Physiological Characterization and Molecular Identification of Bacteriocin Producer Bacillus spp Isolated from Cangkuang Forest.

(1)

ISOLAT-ISOLAT

spp PENGHASIL BAKTERIOSIN

ASAL HUTAN WANA WISATA CANGKUANG

ADE SATRIA SOPYAN

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

ABSTRAK

ADE SATRIA SOPYAN. Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bacillus spp Penghasil Bakteriosin Asal Hutan Wana Wisata Cangkuang. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.

Isolat-isolat Bacillus spp diisolasi dari tanah Hutan Wana Wisata Cangkuang seperti isolat A21, F13, dan G3 diketahui dapat menghambat pertumbuhan Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus. Dalam penelitian ini dilakukan verifikasi daya hambat, uji fisiologi secara manual maupun menggunakan MicrogenTM

GN-ID A+B Panel dan analisis sekuen gen 16S rRNA dari ketiga isolat tersebut. Isolat A21 memiliki IP paling besar terhadap S. aureus dan E. coli, sedangkan isolat G3 memiliki IP paling besar terhadap X. oryzae pv. oryzae. Isolat Bacillus spp memiliki kemampuan dalam mereduksi nitrat (kecuali F13), menghidrolisis pati dan gelatin, dapat memfermentasi glukosa, dan memproduksi ß-galaktosidase. Berdasarkan sekuen 16S rRNA, isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 94% dan 95% dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan sebesar 96% dengan Bacillus subtilis. Kekerabatan antara ketiga isolat pada pohon filogenetik berada pada satu kelompok.

ABSTRACT

ADE SATRIA SOPYAN. Physiological Characterization and Molecular Identification of Bacteriocin Producer Bacillus spp Isolated from Cangkuang Forest. Supervised by IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA.

(3)

ISOLAT-ISOLAT

ADE SATRIA SOPYAN

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

(4)

Judul Skripsi

: Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat

Bacillus

spp Penghasil Bakteriosin Asal Hutan Wana Wisata

Cangkuang

Nama : Ade Satria Sopyan

NIM : G34050208

Menyetujui :

Pembimbing I, Pembimbing II,

Dr.Ir. Iman Rusmana, M.Si.

Alina Akhdiya, M.Si.

NIP 196507201991031002 NIP 080130418

Mengetahui :

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr.Drh. Hasim, DEA

NIP 196103281986011002

(5)

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada ALLAH SWT atas segala kemudahan yang diberikan sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2009 hingga Juli 2009 ini ialah Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-Isolat Bacillus spp Penghasil Bakteriosin Asal Hutan Wana Wisata Cangkuang.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr.Ir. Iman Rumana, M.Si. dan Ibu Alina Akhdiya, M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah memberi bimbingan, kritik, dan saran selama penelitian dan penulisan laporan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Bapak Ir. Hadisunarso yang telah memberi saran dan masukan.

Penulis juga sampaikan terima kasih dan syukur kepada IR crew, Aren, Mba Ari, Mba Ratna, Mba Rika, keluarga besar Lab mikrobiologi FMIPA-IPB, OWA-Biologi, dan teman-teman Biologi angkatan 42 yang telah membantu selama berlangsungnya kegiatan karya ilmiah. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Orang Tua, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2009

(6)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 5 September 1987 dari ayah Judin Sofyan dan ibu Cicih Sukaesih. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis terpilih masuk Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Perkembangan Hewan pada tahun ajaran 2007/2008 dan mata kuliah Mikrobiologi Dasar pada tahun ajaran 2009/2010. Penulis aktif sebagai staff OWA Biologi pada tahun 2006-2007 dan ketua OWA Biologi pada tahun 2007-2008.

(7)

Halaman

DAFTAR TABEL ... vi

DAFTAR GAMBAR ... vi

DAFTAR LAMPIRAN ... vi

PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 1

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat ... 1

Bahan dan Alat ... 1

Metode Penelitian Pemurnian dan Peremajaan Isolat ... 1

Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp Terhadap Bakteri Indikator ... 1

Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat ... 1

Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom ... 2

Sekuensing DNA ... 2

Analisis Filogenetik ... 2

HASIL Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp Terhadap Bakteri Indikator ... 2

Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat ... 2

Isolasi, Amplifikasi, dan visualisasi DNA Genom ... 3

Sekuensing DNA ... 3

Analisis Filogenetik ... 4

PEMBAHASAN ... 4

SIMPULAN ... 6

DAFTAR PUSTAKA ... 6

(8)

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Indeks penghambatan isolat Bacillus spp Penghasil antimikrob terhadap bakteri indikator

dengan metode cawan tuang …... 2

2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus sp …... 3

3 Indeks hidrolisis pati ... 3

4 Indeks proteolitik (24 jam) …... 3

5 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N …... 4

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1 Hasil elekroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukan pita DNA berukuran ~1.3 kb …... 3

2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus spp yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya dan bakteri uji …... 4

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1 Hasil Pewarnaan Gram isolat-isolat Bacillus spp …... 9

2 Hasil Pewarnaan endospora isolat-isolat Bacillus spp …... 10

(9)

Genus Bacillus merupakan bakteri yang sangat baik digunakan sebagai agen biokontrol (Jack et al. 1995). Bakteri ini merupakan bakteri gram positif berbentuk batang, bersifat aerobik, serta dapat menghasilkan endospora (Schilinger 1990; Kone & Fung 1992; Klaenhammer 1993; Irina et al. 2001).

Bakteriosin dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan telah digunakan sebagai biopreservative dan terapeutik (Janes et al. 1999). Bakteriosin adalah zat antimikrob polipeptida atau protein yang diproduksi oleh mikroorganisme dan bersifat bakterisida maupun bakteriostatik. Bakteriosin membunuh sel targetnya dengan menyisip pada membran target dan mengakibatkan fungsi membran sel menjadi tidak stabil sehingga menyebabkan lisis sel (Atlas & Bartha 1998).

Beberapa isolat Bacillus yang diisolasi dari tanah Hutan Wana Wisata Cangkuang seperti isolat A, B, D, E, F, G, J, dan N

diketahui dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli dan Staphylococcus aureus (Sopyan & Findy 2007). Identifikasi isolat-isolat Bacillus tersebut secara morfologi, fisiologi, dan molekular penting dilakukan untuk mengetahui spesies dan karakter fisiologi dari isolat-isolat tersebut. Spesies yang telah teridentifikasi karakter fisiologinya memungkinkan dilakukannya kajian lebih mendalam tentang bioprospeksi hingga peluang rekayasa genetikanya.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi ciri-ciri fisiologi dan mengidentifikasi secara molekular isolat-isolat Bacillus spp asal tanah Hutan Wana Wisata Cangkuang yang memiliki potensi menghasilkan bakteriosin.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari 2009 sampai dengan bulan Juli 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan, yaitu isolat Bacillus spp asal tanah Hutan Wana Wisata

Peralatan yang digunakan, yaitu PCR (Perkin Elmer Biosystem, USA), Laminar Air Flow, autoklaf, sentrifuse, elektroforesis mini-gel (BioRad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), UV Transluminator (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA), dan peralatan lainnya yang biasanya digunakan di laboratorium mikrobiologi.

Metode Penelitian

Pemurnian dan Peremajaan Isolat

Isolat-isolat Bacillus spp dimurnikan dan diremajakan pada media agar nutrisi dan diinkubasi pada suhu ruang selama dua hari.

Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus_spp

terhadap Bakteri Indikator

Verifikasi daya hambat isolat-isolat Bacillus spp terhadap bakteri target dilakukan dengan mengamati zona bening yang terbentuk menggunakan metode cawan tuang (Lisboa et.al 2006). Bakteri uji yang digunakan ialah Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Besarnya indeks penghambatan (IP) dihitung dengan rumus:

Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat

Isolat-isolat Bacillus spp yang telah murni dan berumur kurang dari 24 jam dan ±72 jam secara berurutan diamati bentuk dan morfologinya melalui pewarnaan Gram dan spora (Hadioetomo 1993). Selanjutnya dilakukan karakterisasi fisiologi dengan menggunakan MicrogenTM_{GN-ID A+B Panel.}

Sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik dilakukan masing-masing dengan menggunakan media agar pati dan agar susu skim (Hadioetomo 1993).

Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom

Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode Lazo (Lazo et al. 1987). DNA genom hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan kit Ready To Go PCR Beads (Pharmacia-Biothec) dan primer spesifik 16S rRNA untuk prokariot, yaitu 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA

(10)

GTC) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC) (Marchesi et al. 1998).

Kondisi PCR yang digunakan meliputi pradenaturasi (94o

C, 2 menit), denaturasi (95o_{C, 30 detik),}_{Annealing primer}₍₅₅o_{C, 30}

detik), Elongation atau perpanjangan primer (72o

C, 1 menit), dan post PCR (75o

C, 5 menit), dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus.

Pemisahan DNA produk PCR dilakukan pada Elektroforesis mini-gel dengan menggunakan agarose 1% pada tegangan listrik 70 volt selama 45 menit. Agarose direndam dalam Ethidium Bromida (EtBr) lalu diamati di atas UV Transluminator.

Sekuensing DNA

DNA hasil amplifikasi lalu dilakukan sekuensing di Charoen Phokphand-Jakarta untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Hasil sekuen kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotide) dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) untuk mengetahui kemiripan spesies dari isolat yang diuji.

Analisis Filogenetik

Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007), metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.

HASIL

Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp

Isolat-isolat Bacillus spp penghasil antimikrob dari hasil studi lapang di Hutan Wana Wisata Cangkuang, Sukabumi, Jabar diverifikasi daya hambatnya terhadap E. coli, S. Aureus , dan X. oryzae pv. oryzae dengan menggunakan metode cawan tuang (Lisboa et al. 2006). Tahap ini dilakukan untuk mengetahui bahwa isolat yang digunakan ialah isolat Bacillus spp yang menghasilkan zat antimikrob. Tiga isolat dipilih untuk menunjukkan aktivitas penghambatan terbaik dengan membentuk zona bening terhadap ketiga bakteri indikator tersebut yaitu isolat A21, F13, dan G3.

Besarnya daya hambat Bacillus spp A21, F13, dan G3 terhadap ketiga bakteri uji ditunjukkan pada Tabel 1. Kisaran IP isolat Bacillus spp yang diuji pada X. oryzae pv. oryzae, E. coli, dan S. aureus secara berurutan

pada kisaran 1-3.3, 1-2.25, dan 0.25-1.67. Isolat G3 memiliki IP terbesar terhadap X. oryzae pv. oryzae. yaitu 3.3, isolat A21 memiliki IP terbesar terhadap E. coli dan S. aureus yaitu 2.25 dan 1.67. Isolat F13 memiliki IP yang cukup besar terhadap X. oryzae pv. oryzae yaitu 2.67.

Tabel 1 Indeks penghambatan isolat Bacillus spp penghasil antimikrob terhadap bakteri uji dengan metode cawan tuang

Isolat

Aktivitas penghambatan terhadap Staphylococcu

saureus

Esherichi acoli

X.oryzae pv. oryzae

IP IP IP

A21 1,67 2,25 1

F13 1 1 2,67

G3 0,25 1 3,3

Keterangan: IP= Indeks Penghambatan

Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat

Semua isolat Bacillus spp bersifat Gram positif, berbentuk batang pendek hingga batang sedang dengan penataan tunggal, dan membentuk endospora. Endospora yang dimiliki isolat-isolat Bacillus spp berbentuk bulat dengan posisi sentral.

Uji fisiologi dilakukan dengan menggunakan MicrogenTM

GN-ID A+B Panel, sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik dilakukan secara manual masing-masing menggunakan media agar pati dan agar susu skim. Setelah diinkubasi selama semalam maka didapatkan hasil seperti pada Tabel 2. Isolat-isolat Bacillus spp yang diuji menunjukkan hasil positif terhadap uji pati, uji proteolitik, glukosa, O-nitrophenyl-β-D-galaktopiranosa (ONPG), Tryptophan Deaminase (TDA), gelatin, nitrat (kecuali F13), Xilosa (kecuali A21), indol (kecuali G3), urease (hanya A21), (VP) Voges-Proskauer (hanya A21), dan inositol (hanya A21). Sedangkan uji-uji fisiologi seperti lisin, ornitin, H2S, sitrat, manitol, sorbitol, malonat,

ramnosa, laktosa, arabinosa, adonitol, salisin, rafinosa,dan arginin menunjukkan hasil negatif untuk semua isolat. Semua isolat Bacillus sp. mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis pati yang ditunjukkan pada Tabel 3. Indeks hidrolisis yang dihasilkan semakin meningkat dengan bertambahnya waktu inkubasi. Ketiga isolat Bacillus dapat menghasilkan enzim protease, dilihat dari terbentuknya zona bening pada media agar

3 2

(11)

1 kb 1.5 kb 10 kb M 3 2 1 lainnya, yaitu sebesar 0,68.

Tabel 2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus spp

Tabel 3 Indeks hidrolisis pati Indeks hidrolisis

pada 24 jam

Indeks hidrolisis pada 48 jam

Ø Ø IH 3 Ø IH

A21 7 13.5 0.93 7.8 24.8 2.18

F13 5 6 0.2 6 8.5 0.42

G3 7 14.2 1.03 10.3 25.1 1.44

Keterangan: Ø = Diameter IH= Indeks Hidrolisis

Tabel 4. Indeks proteolitik (24 jam)

Isolat

Indeks proteolitik Ø koloni

(mm)

Ø zona bening (mm)

IP

A21 14,7 24,7 0,68

F13 7,4 11,6 0,57

G3 14 23 0,64

Isolasi DNA genom isolat-isolat Bacillus spp dengan menggunakan metode Lazo (Lazo et al. 1987) dapat dilakukan dengan baik, yang dibuktikan dengan terbentuknya satu pita untuk tiap DNA genom isolat-isolat Bacillus spp setelah dielektroforesis dan diamati di atas UV transluminator.

Amplifikasi gen 16S rRNA dari ketiga isolat Bacillus spp dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r yang spesifik untuk prokario. Hasil amplifikasi pada gel elekroforesis yang diamati di atas UV transluminator memperlihatkan adanya pita DNA penyandi gen 16S rRNA dengan ukuran ~1.3 kb setelah dibandingkan dengan DNA marker (1 kb DNA ladder) (Gambar 1).

M: marker 1 kb DNA ladder Sumur 1: Isolat A21 Sumur 2: Isolat F13 Sumur 3: Isolat G3

Gambar 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukkan pita DNA berukuran ~1.3 kb.

Sekuensing DNA

Hasil amplifikasi gen 16S rRNA kemudian disekuen untuk mengetahui urutan nukleotidanya. Hasil sekuen gen 16S rRNA tiap isolat kemudian dianalisis similaritasnya dengan data di GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida). Berdasarkan analisis program BLAST-N diketahui homologi spesies dari isolat yang diuji (lampiran 3 ).

Isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 94% dan 95% dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan sebesar 96% dengan Bacillus subtilis (Tabel 5). Hasil sekuen ketiga isolat tersebut termasuk ke dalam kingdom: Bacteria, Filum: Firmicutes, kelas: Bacili, ordo: Bacillales, dan famili: Bacillaceae. Uji Fisiologi Isolat Bacillus spp

A21 F13 G3

Nitrat + - +

Lisin - -

-Ornitin - -

-H2S - -

-Glukosa + + +

Manitol - -

-Xilosa - + +

ONPG + + +

Indol + +

-Urease + -

-VP + -

-Sitrat - -

-TDA + + +

Gelatin + + +

Malonat - -

-Inositol + -

-Sorbitol - -

-Rhamnosa - -

-Sukrosa -

-Laktosa - -

-Arabinosa - -

-Adonitol - -

-Raffinosa - -

-Salisin - -

-Arginin - -

-Pati + + +

(12)

Gambar 2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus spp yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya dan bakteri uji.

Tabel 5 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N

Analisis Filogenetik

Data sekuen gen 16S rRNA dari ketiga isolat kemudian dibandingkan dengan beberapa data sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya seperti B. subtilis galur YC11-B dan B. cereus galur HDYM-5. Hasil perbandingan sekuen ini kemudian divisualisasikan dalam bentuk pohon filogenetik yang dapat menunjukkan kekerabatan (Gambar 2). Isolat A21 dan G3 yang diuji berada satu kelompok dengan B. cereus galur HDYM-5, sedangkan isolat F13 berada satu kelompok dengan B. subtilis galur YC11-B. Angka pada cabang menunjukkan nilai bootstrap.

PEMBAHASAN

Verifikasi daya hambat isolat-isolat Bacillus spp terhadap bakteri indikator X.

oryzae pv. oryzae, E. coli, dan S. aureus dilakukan untuk membuktikan bahwa isolat-isolat yang digunakan masih memiliki aktivitas penghambatan antimikrob terutama terhadap bakteri patogen. Genus Xanthomonas merupakan bakteri patogen pada tanaman. Bakteri ini termasuk dalam famili Pseudomonadaceae dan merupakan bakteri gram negatif. X. oryzae pv. oryzae merupakan bakteri patogen pada tanaman yang dapat menyebabkan penyakit bacterial blight pada padi. Serangan yang dihasilkan menyebabkan kerusakan pada daun padi dan mempunyai efek yang serius pada produksi tanaman ini. Bakteri ini masuk melalui luka atau pori-pori air (Hydathodes) pada daun dan menyerang sistem transportasi xilem tanaman ( Dath & Devadath 1983).

Bakteri E. coli dan S. aureus digunakan sebagai bakteri uji untuk melihat kisaran spektrum dari zat antimikrob dihasilkan dari ketiga isolat Bacillus tersebut. Escherichia coli dan Staphylococcus aureus merupakan bakteri standar yang digunakan dalam pengujian bakteri penghasil antimikrob (Suparnika 2007). Pada umumnya bakteriosin lebih efektif menghambat galur-galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Jack et al. 1995). Semua isolat Bacillus yang diuji juga dapat menghambat pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Hal ini menunjukkan zat antimikrob yang dihasilkan oleh ketiga isolat Bacillus spp memiliki spektrum yang luas, ini dibuktikan dengan terbentuknya zona hambat terhadap ketiga bakteri uji.

Bacillus sp. merupakan bakteri Gram

Isolat A21

B. cereus galur HDYM-5 Isolat G3

B. pumilus

B. circulans galur A8

S. aureus

Isolat F13

B. subtilis galur YC11-B

E. coli X. oryzae 93 100 33 99 58 99 98 4 Isolat Spesies Bacillus homolog % identitas No.akses A21 B.cereus galur

HDYM-5 94 % EF428235.2

F13

B.subtilis galur

YC-11B 96% EU240964.1

G3

B.cereus isolat NH12-2

(13)

positif, berbentuk batang tunggal atau rantai, motil dengan flagela, bersifat aerob atau anaerob fakultatif, kemoorganotrof dengan metabolisme fermentatif dan respiratif. Genus ini memiliki kemampuan membentuk endospora di dalam sel vegetatifnya. Endospora adalah struktur berdinding tebal, sangat refraktif, dan hanya mengandung sedikit air sehingga resisten terhadap cekaman fisik (panas, kekeringan, UV) ataupun kimia (desinfektan, antibiotik, asam, dan basa) (Black 1999). Genus Bacillus memiliki endospora berbentuk oval dan kadang-kadang bundar atau silinder (Holt et al. 1994). Sifat endospora yang sangat resisten terhadap berbagai cekaman dan kondisi lingkungan dapat dijadikan bahan pertimbangan dalam mempermudah distribusi suatu produk yang berasal dari mikroorganisme hidup.

Kemampuan fisiologi ketiga isolat Bacillus sangat beragam antara lain peka terhadap panas, pH, dan salinitas, uji katalase dan VP positif, mampu mereduksi nitrat, dan menghidrolisis pati (Holt et al. 1994). Nilai positif pada uji nitrat menunjukkan bahwa isolat dapat mereduksi nitrat (NO3-) menjadi

nitrit (NO2-) dengan menggunakan enzim

nitrat reduktase. Kemampuan isolat Bacillus sp. dalam menghasilkan senyawa yang tidak bersifat asam atau produk akhir netral seperti asetilmetil karbinol dari asam organik (asam piruvat) sebagai hasil fermentasi glukosa ditunjukkan dengan hasil VP positif. Uji glukosa yang positif menunjukkan kemampuan isolat Bacillus sp. dalam melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan produk akhir berupa asam. Uji ONPG dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat dalam memproduksi enzim ß-galaktosidase yang dapat menghidrolisis substrat ONPG yang mengandung laktosa dan bersifat kromogenik, hasil positif akan mengubah warna media yang tidak berwarna menjadi kuning.

Kemampuan isolat dalam menghidrolisis makromolekul ditunjukkan oleh uji pati, uji gelatin, dan uji proteolitik yang bernilai positif. Uji pati positif menujukkan kemampuan isolat dalam menghidrolisis pati yang merupakan polisakarida menjadi oligosakarida dan monosakarida dengan menggunakan enzim amilase. Indeks hidrolisis yang dihasilkan oleh semua isolat

semakin meningkat dengan bertambahnya waktu inkubasi. Hal ini terjadi karena isolat Bacillus terus memanfaatkan pati dengan menghidrolisisnya untuk digunakan sebagai sumber karbon.

Uji gelatin dan uji proteolitik yang positif menunjukkan bahwa isolat dapat menghidrolisis gelatin ataupun protein yang merupakan molekul berukuran besar menjadi polipeptida dan kemudian menjadi asam amino dengan menggunakan enzim proteolitik ekstraseluler berupa gelatinase dan protease (Aronson et al. 1971).

Analisis sekuen gen 16S rRNA menunjukkan dua isolat yaitu isolat A21 dan G3 memiliki kemiripan terdekat dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan terdekat dengan Bacillus subtilis. Analisis gen 16S rRNA dengan sekuen oligonukleotida adalah cara yang efektif untuk mengetahui taksonomi prokariot termasuk bakteri genus Bacillus dan dapat dihubungan secara langsung dengan data filogenetik(Fox et al. 1977).

Bacillus subtilis merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang diketahui mampu memproduksi berbagai macam zat antimikrob, spesies ini dapat memproduksi lebih dari 24 jenis antibiotik dengan berbagai struktur dan bakteriosin. Bakteriosin yang banyak diproduksi oleh B. subtilis ialah subtilin, ericin, mersacidin, sublancin, dan subtilosin A (Stein et al. 2004; Stein 2005). Spesies ini juga mampu memproduksi berbagai macam enzim ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, nuklease, dan fosfatase (Slepecky & Henphill 1992) sehingga dapat digunakan sebagai agen bioremidiasi bahan organik di perairan. Agen bioremidiasi yang baik yaitu dapat memperbanyak diri dengan cepat dan memiliki kemampuan enzimatik yang baik. Bacillus subtilis diketahui tidak bersifat patogen baik terhadap tumbuhan, hewan, dan manusia karena memiliki virulensi dan toksisitas yang rendah (Claus & Berkeley 1986). Selain itu B. subtilis juga dapat bertahan pada kondisi yang tidak menguntungkan dengan membentuk endospora dan mampu hidup secara anaerobik dengan kehadiran glukosa dan nitrat (Claus & Berkeley 1986; Slepecky 1992).

(14)

antimikrob. Bakteri ini juga dapat menghasilkan enzim ektraseluler yaitu protease ( Aronson et al. 1971). Bacillus cereus diketahui dapat bersifat patogen terhadap makanan karena memiliki virulensi dan toksisitas yang cukup tinggi (Jekti 1990), namun untuk strain tertentu dari Bacillus cereus dapat menghasilkan senyawa antimikrob yang dapat dimanfaatkan sebagai agen pengendali hayati. Senyawa antimikrob yang dihasilkan dapat berupa bakteriosin dan antibiotik. Senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh ketiga isolat hanya merupakan bakteriosin ( Findy 2009).

SIMPULAN

Isolat Bacillus spp penghasil bakteriosin asal Hutan Wana Wisata

Cangkuang mampu menghambat

pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae., E. coli, dan S. aureus. Isolat A21 memiliki IP paling besar terhadap S. aureus dan E. coli, sedangkan isolat G3 memiliki IP paling besar terhadap X. oryzae pv. oryzae. Semua isolat merupakan bakteri gram positif dengan endospora berbentuk bulat. Isolat Bacillus spp memiliki kemampuan dalam mereduksi nitrat (kecuali F13), menghidrolisis pati dan gelatin, dapat memfermentasi glukosa, dan memproduksi ß-galaktosidase.

Berdasarkan sekuen 16S rRNA, isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 94% dan 95% dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan sebesar 96% dengan Bacillus subtilis. Kekerabatan antara ketiga isolat pada pohon filogenetik berada pada satu kelompok.

DAFTAR PUSTAKA

Aronson AI, Angelo N, Holt SC. 1971. Regulation of extracelular protease production in Bacillus cereus T: characterization of mutans producing altered amounts of protease. J Bacteriol 133:1016-1025.

Atlas RM, Bartha R. 1998. Microbial Ecology Fundamentals and Applications. Ed. ke-4. California: Benjamin.

Black JG. 1999. Microbiology Principles and Exploration. Ed ke-4. New York: John Wiley & Sons.

Claus D, Berkeley RCW. 1986. Genus Bacillus. Di dalam: Sneath PHA et al., eds. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume ke-2. Baltimore: Lippincott Willians & Wilkins. hlm 1105-1139.

Dath AP, Devadath S. 1983. Role of inoculum in irrigation water and soil in the incidence of bacterial blight of rice. Indian Phythopathol 36: 142-144. Findy K. 2009. Aktivitas penghambatan

Bacillus sp. Terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, dan Pseudomonas fluorescens [Skripsi]. Bogor : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Fox GE, Pechan KR, Woese CR. 1977. Comparative cataloging of 16s ribosomal ribonucleic acid: molecular approach to prokaryotic systematics. J Syst Bacteriol 27:4-57. Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar

dalam Praktek. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Holt JG, Kreig NR, Sneath PHA, Stanley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore: Lippincott Willians & Wilkins.

Irina VP, Philippe B, Bernard V, Bernard F. 2001. In Vitro anti Heliobacter pylori activity of the Probiotic strain B. subtilis is due to secreation of Antibiotic. J Antimicrob Agent Chemother 45:3156-3161.

Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriocin of Gram positive bacteria. Microbiol Rev 59:171-200.

Janes ME, Nannapanemi R, Johnson MG. 1999. Identification and characterization of two bacteriosin producing bacteria isolated from garlic and ginger root. J Food Protect 62:899-904.

Jekti RP. 1990. Cermin Dunia Kedokteran. Jakarta : Pusat Penelitian Penyakit Menular, Badan Penelitian Dan pengembangan Kesehatan,

(15)

Departemen Kesehatan RI.

Klaenhammer TR. 1993. Genetics of bacteriosin produced by latic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 12:39-86.

Kone K, Fung YC. 1992. Understanding bacteriosin and their uses in foods. Dairy, Food and Enviromental Sanitation 12:282-285.

Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987. Conservation of plasmid DNA sequences and pathovar identification of strain Xanthomonas campestris. Pytopathol 77: 1461-1467.

Lisboa MP, Bonato D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006. Characterization of a bakteriosin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from the Brazillian atlantic forest. Int Microbial 9:111-118.

Marchesi JR et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium specific PCR primer that amplify genes coding for bacterial 16S-rRNA. App Environ Microbiol 64:795-799.

Schillinger U. 1990. Bacteriocins of latic acid bacteria. Biotechnol. Food Quality. p. 55-74.

Slepecky RA, Henphill HR. 1992. The Genus Bacillus-nonmedical. Di dalam: Balows A, Trupper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH, editor. The Prokaryotes. Ed. ke-2. New York: Springer-Verlag. hlm 1663-1696. Sopyan AS, Findy K. 2007. Bacillus Sp.

Sebagai Penghasil Zat Antimikrob Dari Tanah Hutan wana Wisata Cangkuang [Studi Lapang]. Bogor : Program Sarjana, Institut Pertanian Bogor.

Stein T, Dusterhus S, Stroh A, Entian KD. 2004. Subtilosin production by two Bacillus subtilis subspecies and variance of the sbo-alb cluster. Appl Environ Microbiol 70:2349-2353. Stein T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics:

structures, syntheses and specific functions. Mol Microbiol 56:845– 857.

Suparnika I. 2007. Aktivitas antimikrob Bacillus sp. yang diisolasi dari

tambak udang [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

(16)

(17)

Lampiran 1 Hasil pewarnaan Gram isolat-isolat Bacillus spp

Pewarnaan Gram

Keterangan :

( ) = Morfologi sel Isolat Bacillus spp Isolat F13

Perbesaran : 100x10

Isolat G3

Perbesaran : 100x10 Isolat A21

(18)

Lampiran 2 Hasil pewarnaan endospora isolat-isolat Bacillus spp

Pewarnaan Spora

10

Keterangan : ( ) = Endospora Isolat F13

Perbesaran : 100x10 Isolat A21

Perbesaran : 100x10

Isolat G3

(19)

Lampiran 3 Hasil sekuen gen 16S rRNA dan BLAST-N isolat-isolat Bacillus spp

A) Isolat A21

Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat A21 (forward)

GNTGNGNCAGCTCTCANNANTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTACTGCC CATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGC ATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATT AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTG GCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAGCGCGCGCAGGTGGTTT CTTAAGTCTGATGTGAANGCCCNCGGCTCACCCGTGGAGGGTCNTNGNAACTGGNAA NTTGAGTGCAAAAGAANTGGATTCCCTGTGTACCGGTGAATGCNTAANATTTGGAGAA CCCCNTGNCAANGCACTTTCTGTCTGTACTGACCTGAGGCCNAAGCTGGGAACAACNG ATAAAACCTGGTATCCCCCCTAACANAANGCTAATGTTAAGGTTCCCCNTTATGTAANTA CCNTAACNNCCCTGGGAATCGCCCAAGTNAACCAAGATNAGGGCCCCCANCGNGACT GNTTTTNNAAACCNAACTNCGGTNACCNTGAACCANANGGTTCCTNGGANAAAAGGG GAGTTNCCCCCNNGGATNGGTACCCCANCCCTTTTTCCTNTTGNCCNGGGCGGGACNA AGGGAAAATNCCTNNGNCCCNTAGGNAAANACNGGGATNACNTNTTNGNCCCA

Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat A21

>gb|EF428235.2| Bacillus cereus strain HDYM-5 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence Length=1532

Score = 1016 bits (1126), Expect = 0.0

Identities = 647/687 (94%), Gaps = 17/687 (2%) Strand=Plus/Plus

Query 10

GCTCTCANNAN-TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTA-CCTGCCCATAAGACT 67 ||||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 79

GCTCTCAAGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACT 138

Query 68

GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAA 127 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 139

GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAA 198

Query 128

ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT 187 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 199

ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT 258

Query 188

GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC 247 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

(20)

GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC 318

Lampiran 3 (lanjutan)

Query 248

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG 307 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 319

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG 378

Query 308

GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC 367 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 379

GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC 438

Query 368

TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA 427 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 439

TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA 498

Query 428

GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC 487 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 499

GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC 558

Query 488

CGGAATTATTGGGCGT-AAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAANGCCCNC 546 |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| |

Sbjct 559

CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCAC 618

Query 547

GGCTCACCCGTGGAGGGTC-NTNGNAACTGGNA-ANTTGAGTGCAAAAAAG--AANTGG- 601 |||||| |||||||||||| | | |||||| | | ||||||||| || || || |||

Sbjct 619

GGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGA 678

Query 602

ATTCCCTGTGTACCGGTG-AATGCNTA-ANATTTGGA-GAAC-CCCNTGNC-AANGC-AC 655 ||||| |||||| ||||| ||||| || | || |||| |||| || || | || || ||

Sbjct 679

ATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAC 738

Query 656 TTTCT-GTCTGT-ACTGAC-CTGAGGC 679 ||||| |||||| |||||| ||||||| Sbjct 739 TTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC 765

(21)

B) Isolat F13

Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat F13 (reverse)

GTTAGGNGGANGATCCGCGATTACTANCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGA CTGCGATCCGAACTGAGAAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGC CCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTG ACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGA ATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC GACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAANGGGACGTC CTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGA ATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTC TTGCGACCGTACTCCCCANGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCG GAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGNGTGGACTACNAGGGTATCTANTC CTGTTCGCTCCCCACGCTTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACANACANAAAGTCGCCTNC GCCACTGGNGTTCTCNAATNTCTACGCATTTCACGCTACCCGTGNAATCCACTCCCCTC TTTTGCACTCANTTCCCNAGTTTCAATGACCCNCCCGGTNGANCNGGGGTTTNCATNA NAATTAAAAACCCCTGNGANCCTTTACCCCANANTTCGNAAAGCTTGCCCNTAGTNTA CCNGGTGGGGNNNTATTACCNGGNTTNGGTAGACNNAAGAACNCCNTNAANGATTTTT TCNTAAAAATTTANCNAACTNTCNCCGGGTNNCCNAATTNCTTGGAANCNAGNNCCCA AANGGNGTCCCNNGGAACNNNGGGNNCTTNTGAATNCNANAAGGNGNCTNGGGACC TTTTANGNANCGTACCTGNNCTAGNCCTCCCCAAAAANCCCTNTTNGGG

Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat F13

>gb|EU240964.1| Bacillus subtilis strain YC-11B 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence Length=800

Query 336

TTCTCCCCTCACCT-AANGTGCCCATCGC-ACTTTACGCATCTNTA-ANCTC-TTGNGGT 391 |||||| ||||||| || |||| |||||| ||||||||||||| || | ||| ||| |||

Sbjct 3

TTCTCCTCTCACCTTAAGGTGCACATCGCCACTTTACGCATCTCTACACCTCCTTGTGGT 62

Query 392

CACCGCNTCCGCTGAAANAC-ANACATTGACTGCGACTCCTCGCTTTTCGCACCCCTCGC 450 |||||| |||||||| | || | |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||

Sbjct 63

CACCGCTTCCGCTGAGAGACCAGACATTGACTGCGACTCCTCGCTTT-CGCACCCCTCGC 121

Query 451

TTGTCCTNATCTATGGGANCATCAGGTGNGGCATTTGCTACTCACGATTCACAATCCCCC 510 ||||||| |||||||||| ||||| ||| ||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 122

TTGTCCTAATCTATGGGACCATCAAGTGCGGCATTTGCTACTCACGATTCACAATCCCCC 181

Query 511

(22)

Sbjct 182

AAAGGCGGGGAATCACGACGTCGATTGCGTAATTCGTGAGGCGGACCCCTCATGCCAGCG 241

Query 571

TTCTGACTTTGAGTTTCCTTAACTGCCCCCGGGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATT 630 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 242

TTCTGACTTTGAGTTTCCTTAACTGCCCCCGGGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATT 301

Query 631

AAGCTTCGTTGCGCTTCTTGGAATGGTCCAGAACTGTAGGAGACTGTTAGGATCTCTATC 690 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 302

AAGCTTCGTTGCGCTTCTTGGAATGGTCCAGAACTGTAGGAGACTGTTAGGATCTCTATC 361

Query 691

CTGCAGGGNAAGCCCCCGTCTCACTGTCCACCACGTACCAACAGCAGTCGAGCACAGCAC 750 |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 362

CTGCAGGGGAAGCCCCCGTCTCACTGTCCACCACGTACCAACAGCAGTCGAGCACAGCAC 421

Query 751

TCTACAACCCAATTCAGGGCGTTGCTCGCGTTGGGAACTAGAATCAACGGTCGTAAGTCA 810 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 422

TCTACAACCCAATTCAGGGCGTTGCTCGCGTTGGGAACTAGAATCAACGGTCGTAAGTCA 481

Query 811

ACCCGTGAGATTCCACTGACGGCCACTGTTTGGCCTCCTTCCACCCCTACTGCAGTTTAG 870 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 482

ACCCGTGAGATTCCACTGACGGCCACTGTTTGGCCTCCTTCCACCCCTACTGCAGTTTAG 541

Query 871

TAGTACGGGGAATACTGGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGC 930 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 542

TAGTACGGGGAATACTGGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGC 601

Query 931

TTTGGCGCTCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTT 990 ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 602

TTTGGCGCTCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGAC-AAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTT 660

Query 991 GAGCTGACGCACTTCGACCTTAGCNATCATTAGCGCCTAG 1030 |||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||

Sbjct 661 GAGCTGACGCACTTCGACCTTAGCGATCATTAGCGCCTAG 700

(23)

C) Isolat G3

Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat G3 (forward)

AGCTCTCATAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGA CTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGGTTC GAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGT TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCG GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCG GGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTT GACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT AGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAA GTCTGATGTGAAAGCCCNCGGCTCANCCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGANACTTG AGTGCAAAAAAAGAAAGTGGANTCCNTGTGTANCGGTGAATGCGTAAANATTTGGAG AACCCCATNGGGNANGCNANTTTTGGTCTGTACTGACCTGAGNCCNAAACNTGGGGG CAACAGGATTAATACCTGGTATCCCCCCTAACAATNNTGCTAANGTAAAGGTTNCCCCN TTATGTGANTTACCNTAANNNCCCTGGGATCGCCCAGGTTAANTCAAGATTGCGGGNCC CCANCGGANNTGTTTNTNAAAACNAAACTTCGGNTGATCTTNAACNAAAAGTTCNTCG ANAANANGGGGNNTCCCCNGCGATNGTACCCACNCCTTTTTCCTTTGCTAGGCGANCN ANGGAAATTNCTNCGCCCTAGGAAAACGGATNACCTTTGNCNAAT

Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat G3

>gb|EF690421.1| Bacillus cereus isolate NH11-2 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence Length=1481

Query 2

GCTCTCAT-AAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACT 60 ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 86

GCTCTCAAGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACT 145

Query 61

GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGGTTCGAA 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 146

GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGGTTCGAA 205

Query 121

ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||

Sbjct 206

ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT 265

Query 181

(24)

Sbjct 266

GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC 325

Query 241

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 326

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG 385

Query 301

GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 386

GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC 445

Query 361

TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA 420 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 446

TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA 505

Query 421

GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC 480 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 506

GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC 565

Query 481

CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCNC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |

Sbjct 566

CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCAC 625

Query 541

GGCTCANCCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGANACTTGAGTGCaaaaaaaGAAAGTGG- 599 |||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || | ||||||||

Sbjct 626

GGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGA 685

Query 600

ANTCCNTGTGTANCGGTG-AATGCGTAAANATTTGGA-GAACCCCA-TNGGGNANGCNAN 656 | ||| |||||| ||||| |||||||| | || |||| |||| ||| | | | | || |

Sbjct 686

ATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAC 745

Query 657

TTT-TGGTCTGT-ACTGAC-CTGAGNC-CNAAA-CNTGGGG-GC-AACAGGATTA-ATA- 707 ||| |||||||| |||||| ||||| | | ||| | ||||| || |||||||||| |||

Sbjct 746

(25)

(26)

KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER

ISOLAT-ISOLAT

Bacillus

ADE SATRIA SOPYAN

DEPARTEMEN BIOLOGI

(27)

! " # $ $ % &'& ! ()#

!#$$%

*+,+-,.-! '!'& '&! ,

, ' / 0

!'&,1 2' ' '2

. 3" +4 & *+'' &

! ,.-'' &!

'' '' ' ' 52 +-6,

'! , ''','' 7 "+4,*+.-''''' &

89: 8;: +- '' ' & 84:

& !&

'

!02 %!2< 2 2

"22 2 ' % / &0

()#

'%=5*+,+-,.-6>&!&!

>! ,

' !& 2/0, !002, ?2 +4

>

22!2!*+!!&!&@

.-!!&!&@

!> /25@ +-6,2!,,2, !0A 2 0+4?2*+.-!>898;:'0

, >! +- ! 84: '0 !02

(28)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tujuan Penelitian

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Bahan dan Alat

Cangkuang, Sukabumi, Jawa Barat. Media agar nutrisi, agar pati, dan agar susu skim. Peralatan yang digunakan, yaitu PCR (Perkin Elmer Biosystem, USA), Laminar Air Flow, autoklaf, sentrifuse, elektroforesis mini-gel (BioRad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), UV Transluminator (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA), dan peralatan lainnya yang biasanya digunakan di laboratorium mikrobiologi.

Metode Penelitian

Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat

(29)

Tujuan Penelitian

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Bahan dan Alat

Peralatan yang digunakan, yaitu PCR (Perkin Elmer Biosystem, USA), Laminar Air Flow, autoklaf, sentrifuse, elektroforesis mini-gel (BioRad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), UV Transluminator (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA), dan peralatan lainnya yang biasanya digunakan di laboratorium mikrobiologi.

Metode Penelitian

Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat

(30)

GTC) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC) (Marchesi et al. 1998).

Kondisi PCR yang digunakan meliputi pradenaturasi (94o

C, 2 menit), denaturasi (95o_{C, 30 detik),}_{Annealing primer}₍₅₅o_{C, 30}

detik), Elongation atau perpanjangan primer (72o

C, 1 menit), dan post PCR (75o

C, 5 menit), dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus.

Pemisahan DNA produk PCR dilakukan pada Elektroforesis mini-gel dengan menggunakan agarose 1% pada tegangan listrik 70 volt selama 45 menit. Agarose direndam dalam Ethidium Bromida (EtBr) lalu diamati di atas UV Transluminator.

Sekuensing DNA

DNA hasil amplifikasi lalu dilakukan sekuensing di Charoen Phokphand-Jakarta untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Hasil sekuen kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotide) dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) untuk mengetahui kemiripan spesies dari isolat yang diuji.

Analisis Filogenetik

Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007), metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.

HASIL

Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp

Isolat-isolat Bacillus spp penghasil antimikrob dari hasil studi lapang di Hutan Wana Wisata Cangkuang, Sukabumi, Jabar diverifikasi daya hambatnya terhadap E. coli, S. Aureus , dan X. oryzae pv. oryzae dengan menggunakan metode cawan tuang (Lisboa et al. 2006). Tahap ini dilakukan untuk mengetahui bahwa isolat yang digunakan ialah isolat Bacillus spp yang menghasilkan zat antimikrob. Tiga isolat dipilih untuk menunjukkan aktivitas penghambatan terbaik dengan membentuk zona bening terhadap ketiga bakteri indikator tersebut yaitu isolat A21, F13, dan G3.

Besarnya daya hambat Bacillus spp A21, F13, dan G3 terhadap ketiga bakteri uji ditunjukkan pada Tabel 1. Kisaran IP isolat Bacillus spp yang diuji pada X. oryzae pv. oryzae, E. coli, dan S. aureus secara berurutan

[image:30.595.317.527.229.365.2]

pada kisaran 1-3.3, 1-2.25, dan 0.25-1.67. Isolat G3 memiliki IP terbesar terhadap X. oryzae pv. oryzae. yaitu 3.3, isolat A21 memiliki IP terbesar terhadap E. coli dan S. aureus yaitu 2.25 dan 1.67. Isolat F13 memiliki IP yang cukup besar terhadap X. oryzae pv. oryzae yaitu 2.67.

Tabel 1 Indeks penghambatan isolat Bacillus spp penghasil antimikrob terhadap bakteri uji dengan metode cawan tuang

Isolat

Aktivitas penghambatan terhadap Staphylococcu

saureus

Esherichi acoli

X.oryzae pv. oryzae

IP IP IP

A21 1,67 2,25 1

F13 1 1 2,67

G3 0,25 1 3,3

Keterangan: IP= Indeks Penghambatan

Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat

Semua isolat Bacillus spp bersifat Gram positif, berbentuk batang pendek hingga batang sedang dengan penataan tunggal, dan membentuk endospora. Endospora yang dimiliki isolat-isolat Bacillus spp berbentuk bulat dengan posisi sentral.

Uji fisiologi dilakukan dengan menggunakan MicrogenTM

GN-ID A+B Panel, sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik dilakukan secara manual masing-masing menggunakan media agar pati dan agar susu skim. Setelah diinkubasi selama semalam maka didapatkan hasil seperti pada Tabel 2. Isolat-isolat Bacillus spp yang diuji menunjukkan hasil positif terhadap uji pati, uji proteolitik, glukosa, O-nitrophenyl-β-D-galaktopiranosa (ONPG), Tryptophan Deaminase (TDA), gelatin, nitrat (kecuali F13), Xilosa (kecuali A21), indol (kecuali G3), urease (hanya A21), (VP) Voges-Proskauer (hanya A21), dan inositol (hanya A21). Sedangkan uji-uji fisiologi seperti lisin, ornitin, H2S, sitrat, manitol, sorbitol, malonat,

ramnosa, laktosa, arabinosa, adonitol, salisin, rafinosa,dan arginin menunjukkan hasil negatif untuk semua isolat. Semua isolat Bacillus sp. mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis pati yang ditunjukkan pada Tabel 3. Indeks hidrolisis yang dihasilkan semakin meningkat dengan bertambahnya waktu inkubasi. Ketiga isolat Bacillus dapat menghasilkan enzim protease, dilihat dari terbentuknya zona bening pada media agar

3 2

(31)

1 kb 1.5 kb 10 kb M 3 2 1 lainnya, yaitu sebesar 0,68.

[image:31.595.113.309.196.547.2]

Tabel 2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus spp

Tabel 3 Indeks hidrolisis pati Indeks hidrolisis

pada 24 jam

Indeks hidrolisis pada 48 jam

Ø Ø IH 3 Ø IH

A21 7 13.5 0.93 7.8 24.8 2.18

F13 5 6 0.2 6 8.5 0.42

G3 7 14.2 1.03 10.3 25.1 1.44

Keterangan: Ø = Diameter IH= Indeks Hidrolisis

Tabel 4. Indeks proteolitik (24 jam)

Isolat

Indeks proteolitik Ø koloni

(mm)

Ø zona bening (mm)

IP

A21 14,7 24,7 0,68

F13 7,4 11,6 0,57

G3 14 23 0,64

Isolasi DNA genom isolat-isolat Bacillus spp dengan menggunakan metode Lazo (Lazo et al. 1987) dapat dilakukan dengan baik, yang dibuktikan dengan terbentuknya satu pita untuk tiap DNA genom isolat-isolat Bacillus spp setelah dielektroforesis dan diamati di atas UV transluminator.

Amplifikasi gen 16S rRNA dari ketiga isolat Bacillus spp dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r yang spesifik untuk prokario. Hasil amplifikasi pada gel elekroforesis yang diamati di atas UV transluminator memperlihatkan adanya pita DNA penyandi gen 16S rRNA dengan ukuran ~1.3 kb setelah dibandingkan dengan DNA marker (1 kb DNA ladder) (Gambar 1).

M: marker 1 kb DNA ladder Sumur 1: Isolat A21 Sumur 2: Isolat F13 Sumur 3: Isolat G3

Gambar 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukkan pita DNA berukuran ~1.3 kb.

Sekuensing DNA

Hasil amplifikasi gen 16S rRNA kemudian disekuen untuk mengetahui urutan nukleotidanya. Hasil sekuen gen 16S rRNA tiap isolat kemudian dianalisis similaritasnya dengan data di GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida). Berdasarkan analisis program BLAST-N diketahui homologi spesies dari isolat yang diuji (lampiran 3 ).

Isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 94% dan 95% dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan sebesar 96% dengan Bacillus subtilis (Tabel 5). Hasil sekuen ketiga isolat tersebut termasuk ke dalam kingdom: Bacteria, Filum: Firmicutes, kelas: Bacili, ordo: Bacillales, dan famili: Bacillaceae. Uji Fisiologi Isolat Bacillus spp

A21 F13 G3

Nitrat + - +

Lisin - -

-Ornitin - -

-H2S - -

-Glukosa + + +

Manitol - -

-Xilosa - + +

ONPG + + +

Indol + +

-Urease + -

-VP + -

-Sitrat - -

-TDA + + +

Gelatin + + +

Malonat - -

-Inositol + -

-Sorbitol - -

-Rhamnosa - -

-Sukrosa -

-Laktosa - -

-Arabinosa - -

-Adonitol - -

-Raffinosa - -

-Salisin - -

-Arginin - -

-Pati + + +

(32)

[image:32.595.111.309.163.328.2]

Analisis Filogenetik

PEMBAHASAN

Isolat A21

B. pumilus

S. aureus

Isolat F13

E. coli X. oryzae 93 100 33 99 58 99 98 4 Isolat Spesies Bacillus homolog % identitas No.akses A21 B.cereus galur

HDYM-5 94 % EF428235.2

F13

B.subtilis galur

YC-11B 96% EU240964.1

G3

[image:32.595.90.498.575.732.2]

(33)

[image:33.595.111.309.163.328.2]

Analisis Filogenetik

PEMBAHASAN

Isolat A21

B. pumilus

S. aureus

Isolat F13

E. coli X. oryzae 93 100 33 99 58 99 98 Isolat Spesies Bacillus homolog % identitas No.akses A21 B.cereus galur

HDYM-5 94 % EF428235.2

F13

B.subtilis galur

YC-11B 96% EU240964.1

G3

[image:33.595.90.498.575.732.2]

(34)

positif, berbentuk batang tunggal atau rantai, motil dengan flagela, bersifat aerob atau anaerob fakultatif, kemoorganotrof dengan metabolisme fermentatif dan respiratif. Genus ini memiliki kemampuan membentuk endospora di dalam sel vegetatifnya. Endospora adalah struktur berdinding tebal, sangat refraktif, dan hanya mengandung sedikit air sehingga resisten terhadap cekaman fisik (panas, kekeringan, UV) ataupun kimia (desinfektan, antibiotik, asam, dan basa) (Black 1999). Genus Bacillus memiliki endospora berbentuk oval dan kadang-kadang bundar atau silinder (Holt et al. 1994). Sifat endospora yang sangat resisten terhadap berbagai cekaman dan kondisi lingkungan dapat dijadikan bahan pertimbangan dalam mempermudah distribusi suatu produk yang berasal dari mikroorganisme hidup.

Kemampuan fisiologi ketiga isolat Bacillus sangat beragam an