1
Pengaruh Ekstrak Ethanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L) Terhadap Ekspresi cAMP Responsive Element Modulator (CREM) Dan Morfologi Spermatozoa Pasca Paparan
Asap Rokok Pada Tikus (Rattus norvegicus) Jantan
The Effect of Mangosteen Peel (Garcinia mangostana L) Ethanol Extract Toward cAMP Responsive Element Modulator (CREM) Expression And Spermatozoa Morphology Of
Cigarette-Smoked Male Rats (Rattus norvegicus)
Friski Rosandi Afrizal, Aulanni’am, Agung Pramana Warih Marhendra Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan,
Universitas Brawijaya
[email protected], [email protected] ABSTRAK
Asap rokok mengandung banyak radikal bebas yang membahayakan kesehatan, radikal bebas tersebut dapat mengganggu proses spermatogenesis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak ethanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L) terhadap ekspresi cAMP Responsive Element Modulator (CREM) dan morfologi spermatozoa pasca paparan asap rokok pada tikus (Rattus norvegicus) jantan. Pada penelitian ini menggunakan tikus (Rattus norvegicus) jantan yang dibagi dalam 5 kelompok. Kelompok (1) adalah kelompok kontrol negatif, kelompok (2) adalah kelompok kontrol positif yang diberikan paparan asap rokok, kelompok (3), (4) dan (5) adalah tikus yang dipapar asap rokok dan diberi terapi ekstrak ethanol kulit manggis dengan dosis 200 mg/kg BB, 400 mg/kg BB, dan 600 mg/kg BB. Paparan asap rokok dilakukan selama 30 hari dan sebanyak 2 batang per hari dengan cara memasukkan asap rokok ke dalam kotak kedap udara yang berisi 5 ekor tikus. Pemberian terapi dilakukan dengan cara sonde. Ekspresi CREM diamati dengan menggunakan metode immunohistokimia dan morfologi spermatozoa diamati menggunakan mikroskop. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi menggunakan ekstrak ethanol kulit buah manggis pada tikus yang terpapar asap rokok secara signifikan (p<0,05) dapat meningkatkan ekspresi CREM dan dapat memperbaiki abnormalitas spermatozoa. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak ethanol kulit buah manggis yang mengandung antioksidan, semakin tinggi dosis terapi yakni dengan dosis 600 mg/kg BB mampu meningkatkan ekspresi CREM sebanyak 95,80% dan dapat memperbaiki abnormalitas morfologi spermatozoa.
Kata kunci : Radikal bebas, Ekstrak ethanol kulit buah manggis, cAMP Responsive Element Modulator (CREM), Morfologi Spermatozoa.
ABSTRACT
Cigarette smoke contains free radicals which are very harmful. These free radicals may harm spermatogenesis process. The purpose of this study is to examine the effect of Mangosteen peel (Garcinia mangostana L) ethanol extract toward cAMP Responsive Element Modulator (CREM) expression and spermatozoa morphology of cigarette-smoked male rats (Rattus norvegicus). The subjects of this research were male rats divided into five groups. The first group was negative control group, the second group was cigarette-smoked rats positive control group, the third, fourth and fifth groups were cigarette-smoked rats given mangosteen peel ethanol extract therapy 200 mg/kg BW, 400 mg/kg BW, and 600 mg/kg BW. The exposure of cigarette smoke was conducted for 30 days by inducing the smoke of two cigarettes into airproof box for five rats. This treatment was given ussualy by “sonde” technique. The CREM expression was examined using immunohistochemistry method, meanwhile the spermatozoa morphology was examined microscopically. The result of this research shows that therapy of mangosteen peel ethanol extract toward cigarette-smoked rats significantly (p< 0.05) increase the CREM expression and repair spermatozoa abnormality. Thus, it can be concluded
2
that ethanol extract of mangosteen peel which is rich in antioxidant, with higher dosage which is 600mg/kg BW could significantly increase CREM expression 95,80% and repair the spermatozoa morphology abnormality.
Keywords: Free radicals, mangosteen peel ethanol extract, cAMP Responsive Element Modulator (CREM), Spermatozoa Morphology
Pendahuluan
Merokok merupakan suatu masalah kesehatan pada masyarakat dan merupakan ancaman besar bagi kesehatan manusia. Rokok secara luas telah menjadi salah satu penyebab kematian terbesar di dunia. Apabila hal ini berlangsung terus menerus sampai tahun 2030, maka kebiasaan merokok dapat menyebabkan kematian sebesar satu dari enam orang (Rehane, 2006).
Rokok mengandung banyak bahan kimia yang membahayakan kesehatan. Bahan kimia di dalam rokok antara lain adalah nikotin, tar, karbon monoksida, methanol, formic acid, dan formaldehyde. Demikian pula asap rokok yang mengandung radikal bebas dalam jumlah yang sangat tinggi. Dalam satu kali hisapan rokok diperkirakan terdapat sekitar 1014 molekul radikal bebas yang terkandung dalam asap rokok (Yuniwati dan Mulyohadi, 2004).
Radikal bebas yang terkandung di dalam asap rokok dapat menyebabkan penyakit berbahaya contohnya adalah infertilitas dan akan menurunkan antioksidan pada semen. Infertilitas sperma tersebut disebabkan oleh kelainan morfologi dan konsentrasi spermatozoa (Saleh et al., 2003). Selain menyebabkan kelainan morfologi spermatozoa, radikal bebas juga dapat mengganggu proses spermatogenesis. Proses
yang terganggu adalah proses transkripsi spermatogenesis yang berhubungan dengan cAMP Responsive Element Modulator (CREM). cAMP Responsive Element Modulator merupakan modulator penting untuk proses spermatogenesis pada fase transkripsi (Aulanni’am, 2011).
Penelitian Mardawati dkk (2008), menyebutkan bahwa kulit buah manggis telah diketahui mengandung banyak senyawa xanthone yang berperan sebagai antioksidan, antiproliferativ, serta antimicrobial. Kulit buah manggis yang mengandung antioksidan diharapkan mampu untuk mereduksi radikal bebas sehingga dapat meningkatkan ekspresi CREM dan menjaga morfologi spermatozoa.
Materi dan Metode Penelitian Perlakuan Hewan Coba
Hewan model menggunakan tikus (Rattus norvegicus) jantan strain wistar. Hewan coba dibagi kedalam lima kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol positif, kelompok negatif, kelompok terapi dosis 200 mg/kg BB, kelompok terapi dosis 400 mg/kg BB dan kelompok terapi 600 mg/kg BB. Hewan coba berumur 8-12 minggu dan berat badan sekitar 150-200 gram. Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini mendapatkan persetujuan laik etik
3 dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya, No 185-KEP-UB.
Pemaparan Asap Rokok
Pemaparan asap rokok ini dilakukan terhadap tikus sehat selama 30 hari menggunakan 2 batang rokok per hari. Pemaparan ini dilakukan pada pagi hari dengan cara hewan coba diletakkan di tempat khusus dan diberi ventilasi berupa selang serta batang rokok yang telah di bakar pada tempat tersebut (Mansour, 2013).
Tatalaksana Terapi Ekstrak Ethanol Kulit Buah Manggis
Terapi tikus terpapar asap rokok dengan ekstrak ethanol kulit manggis, tikus sakit (kelompok terapi) di lakukan terapi secara oral (sonde) dengan ekstrak etanol kulit manggis masing-masing sebanyak 1ml. Perlakuan terapi ini dilakukan 21 hari. Sonde dilakukan pada pagi hari dengan menggunakan alat khusus berupa spuit yang telah dimodifikasi (Mansour, 2013).
Dosis Ekstrak Ethanol Kulit Buah Manggis Penentuan dosis ekstrak ethanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L) yaitu menggunakan dosis 200 mg/Kg BB, dosis 400 mg/Kg BB dan dosis 600 mg/kg BB. Metode pembuatan ekstrak ethanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L) yaitu kulit buah manggis yang telah menjadi serbuk dilakukan penghilangan tannin selanjutnya dilakukan maserasi menggunakan ethanol 50%. Kemudian dilakukan destilasi yang bertujuan untuk memisahkan ethanol dan air.
Metode Imunohistokimia
Preparat testis direndam pada xilol 1, xilol 2, ethanol bertingkat (96%, 90%, 80%, 70%, 70%), dan aquades. Preparat testis dicuci menggunakan PBS pH 7,4 selama 5 menit. Kemudian preparat testis ditetesi dengan H2O2 3% selama 20 menit. Setelah itu dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak tiga kali. Kemudian dilakukan bloking menggunakan BSA 1% (Bovine Serum Albumin) dalam PBS selama 30 menit pada suhu ruang. Setelah itu dicuci menggunakan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak tiga kali. Kemudian diinkubasi dengan menggunakan antibody primer (anti goat CREM) selama semalam pada suhu 40°C, kemudian dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak tiga kali. Preparat diinkubasi menggunakan antibody sekunder berlabel biotin selama 1 jam pada suhu ruang. Kemudian preparat dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak tiga kali. Kemudian preparat ditetesi dengan SA-HRP (Strep Avidin-horse Radish Peroxidase) dan diinkubasi selama 40 menit. Setelah itu preparat dicuci dengan PBS pH 7,4 selama lima menit sebanyak tiga kali. Kemudian preparat ditetesi dengan DAB (Diamino Benzidine) dan diinkubasi selama 10 menit. Setelah itu preparat tersebut dicuci dengan PBS dengan pH 7,4 selama 5 menit sebanyak tiga kali. Preparat dicuci dengan air mengalir kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringanginkan. Preparat di mounting dengan entellan dan ditutup dengan cover glass (Shofia, 2012).
4 Pengamatan morfologi spermatozoa
Spermatozoa diambil dari testis dexter bagian cauda epididimis tikus wistar jantan secukupnya dan diletakkan pada obyek glass yang telah diberi NaCl fisiologis sebelumnya. Pengambilan data kelainan morfologi spermatozoa dilakukan dengan menghitung spermatozoa yang mengalami kelainan morfologi spermatozoa dengan perbesaran 400 kali sebanyak 5 lapang pandang (WHO, 2006).
Hasil dan Pembahasan
Pengaruh paparan asap rokok sebagai radikal bebas terhadap ekspresi cAMP Responsive Element Modulator (CREM) pada penelitian ini dapat diamati menggunakan metode imunohistokimia (Tabel 1).
Perbedaan rata-rata ekspresi CREM yang diamati antara kelompok tikus sehat (P1) (tanpa paparan asap rokok) dengan kelompok P2 (terpapar asap rokok) mengalami penurunan ekspresi CREM sebesar 95,50% yang ditandai dengan hasil yang signifikan (p<0,05). Hasil ini
menunjukkan bahwa pemberian paparan asap rokok yang mengandung radikal bebas dapat menurunkan ekspresi CREM secara signifikan. Pada kelompok perlakuan P4 (terpapar asap rokok + terapi 400 mg/kg BB) dan P5 (terpapar asap rokok + terapi 600 mg/kg BB) menunjukkan adanya peningkatan ekspresi CREM yang signifikan (p<0,05) yang ditandai dengan peningkatan secara berturut-turut 94,94% dan 95,80%. Hal ini diyakini bahwa ekstrak ethanol kulit buah manggis yang mengandung xanthone dan telah di konfirmasi dengan uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) mampu meningkatkan ekspresi CREM. Dosis terapi ekstrak ethanol 600 mg/kg BB telah mampu menjaga homeostasis oksidan dan antioksidan di dalam tubuh, hal ini sesuai
dengan pendapat Miryanti (2011) yang menyebutkan bahwa xanthonemampu mengikat oksigen bebas yang tidak stabil yaitu radikal bebas di dalam tubuh.
Gambar A (kontrol negatif) menunjukkan ekspresi CREM yang tinggi Tabel 1. Data perhitungan rata-rata ekspresi CREM pada tikus
Keterangan: Notasi yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05). No Kelompok Ekspresi CREM
Penurunan Ekspresi (%) Peningkatan Ekspresi (%) 1 P1 12,054 ± 1,06 c 2 P2 0,542 ± 0,21 a 95,50 3 P3 1,034 ± 0,56 a 47,58 4 P4 10,724 ± 3,59 b 94,94 5 P5 12,924 ± 3,18 c 95,80
5 ditandai dengan warna coklat yang tersebar pada tubulus seminiferus. Gambar B (kontrol positif) menunjukkan ekspresi CREM yang jauh menurun jika dibandingkan dengan gambar A. Hasil ini dikarenakan adanya penurunan fungsi hipotalamus yang disebabkan karena adanya
paparan asap rokok yang menurunkan kerja dari pituitary anterior, hal ini karena di dalam asap rokok terdapat banyak bahan kimia yang berbahaya bagi tubuh. Selain nikotin, zat lain yang terkandung dalam asap rokok adalah bahan radikal bebas (Amal, 2011).
Penurunan fungsi fisiologi reproduksi hormonal pada hipotalamus akan menurunkan hormon peptida yakni Gonadotropin Releasing
Hormon (GnRH) yang di alirkan dari kelenjar
pituitary. Adanya rangsangan GnRH akan
mengakibatkan hambatan pituitari
mensekresikan serta melepaskan sejumlah hormon gonadotropik. Hormon gonadotropik tersebut adalah hormon Folicle Stimulating
Hormone (FSH) dan Luitenizing Hormone (LH)
(Aulanni’am, 2011).
Hambatan sekresi FSH dapat mempengaruhi proses spermatogenesis dan Gambar 1. Ekspresi CREM pada testis tikus Rattus norvegicus jantan.
Keterangan : A menunjukkan kelompok sehat. B menunjukkan kelompok sakit. C menunjukkan kelompok 200 mg/kgBB. D menunjukkan kelompok 400 mg/kgBB. E menunjukkan kelompok 600 mg/kgBB. Tanda panah menunjukkan ekspresi CREM.
6 dapat menurunkan produksi spermatozoa pada usia dewasa. Signal transduksi FSH bersama reseptornya (FSH-R) merupakan saat yang kritis dalam menjaga gametogenesis normal pada gonad mamalia (Hermann and Heckert, 2006). Hambatan ikatan antara FSH dan FSH-R pada sel sertoli akan menurunkan induksi adenilat siklase (AS), sehingga menyebabkan penurunan konsentrasi cAMP intra sel sertoli. Kondisi ini menyebabkan penurunan aktivasi cAMP-dependent PKA, yang akhirnya menghambat fosforilasi faktor transkripsi cAMP-responsive element modulator (CREM) (Groussin and Bertherat, 1998). Molekul CREM merupakan kunci regulator molekular terhadap seluruh stadium spermatogenesis dan meregulasi ekspresi sejumlah gen post-meiosis penting, seperti protein transisi dan protamine (Aulanni’am et al., 2011).
Hambatan fosforilasi pada CREM ini akan mengganggu proses spermatogenesis yang akan menyebabkan meningkatnya infertilitas pada pejantan. Penurunan ekspresi CREM secara nyata dapat dilihat antara kelompok P1
dan P2 yang mengalami penurunan sebesar 95,50%.
Untuk meningkatkan fosforilasi CREM ini dibutuhkan suatu antioksidan untuk menangkap radikal bebas. Kulit buah Manggis diketahui mengandung senyawa xanthone sebagai antioksidan (Mardawati dkk, 2008). Xanthone dalam kulit buah manggis ini diharapkan mampu untuk menurunkan radikal bebas sehingga dapat meningkatkan fosforilasi pada CREM. Peningkatan ekspresi CREM dapat dilihat pada gambar C (dosis terapi ekstrak ethanol kulit buah manggis 200 mg/kg BB), gambar D (dosis terapi ekstrak ethanol kulit buah manggis 400 mg/kg BB), gambar E (dosis terapi ekstrak ethanol kulit buah manggis 600 mg/kg BB), menunjukkan ekspresi CREM yang terus meningkat pada tiap tingkatan terapi. Gambar E menunjukkan ekpresi CREM yang paling tinggi dan mendekati hasil ekspresi CREM gambar kontrol negatif.
Pengaruh paparan asap rokok yang mengandung radikal bebas terhadap abnormalitas spermatozoa dalam penelitian ini Tabel 2. Data perhitungan jumlah rata rata abnormalitas spermatozoa.
No Kelompok Rata-Rata morfologi abnormal spermatozoa Peningkatan Abnormalitas (%) Penurunan Abnormalitas (%) 1 Kontrol negatif 8,38 ± 1,09 a 2 Kontrol positif 22,1 ± 1,27c 62,08 3 Terapi 200 mg/kgBB 20,4 ± 0,90 c 7,69 4 Terapi 400 mg/kgBB 15,6 ± 1,14 b 29,41 5 Terapi 600 mg/kgBB 10,18 ± 1,08 a 53,93
7 dapat dilihat dengan mikroskop cahaya (Tabel 2). Perbedaan abnormalitas morfologi spermatozoa antara kelompok P1 (kelompok sehat) dan P2 (kelompok sakit) peningkatan jumlah abnormalitas spermatozoa sebesar 62,08%. Hal ini menunjukkan bahwa pemaparan asap rokok yang mengandung radikal bebas dapat meningkatkan abnormalitas spermatozoa secara signifikan (p<0,05).
Radikal bebas yang terbentuk di dalam tubuh akan merusak sel target seperti lemak, protein, karbohidrat dan DNA (Miryanti, 2011). Morfologi spermatozoa yang abnormal dapat menurunkan tingkat fertilitas bagi pejantan. Spermatozoa pada ternak mempunyai pola dasar yang sama, namun secara morfologi terdapat perbedaan-perbedaan tertentu yang menjadi karakteristik bentuk sperma pada masing-masing spesies. Morfologi spermatozoa berkepentingan dalam penentuan fertilitas pejantan (Barth and Oko, 1989).
Spermatogenesis merupakan proses yang fundamental di dalam sistem reproduksi pria yang melibatkan serangkaian peristiwa genetik di dalam sel-sel germinal yang berperan
penting mengubah spermatogonia menjadi spermatozoa (Liu et al., 2008). Salah satu dari bahan yang bisa menghambat spermatogenesis adalah radikal bebas dari asap rokok. Radikal bebas mampu bereaksi dengan asam deoksiribonukleat (DNA) sehingga terjadi kerusakan sel yang dapat menyebabkan suatu penyakit, salah satunya adalah infertilitas (Halliwell and Gutteridge, 1999).
Proses spermatogenesis ini dikendalikan oleh hormon gonadotropin, yaitu Follicle Stimulating Hormone (FSH) dan Luteinizing Hormone (LH). Penghambatan sekresi FSH oleh inhibin B akan menyebabkan kegagalan ikatan FSH dengan reseptornya (FSH-R) di dalam sel sertoli. Ikatan antara FSH dan FSH-R pada sel sertoli akan merangsang adenylate cyclase (AC) sehingga menyebabkan peningkatan kadar cAMP intratestikuler. Kondisi ini menyebabkan diaktivasinya PKA yang akhirnya memfosforilasi faktor transkripsi CREB dan CREM. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa kegegalan ikatan antara FSH dan FSH-R menyebabkan tidak teraktivasinya pathway cAMP–PKA sehingga menghambat
Gambar 2. Kelainan morfologi spermatozoa pada tikus Rattus norvegicus
Keterangan : Tanda panah menunjukkan abnormalitas spermatozoa. Tanda panah pada gambar A menunjukkan abnormalitas ekor yang menggulung. Pada gambar B menunjukkan ekor spermatozoa yang tidak terbentuk sempurna.
B
8 regulasi ekspresi CREM yang berperan penting pada spermatogenesis (Aulanni’am, 2011).
Gangguan regulasi ekspresi CREM menyebabkan terjadinya gangguan maturasi spermatid akibat terjadinya gangguan regulasi atau defisiensi protamine. Defisiensi protamine berdampak pada kerusakan kromatin spermatozoa. Hal ini disebabkan karena kromatin disusun oleh struktur DNA dan nukleoprotein (protamine). Kerusakan kromatin atau DNA spermatozoa dapat menurunkan kualitas spermatozoa yang pada akhirnya dapat berdampak terhadap abnormalitas spermatozoa (Aulanni’am, 2011). Radikal bebas yang terkandung dalam asap rokok dapat menyebabkan defisiensi protamine, yang mengakibatkan terjadinya infertilitas pada pejantan. Hal ini sesuai dengan pendapat Cho et al., (2001) yang menyebutkan bahwa protamine berperan penting menjaga integritas kromatin spermatozoa manusia, sedangkan defisiensi protamine diyakini sebagai faktor penyebab dihasilkannya spermatozoa yang immotil. Defisiensi protamine yang di sebabkan karena adanya radikal bebas dari asap rokok yang menurunkan sekresi FSH dan akhirnya dapat menurunkan kemampuan spermatozoa untuk melakukan fertilisasi terhadap sel telur (Carrell and Liu, 2001). Ekspresi abnormal protamine menyebabkan terjadinya penurunan jumlah spermatozoa, penurunan motilitas dan morfologi spermatozoa, peningkatan kerusakan kromatin spermatozoa, penurunan viabilitas spermatozoa,
dan infertilitas pada pria (Aulanni’am et al., 2011).
Perbedaan abnormalitas morfologi spermatozoa antara P2 (kelompok sakit) dan P3 (dipapar asap rokok + terapi 200 mg/kg BB) menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata (p>0,05) dengan penurunan abnormalitas spermatozoa sebesar 7,69%. Pada kelompok P4 yakni kelompok yang di papar asap rokok dan di terapi menggunakan ekstrak ethanol 400 mg/kg BB menunjukkan hasil yang signifikan (p<0,05) apabila di bandingkan dengan kelompok P2 (kelompok kontrol positif) yakni penurunan sebesar 29,41%. Demikian pula perbandingan kelompok P5 (dipapar asap rokok dan diterapi menggunakan ekstrak ethanol kulit buah manggis 600 mg/kg BB) dengan kelompok P2 (kelompok kontrol positif), yang menunjukkan hasil penurunan morfologi spermatozoa sebesar 53,93%.
Penurunan abnormalitas spermatozoa tersebut dikarenakan pemberian ekstrak ethanol kulit buah manggis. Kulit buah manggis merupakan sumber antioksidan yang diharapkan mampu untuk mengurangi bahaya dari radikal bebas yang dapat menurunkan kualitas spermatozoa. Moongkarndi et al., (2004) melaporkan bahwa ekstrak kulit buah manggis berpotensi sebagai antioksidan. Ekstrak kulit buah manggis di harapkan mampu meningkatkan ekspresi protamine. Protamine yang terekspresi normal diduga dapat meningkatkan kualitas spermatozoa dan dapat A
9 mengurangi kejadian infertilitas (Aulanni’am, 2011).
Kesimpulan
Pemberian ekstrak ethanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L) mampu meningkatkan ekspresi cAMP Responsive Element Modulator (CREM) dan dapat menurunkan abnormalitas spermatozoa tikus (Rattus norvegicus) jantan yang terpapar asap rokok.
Ucapan Terimakasih
Terimakasih kepada Nabel Ahmed A. Mansour M.Si yang telah memberikan kesempatan dalam mengikuti penelitian ekstrak ethanol kulit buah manggis dan kerjasama yang luar biasa untuk penyelesaian penelitian ini. Daftar Pustaka
Amal. 2011. Pengaruh Paparan Asap Rokok Terhadap Perbaikan Memori Jangka Panjang Tikus. Tugas Akhir, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
Aulanni’am. 2011. Inhibin B: Struktur dan Karakter Biokimiawi Sebagai Kandidat Kontrasepsi Pria. Surabaya: Airlangga University Press.
Aulanni'am, A. Muslim, M. Aris, B. Sutiman, dan B. Basuki. 2011. Inhibin B Menghambat Ekspresi Molekul Protamine P2 di Dalam Kepala Spermatozoa Tikus (Rattus norvegicus). Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya, Malang. Laboratorium Embriologi dan Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh. Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya, Malang
Barth, A.D and R.J. Oko. 1989. Abnormal Morphology of Bovine Spermatozoa. Iowa State University Press. Iowa. Carrell, D.T. and L. Liu. 2001. Altered
protamine 2 expression is uncommon in donors of known fertility, but common among men with poor fertilizing capacity, and may reflect other abnormalities of spermiogenesis. J. Androl. 22:604-610.
Cho, H. Jung-Ha, W.D. Willis, E.H. Goulding, P. Stein, Z. Xu, R.M. Schultz, N.B. Hecth, and E.M. Eddy. 2003. Protamine-2 deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice. Biol. Reprod. 69:211-217.
Groussin, L. and J. Bertherat. 1998. Transcriptional regulation by cyclic AMP is esensial for development, reproduction and survival: Lessons from the transgenic mice. European Journal of Endocrinology. 139:571-572.
Halliwel B and J.M. Gutteridge. 1999. Free radicals, reactive species and toxicology. Dalam: Free radicals in biology and medicine Third edition. New York: Oxford University Press: 547-550. Hermann, B.P. and L.L. Heckert. 2006.
Transcriptional regulation of the FSH receptor: New perspectives. Molecular and Cellular Endocrinology. 260- 262:100-108.
Liu, P.Y, R.S. Swedloff, B.D. Anawalt, R.A. Anderson, W.J. Bremner, J. Elliesen, Yi- Qun Gu, W.M. Kersemaekers, R.I. McLachlan, M.C. Meriggiola, E. Nieschag, R. Sitruk-Ware, K. Vogelsong, Xing-Hai Wang, F.C.W. Wu, M. Zitzmann, D.J. Handelsman, and C. Wang. 2008. Determinants of the rate and extent of spermatogenic suppression during hormonal male contraception: An
10 integrated analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 93(5):1774-1783.
Mansour, N. A. A. 2013. Antioxidant Activity of Crude Extract from Mangosteen (Garcinia mangostana Linn) Pericarp on The Lung Rat Wich Exposure by Cigarette[Thesis]. Master of Agriculture Product Technology. Faculty of Agricultural Technology. Brawijaya University.
Mardawati, S.A Cucu, dan M. Herlina. 2008. Kajian Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Manggis (Garcinia mangostana L ) Dalam Rangka Pemanfaatan Limbah Kulit Manggis Di Kecamatan Puspahiyang Kabupaten Tasikmalaya: Universitas Padjajaran.
Rehane. 2006. Pengaruh Pemberian Kombinasi Vitamin C dan E terhadap Prosentasi Fokus Metaplasi Bronkiolus Paru Tikus (Rattus novergicus Strain Wistar) Yang Dipapar Asap Rokok Subkroniik. Tugas akhir.FKUB. Malang
Miryanti, Y. I. P.A, L. Sapei, K. Budiono, dan S. Indra. 2011. Ekstraksi Antioksidan Dari Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.). Universitas Katolik Parahyangan. Bandung
Moongkarndi P, N. Kosem, S. Kaslungka, O. Luanratana, N. Pongpan, and N. Neungton. 2004. Antiproliferation, antioxidation and induction of apoptosis by Garcinia mangostana (mangosteen) on SKBR3 human breast cancer cell linn. J Ethnopharmacol.
Saleh R.A, A.Ashok, Essam, A.Nada, Mohamed El-Tonsy, K. Rakesh, Sharma, Meyer, and Andrew. 2003. Negative effects of increased sperm DNA damage in relation to seminal oxidative stress in men with idiopathic and male factor infertility. Fertil Steril; 79(3): 1597-1605 Shofia, vivi. 2012. Studi Pemberian Ekstrak Rumput Laut Coklat (Sargassum
prismaticum) Terhadap Kadar Malondialdehid dan Gambaran Histologi Jaringan Ginjal pada Tikus (Rattus norvegicus) Diabetes Melitus Tipe 1 [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya
World Health Organization. 2006. WHO Laboratory Manual for The Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction.4th ed. WHO. Cambrige: Cambrige University Press. Yuniwati Y dan A. Mulyohadi. 2004. Pengaruh
Paparan Asap Rokok Kretek Terhadap Peroksidasi Lemak Dan Sistem Proteksi Superoksid Dismutase Hepar Tikus Wistar. Jurnal Kedokteran YARSI. 12: 89.
