Jurnal Biotropika | Vol.2 No. 4 | 2014 223
Perkembangan sel T CD4 dan CD62L pada Organ Spleen Mencit yang diinfeksi
Salmonella typhimurium setelah pemberian Ekstrak Ethanol Daun Polyscias obtusa dan
Elephantopus scaber
Nida Asfi1, Moch. Sasmito Djati1
1Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang 1)
nida.asfi@gmail.com, 2)msdjati@yahoo.com
ABSTRAK
Polyscias obtusa dan Elephantopus scaber merupakan tanaman yang memiliki kemampuan Immunomodulator. Penelitian menggunakan dua tanaman obat ini secara bersama diharapkan dapat diketahui manfaat sinergis antara kedua tanaman obatini. Penelitian ini dilakukan menggunakan hewan coba mencit Balb/C Musmusculus yang diinfeksi dengan bakteri Salmonella typhi (dosis 108). Treatment diberikansecara oral dari ekstrak etanol daun Tapak liman dan Kedondong laut dengan perbandingan dosis antara kedua yaitu (0%:100%; dan50%:50%) dengan dosis awal Elephantopus scaber dan Polyscias obtuse sebesar 50mg/KgBB. Pembedahan dilakukan pada hari ke-14 dan ke-18 setelah dilakukan injeksi. Sel limfosit diisolasi dari organ spleen, dianalisa dengan flowcitometry dan dianalisa hasil dengan one way ANOVA menggunakan SPSS 16.0 dan dilanjutkan uji Tukey. Berdasarkan hasil yang didapatkan bahwa perlakuan pemberian ekstrak etanol daun Kedondong laut dan Tapak liman menurunkan jumlah relative sel TCD4+ secara signifikan yaitu sebesar 6,29% dibandingkan kontrol positif 18,9%, dan dibandingkan dengan pemberian ekstrak daun tapak liman saja tidak menurun secara signifikan yaitu sebesar 9.22% hal tersebut menunjukkan adanya efek imunosupresan dari Tapak liman dan Kedondong laut yang diberikan bersamaan. Jumlah relative sel T CD62L+ menunjukkan peningkatan yang cukup signifikan pada perlakuan pemberian ekstrak etanol daun Kedondong laut dan Tapak liman yaitu sebesar 14,19% dibandingkan kontrol yaitu 5,35%, dan menurun pada perlakuan pemberian tapak liman saja, hal ini menunjukan bahwa pemberian ekstrak etanoldaun Kedondong laut dan Tapak liman mempengaruhi proliferasi sel naive
Kata kunci: Elephantopus scaber, Polyscias obtusa,Spleen
ABSTRAC
Polyscias obtusa and Elephantopus scaber is a plant that has immunomodulators effect. This research using these two herbs are expected to know the benefits of synergy between these two medicinal plants. This research was conducted using experimental animals Balb / C mice Mus musculus infected with the bacterium Salmonella typhi (108 doses). Treatment was administered orally from the ethanol extract of the leaves Polyscias obtuse and Elephantopusscaber with dose (0%: 100% and 50%: 50%) with an initial dose of Elephantopus scaber and Polyscias obtusa by 50mg/KgBB. Surgery performed on the 14th day and 18th after injection. Lymphocytes isolated from the spleen organ, analyzed with flowcytometry and analyzed the results with one way ANOVA using SPSS 16.0 and Tukey test continued. Based on the results obtained that the treatment of ethanol extract of leaves Polyscias obtuse and Elephantopus scabers showen the relative number of cells was lower significantly TCD4 + is equal to 6.29% compared to positive controls 18.9%, and compared with Elephantopus scaber leaf extract alone did not decrease significantly ie at 9,22% it showed immune suppressive effects of Polyscias obtusa and Elephantopus scaber given simultaneously. Relative number of CD62L+ T cells showed a significant increase in treatment of ethanol extract of leaves Kedondong laut and Tapak liman is equal to 14.19% compared to controls 5.35%, and decreased in treatment just Elephantopusscaber, this shows that the ethanol extract of leaves Plysciasobtusa and Elephantopus scaber makes cell proliferation naïve affect.
Jurnal Biotropika | Vol.2 No. 4 | 2014 224 PENDAHULUAN
Penggunaan antibiotik dapat menghambat perkembangan janin dan hingga dapat menyebab kelahiran cacat. Sehingga dibutuhkan alternatif yang dapat meminimalisir penggunaan antibiotik [1]. Beberapa tanaman obat dapat digunakan sebagai alternatif menimalisir penggunaan antibotik. Kedondong laut (Polyscias obtusa)
merupakan tanaman yang mengandungan senyawa dari kelompok asam oleonic saponin. Saponin merupakan senyawa yang penting untuk nutrisi pada hewan dan manusia. Saponin juga dapat berperan pada permeabilitas membrane, sebagai imunostimulan, agen antikarsinogenik, dan hypocholestrolaemic [2]. Elephantopus scaber juga merupakan tumbuhan yang mengandung zat besi besi (Fe) sebanyak 45,4% dan 30,2% [3]. Zat besi ini penting dalam pembentukan hemoglobin. Kurangnya zat besi dapat menyebabkan terjadinya anemis dimana sel eritrosit tampak kecil dan pucat. Fe dikenal sebagai agen eritropoietic [4].
Tubuh Salmonella thypimurium dibagi menjadi 3 serovar berdasarkan antigen utama yang dimiliki yaitu O (somatic), Vi (capsular/surface), dan H (Flagellar).
Salmonella thyipimurium sebagai agen penyebab typhoid yang dikarenakan antigen Vi yang dimilikinya mampu mereduksi pengeluaran IL-8 yang berperan untuk menginduksi PMN (neutrofil). Secara singkat mekanisme infeksi sistemik Salmonella thypimurium dapat digambarkan dalam beberapa fase, yang pada akhirnya dapat diferensiasi sel T CD4 yang berlebih sehingga mengakibatkan terjadinya infeksi kronis [5].
Sistem imun berfungsi mengenali dan menyerang antigen asing yang masuk dan menginfeksi tubuh. Sistem imun disusun oleh beberapa organ yang yang terbagi menjadi organ limfoid primer dan organ limfoid sekunder. Salah satu organ lomfoid sekuder yang mampu menangkap antigen lebih banyak dari pada organ limfoid sekunder lainnya adalah spleen. Respon imun terhadap antigen diawali dengan diaktifkannya beberapa sel limfosit T dan B. Aktivasi sel limfosit ditandai diekspresikannya beberapa subset sel limfosit seperti sel T CD4 dan CD62L [6]. Sehingga dengan dilakukan pengamatan pada organ spleen diharapkan akan terlihat peningkatan sistem imun mencit Mus musculus BALB/C bunting setelah diberikan suplemen imunomodulator.
METODE 1. Persiapan rancangan percobaan.
Jenis penelitian yang dilakukan yaitu penelitian eksperimental menggunakan 7 kelompok percobaan, yaitu 2 kelompok kontrol dan 2 kelompok perlakuan.Penilaian dilakukan setiap hari ke-14 dan hari ke-18 setelah hewan coba diasumsikan bunting dengan membandingkan hasil observasi pada kelompok perlakuan dan kontrol, serta antar kelompok perlakuan.. Sehingga jumlah total sampel sebanyak 24 ekor. Mencit Balb/C sebanyak 24 ekor dibagi menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompokterdiri atas 3 ekor. Tiap kelompok mencit mendapatkan pakan standar dan minum yangsama secara ad libitum.
2. Proses perkawinan mencit.
Sebelum dilakukan proses pembuntingan mencit Balb/C betina, mencit jantan dan menit betina aklimatisasi terlebih dahulu selama satu minggu. Selama aklimatisasi mencit jantan dan mencit betina dipisah dalam kandang yang berbeda. Pemisahan mencit jantan dan betina bertujuan untuk sinkronisasi masa estrus. Pembuntingan mencit dilakukan secara simultan setelah dipersiapkan sinkronisasi dengan pemanfaatan fenomena biologis yaitu Leeboot effect, Pheromone effect dan Whiten effect [7].
3. Ekstraksi daun Kedondong laut (Polyscias obtusa).
Jurnal Biotropika | Vol.2 No. 4 | 2014 225 4.Ekstraksi daun Tapak Liman (Elephantopus
scaber).
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini selain Daun Kedandong laut adalah Daun Tapak Liman. Daun dipetik dari daun pertama hingga ke lima dari pucuk tanaman, dipilih yang segar, tidak rusak dan utuh. Kemudian daun dicuci sampai bersih, dan dikering anginkan. Setelah itu daun dimasukan ke dalam oven pada suhu 500C sampai daunnya kering, yaitu selama 3 hari. Daun Tapak Liman yang sudah kering diekstraksi dengan menggunakan pelarut akuades steril. Daun tapak liman yang telah kering tersebut ditimbang beratnya (13,8 gr), digerus/dihaluskan dengan menggunakan mortal sampai terbentuk serbuk halus. Kemudian dilarutkan dengan akuades steril 100 ml, dan diaduk dengan stirer pada suhu 500C selama semalam. Selanjutnya disaring dengan kertas saring. Hasil ekstraksnya kemudian dicari kosentarsi akhir, dan larutan ekstrak siap diujikan.
5. Pemberian secara oral ekstrak daun Kedondong laut dan ekstrak daun Tapak liman.
Mencit diberi ekstrak daun Kedondong laut dan ekstrak daun Tapak liman, yang diberikan secara oral menggunakan sonde pada mencit sesuai rancangan percobaan. Mencit disonde dengan campuran Kedondong dan Tapak liman dengan volume total setiap kali sonde yaitu 100 µl. Sende dilakukan setiap hari pada waktu pagi hari sebelum diberi makan.Pemberian ekstrak daun tapak liman dan kedondong laut selama 14 dan 18hari berturut-turut sesuai rancangan percobaan dengan pemberian makan dan minum secara ad libitum
Injeksi Salmonella thypii pada mencit.
Biakan Salmonella thypimuriumyang telah dikonfirmasi dan disimpan dalam medium NA miring ditumbuhkan pada mediumcair NB dan diinkubasi selama 1x 24 jam. Kemdian diambil 1 ml dari medium cair NB yang telah diinkubasi selama 24 jam dan ditambahkan 9ml medium NB baru. Pada medium NB baru tersebut dilakukan perhitungan jumlah sel bakteri tiap 1 jam untuk mendaptkan jumlah sel bakteri 108sel/ml. Perhitungan sel dilakukan dengan
Haemocytometer. Biakan yang telah difikasasi dengan formalin 4% dihitung dengan menggunakan haemocytimeter . Setelah diperoleh jam dengan jumlah sel 108sel/ml maka dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000rpm selama 10 menit pada suhu 25oC.
Pelet yang diperoleh diresuspensi dengan larutan garam fisiologis NaCl 90%.Suspensi tersebut kemudian diinjeksikan pada Mencit yang telah diberi perlakuan selama tujuh hari.Mencit di injeksi dengan Salmonella thypisecara intera peritoneal.Injeksi dilakukan pada mencit sesuai rancangan percobaan. Injeksi dilakukan dengan cara mencit dipegang bagian tengkuk dengan ibu jari dan telunjuk kiri. Kemudian tubuh mencit dibalik yaitu bagian ventral menghadap atas (tangan kiri tetap memegang tengkuk mencit) dan kaki belakang mencit dipegang dengan tangan kanan.Bagian ventral diusap dengan kapas yang dibasahi alkohol 70%. Kulit bagian perut mencit dicubit, lalu spuit yang telah diisi dengan Salmonella thypimurium disuntikkan pelan-pelan pada bagian area kulit yang terangkat.
6. Isolasi Sel dari organ Spleen.
Sel Limfosit yang akan dihitung populasinya diisolasi dari spleen yang diambil dari mencit yang telah dibedah, kemudian dipencet dengan ujung spuid dan digerus searah jarum jam dan disuspensi dengan PBS. Selnjutnya sel-sel yang diperoleh difilter menggunakan wore. Kemudian hasil yang diperoleh disentrifus dengan kecepetan 3200 rpm dengan suhu 20oC, selama 5 menit.Supernatan dibuang dan pelet diresuspensikan dengan PBS 1 ml. Selanjutnya dilakukan pipetinguntuk mendapatkan homogenat.Homogenat sebanyak 100 µl dipindahkan pada tabung mikrosentrifus baru dan ditambahkan 500 µl PBS.Selanjutnya disentrifus pada 3200 rpm dengan suhu 20oC selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 1 ml PBS dan sel hasil isolasi siap untuk proses analisa selanjutnya.
7. Analisa Flowcytometry.
Jurnal Biotropika | Vol.2 No. 4 | 201 8. Analisa Data.
Setelah didapatkan data perlakuan yang dilakukan, ma didapat diuji normalitasnya.Se perlakuan diulang 3 kali, ranca yang dilakukan yaitu Ran Lengkap.Selanjutnya data yang d dengan ANOVA dengan SP windows, kemudian jika dipero signifikan maka dilanjutkan deng
HASIL DAN PEMBAH
1. Analisis Jumlah Sel T CD4
Berdasarkan hasil analisa pada organ spleen (Gambar dilakukan infeksi Salmonella
intraperitoneal pada hari ke-7 um dengan diperlakuan pemberian etanol daun Tapak liman dan K sesuai perlakukan menunjukka berbeda signifikan (P>0,05) ter sel Limfosit T CD4+. Perlakuan menunjukkan jumlah relatif sel 4,16% pada pembedahan hari k berbeda nyata pada perlakuan y pembedahan hari ke-18 yaitu 10 sel relatif ini berbeda jauh de kontrol yang diinfeksi deng thypimurium, pada kontrol posit sel CD4+ pada pembedahan h 18,94% namun pada pembedah jumlah relatif sel CD4+ turun hi ini diduga karena adanya antig dalam tubuh mencit.
Infeksi sistemik Salm menyebabkan teraktivasinya m meningkatkan killing sel memproduksi sitokin [5]. disekresikan antara lain TNFα y untuk produksi IFNγ, dimana meningkatkan CMI dan mengind Th menjadi Th1 dan pada akhirn proliferasi sel T CD4. Setelah pe etanol daun Tapak liman dan k terjadi penurunan jumlah sel T CD
Gambar 4.1 Jumlah relative se g didapatkan di uji SPSS 16.0 for sitif jumlah relatif hari ke-14 yaitu pemberian formula 50%:50% Kedondong laut turun sec dibandingkan dengan kont relatif sel CD4+ menj pembedahan hari ke-14,dan p yang dibedah pada hari signifikan hingga 10,12%. H senyawa aktif pada Tapak lim laut memiliki kemampua sehingga mampu menurun CD4+.Selain itu diduga s Tapak liman dan kedondon bekerja secara sinergis imunostimulan. Demikian j pemberian ekstrak etanol da menunjukkan penurunan mes signifikan yaitu jumlah se menjadi 9.22% pada pembed menurun hingga 7.38% pad ke-18 pada perlakuan yang sa Jumlah relatif sel T C pada perlakuan yang diberi Tapak liman dan Kedondon bahwa kedua tanaman ters imnosupresan terhadap sel T dapat diperoleh dari flavon etanol pada kedua tanaman t Th hasil dari aktivasi CD4 berperan dalam kekebalan menginduksi keluarnya sitok alat komunikasi antar sel . K ini akan menginduksi pemat etelah injeksi Salmonella
dan pemberian ekstrak ak liman dan Kedongong
CD4+ pada perlakuan 50% Tapak liman dan secara signifikan jika ontrol positif, jumlah enjadi 6,29% pada n pada perlakuan sama ri ke-18 naik tidak . Hal ini diduga karena liman dan Kedondong puan imunosupresan, daun Tapak liman saja eskipun tidak berbeda sel limfosit T CD+ bedahan hari ke-14 dan pada pembedahan hari g sama.
Jurnal Biotropika | Vol.2 No. 4 | 201
kompleks, terkadang sinergis antagonis tergantung pada kom yang digunakan, tipe sel, konsent eksperimental. Berdasarkan hal diketahui bahwa desain ekspe dilakukan pada penelitian ini me antagonis. Cara kerja berkebalikan dengan Imunosupresan cenderung meng transkripsi dari sitokin sehingga yag berperan dalam aktivasi sel kadarnya. Imunosupressan penurunan julah IL-2 dn IFNγ
kondisi tersebut jumlah sel yang semakin sedikit [9].
2. Analisa Jumlah Total Sel T
Berdasarkan hasil analisa sel T CD4+CD62L+ menunjukkan peningkatan sel T CD4+ naive pa diinfeksi Salmonella thypimuri
ektrak etanol daun Kedondong liman secara signifkan (P>0,0 3,86% dibanding kontrol negati positif yang hanya 0,23% da pembedahan hari ke-14. Pen terlihat signifikan pada pembeda yaitu pada mencit yang diberi daun Tapak liman dan kedond sebesar 14,19%, dibandingkan k dan kontrol positif yang hanya 0,8 Hal ini menunjukkan bahwa k dalam ekstrak etanol daun Ta Kedondong laut dapat menin relatif sel T CD4+ pada mencit
Salmonella typhimurium.
Gambar 4.3 Jumlah relative sel CD perlakuan infeksi
typhipimurium dan p etanol Tapak liman laut.
Pemberian ekstrak daun T Kedondong laut memiliki jumla CD4 naive lebih tinggi jika diban mencit yang diinfeksi Salmonel
kemudian diberi ekstrak etanol da
| 2014
dan Kedondong laut diband diinfeksi Salmonella thypim
diberi ekstrak etanol daun Ta 5,583% pada pembedahan h pada pembedahan hari menunjukkan bahwa senyaw liman tidak dapat menstiuli p naive, hal itu ditunjang [10] stigmasterol pada Tapak kemampuan untuk menstimu Berdasarkan Tedder ( L selektin merupakan mo memiliki fungsi perlekatan endotel pembuluh darah. mampu diekspresikan ol CD4+CD62L+. Sel T naive sirkulasi di dalam darah, na hinga suatu saat bertemu d sudah bertemu dengan antig akan teraktivasi dan kehilang mampu diekspresikan oleh individu normal orang seh Sedangkan pada individu td akan mengalami penurunan pada organ lymphnode perip akan teraktivasi. Selanjutny melakukan down regulated p menghalangi masuk ke lym endotel. Hal ini untuk mence APC sel dendritik karena ad CD8+ dan peningkatan sel antigen yang masuk.
Gambar 4.4 Presentase jum CD4+CD62L+
andinkan mencit yang
ypimurium dan hanya Tapak liman saja yaitu hari ke-14 dan 5,59% ri ke-18. Hal ini awa aktif pada Tapak li proliferasi sel TCD4 ] bahwa senyawa aktif ak liman memiliki tigen maka sel T naive angan molekul CD62L+ telah injeksi Salmonella
Jurnal Biotropika | Vol.2 No. 4 | 2014 228 KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa :
1. Pemberian ekstrak etanol daun Tapak liman dan Kedondong laut pada mencit yang diinfeksi Salmonella thypimurium
mampu memberikan efek imunosupresan dengan formula 50%:50% dari dosis awal 50mg/KgBB
2. Formula 50%:50% dari dosis awal 50mg/KgBB ekstrak etanol daun Tapak liman dan Kedondong laut yang
diberikan mampu meningkatkan
proliferasi sel T CD4+ naive
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan Syukur kepada Allah SWT yang selalu penulis panjatkan, terimakasih kepada Bpk Dr. Ir Moch. Sasmito Djati M.S selaku dosen pembimbing, Mas Bambang serta Mbak Nanik sebagai laboran atas bimbingannya hingga penulis dapat menyelesaikan artikel ilimiah ini dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
[1].Hollman, P. C. H., M. G. L. Hertog, dan M.B. Katan. 1996. Analysis and Health Effects of Flavonoids. Food Chemistry 57 (1) : 43-46
[2].Francis, G., Z. Karem, H.P.S. Makkar dan K. Becker. 2002 The Biological Action of Saponin in Animal System : S review J. Nutr. British 88: 587-605
[3].Juniarianto, E. 1987.Penetapan Kandungan Zat Besi pada Akar lekok Akar dan DAun Tapak Liman (Elephantopus scaber L.) FF Unair. Surabaya
[4].Guyton, A. C. 1990. Fisiologi Manusia dan Mekanisme Penyakit. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta
[5].Sujudi. 2006. Buku Ajar Edisi Revisi Mikrobiologi kedokeran.Bina Rupa Aksara. Tangerang.
[6].Rifa’i, M. , M. Y. Kawamoto, I. Nakashima dan H Suzuki. 2004 Essensial roles of CD8+CD122+ regulatory T cells in the maintenance.The journal of experimental medicine 2009 (9). 111231134
[7].Sardjono, T. W. 2005. Pengaruh infeksi Toxoplasa pada Hasil Kehamilan melalui Interferon Gamma IFN Caspase-3 dan Apoptosis sel-sel Plasenta. Disertasi Doktor Fakultas Kedokteran Airlangga. Surabaya. [8].Weir, D. M. 1990.Segi praktis Imunologi.
[dalam bahasa Indonesia]. Yulius ES.Jakarta : Binarupa Aksara.
[9].Rifa’i, M. 2010.Andrographolide Ameliorate Rheumatoid Arthritis by Promoting the Development ofRegulatory T Cells. Journal of Tropical Life Science. 1 (1) pp 5-8
