercinta yang telah memberikan doa untuk keberhasilan penulis dalam menyelesaikan tesisi ini.
9. Suami dan anak-anak ku tersayang yang telah sabar dan penuh perhatian kepada penulis.
10.Saudara dan keluarga besarku yang telah memberikan dukungan dan doa. 11.Teman-teman seperjuangan kak Nung, kak Syam, Wiria, Nanik, Naris, Kak
Sigit, dan Iwan yang selalu berbagi suka dan duka selama perkuliahan.
dan pengertiannya selama penulis menyelesaikan perkuliahan.
14.Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah memberikan motivasi moril dan materil kepada penulis.
Bandar Lampung, 17 November 2015
Penulis
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Riset biokimia dan bioteknologi selama bertahun-tahun telah meningkatkan pemanfaatan enzim untuk industri. Banyak teknologi baru dikembangkan untuk memodifikasi enzim agar lebih stabil, lebih murah dan memperluas ruang lingkup aplikasinya. Saat ini enzim sebagai biokatalis telah banyak diaplikasikan secara komersial untuk proses-proses industri, antara lain dalam industri pangan, medis, kimia dan farmasi (August, 2000).
Harga lipase di pasaran internasional pada tahun 2007 adalah 30 juta rupiah per kg (Putranto, 2009). Pada tahun 2010, Sigma Aldrich memasarkan enzim lipase amobil yang diamobilisasi menggunakan immobead 150 dari jamur
Rhizomucor miehei dengan aktivitas enzim sebesar 381 U/g dengan harga ± 2,7
juta per 10 gram (± 270 juta per kg). Secara luas lipase banyak tersebar di alam, yaitu pada hewan (mamalia), tumbuhan dan mikroorganisme (Damaso, 2008). Pseudomonas aeruginosa merupakan mikroorganisme penghasil enzim lipase.
Enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa merupakan enzim ekstraselular yang relatif lebih mudah diisolasi dan diproduksi karena lebih stabil dibandingkan enzim intraselular.
Produksi enzim lipase akan meningkat jika ada induser yang sesuai dalam medium. Tanpa induser enzim lipase tetap diproduksi, tetapi dalam jumlah yang kecil (Pratiwi dkk., 2013). Penggunaan enzim lipase terlarut dalam reaksi enzimatis memiliki kelemahan dan sangat tidak ekonomis, dibandingkan dengan enzim lipase yang tidak terlarut (lipase amobil). Enzim dalam bentuk terlarut relatif tidak stabil dan tidak dapat digunakan secara berulang. Kelemahan tersebut dapat diatasi melalui metode amobilisasi untuk meningkatkan kestabilan enzim.
Enzim amobil adalah suatu enzim yang baik secara fisik maupun kimia tidak dapat bebas bergerak karena enzim tertahan dalam struktur molekul matrik pendukung. Amobilisasi mencegah difusi enzim ke dalam campuran reaksi dan mempermudah memperoleh kembali enzim tersebut dari aliran produk dengan teknik pemisahan padat-cair yang sederhana, sehingga enzim tersebut
Metode amobilisasi secara adsorpsi menggunakan matrik pendukung merupakan metode yang lebih mudah dan murah. Pemilihan bentonit sebagai matrik
pendukung pada proses amobilisasi dikarenakan kemampuan adsorpsi permukaan dan intramolekul yang baik, mempunyai struktur berlapis dengan kemampuan mengembang (swelling) dan memiliki kation-kation yang dapat ditukarkan atau sebagai penukar ion. Bentonit merupakan adsorben yang mempunyai sifat dapat mengadsorpsi karena ukuran partikel sangat kecil dan memiliki kapasitas
permukaan ion yang tinggi (Yusnimar dkk., 2012). Matrik pendukung bentonit mudah diperoleh, tidak beracun dan harganya murah.
Beberapa peneliti sebelumnya telah melakukan amobilisasi dengan menggunakan berbagai matrik pendukung untuk meningkatkan kestabilan enzim lipase.
Amobilisasi enzim lipase menggunakan polimer polistirena EP 400 (Murray et al., 1997). Enzim imobil ini digunakan untuk menghidrolisis minyak bunga matahari. Enzim tetap stabil setelah penggunaan berulang. Amobilisasi menggunakan sepharosa dan resin (Dosanjh and Kaur, 2002). Enzim lipase imobil ini dapat digunakan untuk sintesis ester. Penggunaan kitin yang menghasilkan tiga kali pemakaian berulang untuk menghidrolisis minyak zaitun (Wulan dkk., 2008). Amobilisasi menggunakan matriks sodium alginat, agarose dan polyacrylamide mampu digunakan tujuh kali pemakaian berulang (Deepali et al., 2013).
amobilisasi dilakukan menggunakan bentonit yang diaktivasi secara kimia dengan mencampurkan lautan asam. Aktivitas enzim lipase sebelum dan sesudah
amobilisasi diuji dengan metode titrimetri (Pereira et al., 2001) dan kadar protein ditentukan menggunakan metode Lowry ((Lowry et al., 1951).
B. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1. Memperoleh enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa dengan aktivitas dan tingkat kemurnian yang tinggi.
2. Meningkatkan kestabilitas enzim lipase
3. Memperoleh enzim lipase yang dapat digunakan secara berulang.
C. Manfaat Penelitian
Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi manfaat sebagai berikut: 1. Memberikan informasi tentang karakterisasi enzim lipase hasil pemurnian
dan enzim lipase hasil amobilisasi.
2. Memberikan informasi tentang pengaruh amobilisasi menggunakan bentonit terhadap stabilitas enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. ENZIM
Enzim merupakan biokatalisator yang sangat efektif yang akan meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik secara nyata, dimana reaksi ini tanpa enzim akan berlangsung lambat (Lehninger, 1995). Sifat-sifat istimewa enzim adalah
kapasitas katalitik dan spesifisitasnya yang sangat tinggi. Selain itu enzim mempunyai peran dalam transformasi berbagai jenis energi (Winarno, 1986). Enzim disusun oleh untaian asam amino yang panjang dan antar asam amino dihubungkan dengan ikatan peptida (Judoamidjojo dkk., 1992). Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk mempercepat proses biokimia yang terjadi didalam sel maupun di luar sel (Poedjiadi, 1994). Kelebihan enzim sebagai katalis dibandingkan dengan katalis sintetik lainnya antara lain: (1) enzim
mempunyai spesifitas tinggi, (2) enzim bekerja secara spesifik, (3) tidak terbentuk produk samping yang tidak diinginkan, (4) mempunyai produktivitas yang tinggi, (5) produk akhir umumnya tidak terkontaminasi sehingga mengurangi biaya purifikasi dan mengurangi efek kerusakan terhadap lingkungan (Chaplin, 2004).
dihasilkan di dalam sel yaitu pada bagian membran sitoplasma dan melakukan metabolisme di dalam sel. Eksoenzim (enzim ekstraseluler) merupakan enzim yang dihasilkan sel kemudian dikeluarkan melalui dinding sel sehingga terdapat bebas dalam media yang mengelilingi sel dan bereaksi memecah bahan organik tanpa tergantung pada sel yang melepaskannya (Soedigdo, 1988)
Berdasarkan biosintesisnya, enzim dibedakan menjadi enzim konstitutif dan enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim induktif adalah enzim yang ada dalam jumlah sel yang tidak tetap, tergantung pada adanya induser. Enzim induktif ini jumlahnya akan bertambah sampai beberapa ribu kali bahkan lebih apabila dalam medium mengandung substrat yang menginduksi, terutama bila substrat penginduksi merupakan satu-satunya sumber karbon (Kurnia, 2010).
1. Mekanisme reaksi enzim
Menurut Shahib (2005) ada dua teori yang mendukung dalam penjelasan pembentukan kompleks enzim substrat, teori pertama yang diajukan oleh Fisher yaitu teori Kunci dan Gembok / “Lock and Key” yang menjelaskan bahwa adanya kespesifikan enzim terhadap substrat tertentu yang bentuknya sesuai dengan sisi aktif enzim. Teori kedua adalah teori yang diajukan oleh Koshland yaitu teori “ Induced Fit” yang menjelaskan bahwa substrat akan menginduksi suatu perubahan bentuk sisi aktif enzim sehingga dapat dengan mudah berikatan seperti pada Gambar 1.
Gambar 1. Teori“Lock and Key” dan “Induced Fit” (Shahib, 2005)
2. Penggolongan Enzim
Penamaan dan klasifikasi enzim secara sistematik, telah dikemukakan oleh suatu badan internasional yaitu CEIUB ( Commission on enzymes of the International Union of Biochemistry). Dalam sistem ini enzim dibagi
Klasifikasi enzim secara internasional meliputi: nama golongan dan macam reaksi yang dikatalisisnya (Wirahadikusumah, 1989). Menurut Poedjadi (1994), enzim yang dibagi kedalam enam golongan tersebut digolongkan berdasarkan pada jenis reaksi yang dikatalisis, keenam golongan enzim tersebut yaitu :
a. Oksido-reduktase
Enzim yang berperan dalam reaksi oksidasi-reduksi. Enzim yang termasuk dalam golongan ini ada dua yaitu dehidrogenase dan oksidase. Contoh enzim dehidrogenase yaitu : alkohol dehidrogenase dan glutamat dehidrogenase. Contoh enzim oksidase yaitu : glukosa oksidase dan glisin oksidase
b. Transferase
Enzim yang berperan dalam reaksi pemindahan gugus tertentu. Contoh enzim yang termasuk golongan ini adalah metiltransferase,
hidroksimetiltransferase dan aminotransferase. c. Hidrolase
Enzim yang berperan dalam reaksi hidrolisis. Ada tiga jenis enzim hidrolase, yaitu jenis yang memecah ikatan ester, memecah glikosida, dan yang memecah ikatan peptida. Contoh enzim hidrolase yaitu esterase, lipase, amilase, aminopeptidase, karboksipeptidase, pepsin, tripsin, dan kimotripsin.
d. Liase
atau sebaliknya. Contoh enzim golongan ini yaitu: dekarboksilase, aldolase, dan hidratase.
e. Isomerase
Enzim yang termasuk dalam golongan ini bekerja pada reaksi perubahan intramolekular misalnya reaksi perubahan glukosa menjadi fruktosa. Contoh : ribulosafosfat epimerase, dan glukosafosfat isomerase. f. Ligase
Enzim yang berperan pada reaksi penggabungan dua molekul, oleh karenanya enzim-enzim tersebut juga dinamakan sintetase. Ikatan yang terbentuk adalah ikatan C-O, C-S, C-N, atau C-C. Contoh: glutamin dan piruvat karboksilase.
3. Faktor yang mempengaruhi aktivitas Enzim a. Temperatur
Suhu inkubasi sangat mempengaruhi kerja dari enzim, suhu inkubasi yang lebih tinggi dari suhu optimum kerja enzim dapat menyebabkan
terjadinya perubahan konformasi sisi aktif enzim yang disebabkan adanya denaturasi protein enzim (Arbianto, 1989). Sebagian besar enzim
b. pH (Derajat Keasaman)
pH (Derajat Keasaman) enzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang berarti enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus terminal amino. Perubahan kereaktifan enzim diperkirakan merupakan akibat dari perubahan pH lingkungan (Winarno, 1989). Perubahan pH dapat mempengaruhi asam amino kunci pada sisi aktif, sehingga menghalangi sisi aktif enzim membentuk kompleks dengan substratnya (Page, 1989).
c. Konsentarasi Enzim
Kecepatan laju reaksi enzimatik berhubungan langsung antara konsentrasi enzim dengan substrat (Orten and Neuhaus, 1970). Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju reaksi enzimatik, laju reaksi meningkat dengan bertambahnya konsentrasi enzim (Poedjiadi, 1994). d. Konsentrasi substrat
Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga tercapai suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan reaksi (Lehninger, 1982).
e. Aktivator dan inhibitor
enzimatis. Komponen kimia yang membentuk enzim disebut juga
kofaktor. Kofaktor tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti Zn, Fe, Ca, Mn, Cu, Mg atau dapat pula sebagai molekul organik kompleks yang disebut koenzim (Martoharsono dan Soeharsono, 1997).
Menurut Wirahadikusumah (2001) inhibitor merupakan suatu zat kimia tertentu yang dapat menghambat aktivitas enzim. Pada umumnya cara kerja inhibitor adalah dengan menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim tidak dapat berikatan dengan substrat dan fungsi katalitik enzim tersebut akan terganggu (Winarno, 1989).
B. Kinetika reaksi enzimatik
Parameter dalam kinetika reaksi enzim adalah konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks). Mekanisme reaksi enzimatik untuk sebuah subtrat tunggal. Enzim (E) mengikat substrat (S) dan menghasilkan produk (P).
Kinetika enzim menginvestigasi bagaimana enzim mengikat substrat dengan
mengubahnya menjadi produk. (Shahib, 2005).
Salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi substrat. Konsentrasi substrat ini dapat divariasikan untuk mempelajari mekanisme suatu reaksi enzim, yakni bagaimana tahap-tahap terjadinya pengikatan substrat oleh enzim maupun pelepasan produknya (Suhartono, 1989).
Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan, yang dinyatakan sebagai KM yang bermanfaat dalam menyatakan hubungan yang tepat di antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. Nilai KM didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai kecepatan setengah kecepatan maksimum. Nilai KM merupakan unsur kunci di dalam persamaan Michaelis-Menten dan bersifat khas bagi setiap enzim dengan menggunakan substrat tertentu yang spesifik pada kondisi pH dan temperatur tertentu (Kurnia, 2010).
Persamaan Michaelis-Menten secara matematika dinyatakan dalam persamaan berikut ini :
Vo = kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S] Vmaks = kecepatan maksimum
Km = tetapanMichaelis-Menten enzim bagi substrat tertentu
Persamaan tersebut merupakan persamaan kecepatan bagi suatu reaksi enzimatik satu substrat, merupakan suatu pernyataan mengenai hubungan kuantitatif di antara kecepatan reaksi awal (V0), kecepatan maksimum (Vmaks) dan konsentrasi substrat awal yang dihubungkan melalui tetapan Michaelis-Menten (Km)
Persamaan yang diturunkan oleh Michaelis dan Menten, berawal dari hipotesis dasar bahwa tahap pembatas kecepatan di dalam reaksi enzimatik adalah tahap penguraian kompleks ES, menjadi produk dan enzim bebas. Persamaan Michaelis-Menten merupakan dasar bagi semua aspek kinetika kerja enzim (Lehninger, 1990).
Persamaan Michaelis-Menten dapat ditransformasi secara aljabar menjadi bentuk lain yang lebih umum digunakan untuk memetakan data percobaan. Transformasi yang umum digunakan adalah dengan membuat kebalikan dari kedua sisi
persamaan Michaelis-Menten, sehingga diperoleh hubungan :
Persamaan ini disederhanakan menjadi :
Persamaan ini dikenal dengan persamaan Lineweaver-Burk. Bagi enzim-enzim yang mengikuti hubungan Michaelis-Menten secara benar, pemetaan 1/vo terhadap 1/[S] menghasilkan garis lurus (Gambar 2). Garis ini akan memiliki sudut km/vmaks, perpotongan garis terhadap sumbu y sebesar 1/vmaks (pada sumbu1/vo) dan perpotongan -1/km pada sumbu 1/[S] (Lehninger, 1990).
Gambar 2. Diagram Lineweaver-Burk (Suhartono, 1989)
C. Stabilitas Enzim
Menurut Kazan et al., (1997), stabilitas enzim dapat diartikan sebagai kestabilan aktivitas enzim selama penyimpanan dan penggunaan enzim tersebut, serta kestabilan terhadap senyawa yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam atau basa), oleh pengaruhsuhu dan kondisi –kondisi nonfisiologis lainnya.
Dalam melakukan aktivitasnya, enzim dipengaruhi oleh lingkungan. Pengaruh tersebut dapat mengganggu stabilitas enzim sehingga menjadi masalah yang sering dihadapi dalam industri. Stabilitas merupakan sifat penting yang harus dimiliki oleh enzim dalam aplikasinya sebagai biokatalis. Stabilitas enzim dapat didefinisikan sebagai kestabilan aktivitas enzim selama penyimpanan dan
penggunaan enzim tersebut, serta kestabilan terhadap senyawa yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam, basa), pengaruh temperatur dan pH
ekstrim. Terdapat dua prinsip utama untuk memperoleh enzim yang mempunyai stabilitas tinggi, yaitu menggunakan enzim yang memiliki stabilitas ekstrim alami dan mengusahakan peningkatan stabilitas enzim yang secara alami kurang atau tidak stabil. Menurut Saktiwansyah (2001), peningkatan stabilitas enzim dapat dilakukan dengan cara imobilisasi enzim, modifikasi kimia, protein engineering, dan memperlakukan enzim pada kondisi air yang terbatas (dalam pelarut organik).
1. Pengaruh Temperatur Tinggi (Stabilitas Termal)
2. Pengaruh pH (Stabilitas terhadap pH)
Umumnya enzim bersifat amfolitik, yang berarti enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus basanya, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus terminal aminonya. Perubahan aktivitas enzim akibat perubahan terjadinya perubahan ionisasi enzim, substrat atau kompleks enzim substrat, serta perubahan kemampuan peningkatan dan pengaruh laju reaksi. Pada umumnya enzim
menunjukkan aktivitas maksimum pada suatu kisaran pH yang disebut pH optimum, yang umumnya antara pH 4,5 mempunyai kisaran pH optimum yang sangat sempit. Di sekitar pH optimum enzim mempunyai stabilitas yang tinggi. Dalam hal ini, enzim yang sama sering kali pH optimumnya berbeda tergantung dari sumber enzim (Mangunwidjaja, 1994).
D. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas berasal dari bahasa yunani yaitu pseudo berarti palsu dan monas
berarti satu unit. Pseudomonas sp merupakan bakteri hidrokarbonoklastik yang
mampu mendegradasi berbagai jenis hidrokarbon. Keberhasilan penggunaan
bakteri Pseudomonas dalam upaya bioremediasi lingkungan akibat pencemaran
hidrokarbon membutuhkan pemahaman tentang mekanisme interaksi antara
bakteri Pseudomonas sp. dengan senyawa hidrokarbon. Klasifikasi pseudomonas
berdasar pada homologi rRNA atau DNA dan sifat pertumbuhannya.
a. Karakteristik Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa berbentuk batang dengan ukuran sekitar 0,6 x 2
μm. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan terkadang
membentuk rantai yang pendek. P. aeruginosa termasuk bakteri gram negatif. Strain sel Pseudomonas aeruginosa ditunjukkan pada Gambar 3. Bakteri ini bersifat aerob, katalase positif, oksidase positif, tidak mampu memfermentasi tetapi dapat mengoksidasi glukosa/karbohidrat lain, tidak berspora, tidak mempunyai selubung (sheat) dan mempunyai flagel
monotrika (flagel tunggal pada kutub) sehingga selalu bergerak (Sari, 2005).
b. Klasifikasi Bakteri Pseudomonas aeruginosa
Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Pseudomonadales Famili : Pseudomonadaceae Genus : Pseudomonas
Spesies : Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa termasuk dalam kelas Gamma proteobacteria,
merupakan bakteri gram negatif yang dapat menyebabkan penyakit pada hewan dan manusia. Pseudomonas aeruginosa dapat tumbuh di air suling dan akan tumbuh dengan baik dengan adanya unsur Nitrogen dan Karbon. P. aeruginosa dijumpai melimpah dalam air dan tanah. P. aeruginosa merupakan bakteri gram negatif aerob obligat, berkapsul, mempunyai flagella polar sehingga bakteri ini bersifat motil, berukuran sekitar 0,5-1,0 µm.
Bakteri aerob ini mensekresikan beberapa jenis pigmen, di antaranya pyocyanin (hijau-biru), fluorescein (kuning-hijau) dan pyorubin (merah-cokelat). Bakteri ini dapat tumbuh tanpa oksigen jika tersedia NO3 sebagai akseptor elektron (Jawetz et al., 2001)
P. aeruginosa mampu tumbuh di lingkungan yang mengandung oli dan bahan
bakar minyak lainnya. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan terkadang membentuk rantai yang pendek. Suhu optimum untuk
pertumbuhan P. aeruginosa adalah 35ºC, tetapi dapat juga tumbuh pada suhu 42ºC. P. aeruginosa mudah tumbuh pada berbagai media pembiakan karena kebutuhan nutrisinya sangat sederhana.
Ketika bakteri ini ditumbuhkan pada media yang sesuai, bakteri ini akan menghasilkan pigmen nonfluoresen berwarna kebiruan, piosianin. Beberapa strain Pseudomonas juga mampu menghasilkan pigmen fluoresen berwarna hijau, yaitu pioverdin. Pseudomonas aeruginosa memproduksi katalase, oksidase, dan amonia dari arginin. Bakteri ini dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya (Strohl, 2001).
E. Enzim Lipase.
Enzim lipase atau asilgliserol hidrolase (E.C 3.1.1.3) merupakan enzim yang dapat menghidrolisis rantai panjang trigliserida. Keterangan dari kode enzim ini adalah : 3 Hydrolases, 1 Acting on ester bonds, 1 Carboxylic-ester hydrolases, 3 triacylglycerol lipase (Bornscheuer, 1995). Enzim lipase termasuk dalam enzim
induktif yang sangat dipengaruhi oleh adanya konsentrasi minyak atau lemak didalam substrat. Enzim lipase adalah enzim hidrolase yang berperan sebagai biokatalis dalam menghidrolisis lemak mono-, di-, dan trigliserida untuk menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol (Winarno, 1986)
Selain enzim lipase termolabil, berbagai laporan penelitian mengungkapkan bahwa enzim lipase termostabil diproduksi dari bakteri termofilik, misalnya Bacillus thermotenulatus (Schmid et al.,1997), Bacillus thermotenulatus
Enzim lipase sebagai biokatalisator mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan katalisator alkali diantaranya: bekerja secara spesifik, aktivitas katalitik enzim yang tinggi dan kemampuannya bekerja pada suhu yang relatif rendah sekitar 30ºC, katalisator alkali bekerja pada suhu (220-250) ºC. Suhu yang tinggi menghasilkan produk berwarna coklat (gelap) dan bau tidak diinginkan (Noureddini, 2004).
1. Karakteristik Enzim Lipase yang dihasilkan oleh Mikroba
Salah satu karakteristik utama dari lipase, yaitu enzim ini dapat bekerja pada lapisan antar muka karena adanya perbedaan kepolaran antara lipase dengan substrat yang dikatalisisnya. Lipase cenderung bersifat polar, sedangkan substratnya berupa senyawa non polar, sehingga lipase bekerja pada bagian antar muka antara fasa yang larut dalam air dan fasa minyak dari substratnya (Seniwati dkk., 2010). Aktivasi pada lapisan antar muka dari lipase ini akan meningkat ketika substrat yang tersedia berada dalam bentuk emulsinya. Sebagai akibat dari karakteristik ini, maka kinetika dari lipase tidak mengikuti aturan klasik model Michaelis-Menten (Jaeger et al., 1994). Substrat dan produk yang dihasilkan dari katalitik lipase ini terkadang bersifat tidak dapat larut dengan baik dalam media air. Hal ini membuat enzim dapat dengan mudah dipisahkan dari substrat dan produknya.
senyawa penstabil. Jenis substrat dari lipase juga terkadang tidak dapat larut atau bersifat sedikit larut dalam media air. Karena itu, dalam fenomena seperti ini digunakan suatu pelarut organik atau larutan organik-air sebagai media reaksi. Karena lipase tetap memiliki kemampuan katalitiknya dalam suatu pelarut organik, membuat lipase banyak diaplikasikan dalam bidang bioteknologi (Jaeger et al., 1994).
Lipase yang dihasilkan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya adalah lama waktu inkubasi. Lama waktu inkubasi mempengaruhi jumlah lipase yang dihasilkan. Kemampuan bakteri dalam menghasilkan lipase telah ditemukan dengan lama waktu inkubasi dari beberapa jam sampai beberapa hari.
Pabai et al (1996) melaporkan bahwa Pseudomonas spp., P. fragi, dan P. fluorescens BW 96CC mampu menghasilkan lipase hingga mencapai
maksimum setelah inkubasi antara 72 dan 96 jam. Lipase bakteri adalah glikoprotein, tetapi beberapa lipase bakteri ekstraseluler adalah lipoprotein.
Lipase yang dimurnikan dari Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens, dan Pseudomonas aeruginosa monomer dengan berat molekul 33 kDa, 45 kDa, dan 29 kDa. Lipase ini dihambat oleh Zn2+, Fe2+, dan Al3+ dan activator oleh Ca2+. Gen lipase dari P. fragi telah dikloning dan sequenced.
Karakterisasi enzim lipase berbeda – beda. Enzim ekstraseluler utama yang dihasilkan oleh P. aeruginosa adalah golongan hidrolase, termasuk protease alkali elastase , fosfolipase dan lipase ( Tielen et al., 2010).
2. Aktivitas Enzim Lipase
Unit enzim (U) dinyatakan sebagai jumlah enzim yang melakukan katalisis
sehingga terjadi perubahan satu mikromol (1 x 10-6 mol) substrat per menit. Sedangkan aktivitas spesifik adalah jumlah unit enzim permiligram protein. Aktivitas spesifik biasanya mencerminkan kemurnian enzim. Selama
pemurnian, aktivitas spesifik enzim meningkat dan tetap jika enzim sudah menjadi murni. Aktivitas enzim lipase yang dapat mengkatalisis pemutusan ikatan ester disebut aktivitas hidrolisis lipid (lipolisis). Aktivitas hidrolisis lipid dapat maksimal jika teradsorpsi pada bidang pertemuan (interface) air minyak (Lehninger, 1995).
F. Isolasi dan Pemurnian Enzim
Untuk keperluan penelitian dan analisis, hasil isolasi enzim tidak diperlukan dalam jumlah banyak, tetapi mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi. Isolasinya memerlukan teknologi isolasi enzim yang mempunyai sifat dan aktivitas maksimum (Suhartono, 1989). Dalam melakukan pengisolasian enzim perlu diperhatikan letak / lokasi enzim pada organisme. Menurut lokasinya, enzim dapat bersifat ekstraselluler yaitu enzim yang disekresikan oleh organisme dan bekerja di luar sel organisme.
Ekstraksi enzim ekstraselluler lebih mudah dibandingkan enzim intraselluler, karena tidak memerlukan pemecahan sel / lisis dinding sel, dan enzim yang dikeluarkan dari sel mudah dipisahkan dari pengotor lain serta tidak banyak bercampur dengan bahan-bahan sel lain (Chan and Pelezar, 1989).
Tahapan proses pengisolasian dan pemurnian enzim secara umum menurut Judoamijojo dkk (1992) adalah sebagai berikut :
1. Pemecahan dinding sel / Lisis dinding sel
Proses ini bertujuan untuk mengeluarkan enzim dari sel atau konstituen seluler. Pada proses ini perlu diperhatikan perusakan atau penghancuran dinding sel secara fisik, makanik, atau kimia.
2. Sentrifugasi
Sentrifugasi merupakan suatu cara pemisahan yang berdasarkan kepada perbedaan kecepatan sedimentasi dari partikel-partikel molekul yang
dimana zat terlarut dapat dipisahkan dengan cepat menuju pusat medan sentrifugal. Dalam hal ini partikel-partikel mula-mula yang terdistribusi secara merata di dalam larutan, pada suatu kecepatan perputaran tertentu akan bergerak meninggalkan larutan induknya dan bila partikel-partikel terlarut tersebut lebih besar dari partikel pelarut, maka akan memisah dan terjadi pengendapan. Sebaliknya partikel-partikel yang memiliki berat jenis lebih kecil dari pelarutnya, akan terapung di permukaan. Pada saat kesetimbangan tercapai, dimana konsentrasi zat terlarut di bagian atas lebih kecil dari pada konsentrasi bagian bawahnya, maka pada saat itulah terjadi pengendapan. Sentrifugasi akan menghasilkan supernatan yang jernih dan endapan yang terikat kuat pada dasar tabung, yang kemudian dipisahkan secara normal. Sel-sel mikroba biasanya mengalami sedimentasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit (Scopes,1982; Walsh and Headon, 1994).
3. Fraksinasi
Bila konsentrasi garam dinaikkan sehingga kekuatan ion bertambah besar, maka interaksi ion dari garam dengan air akan bertambah, hal ini akan
menyebabkan interaksi antara protein dengan air menurun. Proses ini disebut salting out. Salting out sangat tergantung pada hidrofobilitas protein.
Peningkatan konsentrasi garam yang ditambahkan secara bertahap, akan mengendapkan protein secara bertahap pula, sehingga dapat digunakan untuk pemurnian protein. Pada peristiwa salting out akan terjadi pengendapan protein, dimulai dari kelarutan yang lebih kecil. Ammonium sulfat adalah salah satu jenis garam yang paling banyak digunakan untuk mengendapkan protein enzim. Peningkatan kekuatan ion ini meningkatkan kadar air yang terikat pada ion dan jika interaksi antar ion kuat, maka kelarutannya menurun akibatnya interaksi antar protein lebih kuat dan kelarutannya menurun
(Agustien dan Munir, 1997).
Beberapa keuntungan menggunakan garam Ammonium sulfat adalah (a) Dalam keadaan jenuh molaritasnya cukup tinggi sehingga dapat
mengendapkan sebagian besar protein; (b) Panas pelarutannya rendah, sehingga panas yang dihasilkannya mudah hilang; (c) Pada larutan jenuhnya (4,04 M pada 20 ºC) memiliki kerapatan sekitar 1,235 gram per cm3, yang tidak cukup besar mengganggu sedimentasi sebagian besar protein yang mengendap karena sentrifugasi; (d) Larutan Ammonium sulfat yang pekat mencegah atau membatasi pertumbuhan bakteri, (e) Dalam larutan
Berdasarkan keuntungan terakhir ini, seringkali protein murni disimpan sebagai suspensi dalam larutan Ammonium sulfat pekat (Scopes, 1982)
Perlakuan penambahan ammonium sulfat dilakukan dengan meningkatkan kejenuhan dari larutan enzim, pembagian fraksinya sebagai berikut: (0-20)%jenuh, (20-40)%jenuh, (40-60)%jenuh, (60-80)%jenuh, (80-100)%jenuh (Soedigdo, 1988).
4. Dialisis
Dialisis dilakukan untuk menghilangkan garam-garam dari larutan protein. Pada proses dialisis diperlukan suatu membran yang bersifat semipermeabel, dapat menahan zat-zat molekul besar tetapi melewatkan zat-zat molekul kecil. Adapun membran yang dipakai pada umumnya adalah kantong selofan
dengan ukuran ketebalan dan panjang yang berbeda-beda. Permeabilitas suatu kantong selofan tergantung pada ukuran dan juga pada praperlakuan yang dilakukan (Stryer, 2007).
membran adalah tekanan osmotik, oleh karena itu selalu diusahakan supaya volume kantong selofan setelah tercapai kesetimbangan masih normal, tidak mengalami kerusakan akibat tekanan osmotik seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4 (Stryer, 2007)
Sebaliknya dapat terjadi, misalnya jika biomolekul yang keluar meninggalkan kantong selofan lebih cepat, sehingga kantong selofan menjadi kempes. Sebagai contoh dari 200 mL isi kantong selofan jika dibiarkan satu malam dapat bertambah volumenya menjadi beberapa mililiter lagi. Proses dialisis berlangsung karena adanya perbedaan konsentrasi zat terlarut di dalam dan di luar membran. Difusi zat terlarut bergantung pada suhu dan viskositas larutan. Meskipun suhu tunggi dapat meningkatkan laju difusi, tetapi sebagian besar protein dan enzim stabil pada suhu 4-8oC sehingga dialisis harus dilakukan di dalam ruang dingin (Pohl, 1990).
Gambar 4. Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dengan dialisis (Stryer, 2007).
kantong dialisis larutan protein
Cara-cara untuk mempercepat pergerakan molekul:
a. Membuat luas permukaan membran sebesar mungkin, antara lain dengan menambah panjang tabung (kantong).
b. Mengubah lapisan larutan yang berhubungan langsung dengan membran secara terus menerus dengan mengaduk pelarut. c. Mengganti pelarut pada selang waktu tertentu
G. Pengujian aktivitas enzim lipase metode Titrimetri
Aktivitas enzim lipase ditentukan dengan mengukur pembentukan asam lemak bebas menggunakan titrasi dengan larutan basa berkonsentrasi rendah dan
mengasumsikan bahwa jumlah basa titrasi sama dengan jumlah asam lemak bebas yang terhidrolisis oleh lipase (Gambar 5). Untuk menandakan akhir titrasi
Triasilgliserol Diasilgliserol Monoasilgliserol
Gambar 5. Reaksi hidrolisis triasilgliserol oleh lipase (L. Stryer 2007)
Metode ini banyak digunakan karena kemudahan dan keakuratannya. Pada metode titrimetri untuk mengukur aktivitas lipase digunakan minyak zaitun sebagai substrat (Gupta et al., 2013).
H. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat dua reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk
sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat, menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam
amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya.
berkisar pada konsentrasi 0,01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Lowry et al., 1951).
Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen,
gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferensi tersebut. Oleh karena itu dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein (Lowry et al., 1951).
Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan
fosfomolibdat (reagen Lowry D) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap
cahaya (Lowry et al., 1951).
menggunakan volume sampel yang sangat kecil sehingga tidak mempengaruhi reaksi (Lowry et al., 1951).
I. Amobilisasi Enzim
Amobilisasi enzim merupakan suatu proses dimana pergerakan molekul enzim dalam ruang tempat reaksi ditahan sedemikian rupa sehingga terbentuk sistem enzim yang aktif dan tidak larut dalam air. Dalam amobilisasi enzim, pengikatan enzim pada suatu karier haruslah terjadi tanpa adanya perusakan pada struktur ruang tiga dimensi dari sisi aktif enzim tersebut, sehingga spesifitas substrat maupun gugus fungsi aktif tidak terganggu oleh proses ini. Amobiisasi enzim diketahui memiliki beberapa keunggulan diantaranya stabilitas enzim dan enzim dapat digunakan berulang-ulang. Aktivitas dan stabilitas enzim dipengaruhi oleh metoda amobilisasi, jenis enzim maupun jenis matrik yang digunakan
(Wirahadikusumah, 1981).
kelebihan yaitu aktivitas dari enzim tetap tinggi (tidak terjadi perubahan konformasi enzim) dan media dapat diregenerasi (Susanto, 2003).
Aktivitas enzim amobil ditentukan oleh bahan pendukung yang digunakan. Pada proses amobilisasi, jumlah enzim yang teradsorpsi dipengaruhi oleh lama
pengocokan dan konsentrasi adsorbat / enzim (Sediawan, 2000).
Lama pengocokan dan konsentrasi enzim akan mempengaruhi massa enzim yang teradsorpsi, sehingga berpengaruh terhadap aktivitas enzim tersebut (Ariesta, 2009).
Adsorpsi secara fisik merupakan metode yang relatif mudah dilakukan. Adsorben yang umum digunakan dari berbagai bahan organik dan anorganik seperti alumina (aminosilase, amilase), selulosa (selulase), tanah liat (katalase), kaca (urease) hidroksilapatit (NAD pirofosforilase), karbon dan berbagai macam bahan silika (amilase).
Adsorpsi terjadi karena gaya Van der Waals, ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik diantara molekul enzim dan molekul penyangga dicampurkan pada kondisi lingkungan yang sesuai, selama waktu tertentu. Enzim terikat oleh bahan dengan ukuran fisik yang lebih besar sehingga dapat dipisahkan dari enzim bebas dengan cara filtrasi dan sentrifugasi (Suhartono, 1989).
ion (Gupta et al., 2013) . Terdapat tiga cara untuk meningkatkan stabilitas enzim yaitu amobilisasi, modifikasi kimia dan mutagenesis langsung (Mozhaev et al., 1988).
Keuntungan penggunaan enzim yang telah diamobi diantaranya adalah : 1. Sistem enzim yang telah diamobil dapat digunakan berulang-ulang 2. Memungkinkan proses pengoperasian secara berkesinambungan
3. Dapat meminimalkan terjadinya pencampuran antara hasil reaksi dengan residu 4. Memudahkan pengendalian kondisi reaksi
5. Dapat meningkatkan stabilitas enzim.
Selain keuntungan amobilisasi enzim juga mempunyai kekurangan yaitu dapat menyebabkan penurunan aktivitas katalitik enzim untuk beberapa kasus serta terjadi pergeseran pH dan suhu optimum dari enzim (Payne et al.1992).
1. Sifat-sifat enzim amobil
Pada umumnya masa aktif enzim amobil melebihi masa aktif enzim terlarut. Apabila substrat atau produk yang dihasilkan sensitif terhadap pH, maka teknologi amobilisasi memungkinkan memilih polimer pengikat yang sesuai, sehingga kisaran pH optimum enzim amobil sesuai dengan stabilitas substrat maupun produknya. Perubahan konformasi molekul enzim yang menimbulkan perubahan stereokimiawi dan muatan total pada sisi aktif enzim akan mengubah daya katalitik enzim terhadap substratnya. Hal ini tercermin pada perubahan beberapa parameter kinetika enzim. Konstanta kinetika enzim amobil biasanya berubah dari bentuk aslinya (Kavardi et al., 2012).
Amobilisasi dapat meningkatkan atau menurunkan nilai KM enzim. Penurunan KM mencerminkan reaksi yang lebih cepat dibandingkan dengan reaksi pada enzim bebas. Penurunan KM enzim terjadi apabila muatan polimer penyangga dan muatan substrat terjadi tarik menarik elektrostatik diantara polimer penyangga dan substrat yang akan membantu meningkatkan konsentrasi substrat di sekitar enzim amobil.
terlalu besar dapat meningkatkan harga KM enzim amobil. Hal ini berkaitan dengan pengaruh difusi substrat (Suhartono, 1989).
J. BENTONIT
Bentonit mempunyai bentuk berupa partikel butiran halus berwarna kuning muda, putih dan abu-abu dengan massa jenis 2,2 – 2,7 g/L dan massa molekul relatif besar 549,07 g/mol. Bentonit termasuk jenis mineral yang banyak mengandung montmorillonit memiliki struktur mineral lempung liat jenis TOT (2:1) artinya
struktur lembarannya disusun oleh dua lapisan Tetrahedral (T) dan satu lapisan Oktahedral (O). Bentonit termasuk mineral clay golongan smektit dioktahedral
yang mengandung sekitar 80 % montmorillonit dan sisanya antara lain kaolin, illite, gipsum, fieldspar, abu vulkanik, pasir kuarsa dan montmorillonit yang berada diantara dua lapisan tetrahedral. Bentonit sering diaplikasikan pada berbagai bidang diantaranya industri logam, pertanian, makanan dan minuman, farmasi, lingkungan dan katalis karena bentonit memiliki sifat sebagai penukar kation. Kation yang terserap didaerah interlayer disebut kation interlayer /exchangeable cations (Lambe and Whitman, 1979).
a. Struktur Bentonit
Bentonit merupakan sumber daya mineral yang melimpah terdapat di
Indonesia. Mineral bentonit memiliki diameter kurang dari 2 mikrometer yang terdiri dari berbagai macam phyllosilicate yang mengandung silika,
dari 3 layer yang tersusun dari 2 layer silika tetrahedral dan satu sentral octahedral (Gambar 6). Diantara lapisan octahedral dan tetrahedral terdapat kation monovalent maupun bivalent, seperti Na+, Ca2+ dan Mg2+ (Cheetam, 1992)
Montmorilonit merupakan penyusun terbesar bentonit yaitu sebesar 85%.
Rumus kimia bentonit adalah (Mg, Ca) xAl2O3. ySiO2. nH2O dengan nilai n sekitar 8 dan x,y adalah nilai perbandingan antara Al2O3 dan SiO2. Penyusun lainnya yaitu campuran kristobalit, feldspar, kalsit, gypsum, kaolinit,
plagioklas, illit (Katti and Katti, 2001)
Gambar 6. Struktur Montmorillonit / Bentonit (Holtz and Kovacs, 1981)
b. Pembagian tipe bentonit
Bentonit dibagi menjadi dua yaitu Swelling dan Non Swelling (Gambar 7): 1. Tipe Wyoming (Na-bentonit – Swelling bentonite)
air. Dalam keadaan kering berwarna putih atau cream, pada keadaan basah dan terkena sinar matahari akan berwarna mengkilap.
Perbandingan soda dan kapur tinggi, suspensi koloidal mempunyai pH: 8,5-9,8, tidak dapat diaktifkan, posisi pertukaran diduduki oleh ion-ion sodium (Na+). Penggunaan yang utama adalah untuk lumpur (bor) pembilas dalam kegiatan pemboran, pembuatan pellet biji besi, penyumbat kebocoran bendungan/kolam.
2. Mg, Ca-bentonit – (non swelling bentonite)
Tipe bentonit ini kurang mengembang apabila dicelupkan ke dalam air, dan tetap terdispersi di dalam air, tetapi secara alami atau setelah diaktifkan mempunyai sifat menghisap yang baik. Perbandingan
kandungan Natrium dan Calsium rendah, suspensi koloidal memiliki pH: 4-7. Posisi pertukaran ion lebih banyak diduduki oleh ion-ion kalsium dan magnesium. Dalam keadaan kering bersifat rapid slaking, berwarna abu-abu, biru, kuning, merah dan coklat. Penggunaan bentonit dalam proses pemurnian minyak goreng perlu aktivasi terlebih dahulu.
c. Pengaktifan bentonit
Bentonit mempunyai struktur berlapis dengan kemampuan mengembang (swelling) dan memiliki kation-kation yang dapat ditukarkan (Katti and Katti
2001). Meskipun lempung bentonit sangat berguna untuk adsorpsi, namun kemampuan adsorpsinya terbatas (Cool et al., 1988). Kelemahan tersebut dapat diatasi melalui proses aktivasi menggunakan asam (HCl, H2SO4 dan HNO3) sehingga dihasilkan lempung dengan kemampuan adsorpsi yang lebih tinggi (Kumar and Jasra, 1995).
Aktivasi bentonit menggunakan asam akan menghasilkan bentonit dengan situs aktif lebih besar dan keasamaan permukan yang lebih besar, sehingga akan dihasilkan bentonit dengan kemampuan adsorpsi yang lebih tinggi dibandingkan sebelum diaktivasi (Komadel, 2003).
Ada dua cara untuk mengaktivasi bentonit yaitu : 1. Pengaktifan secara kimia
Pengaktifan secara kimia dilakukan dengan mencampurkan bentonit dengan H2SO4 5 N (1 gram bentonit : 10 ml asam) ke dalam beaker glass. Aktivasi ini dilakukan di waterbatch selama dua jam pada suhu
700 ºC. Bentonit disaring, dicuci dengan air panas sampai pH air pencuci netral.Kemudian dikeringkan dioven pada suhu 105 ºC sampai beratnya konstan. Tujuan dari aktivasi kontak asam adalah untuk
kisi-kisi struktur, sehingga secara fisik bentonit tersebut menjadi aktif. Untuk keperluan tersebut asam sulfat dan asam klorida adalah zat kimia yang umum digunakan. Selama proses bleaching tersebut, Al, Fe, dan Mg larut dalam larutan, kemudian terjadi penyerapan asam ke dalam struktur bentonit, sehingga rangkaian struktur mempunyai area yang lebih luas.
2. Pengaktifan secara fisika
Pengaktifan fisika dilakukan dengan memanaskan bentonit di-furnace pada suhu 400 ºC selama 6 jam untuk memperluas permukaan butiran bentonit (Adel dan Haerudin, 2003). Perubahan dari gugus oktahedral menjadi tetrahedral membuat kisi kristal bermuatan negatif pada permukaan kristal, sehingga dapat dinetralisir oleh ion hidrogen (Supeno, 2003)
Berikut adalah beberapa sifat umum bentonit :
1. Lunak, berbentuk kristal, bewarna pucat umumnya putih, hijau, kelabu, merah muda dalam keadaan segar dan mempunyai kilap lilin.
III. METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari - Mei 2015 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah erlenmeyer, beaker glass, jarum ose, pipet tetes, mikropipet Eppendroff, neraca analitik, lemari pendingin, pembakar spirtus, biuret dan statif, sentrifuga, magnetik stirer, autoclave model S-90N, oven, laminar air flow CRUMA model 9005-FL, waterbatch shaker incubator HAAKE, pH meter,
waterbath, incubator, ayakan 100 mesh dan spektrofotometer UV-VIS Cary Win
UV 32.
Asam Oksalat (H2C2O4 . 2H2O), kantong selofan dan Bentonit. Mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Balai Laboratorium Kesehatan Daerah Provinsi Lampung.
C. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan Media dan Larutan Pereaksi
a. Pembuatan media pertumbuhan bakteri dengan induser minyak zaitun 2,8 gram nutrient agar (NA) dan 2 ml minyak zaitun, dilarutkan dalam 100 mL aquades kemudian disterilkan pada temperatur 120 ºC tekanan 1 atm, setelah itu dituang ke dalam tabung, dimiringkan dan simpan pada suhu kamar.
b. Pembuatan media inokulum
Media yang digunakan adalah media cair M.Sarley yang dimodifikasi. Media inokulum dibuat dengan cara menimbang bahan-bahan yang terdiri dari pepton 1 g; Gum arab 5 g; minyak zaitun 10 ml; NaNO3 0,1 g; KH2PO4 0,1 g; MgCl2 .6H2O 0,05 g; CaCl2. 2H2O 0,05 g; dilarutkan dalam 1000 ml buffer posfat pH 7 kemudian media disterilkan pada temperatur 121 °C, tekanan 1 atm selama 15 menit dalam autoclave.
c. Pembuatan media fermentasi
CaCl2. 2H2O 0,05 g; dilarutkan dalam buffer posfat pH 7 sebanyak 1000 mL dalam labu erlenmeyer dan media fermentasi tersebut disterilkan
menggunakan autoclave pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm selama 15 menit. d. Pembuatan larutan pereaksi
Pereaksi yang digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim lipase metode
Titrimetri (Pereira et al., 2001).
- Larutan NaOH 0,05 N, dengan menimbang 2 gram NaOH kemudian dilarutkan ke dalam 1000 ml aquades.
- Campuran etanol dan aseton perbandingan (1:1), dengan mencampurkan 100 ml etanol dan 100 ml aseton.
- Larutan standar primer asam oksalat 0,05 N, dengan menimbang 0,63 gram H2C2O4 . 2H2O yang dilarutkan dalam 100 ml aquades.
Pereaksi yang digunakan untuk penentuan kadar protein metode Lowry
(Lowry et al., 1951).
- Pereaksi A : 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 NaOH 0,1 N - Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan
kedalam 5 mL larutan Na(K) tartarat 1%
- Pereaksi C : 2 mL pereksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A - Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades
1:1.
2. Penentuan kondisi optimum pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Penentuan kondisi optimum dilakukan dengan menginokulasi bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pada media cair inokulum M.Sarley
dalam buffer fosfat pH 7 pada suhu ruang yang diinkubasi selama 24 jam. Kondisi optimum meliputi: variasi suhu (ºC ) 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60, variasi pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9, dan variasi waktu inkubasi selama 120 jam dengan interval waktu sampling per 24 jam. Setiap perlakuan ditentukan aktivitas enzim lipase dengan metode Titrimetri.
3. Produksi enzim lipase
Sebanyak 2% inokulum bakteri ditambahkan ke dalam media fermentasi dan diinkubasi pada suhu optimum, pH optimum dan waktu fermentasi optimum untuk memperoleh jumlah maksimum enzim yang diproduksi.
4. Isolasi enzim Lipase
yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran 5000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim lipase. Ekstrak kasar enzim lipase kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
5. Uji aktivitas enzim lipase metode Titrimetri (Pereira et al., 2001).
a. Uji aktivitas lipase menggunakan larutan NaOH 0,05 N, yaitu, sebanyak 2 mL substrat minyak zaitun, ditambah 1 mL buffer posfat 0,05 M pH 7 dan 1 mL larutan enzim. Campuran larutan substrat dan enzim ini kemudian di inkubasi pada temperatur 35 ºC selama 30 menit. Kemudian substrat enzim diinaktifkan dengan menggunakan 1 mL campuran aseton : etanol (1:1) , lalu tambahkan 5 tetes indikator PP 1% dan titrasi dengan larutan standar NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan pada saat terjadi perubahan warna larutan menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo. b. Untuk penentuan blanko dilakukan dengan komposisi larutan yang sama,
tetapi saat dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran aseton : etanol (1:1) sebanyak 1 mL, lalu titrasi dengan prosedur yang sama dengan analisis sampel. Analisis aktivitas lipase dihitung
berdasarkan selisih volume titran sampel dengan blanko, seperti persamaan dibawah ini;
Keterangan :
V.sampel : Volume titran sampel (mL) V.blanko : Volume titran blanko (mL) [NaOH] : Konsentrasi NaOH (Normalitas) V.enzim : Volume enzim (mL)
t. : waktu inkubasi (menit)
1000 : nilai konversi dari mmol kedalam satuan µmol
6. Penentuan kadar protein metode Lowry (Lowry et al., 1951).
Sebanyak 0,1 mL enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C dan diaduk rata. Kemudian dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades, selanjutnya
perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm. Untuk
menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).
7. Pemurnian Enzim Lipase
Enzim lipase yang diperoleh dimurnikan melalui 2 tahap sebagai berikut:
Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam ammonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-20 %; (20-40)%; (40-60)%; (60-80)%; dan (80-100)%. Skema proses pengendapan ditunjukkan pada Gambar 8. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh
ditambahkan garam ammonium sulfat secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirer pada suhu 4°C. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 30 menit. Kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
Gambar 8. Skema proses pengendapan protein enzim dengan pengendapan ammonium sulfat
+ (NH4)2SO4 (0-20%)
+ (NH4)2SO4 (20-40%) Ekstrak Kasar Enzim
Endapan(F1) Filtrat
Endapan(F2) Filtrat
Endapan(F3) Filtrat
+ (NH4)2SO4 (40-60%)
Endapan(F4) Filtrat
+ (NH4)2SO4 (60-80%)
+ (NH4)2SO4 (80-100%)
b. Dialisis
Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi ammonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,05 M pH 7 selama ±24 jam pada suhu dingin. Selama dialisis, dilakukan pergantian larutan bufer selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2 atau BaCl2. Bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO4. Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Titrimetri serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
8. Amobilisasi enzim lipase menggunakan bentonit.
a. Preparasi matriks bentonit
b. Penentuan pH untuk proses pengikatan enzim lipase pada bentonit
Enzim lipase sebanyak 1 ml diikatkan pada 1 gram bentonit dengan variasi pH 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 dan 8 menggunakan buffer fosfat 0,05 M, kemudian, diaduk 5-10 menit. Campuran tersebut dibiarkan hingga terpisah antara endapan dan filtrat lalu endapan dan filtrat diuji aktivitas enzim lipase dengan metode titrimetri.
c. Amobilisasi enzim lipase
Sebanyak 1 mL enzim lipase di amobil dengan 1 gram bentonit pada pH pengikatan. Kemudian campuran diaduk hingga rata dan simpan dalam fryzer selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak tiga
kali, dicentrifuge dan endapan (enzim amobil) diuji aktivitasnya untuk pemakaian berulang dengan metode Titrimetri.
Pemakaian berulang enzim amobil
1. Endapan (enzim amobil) ditambah 2 mL minyak zaitun dan 1 mL buffer fosfat 0,05 M pH 7.
2. Untuk blanko ditambahkan 1 ml campuran aseton : etanol (1:1) 3. Campuran diinkubasi pada suhu 35 ºC selama 30 menit 4. Kemudian disaring sampai diperoleh filtrat dan endapan
5. Filtrat di titrasi dengan NaOH 0,05 N menggunakan indikator PP 1% 6. Endapan sebagai enzim lipase amobil yang telah dipakai dilakukan
9. Karakterisasi enzim lipase sebelum dan sesudah amobilisasi
a. Penentuan suhu optimum
Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan memvariasikan suhu yaitu 30, 35; 40; 45; 55; 60; 65; dan 70; . Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Titrimetri.
b. Penentuan KM dan Vmaks
Konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks) enzim lipase ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat 0.5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5% dalam buffer fosfat pada pH 8 dan suhu 35 ºC selama 30 menit. Selanjutnya diukur aktivitas enzim dengan metode Titrimetri dan data aktivitas enzim dan konsentrasi substrat diplotkan ke dalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan nilai KM dan Vmaks.
c. Uji stabilitas termal enzim lipase (Yang et al., 1996)
Perhitungan aktivitas sisa (Virdianingsih, 2002).
d. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki), dan perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi)
Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim lipase hasil pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan persamaan kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan persamaan:
ln (Ei/E0) = - ki t
Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan persamaan (Yandri et al., 2007):
∆Gi = - RT ln (ki h/kB T)
Keterangan :
R = konstanta gas (8,315 J K-1 mol-1) T = suhu absolut (K)
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang ditunjukkan dalam Gambar 9.
Gambar 9. Diagram alir penelitian Isolasi Enzim
Ekstrak Kasar Enzim
Uji aktivitas enzim lipase (metode Titrimetri) dan penentuan kadar protein metode Lowry
Pemurnian Enzim : 1. Fraksinasi dengan
ammonium sulfat 2. Dialisis
Amobilisasi Enzim Karakterisasi Enzim
Enzim Lipase amobil
Penentuan suhu optimum
Penentuan Km dan Vmaks
Penentuan stabilitas termal Produksi Enzim
Uji pemakaian
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Simpulan dari pembahasan hasil penelitian yang telah dilakukan adalah sebagai berikut:
1. Bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dapat memproduksi enzim lipase pada kondisi optimum fermentasi yaitu pH 7, suhu 35ºC dan waktu inkubasi 48 jam. Pada kondisi ini diperoleh aktivitas unit tertinggi yaitu 3,333 U/mL.
2. Aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian sebesar 520,000U/mg, meningkat kemurniannya 9,2 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim dengan aktivitas spesifik sebesar 56,491U/mg.
3. Enzim lipase amobil mampu digunakan sebanyak lima kali pemakaian berulang dengan aktivitas katalitik tersisa 14% dan efektif pada
pengulangan yang ke-3 dengan aktivitas katalitik tersisa 43%.
