III
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1. Bahan Penelitian 3.1.1. Objek Penelitian
Objek Penelitian yang digunakan adalah semen yang didapat dari lima ekor kambing Peranakan Etawah jantan berumur 1,5-3 tahun yang dipelihara di Breeding Station Fakultas Peternakan, Universitas Padjadjaran. Pakan yang diberikan yaitu berupa hijauan sebanyak 5-6 kg/hari/ekor serta diberi tambahan berupa konsentrat sebanyak 700-800 gr/hari/ekor.
3.1.2. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam kegiatan;
1) Penampungan Semen
a. Vagina buatan yang terdiri dari Inner liner dan corong karet tipis sebagai alat utama untuk menampung semen
b. Termos untuk menyimpan air hangat
c. Thermometer untuk mengukur suhu air hangat dalam termos
d. Tabung penampung semen berskala untuk menampung semen segar hasil ejakulat ternak
2) Alat Evaluasi semen
a. Mikroskop untuk identifikasi spermatozoa secara mikroskopis b. Tabung Semen untuk menyimpan semen hasil penampungan c. Pipet untuk mengambil semen dari tabung semen
d. Objek glass untuk wadah menyimpan media pengamatan saat mengamati dengan mikroskop
e. Cover glass untuk menutup media pengamatan yang terdapat dalam objek glass
f. Batang pengaduk untuk mengaduk pengencer dengan semen g. Tabung reaksi untuk wadah menyimpan semen maupun pengencer h. Haemocytometer batu merah dan kamar hitung Neubaeur untuk
pengamatan konsentrasi spermatozoa
i. Pipet erythrocyt untuk menghisap semen saat pengamatan konsentrasi spermatozoa
j. Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi k. Kertas lakmus untuk mengecek pH
3) Alat pengencer semen
a. Timbangan analitik untuk menimbang bahan pengenceran semen b. Kertas saring utuk mmisahkan kuning telur dengan albumen
c. Tabung erlenmeryer untuk menyimpan larutan pengencer dan semen d. Alumunium foil untuk menutup larutan pengencer dalam tabung
erlenmeyer
e. Gelas ukur untuk mengukur kebutuhan larutan peengencer 4) Alat pembekuan semen
a. Straw volume 0,25 ml sebagai wadah semen saat pembekuan
b. Goblet dan canister untuk menyimpan straw yang terdapat dalam container
c. Container untuk wadah penyimpanan straw yang terendam dengan nitrogen cair
d. Kotak styrofoam yang berisi rak besi untuk proses pembekuan semen
3.1.3. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam kegiatan;
1) Penampungan Semen
a. Air hangat dengan suhu 38- 450C untuk dimasukkan dalam selongsong karet vagina buatan sebagai manipuasi suhu vagina yang sebenarnya.
b. Vaseline untuk melicinkan vagina buatan agar penis mudah masuk dalam vagina buatan.
2) Evaluasi Semen Secara Mikroskopis yaitu menggunakan larutan NaCl 3%
untuk pengamatan konsentrasi spermatozoa.
3) Pengenceran Semen
a. Sitrat sebagai bahan pengencer utama atau media buffer.
b. kuning telur untuk pencegah coldshock saat pembekuan.
c. Fruktosa sebagai sumber nutrisi pada spermatozoa.
d. Penicillin dan streptomycin sebagai bahan antibiotik dalam pengenceran semen.
e. Gliserol untuk proses kriopreservasi.
f. Aqubidestilata untuk melarutkan bahan pengencer.
4) Pembekuan Semen menggunakan nitrogen cair 2,5 liter untuk proses pembekuan semen.
5) Thawing Semen menggunakan air hangat dengan suhu 370 C untuk mencairkan kembali semen yang telah dibekukan.
6) Tudung akrosom utuh menggunakan NaCl dan formalin 1% untuk pengamatan keutuhan selimut pada kepala spermatozoa
3.1.4. Prosedur Penelitian
A. Prosedur Penampungan Semen
1. Vagina buatan (VB) diisi dengan air hangat suhu 38- 450 C dan atur suhu air menggunakan thermometer. Sesudah diisi air, tekanan udara disesuaikan menggunakan pompa.
2. Vagina Buatan diberi vaseline pada bagian selongsong.
3. Vagian buatan dipegang oleh operator dengan tangan kanan.
4. Operator siap di sebelah kanan belakang pemancing.
5. Pejantan didekatkan dengan ternak pemancing yang bertujuan untuk merangsang libido pejantan yang akan ditampung.
6. Setelah dilakukan 2 – 3 kali False mount, pejantan diizinkan menaiki pemancing dan operator penampung segera membelokkan arah penis ke arah mulut VB yang telah disiapkan.
7. Setelah penis masuk kedalam VB akan terjadi sentakan keras dan pada saat itu terjadi ejakulasi sehingga pejantan mengeluarkan semen.
8. Semen yang masuk akan tertampung ke dalam tabung gelas penampung semen dengan cepat.
9. Pejantan diturunkan secara perlahan-lahan secara bersamaan mengeluarkan penis dengan meletakkan VB agak miring.
10. Tabung gelas kemudian dilepaskan dari corong karet dan segera bagian yang terbuka ditutup dengan aluminium foil atau plastik.
11. Semen segera dibawa ke laboratorium untuk segera di evaluasi.
B. Evaluasi Semen
Pemeriksaan semen dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis yang bertujuan untuk mengetahui kualitas semen yang dihasilkan sebagai uji layak atau tidaknya untuk dianjutkannya ke tahap pembekuan semen.
1) Evaluasi Semen Segar Secara Makroskopis
1. Volume Semen dapat diketahui dengan melihat angka pada tabung penampungan semen atau melihat skala pada ampul semen.
2. Warna semen dapat diketahui secara langsung. Warna semen bervariasi antara kuning, krem, ataupun menyerupai warna susu. Warna yang tidak normal dapat disebabkan akibat adanya penyakit, luka ataupun kambing sering melakukan ejakulasi yang menyebabkan konsentrasi sperma menurun atau semen encer.
3. Derajat Keasaman (pH) diukur menggunakan kertas lakmus dengan cara dicelupkan kedalam tabung berisi semen. Selanjutnya, amati perubahan warna pada kertas lakmus dan bandingkan dengan standar warna pH meter.
4. Bau semen segar dilakukan dengan mencium bau semen dari ujung tabung. Semen yang baik memiliki bau khas emen. Bau yang tidak wajar atau busuk dapat disebabkan spermatozoa pada semen telah banyak yang mati karena ternak terjangkit penyakit.
5. Konsistensi atau kekentalan diketahui dengan mengamati jatuhnya sperma saat memiringkan sedikit demi sedikit semen yang ada pada tabung reaksi kemudian dikembalikan pada kondisi semula. Rata rata semen yang baik akan memiliki konsistensi yang kental.
2) Evaluasi Semen Segar Secara Mikroskopis
1. Gerakan Massa dilihat dengan meneteskan semen ke objek glass dan mengamatinya dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10. Jika semen yang diamati gerakannya cepat berpindah, dan terbentuk gumpalan tebal dan gelap, maka gerakan massanya bernilai (+++). Gerakan massa memliki nilai (++) apabila gerakannya cepat, terbentuk gumpalan agak terang.
Apabila hanya terlihat gerakan sperma sendiri dan tidak ada gumpalan, maka nilai gerakan massanya adalah (+).
2. Konsentrati Total diketahui dengan menghitung jumlah total sperma yang terdapat pada 5 kotak besar yang terdiri dari 16 kotak kecil yang terdapat pada kamar hitung Neubeur dengan cara;
a. Semen dihisap menggunakan pipet erythrocyt sampai tanda 0,5 b. Kemudian Nacl 3% dihisap sampai tanda 101
c. Homogenkan dengan membentuk angka delapan selama 2-3 menit d. Tetesan pertama dibuang dan kemudian larutan yang telah homogen
diteteskan pada celah kamar hitung yang telah diberi cover glass.
e. Larutan yang berlebih dihisap menggunakan tissue secara perlahan.
f. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x40.
Sperma yang terhitung misalnya x, dikalikan 107 dan hasilnya merupakan konsentrati total.
3. Motilitas Spermatozoa bertujuan untuk melihat pergerakan sperma, metode perhitungan ini sama dengan perhitungan konsentrasi sperma total.
Pengamatan motilitas spermatozoa yaitu dengan menghitung jumlah spermatozoa mati dan spermatozoa yang tidak bergerak progresif sehingga diperoleh konsentratsi sperma mati. Selanjutnya spermatozoa total
didapatkan dengan menghitung jumlah spermatozoa setelah mati semua.
Motilitas dapat dihitung dengan rumus :
Keterangan :
Y = Motilitas sperma
C. Perhitungan Jumlah Pengencer
Setelah melakukan evaluasi makroskopis dan mikroskopis, semen yang memenuhi syarat selanjutnya dilakukan pengenceran semen.
1. Perhitungan jumlah dosis :
2. Perhitungan volume pengencer dan semen :
Volume Pengencer dan Semen = Jumlah dosis x Volume Inseminasi 3. Perhitungan Volume pengencer yang ditambahkan:
Pengencer = (Volume pengencer dan semen) – (Volume semen)
D. Pembuatan Pengecer Sitrat-kuning telur
1. Pengencer Sitrat-kuning telur yang terdiri atas 2,9 gram Natriumsitratdihidrat dan 0,5 gram kristal Fruktosa dilarutkan dengan aqubidestilata hingga mencapai volume 100 ml.
2. Kocok sampai semua kristal Natriumsitrat larut.
3. Larutan tersebut dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer dan mulut labu ditutup dengan aluminium foil.
Y =
∑ Spermatozoa total - ∑ Spermatozoa yang mati
x 100%
Spermatozoa total
∑ Dosis=
Volume semen x Konsentrasi total x Motilitas sperma 2x Konsentrasi spermatozoa motil dalam satu dosis IB
4. Larutan buffer (Natrium sitrat fruktosa) sebanyak 80 ml disiapkan dalam Beaker glass 100 ml
5. Sebanyak 20 ml kuning telur (telah dipisahkan antara kuning telur dan selaput vitelin dengan albumen) dimasukkan kedalam beaker glass yang berisi Natrium sitrat
6. Aduk hingga merata dengan menggunakan batang pengaduk gelas.
7. Lakukan pengadukan dengan hati-hati agar tidak terbentuk busa yang berlebihan.
8. Kemudian, ditambahkan 100.000 internasional unit (IU) Penicillin dan 100 mg Streptomycin kedalam larutan Natrium sitrat Kuning Telur (1000 IU Penicillin dan 1 mg Streptomycin untuk setiap milliliter pengencer)
9. Mulut beaker glass ditutup dengan aluminium foil.
E. Gliserolisasi
Gliserolisasi dilakukan dengan cara;
1. Siapkan 2 rak tabung reaksi yang masing-masing terdiri dari 5 tabung serta diberi label pada setiap tabung sesuai perlakuan
2. Setiap tabung pada kedua rak diisi dengan pengencer sitrat-kuning telur sesuai dengan hasil perhitungan pengencer yang dibutuhkan pada masing-masing tabung.
3. Pengencer sitrat-kuning telur dicampurkan dengan semen pada rak tabung reaksi pertama
4. Gliserol ditambahkan kedalam setiap tabung rak kedua sesuai dengan jumlah dosis yang dibutuhkan pada setiap perlakuan yaitu 5%, 6%, 7%, 8%, dan 9%.
5. Setiap tabung pada rak kedua dicampurkan dengan setiap tabung semen pada rak pertama sesuai dengan label yang sama.
6. Aduk secara perlahan hingga homogen pada suhu kamar
7. Semen cair disimpan kedalam lemari es dengan temperatur 50C selama 2-4 jam untuk proses equibrasi. Equlibrasi merupakan periode yang dibutuhkan spermatozoa sebelum pembekuan agar beradaptasi dengan pengecer maupun suhu ligkungannya.
F. Pengemasan Straw
Pengemasan semen ke dalam straw dilakukan di dalam lemari es atau cool top agar temperaturnya tetap pada 5C. Kemasan Straw yang diguakan pada
penelitian ini adalah model IMV Perancis dengan volume tiap straw sebesar 0,25 ml. Pengemasan staw dilakukan dengan cara;
1. Ujung straw yang memiliki sumbat kapas disambungkan dengan selang penghisap dan ujung straw yang lain disambungkan dengan pompa penghisap
2. Tuangkan semen dari beaker glass ke dalam cawan plastik khusus untuk pengisian straw
3. Hidupkan pompa penghisap dan biarkan cairan semen memasuki straw sampai penuh
4. Setelah selesai pengisian maka tutup ujung bebas straw dengan tepung polyvinyl alcohol.
G. Prosedur Pembekuan Semen
Siapkan styrofoam yang di dalamnya terdapat kotak logam pada bagian bawah dan keranjang kawat diatasnya. Nitrogen cair sebanyak 2,5 liter
dimasukan dalam kotak logam secara hati-hati menggunakan corong plastik besar yang disambung dengan selang plastik, lalu straw disimpan pada keranjang kawat dan atur agar tidak bertumpuk. Lakukan proses pre-freeezing dengan suhu -80 sampai -100 0C dan biarkan gas Nitrogen menguapi straw dengan jarak 5 cm selama 7-8 menit. Lalu proses freezing dengan cara memasukkan straw ke dalam Nitrogen cair bersuhu -1960C. Straw yang telah beku dimasukkan ke dalam goblet yang ditempatkan dalam canister dan disimpan di dalam container.
H. Thawing (pencairan kembali)
Thawing semen yang telah dibekukan dilakukan dengan cara memasukkan semen ke dalam air yang bersuhu 370C selama kurang lebih 30 detik. Selesai thawing semen siap di evaluasi.
I. Prosedur Pengamatan Daya Hidup Spermatozoa
Daya tahan hidup sperma dilakukan dengan mengamati seberapa lama spermatozoa tersebut dapat bertahan hidup hingga spermatozoa yang didapatkan mati semua atau motilitas 0% setelah di thawing yang diamati setiap 3 jam sekali.
Jika motilitasnya sudah mencapai ≤ 20%, maka pengamatan dilakukan tiap 1 jam sekali. Pengamatan daya tahan hidup ini sama dengan pengamatan motilitas, tetapi pengencernya menggunakan larutan sitrat bukan NaCl 3%. Spermatozoa yang bergerak tidak progresif dan yang mati dihitung sebagai sperma mati.
J. Prosedur Pengamatan Tudung Akrosom Utuh
Tudung akrosom utuh (TAU) diamati dengan melihat kesempurnaan kondisi kepala spermatozoa menggunakan mikroskop fase kontras pada pembesaran obyektif 400 kali dengan cara;
1. Siapkan semen yang telah dicampur dengan pengencer sesuai dengan perlakuan yang diamati
2. Sebanyak 0,9 gram NaCl dilarutkan dengan Aqubidestilata hingga mencapai 100 ml
3. Tambahkan 1 ml formalin ke dalam 99 ml larutan NaCl fisiologis 4. Campurkan larutan tersebut hingga homogen
5. Larutan tersebut diteteskan pada semen yang telah ditempatkan pada objek Glass lalu buat preparat ulas
6. Amati 200 spermatozoa dengan tudung akrosom yang utuh menggunakan mikroskop pembesaran 400 kali
7. Tudung akrosom yang utuh ditandai oleh tudung atau penutup bagian ujung kepala spermatozoa berwarna hitam, sedangkan yang rusak tudung akrosomnya berwarna putih (mengkilat).
4.2. Metode Penelitian 4.2.1. Peubah yang diamati
A. Daya Hidup sperma
Pengamatan daya hidup sperma diamati hingga seberapa lama sperma dapat bertahan hidup hingga sperma tersebut mati semua atau motilitas 0%
setelah di thawing.
B. Tudung akrosom Utuh
Evaluasi dilakukan dengan menghitung keutuhan tudung akrosom spermatozoa. Perhitungan tudung akrosom utuh sebagai berikut;
TAU = Jumlah spermatozoa bertudung akrosom utuh x 100%
Jumlah spermatozoa yang dihitung
4.2.2. Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Rancangan Acak Kelompok (RAK), dengan 5 perlakuan dan 5 kelompok.
sehingga terdapat 25 unit percobaan. Kelima kelompok dalam penelitian ini adalah penampungan semen dari lima ekor kambing dan perlakuan dalam penelitian ini yaitu;
1. P1 = Semen + (Pengencer + gliserol 5%) 2. P2 = Semen + (Pengencer + gliserol 6%) 3. P3 = Semen + (Pengencer + gliserol 7%) 4. P4 = Semen + (Pengencer + gliserol 8%) 5. P5 = Semen + (Pengencer + gliserol 9%)
model matematika dan rancangan yang digunakan yaitu sebagai berikut:
Yij = µ + γi + βj + εij Keterangan:
Yij : Respon hasil pengamatan dari perlakuan ke-i dan kelompok ke-j µ : Nilai tengah populasi
γi : Pengaruh perlakuan ke-i βj : Pengaruh kelompok ke-j
εij : pengaruh galat yang timbul dari perlakuan ke-i kelompok ke-j
Hipotesis:
: Pengaruh perlakuan berarti tidak ada perlakuan yang berpengaruh nyata terhadap daya hidup dan tudung akrosom utuh sperma.
: Pengaruh perlakuan , atau paling sedikit ada satu perlakuan yang mempengaruhi daya hidup dan tudung akrosom utuh sperma.
Hasil analisis data penelitian yang didapat, akan disajikan dalam tabel sidik ragam.
Tabel 1. Daftar Sidik Ragam
Sumber Keragaman db JK KT Fhit F0,05 Kelompok (r-1) 4 JKK JKK/db
Perlakuan (t-1) 4 JKP JKP/db KTP/KTG Galat ((r-1)(t-1)) 16 JKG JKG/db
Total (tr-1) 24 JKT
Keterangan: db = Derajat bebas JK = Jumlah kuadrat KT = Kuadrat tengah
Kaidah keputusan:
1. Bila Fhitung ≤ F0.05 berbeda tidak nyata (non significant), maka terima dan tolak H1.
2. Bila Fhitung > F0.05 berbeda nyata (significant), maka tolak dan terima H1. Jika Ho ditolak, maka selanjutnya untuk mengethui perbedaan antar perlakuan dilakukan analisis dengan menggunakan Uji Jarak Berganda Duncan, dengan rumus :
LSR = SSR x Sy
Sy = KTG r
Keterangan :
Sy = Galat Baku
KTG = Kuadrat Tengah Galat r = Ulangan Periode
LSR = Least Significant Range (Jarak beda nyata terkecil) SSR = Studentized Significant Range
Bila selisih antara perlakuan dibanding dengan LSR, kaidah keputusan “ 1. Bila d < nilai LSR, maka non signifikan
2. Bila d ≥ nilai LSR, maka siginifikan Keterangan :
d = selisih antar perlakuan
