Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari 2009 sampai dengan bulan Juli 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan, yaitu isolat Bacillus spp asal tanah Hutan Wana Wisata
Cangkuang, Sukabumi, Jawa Barat. Media agar nutrisi, agar pati, dan agar susu skim. Peralatan yang digunakan, yaitu PCR (Perkin Elmer Biosystem, USA), Laminar Air Flow, autoklaf, sentrifuse, elektroforesis mini-gel (BioRad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), UV Transluminator (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA), dan peralatan lainnya yang biasanya digunakan di laboratorium mikrobiologi.
Metode Penelitian
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat-isolat Bacillus spp dimurnikan dan diremajakan pada media agar nutrisi dan diinkubasi pada suhu ruang selama dua hari.
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp terhadap Bakteri Indikator
Verifikasi daya hambat isolat-isolat Bacillus spp terhadap bakteri target dilakukan dengan mengamati zona bening yang terbentuk menggunakan metode cawan tuang (Lisboa et.al 2006). Bakteri uji yang digunakan ialah Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Besarnya indeks penghambatan (IP) dihitung dengan rumus:
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Isolat-isolat Bacillus spp yang telah murni dan berumur kurang dari 24 jam dan ±72 jam secara berurutan diamati bentuk dan morfologinya melalui pewarnaan Gram dan spora (Hadioetomo 1993). Selanjutnya dilakukan karakterisasi fisiologi dengan menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel. Sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik dilakukan masing-masing dengan menggunakan media agar pati dan agar susu skim (Hadioetomo 1993).
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom
Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode Lazo (Lazo et al. 1987). DNA genom hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan kit Ready To Go PCR Beads (Pharmacia-Biothec) dan primer spesifik 16S rRNA untuk prokariot, yaitu 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA
(mm) koloni diameter (mm) koloni diameter -(mm) zona diameter IP=
Genus Bacillus merupakan bakteri yang sangat baik digunakan sebagai agen biokontrol (Jack et al. 1995). Bakteri ini merupakan bakteri gram positif berbentuk batang, bersifat aerobik, serta dapat menghasilkan endospora (Schilinger 1990; Kone & Fung 1992; Klaenhammer 1993; Irina et al. 2001).
Bakteriosin dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan telah digunakan sebagai biopreservative dan terapeutik (Janes et al. 1999). Bakteriosin adalah zat antimikrob polipeptida atau protein yang diproduksi oleh mikroorganisme dan bersifat bakterisida maupun bakteriostatik. Bakteriosin membunuh sel targetnya dengan menyisip pada membran target dan mengakibatkan fungsi membran sel menjadi tidak stabil sehingga menyebabkan lisis sel (Atlas & Bartha 1998).
Beberapa isolat Bacillus yang diisolasi dari tanah Hutan Wana Wisata Cangkuang seperti isolat A, B, D, E, F, G, J, dan N
diketahui dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli dan Staphylococcus aureus (Sopyan & Findy 2007). Identifikasi isolat-isolat Bacillus tersebut secara morfologi, fisiologi, dan molekular penting dilakukan untuk mengetahui spesies dan karakter fisiologi dari isolat-isolat tersebut. Spesies yang telah teridentifikasi karakter fisiologinya memungkinkan dilakukannya kajian lebih mendalam tentang bioprospeksi hingga peluang rekayasa genetikanya.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi ciri-ciri fisiologi dan mengidentifikasi secara molekular isolat-isolat Bacillus spp asal tanah Hutan Wana Wisata Cangkuang yang memiliki potensi menghasilkan bakteriosin.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari 2009 sampai dengan bulan Juli 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan, yaitu isolat Bacillus spp asal tanah Hutan Wana Wisata
Peralatan yang digunakan, yaitu PCR (Perkin Elmer Biosystem, USA), Laminar Air Flow, autoklaf, sentrifuse, elektroforesis mini-gel (BioRad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), UV Transluminator (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA), dan peralatan lainnya yang biasanya digunakan di laboratorium mikrobiologi.
Metode Penelitian
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat-isolat Bacillus spp dimurnikan dan diremajakan pada media agar nutrisi dan diinkubasi pada suhu ruang selama dua hari.
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp terhadap Bakteri Indikator
Verifikasi daya hambat isolat-isolat Bacillus spp terhadap bakteri target dilakukan dengan mengamati zona bening yang terbentuk menggunakan metode cawan tuang (Lisboa et.al 2006). Bakteri uji yang digunakan ialah Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Besarnya indeks penghambatan (IP) dihitung dengan rumus:
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Isolat-isolat Bacillus spp yang telah murni dan berumur kurang dari 24 jam dan ±72 jam secara berurutan diamati bentuk dan morfologinya melalui pewarnaan Gram dan spora (Hadioetomo 1993). Selanjutnya dilakukan karakterisasi fisiologi dengan menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel. Sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik dilakukan masing-masing dengan menggunakan media agar pati dan agar susu skim (Hadioetomo 1993).
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom
Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode Lazo (Lazo et al. 1987). DNA genom hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan kit Ready To Go PCR Beads (Pharmacia-Biothec) dan primer spesifik 16S rRNA untuk prokariot, yaitu 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA
(mm) koloni diameter (mm) koloni diameter -(mm) zona diameter IP=
GTC) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC) (Marchesi et al. 1998).
Kondisi PCR yang digunakan meliputi pradenaturasi (94o
C, 2 menit), denaturasi (95oC, 30 detik), Annealing primer (55oC, 30 detik), Elongation atau perpanjangan primer (72o
C, 1 menit), dan post PCR (75o
C, 5 menit), dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus.
Pemisahan DNA produk PCR dilakukan pada Elektroforesis mini-gel dengan menggunakan agarose 1% pada tegangan listrik 70 volt selama 45 menit. Agarose direndam dalam Ethidium Bromida (EtBr) lalu diamati di atas UV Transluminator.
Sekuensing DNA
DNA hasil amplifikasi lalu dilakukan sekuensing di Charoen Phokphand-Jakarta untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Hasil sekuen kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotide) dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) untuk mengetahui kemiripan spesies dari isolat yang diuji.
Analisis Filogenetik
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007), metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.
HASIL
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp terhadap Bakteri Indikator
Isolat-isolat Bacillus spp penghasil antimikrob dari hasil studi lapang di Hutan Wana Wisata Cangkuang, Sukabumi, Jabar diverifikasi daya hambatnya terhadap E. coli, S. Aureus , dan X. oryzae pv. oryzae dengan menggunakan metode cawan tuang (Lisboa et al. 2006). Tahap ini dilakukan untuk mengetahui bahwa isolat yang digunakan ialah isolat Bacillus spp yang menghasilkan zat antimikrob. Tiga isolat dipilih untuk menunjukkan aktivitas penghambatan terbaik dengan membentuk zona bening terhadap ketiga bakteri indikator tersebut yaitu isolat A21, F13, dan G3.
Besarnya daya hambat Bacillus spp A21, F13, dan G3 terhadap ketiga bakteri uji ditunjukkan pada Tabel 1. Kisaran IP isolat Bacillus spp yang diuji pada X. oryzae pv. oryzae, E. coli, dan S. aureus secara berurutan
pada kisaran 1-3.3, 1-2.25, dan 0.25-1.67. Isolat G3 memiliki IP terbesar terhadap X. oryzae pv. oryzae. yaitu 3.3, isolat A21 memiliki IP terbesar terhadap E. coli dan S. aureus yaitu 2.25 dan 1.67. Isolat F13 memiliki IP yang cukup besar terhadap X. oryzae pv. oryzae yaitu 2.67.
Tabel 1 Indeks penghambatan isolat Bacillus spp penghasil antimikrob terhadap bakteri uji dengan metode cawan tuang
Isolat
Aktivitas penghambatan terhadap Staphylococcu saureus Esherichi acoli X.oryzae pv. oryzae IP IP IP A21 1,67 2,25 1 F13 1 1 2,67 G3 0,25 1 3,3
Keterangan: IP= Indeks Penghambatan
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Semua isolat Bacillus spp bersifat Gram positif, berbentuk batang pendek hingga batang sedang dengan penataan tunggal, dan membentuk endospora. Endospora yang dimiliki isolat-isolat Bacillus spp berbentuk bulat dengan posisi sentral.
Uji fisiologi dilakukan dengan menggunakan MicrogenTM
GN-ID A+B Panel, sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik dilakukan secara manual masing-masing menggunakan media agar pati dan agar susu skim. Setelah diinkubasi selama semalam maka didapatkan hasil seperti pada Tabel 2. Isolat-isolat Bacillus spp yang diuji menunjukkan hasil positif terhadap uji pati, uji proteolitik, glukosa, O-nitrophenyl-β-D-galaktopiranosa (ONPG), Tryptophan Deaminase (TDA), gelatin, nitrat (kecuali F13), Xilosa (kecuali A21), indol (kecuali G3), urease (hanya A21), (VP) Voges-Proskauer (hanya A21), dan inositol (hanya A21). Sedangkan uji-uji fisiologi seperti lisin, ornitin, H2S, sitrat, manitol, sorbitol, malonat, ramnosa, laktosa, arabinosa, adonitol, salisin, rafinosa,dan arginin menunjukkan hasil negatif untuk semua isolat. Semua isolat Bacillus sp. mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis pati yang ditunjukkan pada Tabel 3. Indeks hidrolisis yang dihasilkan semakin meningkat dengan bertambahnya waktu inkubasi. Ketiga isolat Bacillus dapat menghasilkan enzim protease, dilihat dari terbentuknya zona bening pada media agar
3 2
1 kb 1.5 kb 10 kb M 3 2 1 lainnya, yaitu sebesar 0,68.
Tabel 2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus spp
Tabel 3 Indeks hidrolisis pati Indeks hidrolisis pada 24 jam Indeks hidrolisis pada 48 jam Ø Ø IH 3 Ø IH A21 7 13.5 0.93 7.8 24.8 2.18 F13 5 6 0.2 6 8.5 0.42 G3 7 14.2 1.03 10.3 25.1 1.44 Keterangan: Ø = Diameter IH= Indeks Hidrolisis
Tabel 4. Indeks proteolitik (24 jam) Isolat Indeks proteolitik Ø koloni (mm) Ø zona bening (mm) IP A21 14,7 24,7 0,68 F13 7,4 11,6 0,57 G3 14 23 0,64
Isolasi DNA genom isolat-isolat Bacillus spp dengan menggunakan metode Lazo (Lazo et al. 1987) dapat dilakukan dengan baik, yang dibuktikan dengan terbentuknya satu pita untuk tiap DNA genom isolat-isolat Bacillus spp setelah dielektroforesis dan diamati di atas UV transluminator.
Amplifikasi gen 16S rRNA dari ketiga isolat Bacillus spp dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r yang spesifik untuk prokario. Hasil amplifikasi pada gel elekroforesis yang diamati di atas UV transluminator memperlihatkan adanya pita DNA penyandi gen 16S rRNA dengan ukuran ~1.3 kb setelah dibandingkan dengan DNA marker (1 kb DNA ladder) (Gambar 1).
M: marker 1 kb DNA ladder Sumur 1: Isolat A21 Sumur 2: Isolat F13 Sumur 3: Isolat G3
Gambar 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukkan pita DNA berukuran ~1.3 kb.
Sekuensing DNA
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA kemudian disekuen untuk mengetahui urutan nukleotidanya. Hasil sekuen gen 16S rRNA tiap isolat kemudian dianalisis similaritasnya dengan data di GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida). Berdasarkan analisis program BLAST-N diketahui homologi spesies dari isolat yang diuji (lampiran 3 ).
Isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 94% dan 95% dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan sebesar 96% dengan Bacillus subtilis (Tabel 5). Hasil sekuen ketiga isolat tersebut termasuk ke dalam kingdom: Bacteria, Filum: Firmicutes, kelas: Bacili, ordo: Bacillales, dan famili: Bacillaceae. Uji Fisiologi Isolat Bacillus spp
A21 F13 G3 Nitrat + - + Lisin - - -Ornitin - - -H2S - - -Glukosa + + + Manitol - - -Xilosa - + + ONPG + + + Indol + + -Urease + - -VP + - -Sitrat - - -TDA + + + Gelatin + + + Malonat - - -Inositol + - -Sorbitol - - -Rhamnosa - - -Sukrosa - -Laktosa - - -Arabinosa - - -Adonitol - - -Raffinosa - - -Salisin - - -Arginin - - -Pati + + + 3 zona bening (mm) koloni (mm) zona bening (mm) koloni (mm) Isolat
Gambar 2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus spp yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya dan bakteri uji.
Tabel 5 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N
Analisis Filogenetik
Data sekuen gen 16S rRNA dari ketiga isolat kemudian dibandingkan dengan beberapa data sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya seperti B. subtilis galur YC11-B dan B. cereus galur HDYM-5. Hasil perbandingan sekuen ini kemudian divisualisasikan dalam bentuk pohon filogenetik yang dapat menunjukkan kekerabatan (Gambar 2). Isolat A21 dan G3 yang diuji berada satu kelompok dengan B. cereus galur HDYM-5, sedangkan isolat F13 berada satu kelompok dengan B. subtilis galur YC11-B. Angka pada cabang menunjukkan nilai bootstrap.
PEMBAHASAN
Verifikasi daya hambat isolat-isolat Bacillus spp terhadap bakteri indikator X.
oryzae pv. oryzae, E. coli, dan S. aureus dilakukan untuk membuktikan bahwa isolat-isolat yang digunakan masih memiliki aktivitas penghambatan antimikrob terutama terhadap bakteri patogen. Genus Xanthomonas merupakan bakteri patogen pada tanaman. Bakteri ini termasuk dalam famili Pseudomonadaceae dan merupakan bakteri gram negatif. X. oryzae pv. oryzae merupakan bakteri patogen pada tanaman yang dapat menyebabkan penyakit bacterial blight pada padi. Serangan yang dihasilkan menyebabkan kerusakan pada daun padi dan mempunyai efek yang serius pada produksi tanaman ini. Bakteri ini masuk melalui luka atau pori-pori air (Hydathodes) pada daun dan menyerang sistem transportasi xilem tanaman ( Dath & Devadath 1983).
Bakteri E. coli dan S. aureus digunakan sebagai bakteri uji untuk melihat kisaran spektrum dari zat antimikrob dihasilkan dari ketiga isolat Bacillus tersebut. Escherichia coli dan Staphylococcus aureus merupakan bakteri standar yang digunakan dalam pengujian bakteri penghasil antimikrob (Suparnika 2007). Pada umumnya bakteriosin lebih efektif menghambat galur-galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Jack et al. 1995). Semua isolat Bacillus yang diuji juga dapat menghambat pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Hal ini menunjukkan zat antimikrob yang dihasilkan oleh ketiga isolat Bacillus spp memiliki spektrum yang luas, ini dibuktikan dengan terbentuknya zona hambat terhadap ketiga bakteri uji.
Bacillus sp. merupakan bakteri Gram
Isolat A21
B. cereus galur HDYM-5 Isolat G3
B. pumilus
B. circulans galur A8
S. aureus
Isolat F13
B. subtilis galur YC11-B
E. coli X. oryzae 93 100 33 99 58 99 98 4 Isolat Spesies Bacillus homolog % identitas No.akses A21 B.cereus galur HDYM-5 94 % EF428235.2 F13 B.subtilis galur YC-11B 96% EU240964.1 G3 B.cereus isolat NH12-2 95% EF690431.1
Gambar 2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus spp yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya dan bakteri uji.
Tabel 5 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N
Analisis Filogenetik
Data sekuen gen 16S rRNA dari ketiga isolat kemudian dibandingkan dengan beberapa data sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya seperti B. subtilis galur YC11-B dan B. cereus galur HDYM-5. Hasil perbandingan sekuen ini kemudian divisualisasikan dalam bentuk pohon filogenetik yang dapat menunjukkan kekerabatan (Gambar 2). Isolat A21 dan G3 yang diuji berada satu kelompok dengan B. cereus galur HDYM-5, sedangkan isolat F13 berada satu kelompok dengan B. subtilis galur YC11-B. Angka pada cabang menunjukkan nilai bootstrap.
PEMBAHASAN
Verifikasi daya hambat isolat-isolat Bacillus spp terhadap bakteri indikator X.
oryzae pv. oryzae, E. coli, dan S. aureus dilakukan untuk membuktikan bahwa isolat-isolat yang digunakan masih memiliki aktivitas penghambatan antimikrob terutama terhadap bakteri patogen. Genus Xanthomonas merupakan bakteri patogen pada tanaman. Bakteri ini termasuk dalam famili Pseudomonadaceae dan merupakan bakteri gram negatif. X. oryzae pv. oryzae merupakan bakteri patogen pada tanaman yang dapat menyebabkan penyakit bacterial blight pada padi. Serangan yang dihasilkan menyebabkan kerusakan pada daun padi dan mempunyai efek yang serius pada produksi tanaman ini. Bakteri ini masuk melalui luka atau pori-pori air (Hydathodes) pada daun dan menyerang sistem transportasi xilem tanaman ( Dath & Devadath 1983).
Bakteri E. coli dan S. aureus digunakan sebagai bakteri uji untuk melihat kisaran spektrum dari zat antimikrob dihasilkan dari ketiga isolat Bacillus tersebut. Escherichia coli dan Staphylococcus aureus merupakan bakteri standar yang digunakan dalam pengujian bakteri penghasil antimikrob (Suparnika 2007). Pada umumnya bakteriosin lebih efektif menghambat galur-galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Jack et al. 1995). Semua isolat Bacillus yang diuji juga dapat menghambat pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Hal ini menunjukkan zat antimikrob yang dihasilkan oleh ketiga isolat Bacillus spp memiliki spektrum yang luas, ini dibuktikan dengan terbentuknya zona hambat terhadap ketiga bakteri uji.
Bacillus sp. merupakan bakteri Gram
Isolat A21
B. cereus galur HDYM-5 Isolat G3
B. pumilus
B. circulans galur A8
S. aureus
Isolat F13
B. subtilis galur YC11-B
E. coli X. oryzae 93 100 33 99 58 99 98 Isolat Spesies Bacillus homolog % identitas No.akses A21 B.cereus galur HDYM-5 94 % EF428235.2 F13 B.subtilis galur YC-11B 96% EU240964.1 G3 B.cereus isolat NH12-2 95% EF690431.1
positif, berbentuk batang tunggal atau rantai, motil dengan flagela, bersifat aerob atau anaerob fakultatif, kemoorganotrof dengan metabolisme fermentatif dan respiratif. Genus ini memiliki kemampuan membentuk endospora di dalam sel vegetatifnya. Endospora adalah struktur berdinding tebal, sangat refraktif, dan hanya mengandung sedikit air sehingga resisten terhadap cekaman fisik (panas, kekeringan, UV) ataupun kimia (desinfektan, antibiotik, asam, dan basa) (Black 1999). Genus Bacillus memiliki endospora berbentuk oval dan kadang-kadang bundar atau silinder (Holt et al. 1994). Sifat endospora yang sangat resisten terhadap berbagai cekaman dan kondisi lingkungan dapat dijadikan bahan pertimbangan dalam mempermudah distribusi suatu produk yang berasal dari mikroorganisme hidup.
Kemampuan fisiologi ketiga isolat Bacillus sangat beragam antara lain peka terhadap panas, pH, dan salinitas, uji katalase dan VP positif, mampu mereduksi nitrat, dan menghidrolisis pati (Holt et al. 1994). Nilai positif pada uji nitrat menunjukkan bahwa isolat dapat mereduksi nitrat (NO3-) menjadi nitrit (NO2-) dengan menggunakan enzim nitrat reduktase. Kemampuan isolat Bacillus sp. dalam menghasilkan senyawa yang tidak bersifat asam atau produk akhir netral seperti asetilmetil karbinol dari asam organik (asam piruvat) sebagai hasil fermentasi glukosa ditunjukkan dengan hasil VP positif. Uji glukosa yang positif menunjukkan kemampuan isolat Bacillus sp. dalam melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan produk akhir berupa asam. Uji ONPG dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat dalam memproduksi enzim ß-galaktosidase yang dapat menghidrolisis substrat ONPG yang mengandung laktosa dan bersifat kromogenik, hasil positif akan mengubah warna media yang tidak berwarna menjadi kuning.
Kemampuan isolat dalam menghidrolisis makromolekul ditunjukkan oleh uji pati, uji gelatin, dan uji proteolitik yang bernilai positif. Uji pati positif menujukkan kemampuan isolat dalam menghidrolisis pati yang merupakan polisakarida menjadi oligosakarida dan monosakarida dengan menggunakan enzim amilase. Indeks hidrolisis yang dihasilkan oleh semua isolat
semakin meningkat dengan bertambahnya waktu inkubasi. Hal ini terjadi karena isolat Bacillus terus memanfaatkan pati dengan menghidrolisisnya untuk digunakan sebagai sumber karbon.
Uji gelatin dan uji proteolitik yang positif menunjukkan bahwa isolat dapat menghidrolisis gelatin ataupun protein yang merupakan molekul berukuran besar menjadi polipeptida dan kemudian menjadi asam amino dengan menggunakan enzim proteolitik ekstraseluler berupa gelatinase dan protease (Aronson et al. 1971).
Analisis sekuen gen 16S rRNA menunjukkan dua isolat yaitu isolat A21 dan G3 memiliki kemiripan terdekat dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan terdekat dengan Bacillus subtilis. Analisis gen 16S rRNA dengan sekuen oligonukleotida adalah cara yang efektif untuk mengetahui taksonomi prokariot termasuk bakteri genus Bacillus dan dapat dihubungan secara langsung dengan data filogenetik(Fox et al. 1977).
Bacillus subtilis merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang diketahui mampu memproduksi berbagai macam zat antimikrob, spesies ini dapat memproduksi lebih dari 24 jenis antibiotik dengan berbagai struktur dan bakteriosin. Bakteriosin yang banyak diproduksi oleh B. subtilis ialah subtilin, ericin, mersacidin, sublancin, dan subtilosin A (Stein et al. 2004; Stein 2005). Spesies ini juga mampu memproduksi berbagai macam enzim ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, nuklease, dan fosfatase (Slepecky & Henphill 1992) sehingga dapat digunakan sebagai agen bioremidiasi bahan organik di perairan. Agen bioremidiasi yang baik yaitu dapat memperbanyak diri dengan cepat dan memiliki kemampuan enzimatik yang baik. Bacillus subtilis diketahui tidak bersifat patogen baik terhadap tumbuhan, hewan, dan manusia karena memiliki virulensi dan toksisitas yang rendah (Claus & Berkeley 1986). Selain itu B. subtilis juga dapat bertahan pada kondisi yang tidak menguntungkan dengan membentuk endospora dan mampu hidup secara anaerobik dengan kehadiran glukosa dan nitrat (Claus & Berkeley 1986; Slepecky 1992).
Seperti halnya B. subtilis, Bacillus cereus juga mampu memproduksi antibiotik dan
antimikrob. Bakteri ini juga dapat menghasilkan enzim ektraseluler yaitu protease ( Aronson et al. 1971). Bacillus cereus diketahui dapat bersifat patogen terhadap makanan karena memiliki virulensi dan toksisitas yang cukup tinggi (Jekti 1990), namun untuk strain tertentu dari Bacillus cereus dapat menghasilkan senyawa antimikrob yang dapat dimanfaatkan sebagai agen pengendali hayati. Senyawa antimikrob yang dihasilkan dapat berupa bakteriosin dan antibiotik. Senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh ketiga isolat hanya merupakan bakteriosin ( Findy 2009).
SIMPULAN
Isolat Bacillus spp penghasil bakteriosin asal Hutan Wana Wisata
Cangkuang mampu menghambat
pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae., E. coli, dan S. aureus. Isolat A21 memiliki IP paling besar terhadap S. aureus dan E. coli, sedangkan isolat G3 memiliki IP paling besar terhadap X. oryzae pv. oryzae. Semua isolat merupakan bakteri gram positif dengan endospora berbentuk bulat. Isolat Bacillus spp memiliki kemampuan dalam mereduksi nitrat (kecuali F13), menghidrolisis pati dan gelatin, dapat memfermentasi glukosa, dan memproduksi ß-galaktosidase.
Berdasarkan sekuen 16S rRNA, isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 94% dan 95% dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan sebesar 96% dengan Bacillus subtilis. Kekerabatan antara ketiga isolat pada pohon filogenetik berada pada satu kelompok.